Introduzione delle analisi Insulina e hGH in Eolab · Malattie associate all’hGH ... In bambini...

Lavoro di diploma, SSMT Locarno, Tecnici di Analisi Biomediche

Introduzione delle analisi Insulina e hGH in EOLAB

Lavoro di diploma Carolina de Almeida

Figura 1: Immulite 2000

Scuola Superiore Medico Tecnica Locarno Tecnici in Analisi Biomediche

Laboratorio Centrale di Chimica e di Immunologia

Clinica di Bellinzona Responsabile: Dottor Franco Keller

Anno 2010/2011


ABSTRACT

1

Introduzione e obbiettivo

I dosaggi di insulina esercitano un ruolo essenziale nell’identificazione degli insulinomi. I dosaggi dell’hGH invece sono utili principalmente nella diagnosi e per il trattamento delle varie forme di secrezione anomala dell’hGH. Un’iposecrezione può essere indice di nanismo e di potenziale di crescita non raggiunto mentre un’ipersecrezione può indicare gigantismo ed acromegalia. Le analisi di insulina richieste in Ticino vengono spedite a Viollier di Allschwil, mentre quelle dell’hGH vengono spedite all’Inselspital di Berna. L’obbiettivo è introdurre al LC-CIC di Bellinzona queste due analisi, facendo un confronto tra i dati ottenuti nel laboratorio esterno ed i dati ottenuti al LC-CIC e valutando se ci sono differenze clinicamente significative tra questi.

Materiali e metodi

Per questo lavoro sono state prese a caso 30 aliquote per l’insulina e 29 per l’hGH che sono state conservate a -20°C durante 2 mesi. Sono poi state analizzate con l’apparecchio Immulite 2000 con metodo di dosaggio immunometrico in fase solida a doppio sito, in chemiluminescenza. I dati sono stati analizzati e interpretati tramite il software Analyse-it® Ltd., Leeds, UK, versione 2.20.

Risultati

L’insulina misurata al LC-CIC ha uno scostamento proporzionale rispetto ai valori del Viollier. Questo è dovuto al fatto che gli apparecchi sono diversi. L’hGH misurato al LC-CIC ha un leggero scostamento costante e proporzionale rispetto all’Inselspital. Gli apparecchi in questo caso sono gli stessi.

Conclusioni

Per l’insulina da misurare in pazienti che hanno già dei valori precedenti, il medico potrà decidere se continuare a spedire le analisi o se iniziare a farle al LC-CIC con o senza una formula di correzione dei valori. L’hGH potrà essere analizzato al LC-CIC senza che per i pazienti con valori precedenti vi siano problemi di interpretazione e relazione ossia le misurazioni sono comparabili.

Introduction and objective

Measurements of insulin have a essential role in the identification of insulinomas. Measurements of hGH on the other hand are mainly useful for the diagnosis and the treatment of the various kinds of abnormal hGH secretion. Hiposecretion can be an index of dwarfism or of growth potential not reached whereas a hypersecretion can indicate a gigantism or an acromegalia. Analyses of insulin which are requested in Ticino are sent to Viollier of Allschwil while the hGH analyses are sent to Inselspital in Bern. The objective of the research was to introduce at LC-CIC of Bellinzona two new analysis, making a comparision between the data obtained at the LC-CIC and evalueiting if there are clinical significant differences between those ones.

Materials and Methods

For this study 30 aliquots for insulin and 29 for hGH were taken randomly and were conserved at -20 °C for 2 months. They were than analysed with the Immulite 2000 with the method of solid-phase, two-site chemiluminescent immunometric assay. The data were analysed and interpretated with the software Analyse-it® Ltd., Leeds, UK, 2.20 version.

Results

The insuline measured at the LC-CIC has a proportional bias compared to the values of Viollier. This can be explained by the use of different apparatus. The hGH measured at the LC-CIC has a low, constant and proportional bias compared to the values of Inselspital.

Conclusions

For the measurement of insulin in patients who have previous test results, the doctor will be able to decide whether to continue to send the analyses to external laboratories or start to make them at the LC-CIC with or without a correction formula of the value. The hGH can be analysed at the LC-CIC and for the patients with previous test results there are no problems of interpretation that is to say the measurements are comparable.


2

Indice I Introduzione ............................................................................................................................... 4

1.1. Ormone della crescita (hGH)............................................................................................. 4

1.1.1. Cause di ipopituitarismo ............................................................................................. 4

1.1.2. Perché e quando fare il test di stimolazione per l’hGH? ............................................ 4

1.1.3. GH usato come terapia e farmacogenomica ............................................................... 5

1.1.4. Altre analisi correlate all’ hGH .................................................................................. 5

1.1.5. Malattie associate all’hGH ......................................................................................... 6

1.2. Insulina .............................................................................................................................. 7

1.2.1. Introduzione ................................................................................................................ 7

1.2.2. Regolazione della secrezione ..................................................................................... 7

1.2.3. Azione dell’insulina ................................................................................................... 8

1.2.4. Scopo dell’analisi di insulina ..................................................................................... 8

1.2.5. Insulinoma .................................................................................................................. 9

1.2.6. Test che possono essere associati all’analisi di insulina: ........................................... 9

II Obiettivo ................................................................................................................................. 10

III Materiali e metodi.................................................................................................................. 11

3.1. Differenze tra gli apparecchi ........................................................................................... 11

3.2. Metodo della ADVIA Centaur® XP Immunoassay System ........................................... 11

3.3. Immulite 2000 ................................................................................................................. 12

3.4. Reazione in chemiluminescenza dell’Immulite 2000...................................................... 12

3.5. Esecuzione del test da carico ........................................................................................... 13

3.5.1. Test da carico di glucosio con dosaggio dell’hGH ................................................... 13

3.5.2. Test al GHRH ........................................................................................................... 13

3.6. Raccolta dei campioni e kit usati ..................................................................................... 13

3.7. Software di analisi statistica ............................................................................................ 13

IV Risultati ................................................................................................................................. 14

4.1. Introduzione ..................................................................................................................... 14

4.2. Calibrazioni e controlli: ................................................................................................... 14

4.3 Dati ottenuti ...................................................................................................................... 14

4.4. Analisi statistica human Growth Hormone ..................................................................... 16

4.4.1. Metodo delle differenze Altman & Bland ................................................................ 16

4.4.2. Regressione secondo Deming................................................................................... 17

4.5. Analisi statistica Insulina ................................................................................................. 19

4.5.1. Altman Bland Test-Metodo delle differenze ............................................................ 19

4.5.2. Analisi degli outliers con il metodo di Tukey applicato alla statistica bivariata. ..... 21

4.5.3. Passing e Bablok....................................................................................................... 21


3

4.6 Stima dei costi dei reattivi di insulina e hGH per un anno al LC-CIC ............................. 23

V Discussione ............................................................................................................................. 24

VI Conclusioni ........................................................................................................................... 25

VI Ringraziamenti ...................................................................................................................... 26

VII Bibliografia .......................................................................................................................... 27

VIII Allegati ............................................................................................................................... 27

