CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –FONACYT- UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA -USAC- FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA –CCQQ Y F-

LABORATORIO DE ENTOMOLOGÍA APLICADA Y PARASITOLOGÍA –LENAP-

INFORME FINAL

“ANÁLISIS POR MEDIO DE LA TECNICA DE ESPACIADORES INTERNOS TRANSCRITOS -ITS 2- DE POBLACIONES RE INFESTANTES DE Triatoma

dimidiata Latreille (Hemiptera: Reduviidae), COLECTADAS PRE Y POST ROCIAMIENTO EN 10 LOCALIDADES DEL DEPARTAMENTO DE JUTIAPA”

PROYECTO FODECYT No. 101-2006

BARBARA BEATRIZ MOGUEL RODRIGUEZ Investigadora

Principal

Guatemala, Diciembre de 2010

Equipo de Investigación

Investigadora Principal: Bárbara Moguel Rodríguez

Investigadora Asociada: Elizabeth Solórzano Ortiz

AGRADECIMIENTOS La realización de este trabajo, ha sido posible gra cias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –CONCYT-.

Resumen

Desde su descubierta ya Carlos Chagas sospechaba el inmenso daño

médico-social que la tripanosomiasis americana (mal de Chagas) podría causar en

todo el Continente. Todavía, después de la muerte de Chagas, el reconocimiento

de la enfermedad ha sido muy débil, por falta de definiciones clínicas y

laboratoriales, así como de muy poca investigación en áreas endémicas. A finales

de 1980 la OMS mencionaba la existencia de 18 millones de infectados y de 100

millones de personas bajo riesgo de contaminación por el Trypanosoma

(Schizotrypanum) cruzi.

Triatoma dimidiata perteneciente a la familia Reduviidae, se distribuye

desde México hasta Ecuador. En Guatemala ha sido reportado en 13

departamentos, actualmente se considera el principal vector de esta enfermedad

por los índices de infestación y su difícil control.

Algunas poblaciones reportan repetidamente procesos de re-infestación

después del rociamiento con insecticida. Por lo que el control de las mismas

requiere estudios de su biología, comportamiento, ambiente y movilidad.

Este estudio pretendió evaluar si existía alguna diferencia a nivel molecular

entre poblaciones pre y post rociamiento utilizando el la técnica del ITS2. El ITS2 es

un buen marcador molecular polimórfico para diferencias entre poblaciones de

especies dadas.

Este proyecto brinda información para continuar con los estudios de

poblaciones de Triatoma dimidiata e intentar comprender que sucede con las

poblaciones reinfestantes. Estas poblaciones únicamente han sido estudiadas con

técnicas fenéticas por lo que los resultados moleculares podrían respaldar y hacer

más efectivo el control de este vector tan importante para Guatemala en la

transmisión de la Enfermedad de Chagas.

La importancia de este estudio consistió en observar si existe alguna

diferencia genética entre las poblaciones colectadas pre y post rociamiento de

este vector, estas diferencias podrían tener implicaciones en las iniciativas para el

control de los vectores de la Enfermedad de Chagas en Centro América (IPCA)

(OPS, 2003).

Al analizar las 10 sub -poblaciones que reportan reinfestación de Triatoma

dimidiata en el Departamento de Jutiapa se observó diferenciación entre El

Carrizal, Copante y Valle Abajo del resto de las sub-poblaciones estudiadas

empleando la técnica de ITS.

Sin embargo no fue posible observar diferenciación entre las sub-

poblaciones colectadas pre y post rociamiento, esto pudo deberse a que las sub-

poblaciones provienen de los mismos remanentes naturales del área lo que

permite intercambio genético entre ellas, estudios previos reportan alta movilidad

de esta especie y su capacidad de ocupar diversos ambientes (Moguel 2006;

Calderón 2004; Pentana 1971; Monroy 003a; Dumontiel 2004), por lo que si

existieran diferencias a esos niveles sería muy difícil de detectar y se requeriría

emplear varias técnicas combinadas como retro cruces con marcadores

fenotípicos y genotípicos. Debido a esto el marcador molecular empleado pudo no

ser lo suficientemente sensible para detectar diferencias a este nivel.

Abstract

Since the discovery of “Tripanosomiasis Americana” (Chagas disease) by

Carlos Chagas the widespread medical and social implications that this disease

could have in the population of the entire continent was suspected. But many years

after Chagas’ death there is still need of information about the disease, because of

the lack of diagnostic standards at the clinical level and the absence of research in

the endemic areas. The World Health Organization reported for the 1980´s 18

million people infected and 100 million in contamination risk. (Guhl 2006).