Indice delle Figure Figura 1: Immulite 2000 ............................................................................................................... 1 Figura 2: Reazione in chemiluminescenza Immulite 2000 (22). ................................................ 12 Figura 3: Plot secondo Altman & Bland, di hGH ...................................................................... 16 Figura 4: Plot delle differenze secondo Altman & Bland, hGH ................................................. 17 Figura 5: Regressione secondo Deming, hGH ........................................................................... 18 Figura 6: Plot delle differenze secondo Altman & Bland, hGH ................................................. 18 Figura 7: Plot secondo Altman e Bland, insulina n=21 dati ....................................................... 19 Figura 8: Difference Plot, Altman & Bland, Insulina N=21 ...................................................... 20 Figura 9: Box and Whiskers di Tukey, insulina n=21 dati ......................................................... 21 Figura 10: Regressione secondo Passing e Bablok, Insulina n=21 ............................................ 22 Figura 11: Regressione secondo Passing Bablok, Insulina n=21 dati ........................................ 22 Indice delle Tabelle Tabella 1: Cause di aumenti e diminuzioni di hGH. (1) (2) ......................................................... 4 Tabella 2: Cause di aumenti e diminuzioni dell’IGF-1 (2) .......................................................... 5 Tabella 3: Test di screening in caso di deficit di sviluppo strutturale (1) .................................... 6 Tabella 4: Sostanze che influiscono sulla regolazione della secrezione dell’insulina (1) ............ 7 Tabella 5: Patofisiologia dell’insulina (1) .................................................................................... 8 Tabella 6: calibrazione hGH ....................................................................................................... 14 Tabella 7: Controlli di qualità hGH ............................................................................................ 14 Tabella 8: Calibrazione Insulina ................................................................................................. 14 Tabella 9: Controlli di qualità Insulina ....................................................................................... 14 Tabella 10: Dati grezzi ............................................................................................................... 15 Tabella 11: Valutazione costo dei reagenti per insulina e hGH al LC-CIC per un anno. .......... 23 Sigle e abbreviazioni

EOC: Ente Ospedaliero Cantonale EOLAB: Dipartimento di Medicina di Laboratorio dell’EOC GHIH: Growth hormone-inhibiting hormone. Conosciuta anche come somatostatina o

SRIF. GHR: Growth Hormone Receptor GHRH : Growth-hormone-releasing hormone GLP-1: Glucagon-like peptide-1 hGH: human Growth Hormone IGF-1: Insulin-like growth factor 1 o somatomedina C LC-CIC: Laboratorio Centrale di Chimica e di Immunologia Clinica NIBSC: National Institute for Biological Standards and Control ORBV: Ospedale Regionale Bellinzona e Valli TAB: Tecnico/a di Analisi Biomediche WHO: World Health Organisation


INTRODUZIONE

4

I Introduzione

1.1. Ormone della crescita (hGH) L’hGH, l’ormone della crescita viene anche chiamato somatotropina, ormone somatotropo o STH. L’hGH è secreto dall’ipofisi anteriore in risposta a diversi stimoli: ipoglicemia, digiuno, aminoacidi, attività fisica. Promuove lo sviluppo delle ossa, dei muscoli, dei visceri, la ritenzione di Na, K, Ca, P ed esplica un’azione diabetogena. Esiste un meccanismo di controllo a feedback negativo sulla secrezione di hGH: l’ipotalamo secerne GHRH che stimola il rilascio di hGH dall’ipofisi anteriore; quest’ultimo esercita i suoi effetti sui tessuti bersaglio attraverso un gruppo di peptidi chiamati somatomedine, tra cui l’IGF-1. Elevati livelli di somatomedine stimolano la produzione di somatostatina da parte dell’ipotalamo, che a sua volta blocca un’ulteriore secrezione di hGH dall’ipofisi (1). Nella tabella 1 sono elencate le varie possibili cause di aumento o di diminuzione dell’hGH. Tabella 1: Cause di aumenti e diminuzioni di hGH. (1) (2) Aumenti Diminuizioni Acromegalia Ipofisectomia Gigantismo Panipopituitarismo Sindrome paraneoplastica Ipopituitarismo parziale Insufficienza renale Ipercorticosurrenalismo Digiuno Terapia cortisonica Malnutrizione Obesità Estrogeni, contraccettivi Nanismo

1.1.1. Cause di ipopituitarismo L’ipopituitarismo è una condizione nella quale l’ipofisi non produce una quantità normale di alcuni o di tutti i suoi ormoni. Può avere origine da una neoplasia ipofisaria o ipotalamica, da un evento ischemico, da una malattia autoimmune, da irradiazione, da una patologia infiltrante, da infezione, traumi o interventi chirurgici (2).

1.1.2. Perché e quando fare il test di stimolazione per l’hGH? Una valutazione dell’hGH può esser fatta nei soggetti che presentano statura bassa, rallentamento della velocità della crescita e ritardata maturazione ossea in cui si sospetta un deficit di hGH. In bambini con bassa statura idiopatica, il dosaggio della GHBP può essere utilizzata per differenziare le anomalie genetiche del recettore per il GH. Uno studio di biologia molecolare è necessario per evidenziare eventuali mutazioni o delezioni del gene per l’hGH (4). La necessità di basarsi su un test a stimolazione per l’ hGH nasce dall’evidenza che le misurazioni dei livelli di IGF-I e di IGFBP-3 non distinguono i pazienti normali dai pazienti con deficit di hGH (5). Per la diagnosi di un’acromegalia viene fatto il test da carico di glucosio con dosaggio di hGH poiché un singolo prelievo casuale di hGH esclude la diagnosi di acromegalia solo se è inferiore a 0.4 mg/L e si accompagna a livelli di IGF-I normali per sesso ed età, in un paziente che non abbia altre malattie intercorrenti. A causa della secrezione pulsatile di hGH anche in un soggetto normale si possono all’opposto trovare livelli elevati di hGH. Non è stato stabilito un livello al di sopra del quale la diagnosi possa dirsi certa senza il ricorso a valutazioni dinamiche (16).


INTRODUZIONE

5

1.1.3. GH usato come terapia e farmacogenomica L’hGH è usato nel trattamento di bassa statura in diverse condizioni ma esiste una considerevole variazione interindividuale nella risposta alla terapia. Negli ultimi anni il polimorfismo del recettore dell’hGH riflettente una presenza (GHRfl) o assenza (GHRd3) dell’esone 3 è stato sotto intensa investigazione per via della sua influenza riguardo alla risposta della terapia con GH. Studi fatti che valutavano la risposta al trattamento con GH determinati su queste due isoforme, in bambini con deficit di GH, sindrome di Turner, bimbi nati piccoli per l’età gestazionale e pazienti con l’acromegalia, mostrano che i pazienti portatori dell’allele GHRd3 dimostravano una grande sensibilità all’hGH rispetto ai pazienti omozigoti per l’allele GHRfl. Altri studi presentano dati contradditori (13).

1.1.4. Altre analisi correlate all’ hGH

1.1.4.1. IGF‐I

Il fattore di crescita insulino-simile 1 è un ormone con una struttura simile a quella dell’insulina. Circola nel sangue legato a proteine di trasporto ad alta affinità (IGFBPs). Meno dell’1% di IGF-I circola in forma libera. È il principale mediatore dell’azione stimolante sulla crescita postnatale dell’hGH. La secrezione di hGH stimola la sintesi di IGF-1 nel fegato e negli altri tessuti. Il dosaggio dell’IGF-1 è indicato per valutare l’attività biologica dell’hGH. La determinazione dell’IGF-1 presenta alcuni limiti. Al di sotto dei cinque anni d’età i livelli sono talmente bassi che non è possibile distinguere i soggetti con deficit di hGH da quelli normali. Al di sopra dei 6 anni vi sono molte condizioni che determinano bassi livelli di IGF-1: digiuno prolungato, malnutrizione, malattie sistemiche, assunzione di alte dosi di steroidi sessuali e tumori mesenchimali (1) (16). Nella tabella 2 sono elencate le possibili cause di aumenti e diminuzioni dell’IGF-1. Tabella 2: Cause di aumenti e diminuzioni dell’IGF-1 (2) Aumenti Diminuzioni Gigantismo Deficit di GH Acromegalia Insufficienza ipofisaria Stress Nanismo Ipoglicemia Iperglicemia Esercizio fisico Maturità sessuale ritardata Malnutrizione Malassorbimento Anoressia nervosa Insufficienza epatica grave Ipotiroidismo Malattia cardiovascolare (fase acuta del diabete)

1.1.4.2. IGFBP‐3

L’IGFBP-3 è conosciuto per modulare le azioni di IGFs in circolazione. Sono stati descritti anche degli effetti che contribuiscono a promuovere la patofisiologia di una varietà di malattie umane come cancro, diabete e malnutrizione. Secondo recenti studi epidemiologici, livelli elevati di IGF-1 e livelli diminuiti di IGFBP-3 sono stati indipendentemente associati a maggiori rischi per cancri comuni come quello della prostata, colorettale, polmonare e del seno premenopausale (15).


INTRODUZIONE

6

1.1.5. Malattie associate all’hGH

1.1.5.1. Deficit di hGH

Il difetto di produzione di hGH determina una bassa statura ed un rallentamento della maturazione ossea oltre a possibili alterazioni metaboliche quali l’ipoglicemia, la riduzione dello sviluppo muscolare, le alterazioni del metabolismo lipidico. Nei casi in cui il deficit di hGH sia associato a difetti di produzione di altri ormoni ipofisari, si rilevano alterazioni dello sviluppo puberale, della funzionalità tiroidea, della funzionalità surrenalica (17). Nella tabella 3 sono elencati i vari test di screening in caso di deficit di sviluppo strutturale. Tabella 3: Test di screening in caso di deficit di sviluppo strutturale (1)

1.1.5.2. Sindrome di Laron

La sindrome di Laron è una malattia ereditaria caratterizzata da un difetto genico del recettore dell’hGH. Sono conosciute più di 100 mutazioni di diverso tipo a carico dei vari domini del GHR. La malattia si associa ad elevate concentrazioni seriche di hGH ed a livelli molto bassi di IGF-I, che non aumentano in seguito a somministrazione esogena di hGH (18).

1.1.5.3. Acromegalia e gigantismo

Nel gigantismo ipofisario l'ipersecrezione di hGH ha inizio durante l'infanzia, prima della saldatura delle cartilagini epifisarie, e porta ad un accrescimento scheletrico esagerato. Quando l'ipersecrezione di hGH comincia dopo la saldatura delle epifisi, la manifestazione clinica più precoce è la trasformazione dei lineamenti, che diventano grossolani, e l'ispessimento dei tessuti molli delle mani e dei piedi che porta all’acromegalia (14). L’acromegalia colpisce 1 su 60-70000 abitanti, quasi sempre la causa è un adenoma ipofisario (16). La tolleranza al glucosio è solitamente alterata ed i livelli sierici di fosfato sono generalmente elevati. Nel carico orale di glucoso, nei soggetti normali la secrezione viene soppressa a < 5 ng/mL, 90 min dopo la somministrazione di glucoso. La maggior parte dei pazienti acromegalici presenta valori più elevati. I livelli plasmatici basali di GH sono importanti anche per seguire nel tempo la risposta alla terapia. Nell’acromegalia i livelli di IGF-I sono notevolmente elevati (da tre a dieci volte) ed i dosaggi dell’IGF-I possono essere utilizzati per controllare la risposta alla terapia (15).

Test di screening in caso di deficit di sviluppo strutturale Ormoni tiroidei (ipotiroidismo)IGF-1 (deficit) GH (deficit) Test di stimolazione dell’GH (deficit) Calcemia (pseudoipoparatiroidismo) Fosfatemia Bicarbonati sierici Azotemia (insufficienza renale)Emocromocitemia (anemia, malnutrizione) VES (malattia infiammatoria intestinale) Cariotipo (disgenesia gonadica)


INTRODUZIONE

7

1.1.5.4. Sindrome dell’ovaio policistico

I bassi livelli di ormone della crescita, probabilmente dovuti a resistenza all’insulina, e l’aumento della massa grassa addominale sono ben descritti nella sindrome dell’ovaio policistico. L’ormone della crescita ha un ruolo importante sulla funzionalità ovarica e la carenza dell’ormone della crescita può rappresentare un addizionale fattore patogenetico nella sindrome dell’ovaio policistico (6).

1.2. Insulina

1.2.1. Introduzione L’insulina è un ormone sintetizzato nelle cellule β delle isole di Langherans del pancreas e viene rilasciata nel sangue. Ha un emivita di 3-5 minuti ed è catabolizzato nel fegato e nei reni. (Allegato 1). Il precursore dell’insulina, la proinsulina è composta da tre catene: A, B e C. La catena C viene tagliata formando così l’insulina ed il frammento C-Peptide, biologicamente inattivo. La produzione di insulina e C-Peptide è equimolare.

1.2.2. Regolazione della secrezione Il glucosio è il maggior regolatore di insulina ma come si può vedere nella tabella 4 ci sono molte altre sostanze regolatrici. La secrezione di insulina ha delle fluttuazioni fisiologiche durante il giorno: da 6 a 100 mIU/L. La concentrazione di insulina nel sangue mostra oscillazioni regolari con cicli di 5-10 minuti. Una secrezione alterata può rientrare nelle seguenti categorie:

Ipoinsulinemia in normoglicemia (Pre-Diabete Mellito) o in iperglicemia manifesta (diabete mellito)

Iperinsulinemia in normoglicemia; insulinoresistenza ed ipertonia Iperinsulinemia e sindrome ipoglicemica (3)

Tabella 4: Sostanze che influiscono sulla regolazione della secrezione dell’insulina (1)

Stimolatori Inibitori Substrati: Glucosio-Mannosio-Fruttosio 2-Desossiglucosio Pentosi Mannoeptulosio Aminoacidi (arginina, leucina) Ipossia Acidi grassi liberi-Corpi cheonici Digiuno 3’5’-AMP ciclico Ormoni: Enterormoni (gastrina, enteroglucagone) Adrenalina Glucagone pancreatico Noradrenalina ACTH – GH – HLP Sistema nervoso autonomo: Stimolatori dei recettori β2 (salbutamolo) Inibitori dei recettori β2 (propranolo) Stimolatori dei recettori α (adrenalina) Blocco colinergico Ioni: Ca++; Mg++; K+ Farmaci: Sulfoniluree – Metilxantine Diazosio – Allossana - Streptozotocina


MATERIALI E METODI

8

1.2.3. Azione dell’insulina L’insulina si lega sui recettori per l’insulina presenti sulla superficie di cellule bersaglio nel fegato, nei muscoli e nel tessuto grasso (7). Può agire anche su altre cellule come quelle dell’ovaio tramite interazioni con i recettori dell’insulina o tramite reazione crociata con i recettori dell’IGF-1 che possono causare cambiamenti nelle proteine responsabili per gli effetti biologici dell’insulina. Nel fegato l’insulina stimola la sintesi di glicogeno e inibisce la gluconeogenesi e inibisce la glicogenolisi. Stimola anche la glicolisi, la lipogenesi e inibisce la chetogenesi. Nel muscolo stimola la sintesi di glicogeno e di proteine e inibisce il catabolismo del glicogeno. Nel tessuto grasso stimola la riserva di grasso (8). L’azione dell’insulina può essere classificata in base alla sua durata:

Corta: serve per il mantenimento dell’omeostasi del glucosio, agisce direttamente sulla membrana e sugli enzimi citoplasmatici.

Lunga: è un effetto insulino-mediato. Sono necessarie ore, fino ad alcuni giorni e coinvolgono la sintesi di DNA e proteine, la regolazione di specifiche espressioni geniche e la crescita cellulare (3).

1.2.4. Scopo dell’analisi di insulina I dosaggi dell’insulina esercitano un ruolo essenziale nell’identificazione degli insulinomi. La scoperta di ipoglicemia da digiuno in associazione ad una concentrazione di insulina nel siero impropriamente alta è considerata di rilevanza diagnostica (Allegato 1). La determinazione dell’insulina, C-Peptide e proinsulina si esegue solitamente per la diagnosi differenziale di un’ipoglicemia, screening metabolico per collocare una diagnosi nelle sindromi ovariche policistiche, se si sospetta un Pre-Diabete Mellito tipo 1, per valutare l’insulinoresistenza o in previsione di uno sviluppo di una malattia coronarica in non-diabetici (3). L’utilizzo del dosaggio dell’insulina in pazienti già trattati con terapia insulinica è complicata dal fatto che tipicamente questa terapia porta alla formazione di anticorpi anti-insulina capaci di interferire con il dosaggio (Allegato 1). I livelli di insulina ottenuti durante un test di tolleranza al glucosio sembrano avere un valore prognostico nel precorrere i vantaggi della terapia insulinica e le probabilità di progressione verso la dipendenza da insulina e verso le complicazioni da diabete (Allegato 1). Nella tabella 5 vediamo i vari casi in cui l’insulina aumenta o diminuisce. Per diabete endocrino si intende un insulinoma, un ipercorticosurrenalismo, un glucagonoma, un ipertiroidismo o un’acromegalia. Per diabete pancreatico s’intende invece un pancreasectomia, una postpancreatite o un’emocromatosi. Tabella 5: Patofisiologia dell’insulina (1) Aumenti Diminuizioni Obesità Diabete insulinodipendente tipo I Gravidanza Diabete pancreatico Diabete endocrino Diabete insulinodipendente tipo II in fase avanzata Diabete insulinodipendente tipo II Ipopituitarismo Intolleranza a fruttosio e galattosio Distrofia miotonica Terapia con farmaci diabetogeni


MATERIALI E METODI

9

1.2.5. Insulinoma L’insulinoma è un tumore neuroendocrino del pancreas e proviene principalmente dalle cellule delle isole pancreatiche. La diagnosi biochimica viene stabilita nel 95% dei pazienti durante un digiuno prolungato (fino a 72h) quando i seguenti parametri vengono trovati (9) (10):

Livelli di insulina sierica di 10 mIU/L o più (normale < 6 mIU/L) Livelli di glucosio di meno di 40 ng/mL (ipoglicemia) C-Peptide eccedente 2.5 ng/mL (normale < 2ng/mL) Livelli di proinsulina aumentati più del 25% (fino al 90%) Screening per sulfonilurea negativo

1.2.6. Test che possono essere associati all’analisi di insulina: Test da carico con glucosio (75 g):

Viene fatto spesso per le donne in gravidanza per determinare lo sviluppo di un diabete gestazionale. La stessa procedura viene usata per determinare l’hGH nel sospetto di un iperproduzione.

Urine: Con esso è possibile identificare la presenza di glicosuria e chetonuria. Se vi è glucosio nelle urine significa che la glicemia è oltre i 180 mg/dL o 10 mmol/L perché solo oltre questa concentrazione il rene elimina il glucosio nelle urine.

C-Peptide: Nei pazienti che fanno terapia con insulina, per verificare la capacità secretoria delle cellule beta non possiamo valutare direttamente l’insulinemia, perché verrebbe misurata anche quella somministrata come farmaco. Possiamo allora valutare la concentrazione di peptide C.

Anticorpi anti-cellule insulari (ICA, Islet Cell Antibody): Questi anticorpi sono presenti in più del 95% dei casi di diabete di tipo I in fase iniziale e tendono poi a ridursi sino alla loro scomprsa. Si tende ad attribuire a questi anticorpi un ruolo predittivo.

Anticorpi anti-insulina (IAA, Insuline Auto Antibodies): Questi anticorpi possono comparire in circolo prima dell’esordio clinico del diabete e sono associati ad un elevato rischio di malattia nei parenti di primo grado di soggetti con diabete di tipo 1.

Anticorpi anti-GAD (Glutamic Acid decarboxylase auto antibodies): Questi anticorpi sono più sensibili e più specifici rispetto agli ICA. Anticorpi anti-tirosina fosfatasi insulare IA-2: Sono altamente predittivi di futura comparsa della malattia in parenti di 1° grado di soggetti con diabete di tipo 1.

Emoglobina glicata: Indica se la glicemia è stata ben controllata nei precedenti 3 mesi circa (21).


OBIETTIVO

10

II Obiettivo L’obbiettivo del mio lavoro è introdurre nel LC-CIC di Bellinzona due analisi ospedaliere che vengono normalmente spedite in altri laboratori esterni. Le analisi di insulina sono spedite a Viollier ad Allschwil, mentre quelle dell’hGH vengono principalmente spedite all’Universitätsklinik für Kinderheilkunde dell’Inselspital di Berna poiché i pazienti sono di età pediatrica. La richiesta di analisi di insulina e ormone della crescita in EOLAB è aumentata negli ultimi tre anni. Questo fa si che mi è stato richiesto di valutare l’introduzione di queste analisi al LC-CIC di Bellinzona. Sarà mio compito fare un confronto tra i valori misurati al LC-CIC ed i valori misurati in svizzera interna, per verificare se ci sono differenze o meno. Questo sarà di utilità al medico per decidere come poter interpretare i dati del LC-CIC. Se un paziente ha già dei precedenti, il medico deve sapere se gli apparecchi dei laboratori esterni misurano l’insulina o l’hGH allo stesso modo dell’apparecchio al LC-CIC e se dunque le misure sono confrontabili.


MATERIALI E METODI

11

III Materiali e metodi

3.1. Differenze tra gli apparecchi Per l’hGH l’apparecchio dell’Inselspital è un Immulite One e l’apparecchio del LC-CIC è un Immulite 2000. Il metodo e i reagenti sono gli stessi, si può dire che gli apparecchi non sono uguali ma sono equivalenti.

Valori attesi per gli adulti sono: Maschi: fino a 1 ng/mL; Donne: fino a 10 ng/mL I valori attesi in età pediatrica variano per fascia dì età e per il sesso, vedi allegato 3. Sensibilità analitica: 0.01 ng/mL Range di calibrazione: fino a 40 ng/mL Fattore di conversione: ng/mL × 2.6 → mIU/L Precisione nota fino a 17 ng/mL con un CV% < 10. (Allegato 2)

Per l’insulina invece gli apparecchi sono diversi. Il principio è lo stesso, il metodo è differente. I valori attesi sono diversi.

ADVIA Centaur®XP Immunoassay System: o Valori attesi: 3.0-25.0 mIU/L o Valori di riferimento Viollier: 1.7 – 31.0 mIU/L o Sensibilità analitica: 0.5-300 mIU/L o Precisione testata fino a 124 IU/mL, con CV% < 10 (20)

Immulite 2000: o Valori attesi: fino a 29.1 mIU/L. o Sensibilità analitica al limite inferiore: 2 mIU/L o Range di calibrazione: fino a 300 mIU/L o Fattori di conversione: µIU/mL x 7.217 = pmol/L o Precisione testata fino a 291 IU/mL, con CV% < 10. (Allegato 1)

3.2. Metodo della ADVIA Centaur® XP Immunoassay System (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, USA) È un immunodosaggio a sandwich a due siti che utilizza la tecnica della chemiluminescenza diretta, la quale utilizza quantità costanti di due anticorpi. Il primo anticorpo, nel Reagente Lite, è un anticorpo anti-insulina marcato con estere di acridinio. Il secondo è un anticorpo anti-insulina legato covalentemente a particelle paramagnetiche. L’apparecchio eroga campioni, reagente Lite e fase solida automaticamente in una cuvetta, incubando nei momenti necesari. In seguito separa, aspira e lava le cuvettes con acqua distillata. Eroga poi un reagente acido e un reagente basico per dare inizio alla reazione di chemiluminescenza e infine elabora i risultati. Esiste una relazione diretta fra la quantità di insulina presente in un campione e le unità di luce relativa rilevata dal sistema.


MATERIALI E METODI

12

3.3. Immulite 2000 L’Immulite 2000 (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, USA) esegue dei dosaggi immunometrici in chemiluminescenza in fase solita a doppio sito. Una singola sferetta di polistirene viene erogata in una provetta di reazione speciale che serve come contenitore per i processi di incubazione, lavaggio e sviluppo del segnale. Dopo che il campione è stato incubato con un reagente marcato con fosfatasi alcalina, la miscela di reazione viene separata. Vengono eseguiti quattro lavaggi distinti e al termine di questo processo, la sferetta non presenta alcun residuo di reagente marcato non legato. Il reagente marcato legato viene quindi quantificato utilizzando il substrato per produrre luce. Il fotomoltiplicatore rileva questa emissione di fotoni e il sistema calcola i risultati dei singoli campioni.

3.4. Reazione in chemiluminescenza dell’Immulite 2000 Le biglie sono coattate con un anticorpo anti - analita. L’analita presente nel siero del paziente si lega a questi anticorpi. Viene aggiunto il reagente che contiene una fosfatasi alcalina coniugata con due diversi

anticorpi sempre anti-analita. La fosfatasi alcalina del reagente catturata sarà proporzionale alla concentrazione

dell’analita. Dopo il lavaggio, alla provetta di reazione viene aggiunto il substrato luminogeno. Dopo l’incubazione, il fotomoltiplicatore misura la luce prodotta dalla reazione.

Figura 2: Reazione in chemiluminescenza Immulite 2000 (22). Nella reazione luminogena raffigurata nella figura 2 a destra, il substrato è un adamantil dioxetano fosfato che viene defosforilato in un anione intermedio instabile dal coniugato fosfatasi alcalina catturato sulla sferetta. Al momento della trasformazione, l’anione intermedio emette un fotone. La quantità di luce emessa è direttamente proporzionale alla quantità di FAL legata.


MATERIALI E METODI

13

3.5. Esecuzione del test da carico

3.5.1. Test da carico di glucosio con dosaggio dell’hGH Sospetta iperproduzione di hGH. Procedura:

Dieta normale nei giorni precedenti il test Digiuno di 8-12 ore prima del test Bambini somministrare 1.75 g glucosio per kg di massa corporea. Bere 75 g di glucosio in 3-4 dL di acqua (entro 10-15 min) Restare seduti o sdraiati fino alla fine del test (non mangiare, non fumare) Determinare la glicemia nel sangue capillare o venoso

o Prima dell’inizio del test o Dopo 2 ore

Interpretazione: soppressione della sintesi dell’hGH nei pazienti normali. (11)

3.5.2. Test al GHRH Sospetta insufficienza secretoria di hGH. Sostanza utilizzata: GH-RH-Ferring Procedura:

Prelievo per la determinazione basale del valore di hGH Somministrare al paziente 1 mg/kg di massa corporea di GHRH Prelievi ai tempi 30, 60, 90, 120 min (utile, una via venosa da mantenere con flebo di

NaCl 0,9%. Attenzione a possibili contaminazioni e diluizione!) Interpretazione: normale funzione ipofisaria con valori di hGH < 20 mIU/L (11).

3.6. Raccolta dei campioni e kit usati Il personale del laboratorio centrale dell’ORBV ha gentilmente fornito le aliquote dei campioni di insulina e di hGH tra metà dicembre e metà febbraio. Queste sono state congelate e conservate a -20°C. I kit comandati sono stati:

Insulina Immulite® Systems, REF: L2KIN2, Lot: 304, exp: 12.2011 GRH Immulite® Systems, REF: L2KGRH2, Lot 117, exp: 11.2011

Un Kit ha dunque una stabilità di circa un anno.

3.7. Software di analisi statistica È stato utilizzato Analyse-it Software, Ltd. Versione 2.20. The Tannery, 91 Kirkstall Road, Leeds, LS3 1HS, United Kingdom. Della Analyse-it® Company.


RISULTATI

14

IV Risultati

4.1. Introduzione La parte pratica è stata eseguita il 16.02.2011, insieme alla vice-capolaboratorio del LC-CIC, la signora Silvia Torre. Prima di tutto è stata fatta la manutenzione giornaliera dell’apparecchio. Sono state poi inserite biglie e reagenti. Per l’hGH sono stati utilizzati i calibratori col lotto LGHH119 del Kit e per i controlli è stato usato il Lyphochek® Immunoassay Plus Control, Bio-Rad, lotto 40230. Per l’insulina sono stati usati i calibratori col lotto LINL127 e LINH127 ed i controlli con il lotto LINC1125 e LINC2125, del kit.

4.2. Calibrazioni e controlli: Tabella 6: calibrazione hGH Calibratore CPS 1 misura 2 misura 3 misura 4 misura media CV%Low 44’889 50’665 44’194 45’090 46’210 6.481High 12’793’474 12’640’190 13’617’426 12’590’001 12’910’273 3713y=1.0046*x+3.137 è la retta di calibrazione. CPS sono i Counts Per Second. Tabella 7: Controlli di qualità hGH

Tabella 8: Calibrazione Insulina Calibratore CPS 1 misura 2 misura 3 misura 4 misura media CV% Low 141’055 145’908 146’315 145’407 144’671 1.689 High 1’586’649 1’569’149 1’615’818 1’610’588 1’595’551 1.360 y=1.1549*x+1.484 è la retta di calibrazione. CPS sono i Counts Per Second. Tabella 9: Controlli di qualità Insulina

L’ Immulite 2000 misura la chemiluminescenza tramite i CPS. Un determinato valore di CPS corrisponde a un valore in mIU/L per l’insulina ed in ng/mL per l’hGH. Questa corrispondenza è determinata dall’equazione della retta di calibrazione delle tabelle 6 e 8. La curva di calibrazione è a due punti. La ditta Siemens non fornisce i valori dichiarati dei calibratori, dichiara però che questi provengono da uno standard internazionale garantito da NIBSC. Per l’hGH il riferimento è WHO NIBSC 2nd IS (98/574) mentre per l’insulina è WHO NIBSC 1st IRP (66/304). Nelle tabelle 7 e 9 sono riportati le misure dei controlli e i range attesi.

4.3 Dati ottenuti Nella tabella 10 in azzurro sono segnalati i CV% > 10 solo per l’hGH poiché in questo caso si confrontano misure fatte con lo stesso tipo di apparecchio. Nell’hGH invece gli apparecchi sono diversi. In rosa sono segnalati i valori clinicamente patologici secondo i valori attesi. Per l’hGH i valori attesi cambiano secondo l’età e il sesso. Le discrepanze tra valore patologico e valore normale sono segnalate nella tabella 10 con . Per l’insulina ho segnalato in grigio alcuni valori che ho provato ad eliminare perché o hanno un valore che supera il range di calibrazione o hanno un valore sotto la sensibilità analitica dell’Immulite 2000.

Controllo di Qualità ng/mL Livello 1 Livello 2 Livello 3Range atteso 2.38-3.22 5.50-7.60 11.1-15.1Valori ottenuti 2.64 6.08 12.6

Controllo di Qualità mU/L Livello 1 Livello 2Range atteso 9.3-12.5 43-57Valori ottenuti 12.0 46.5


RISULTATI

15

hGH: Valori attesi: Maschi adulti: fino a 1 ng/mL; Donne adulte: fino a 10 ng/mL (Allegato 2). Per pazienti in età pediatrica guardare allegato 3.

Insulina: o Valori di riferimento Viollier: 1.7 – 31.0 mIU/L o Valori attesi Immulite 2000: fino a 29.1 mIU/L.

Tabella 10: Dati grezzi

hGH ng/mL Età e sesso Inselspital LC-CIC CV%

Insulina mIU/L Viollier LC-LIC

1 M, 13 anni 0.05 0.05 1.40 1 3.4 <2.02 M, 13 anni 0.06 0.05 10.10 2 3.7 <2.03 M, 13 anni 0.08 0.07 11.47 3 4.8 4.04 F, 12 anni 0.33 0.29 10.35 4 4.8 <2.05 M, 13 anni 0.50 0.45 8.23 5 5.8 <2.06 M, 11 anni 0.52 0.46 9.27 6 5.8 <2.07 M, 11 anni 0.65 0.64 0.99 7 6.3 4.18 F, 12 anni 0.77 0.69 7.65 8 6.7 <2.09 F, 12 anni 0.80 0.81 1.05 9 6.8 3.7

10 M, 6 anni 0.83 0.75 7.16 10 6.8 <2.011 F, 12 anni 1.10 0.99 7.37 11 7.3 2.112 F, 12 anni 1.20 1.10 6.15 12 8.1 4.013 M, 13 anni 1.30 1.54 11.95 13 8.2 5.714 M, 13 anni 1.70 1.66 1.68 14 8.6 8.715 M, 6 anni 1.80 1.92 4.56 15 11.1 4.716 M, 11 anni 2.20 2.12 2.62 16 12.0 11.9

17 M, 6 anni 2.20 2.57 10.97 17 12.1 10.218 M, 11 anni 3.10 3.08 0.46 18 12.5 5.719 F, 12 anni 3.10 3.06 0.92 19 12.6 8.420 M, 11 anni 4.20 4.42 3.61 20 15.8 12.521 F, 12 anni 4.40 4.54 2.21 21 17.1 10.9

22 M, 11 anni 4.70 5.33 8.88 22 17.8 12.923 M, 13 anni 4.90 5.21 4.34 23 20.1 10.324 M, 13 anni 5.30 5.44 1.84 24 27.0 26.825 M, 11 anni 6.20 7.08 9.37 25 37.3 33.526 M, 11 anni 7.00 6.98 0.20 26 43.8 22.927 M, 11 anni 8.20 7.92 2.46 27 89.9 59.928 F, 12 anni 14.10 12.20 10.22 28 112.2 64.629 F, 12 anni 30.50 24.50 15.43 29 314.2 205.0

30 376.5 288.0 : Discrepanze tra valore clinicamente patologico e un valore normale, secondo i valori attesi. Rosa: misurazioni che sono fuori dai valori attesi Azzurro: CV% > 10 Grigio: misure eliminate poiché hanno valori sopra al range di calibrazione o sotto alla sensibilità analitica dell’apparecchio.


RISULTATI

16

4.4. Analisi statistica human Growth Hormone

4.4.1. Metodo delle differenze Altman & Bland

Mediamente l’Inselspital misura valori più alti. C’è uno scostamento del - 0.203 che però non si scosta molto dallo 0. Secondo il t Test i dati non sono significativamente diversi, poiché p 0.3696 è > a 0.05.

Figura 3: Plot secondo Altman & Bland, di hGH

n 29

Correlation diff v aver 0.72

Bias -0.203

95% CI -0.658 to 0.253 SE 0.2223

t statistic -0.91

DF 28 p 0.3696

SD of diff. 1.197 between sgl mes.

95% Limits of a. 95% CI

Lower -2.549 -3.336 to -1.761 Upper 2.143 1.356 to 2.930

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15hu

man

Gro

wth

Ho

rmo

ne

(ng

/mL

) -

LC

-CIC

human Growth Hormone (ng/mL) - Inselspital

Scatter Plot

Identity


RISULTATI

17

Nella figura 3 le misure dell’Inselspital sono sull’ascissa mentre quelle del LC-CIC sono sulle ordinate. È presente anche la retta bisettrice. I dati sono maggiormente distribuiti vicino all’origine.

Figura 4: Plot delle differenze secondo Altman & Bland, hGH Nella figura 4 possiamo notare come lo scostamento sia molto basso, quasi uguale a zero. Anche gli intervalli di confidenza sono molto bassi.

4.4.2. Regressione secondo Deming

Interpretazione: S y|x (vertical) è l’errore standard e per rapporto allo scarto quadratico. In questo caso è un errore minimo. In rosso possiamo vedere le ipotesi in cui si suppone che l’intercetta sia uguale a 0 e la pendenza è uguale a 1. Si può dire che le ipotesi sono confermate poiché nell’intervallo di confidenza della “Constant” (-0.16 – 1.08) è compreso il valore 0, dunque lo scostamento è proporzionale. Nell’intervallo di confidenza “Proportional” (0.59 – 1.06) è compreso il valore 1 dunque lo scostamento è anche costante.

n 29

Range 0.050 to 30.500

Variance ratio 1.00

Sy|x (vertical) 0.579

Bias 95% CI SE p

Constant 0.46 -0.16 to 1.08 0.303 0.1419Proportional 0.83 0.59 to 1.06 0.114 0.1450

H0: C. bias = 0. H1: C. bias ≠ 0.

H0: P. bias = 1. H1: P. bias ≠ 1.


RISULTATI

18

Figura 5: Regressione secondo Deming, hGH Nella figura 5 possiamo osservare che i due punti con valore > di 10ng/mL hanno una grossa inflenza sulla regressione. Possiamo comunque dire che lo scostamento è costante e proporzionale.

Figura 6: Plot delle differenze secondo Altman & Bland, hGH I residui sono la differenza tra i dati reali e i dati teorici. Nella figura 7 sembra che i residui abbiano una tendenza che viene si inverte con gli ultimi dati.

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15

hu

man

Gro

wth

Ho

rmo

ne

(ng

/mL

) -

LC

-CIC

human Growth Hormone (ng/mL) - Inselspital

Scatter Plot with Deming Fit

Identity


RISULTATI

19

4.5. Analisi statistica Insulina I risultati sono stati analizzati con software Analyse-it® Ltd, Leeds, UK versione 2.20. L’analisi è stata fatta scartando i dati segnalati in grigio nella tabella 10. Questi valori sono stati scartati perché o hanno un valore che supera il range di calibrazione o hanno un valore sotto la sensibilità analitica dell’Immulite 2000.

4.5.1. Altman Bland TestMetodo delle differenze

Mediamente il laboratorio LC-CIC misura valori più bassi del Viollier. Possiamo notare che lo scostamento di -7.80 è di rilevanza. Secondo il test t i dati sono significativamente diversi, poiché p 0.0058 è < a 0.05.

N=21

Correlation - absolute difference v average

0.43

Bias

-7.80

95% CI

-13.07 to -2.53

SE

2.526

t statistic

-3.09

DF

20

p

0.0058

SD of differences

11.58

95% L. A.t

95% CI Lower -30.50 -39.65 to -21.34

Upper

14.89

5.73 to 24.04

Figura 7: Plot secondo Altman e Bland, insulina n=21 dati


RISULTATI

20

Nella figura 7 le misure di Viollier sono sull’ascissa mentre quelle del LC-CIC sono sulle ordinate. È presente anche la retta bisettrice. I punti sono maggiormente disposti vicino all’origine ed i valori del LC-CIC tendono ad essere più bassi dei valori di Viollier. Già qui si ipotizza che i dati non hanno una distribuzione normale.

Figura 8: Difference Plot, Altman & Bland, Insulina N=21 Per il grafico della figura 8, si ricavano la media delle due misure e la differenza tra le due misure, per ogni campione. Si costruisce dunque un grafico sul quale nelle ascisse sono riportate le medie e sulle ordinate le differenze. Questo metodo risulta appropriato quando le differenze restano costanti. Ma spesso non lo sono. I limiti di concordanza sono molto ampi ed il bias è significativo, c’è una differenza tra le misure di Viollier e quelle del LC-CIC. Il test di Bland-Altman consiste nel giudizio del ricercatore: se la variazione della media entro l’intervallo di confidenza non è clinicamente importante, i due metodi o apparecchi, possono essere considerati intercambiabili.


RISULTATI

21

4.5.2. Analisi degli outliers con il metodo di Tukey applicato alla statistica bivariata. Regressione con alle X il metodo ritenuto più affidabile, quello di Viollier e sulle Y quello del LC-CIC. Calcolata pendenza ed intercetta, si possono stimare i punti tramite l'equazione della retta. Si calcolano tutte le Y teoriche. Poi si calcola la differenza tra le Y misurare e quelle teoriche ossia i residui o gli errori. Su questo insieme di dati si applica l'analisi di Tukey, che è un metodo NON parametrico. Si utilizza un grafico Box and Whisker per visualizzare meglio gli outliers.

La linea interna della scatola rappresenta la mediana Le due linee orizzonatali ai bordi della sctola rappresentano

il primo (in basso) e il terzo quartile (in alto) e la distanza tra i due comprende il 50% dei dati.

Dai bordi della scatola si allungano due linee verticali dette “whiskers” (baffi) ed equivalgono a 1.5 * la distanza interquartile.

Anche se non è visualizzata, esiste un limite equivalente a tre volte la distanza interquartile per cui gli outliers diventano estremamente anomali.

I punti visualizzati in blu non sono fuori dal limite di 3 volte la distanza interquartile mentre quelli visualizzati in bianco si.

È prassi eliminare solo gli outliers estremamente anomali (12).

Nella figura 9 si vedono due outliers ossia punti fuori dai limiti, "moderati". In questo caso sono stati utilizzati i 21 punti ritenuti validi e il risultato è che non ci sono outliers estremi, dunque nessun punto è da eliminare.

4.5.3. Passing e Bablok Questo è un metodo che non confronta più i dati numerici delle due serie di misure ma bensì i loro ranghi. Si tratta cioè di una regressione non parametrica in cui i dati sono considerati indipendenti gli un dagli altri.

N=21

Range

4.80 to 112.20

Bias

95% CI

Constant -0.22 -3.92 to 1.24

Proportional

0.68

0.56 to 0.98

H0: C. bias = 0. H1: C. bias ≠ 0.

H0: P.l bias = 1. H1: P.l bias ≠ 1.

Figura 9: Box and Whiskers di Tukey, insulina n=21 dati


RISULTATI

22

Interpretazione: in rosso possiamo vedere le ipotesi in cui si suppone che l’intercetta sia uguale a 0 e la pendenza è uguale a 1. Possiamo dire che le ipotesi non sono tutte confermate. Nell’intervallo di confidenza della “Constant” (-3.92 – 1.24) è compreso il valore 0, dunque lo scostamento è proporzionale. L’ipotesi H0: Constant bias = 0 è confermata. Nell’intervallo di confidenza “Proportional” (0.56 – 0.98) non è compreso il valore 1 dunque lo scostamento non è costante. L’ipotesi H0: Proportional bias = 1 non è confermata.

Figura 10: Regressione secondo Passing e Bablok, Insulina n=21 Nella figura 10 lo scostamento per n=21 lo scostamento è proporzionale.

Figura 11: Regressione secondo Passing Bablok, Insulina n=21 dati Nella figura 11 possiamo notare come all’aumentare del rango aumenta il residuo, che è l’errore calcolato facendo la differenza tra il i dati reali e idati teorici stimati giusti.


RISULTATI

23

4.6 Stima dei costi dei reattivi di insulina e hGH per un anno al LC-CIC Secondo l’Elenco delle analisi 2011, l’analisi Insulina, numero di riferimento 1471.00 ha un punteggio di 21 mentre l’hGH, numero di riferimento 1761.00, ha un punteggio di 68. Un punto vale un franco (19). In un anno nel periodo dal 01.01.2010 al 31.12.2010 sono stati spediti 288 campioni di hGH dal reparto di Endocrinologia Pediatrica dell’ORBV e 288 campioni di insulina sono stati spediti da tutti i laboratori centrali dell’EOC. La domanda a cui si vuole rispondere è se vale la pena introdurre queste analisi dal punto di vista economico, calcolando quali sono i costi e i guadagni in un anno se si fanno 288 analisi di insulina e 288 analisi di hGH. Questa valutazione è fatta senza tener conto dei costi quali il personale, l’ammortamento dell’apparecchio, dello stabile, i costi energetici, di manutenzione e di altro materiale aggiuntivo. Si è tenuto conto del numero di test fatti per i campioni, per i controlli e per le calibrazioni se si fanno le analisi in un solo giorno fisso per settimana. Si è tenuto conto di fare i controlli di qualità anche una volta alla settimana e di fare la calibrazione ogni due settimane per l’hGH e ogni quattro settimane per l’insulina. È dunque una valutazione sommaria ma che rispecchia la realtà poiché oltre ai reattivi non vi è un aumento di costi significativo per il laboratorio LC-CIC. Tabella 11: Valutazione costo dei reagenti per insulina e hGH al LC-CIC per un anno. Numero di test

usati per calibrare per un anno:

Numero di test usati per fare i controlli di qualità per un anno:

Numero campioni per un anno:

Totale test necessari per un anno:

Costo di 2.5 Kit, necessari per una anno:

Punti totali per 288 campioni

hGH 52 156 288 52 + 156 + 288 = 496

1880 Fr. 288 x 68 punti = 19584 punti

Insulina 96 104 288 96 + 104 + 288 = 488

1880 Fr. 288 x 21 punti = 6048 punti

Nella tabella 11 è stato calcolato il numero di test necessari per una anno, secondo il calcolo di quanti test vengono usati per calibrare, per fare i controlli di qualità e per fare i campioni. È risultato che sia per hGH che per insulina sono necessari almeno 2.5 Kit per un anno, che corrispondono a 500 test. Da qui è stato calcolato il costo di 2.5 Kit. Infine si è calcolato semplicemente il numero di punti totale di fatturazione per 288 campioni che è di 19584 punti per l’hGH e di 6048 punti per l’insulina.


DISCUSSIONE

24

V Discussione Solo guardando i dati ottenuti possiamo dire che ci sono poche discrepanze clinicamente rilevanti. Nella tabella 10 sono segnalate con il simbolo le discrepanze: sono due per l’hGH e una sola per l’insulina. Questo può essere spiegato dal fatto che le aliquote del LC-CIC sono state subito congelate per la durata di diversi giorni fino a mesi, mentre i campioni originali sono stati spediti mantenuti alla temperatura di 4°C. Le condizioni di trasporto e conservazione sono dunque diverse. Per l’hGH il metodo delle differenze secondo Altman e Bland mostra che i dati di Inselspital e LC-CIC non sono significativamente diversi poiché il t test ha un valore p di 0.3686 che è > a 0.05. Inoltre è chiaro anche nella figura 3 che i dati sono simili perché sono distribuiti lungo la bisettrice. Nella figura 4 si nota che la maggior parte dei dati sono distribuiti normalmente, solo un dato esce dall’intervallo di confidenza al 95%. Si vede anche qui che lo scostamento è vicino allo zero. È stata fatta la per l’hGH. La regressione è di tipo proporzionale e costante ed è data dall’equazione (LC-CIC) = 0.83 x (Inselspital) + 0.46 ng/mL. È stata fatta anche una regressione non parametrica secondo Passing Bablok che è risultata essere simile a quella secondo Deming, ossia (LC-CIC) = 1.01 x (Inselspital) - 0.04 ng/mL È proprio per questo che è da tenere più rilevante quella secondo Deming. È stata fatta anche una correlazione tra Immulite One e Immulite 2000 da parte della ditta Siemns: (IML 2000) = 0.98 x (IML) + 0.41 ng/mL r = 0.991. Per l’insulina come detto prima si è deciso di eliminare alcune coppie di dati poiché ritenute non valide, vedi tabella 10, poiché o hanno un valore che supera il range di calibrazione o hanno un valore sotto la sensibilità analitica dell’Immulite 2000, ossia <2.0 mIU/L. Si ottengono in questo modo 21 coppie di dati. Nonostante ciò è stata fatta una valutazione anche con tutti i dati n= 30, non presente nei risultati di questo scritto. Il tipo di relazione con n=30 dati e con n=21 dati era diversa. Per questo si ritiene più affidabile fare il confronto con i 21 dati rimanenti. Secondo il metodo di Altman e Bland, per insulina con n=21 dati, i dati di Viollier e LC-CIC sono significativamente diversi, con un p di 0.0058 che è < 0.05. Lo scostamento di -7.80 risulta rilevante. Nella figura 7 si nota che tutti i dati sono sotto la bisettrice, c’è dunque uno scostamento tra i dati. Anche nella figura 8 notiamo che la linea dello scostamento si stacca dallo zero e si nota un valore fuori dagli intervalli di confidenza al 95%. I dati sembrano essere distribuiti normalmente ma c’è una tendenza di alcuni dati che hanno una differenza tra valore LC-CIC – Viollier maggiore rispetto alla maggioranza degli altri dati. Per questo motivo è stata scelta una regressione non parametrica per la valutazione della correlazione. È stata fatta inoltre un ulteriore valutazione degli outliers secondo il metodo di Tukey utilizzando il grafico Box and Whiskers. Nella figura 13 vediamo che vi sono due outliers moderati che dunque non vengono eliminati. Nella regressione secondo Passing e Bablok c’è uno scostamento di tipo proporzionle. La correlazione è definita dall’equazione (Viollier) = 0.68 x (LC-CIC) -0.22. Per quanto riguarda la valutazione economica si può vedere nella tabella 11 che per l’hGH avendo 288 campioni all’anno il costo dei reagenti è di Fr 1880 mentre la fatturazione è di 19584 punti. Sono dunque più che coperti anche altri costi di materiale aggiuntivo. Per l’insulina avendo anche 288 campioni l’anno, il costo dei reagenti è anche di Fr 1880 ma la fatturazione è di 6048 punti. Anche qui i costi dei reagenti sono coperti.


CONCLUSIONI

25

VI Conclusioni Lo scopo del lavoro era verificare se ci sono differenze o meno tra i valori misurati al LC-CIC ed i valori misurati in svizzera interna. Per l’insulina da misurare in pazienti che hanno già dei precedenti, il medico potrà decidere se continuare a spedire le analisi o se iniziare a farle al LC-CIC con o senza una formula di correzione del valore. La formula di correzione è ottenuta secondo il metodo Passing e Bablok ed è (LC-CIC) = 0.68 x (Viollier) – 0.22. Clinicamente tra i dati c’è una sola discrepanza tra valore patologico e normale. L’hGH ha valori molto simili e per la rilevanza clinica questa analisi potrà essere fatta al LC-CIC senza che per i pazienti con precedenti all’Inselsital vi siano problemi di interpretazione e relazione. E comunque disponibile la formula ricavata dal confronto metodi della Siemens: (IML 2000) = 0.98 x (IML) + 0.41 ng/mL r = 0.991 Questa formula è simile a quella trovata nel mio lavoro, secondo la regressione di Deming: (LC-CIC) = 0.83 x (Inselspital) + 0.46 ng/mL Guardando i dati grezzi si notano due discrepanze che sono però sul limite superiore del range di calibrazione. Posso inoltre concludere che con 288 analisi di insulina e hGH all’anno, si riescono a coprire tutte le spese primarie costituite dal costo dei reagenti del Kit. Posso dunque affermare che l’introduzione delle analisi di insulina e hGH in EOLAB è fattibile ossia non è troppo dispendiosa. In conclusione le analisi di insulina e hGH possono venir introdotte al LC-CIC.


RINGRAZIAMENTI

26

VI Ringraziamenti Vorrei ringraziare tutte le persone che mi hanno aiutato nello svolgere questo lavoro. Ringrazio Franco Keller responsabile del mio lavoro di diploma per tutto il tempo dedicatomi e per i consigli e le risposte alle mie domande. Ringrazio in particolare Silvia Torre per la disponibilità e l’aiuto nella parte pratica. Ringrazio di cuore Roberto Francesconi e tutto il personale del laboratorio centrale dell’ORBV che mi hanno aiutato nella raccolta dei campioni e nella parte pratica. Un grande ringraziamento al docente Giorgio Pioda per tutte le delucidazioni e l’aiuto datomi nella parte statistica del lavoro di diploma e ai docenti Andrea Boffini, Sonja Marci e Giovanni Togni per i consigli nella parte metodologica. Ringrazio inoltre Susan Gilbert per le correzioni della parte del lavoro in inglese. I miei ringraziamenti vanno anche Piero Balice per avermi fornito i risultati dei campioni di hGH.


BIBLIOGRAFIA

27

VII Bibliografia 1. Bonardi R, Deambrogio V, Oliaro A. Interpretazione dati di laboratorio. Quinta

edizione. Minerva medica; 2005. p.357, 439-441. 2. Ciranowicz MM, Strodtman LK, Jones S, Croce J, Kessler CA. Problemi endocrini.

Masson Spa; 1992. 3. Thomas L. Labor und Diagnose. 6e Auflage. Frankfurt/Main (D): TH-Books

Verlaggesellschaft mbh; 2005. p. 214-223. 4. Bozzola M, Stabile M, Pagani S, Papacchini O, Temporini F, Bozzola E. Significato del

dosaggio del GH e della GH binding protein. Riv Med Lab – JLM 2000; Vol.1: 38-40 5. Ghigo E, Aimaretti G, Corneli G. Review. Diagnosis of adult GH deficiency. Elsevier;

2008. 6. Glintborg D et al. J Clin Endocrinol Metab. 2005; 90: 5605-5612 7. Togni G. Dispense di chimica clinica, Cap. 10 Carboidrati, 2008 8. McPhee SJ. Pathophysiology of disease. Appleton & Lange; 1997. p. 423 9. Zonera AA. Insulinoma: Differential Diagnoses & Workup. Lankenau Cancer Center.

2009. Consultato il 08.03.2011 Disponibile al sito : http://emedicine.medscape.com 10. Zografos GN. Pancreatic insulinoma: current issues and trends. Athens General

Hospital. 2010. Consultato il 26.12.2010. Disponibile al sito: http://www.hbpdint.com 11. Vademecum EOLAB. Consultato il 08.03.2011. Disponibile nel sito:

http://www.eoc.ch 12. Soliani L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione. 2005 Cap. XII, p. 83-7 13. Jorge AA, Arnhold IJ. Growth hormone receptor exon 3 isoforms and their implication

in growth disorders and treatment. São Paulo (Brasile). 2009 14. Yetkin DO, Boysan SN, Tiryakioglu O, Yalin AS, Kadioglu. Forty month follow-up of

persistent and difficultly controlled acromegalic patients treated with depot long acting somatostatin analog octreotide. Istanbul (Turchia). 2007

15. Sherryline J, Feldman D, Youngman O. Unraveling Insulin-Like Growth Factor Binding Protein-3 Actions in Human Disease. Department of Pathology, Virginia

16. Arosio M. Utilità clinica del dosaggio di hGH e dei fattori di crescita. LigandAssay 12 (1) 2007

17. Grossi A. Deficit di ormone della crescita. 20.05.2010. Consultato il 10.04.2011. Disponibile al sito: http://www.ospedalebambinogesu.it/

18. Cantoni F, Bianco C, Pagani S, Meazza C, Pozzi M, Leoni MC, Laarej K. Sindrome di Laron: sindrome da insensibilità del recettore all’ormone della crescita (GH). Bollettino della Società Medico Chirurgica di Pavia 123(1): 203 – 208. 2010

19. Elenco delle analisi 2011. Consultato il 02.04.2011. Disponibile al sito http://www.bundespublikationen.admin.ch

20. Manuale dei dosaggi ADVIA Centaur e ADVIA Centaur XP, Insulina, 2008 21. De Leo E. Il Diabete. Consultato il 30.03.2011. Disponibile nel sito:

www.erbeofficinali.org/ 22. Immulite 2000/2500 Operator’s Manual. Siemens Medical Solutions Diagnostic.

Flanders, New Jersey.

VIII Allegati 1) Immulite 2000 Insulin (PIL2KIN-20, 29.12.2006) pdf 2) Immulite 2000 Growth Hormone (hGH) (PIL2KGH-10, 05.04.2004) pdf 3) Immulite® et Immulite® 2000, Valeurs de réfèrence, 3eme Edition, 2004, Siemens


ALLEGATO 1

28


ALLEGATO 1

29


ALLEGATO 1

30


ALLEGATO 1

31


ALLEGATO 1

32


ALLEGATO 1

33


ALLEGATO 2

34


ALLEGATO 2

35


ALLEGATO 2

36


ALLEGATO 2

37


ALLEGATO 2

38


ALLEGATO 2

39


ALLEGATO 3

40


ALLEGATO 3

41

Introduzione delle analisi Insulina e hGH in Eolab · Malattie associate all’hGH ... In bambini...

Documents

Transcript of Introduzione delle analisi Insulina e hGH in Eolab · Malattie associate all’hGH ... In bambini...