Triatoma dimidiata is one of the main insect vectors of Chagas disease.

This species belongs to the Reduviidae family, and it is distributed from Mexico to

Ecuador. In Guatemala, it has been report in 13 departments; actually it is

considered the main vector of this disease due to infestation index and its difficult

control.

Some populations report several events of re infestation after the spraying

with insecticide. This is why vector control needs a better understanding of the

biology, behavior, environment and mobility of this vector.

This study wanted to see if there is any genetic difference between insects

collected before and after spraying in the same village, using the ITS2 genetic marker.

ITS2 is a good polymorphic molecular marker to differentiate between populations of

species, because its normally present how a repetitive blocks or microsatellites, and

their repetition unit is between 1 and 5 bases pair.

This project provides new information about Triatoma dimidiata populations

studies aimed to elucidate the process of reinfestation. These populations have

been studied with fenetic tools like morphometry, and this data that could be

supported with molecular information. This could lead to more effective ways of

vector control in Guatemala.

We analyzed 10 sub populations, who report reinfestation of Triatoma

dimidiata in the department of Jutiapa. There were differences between El

Carrizal, Copante and Valle Abajo of the rest of the sub populations analyzed using

ITS technique.

However, it was not possible to observe differentiation between the

populations pre and post spraying. The individuals collected in the post spraying

could be coming from the same natural remnants of this area, allowing a genetic

exchange between them. Previous studies report high mobility of this species and

its capacity to invade several environments. This makes a detection of these

differences, if they exist, difficult. The sequence of the primer used was not

sensitive enough to detect differences between these populations at this level. A

combination of several techniques such as retro cross, phenotypic and genotypic

markers might be necessary to detect differences, if they exist.

2.2 Palabras claves. Triatoma dimidiata, re-infestación, ITS

INDICE

Contenido Pag. PARTE I I.1 Introducción 1 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA I.2.1 Antecedentes en Guatemala 3 I.2.2 Justificación del Trabajo de Investigación 6 I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS I.3.1 Objetivo general 7 I.3.2 Objetivos específicos 7 I.3.3 Hipótesis 7 I.4 METODOLOGÍA I.4.1 Localización 8 I.4.2 Variables I.4.2.1 Variables dependientes 9 I.4.2.2 Variables independientes 9 I.4.3 Indicadores 9 I.4.4 Estrategia metodológica I.4.4.1 Población y muestra 9 I.4.5 El método I.4.5.1 Análisis de ITS2 y PCR 9 I.4.5.1.1 Extracción de ADN 9 I.4.5.1.2 Amplificación de ADN 12 I.4.5.1.3 Montaje y corrimiento de geles I.4.5.2.3.1 Preparación de los geles 13 I.4.5.2.3.2 Montaje de geles 13 I.4.5.2.3.3 Registro de resultados de electroforesis 14 I.4.5.2.3.4 Purificación de los productos de PCR 14 I.4.5.2.3.5 Secuenciación del ADN de T. dimidiata 15 I.4.5.2.3.6 Análisis de secuencias obtenidas 15 I.4.6 Técnica estadística para el análisis de secuencias 16 I.4.7 Instrumentos a utilizar 17 PARTE III: MARCO TEÓRICO II.1 La enfermedad de Chagas 18 II.2 Triatoma dimidiata II.2.1 Características 18 II.2.2 Clasificación taxonómica 18 II.2.3 Control vectorial 19 II.2.4 Reinfestación 21 II.2.5 Genética de poblaciones 21 II.2.6 Estudios empleando marcadores moleculares 22 II.2.7 Reacción en cadena de la polimerasa 23 II.2.8 Secuencias de ADN 24 II.2.9 ADN ribosomal 24 II.2.10 Ventajas de la utilización del ITS2 26 II.2.11 Análisis filogeográficos 27 II.2.12 Estimadores e índices de diversidad genética 28 II.2.13 Diversidad nucleotídica Pi 29 II.2.14 Análisis de flujo genético 29

II.2.15 Estadísticos de secuencias 30 II.2.16 Número efectivo de migrantes 32 PARTE III: RESULTADOS III.1 Cromatogramas 33 III.2 Características de las secuencias 33 III.3 Análisis filogeográfico 34 III.4 Análisis de agrupamiento 34 III.5 Genética de poblaciones 35 III.5.1 Estimadores e índices de diversidad genética 36 III.5.1.1 Estadísticos de haplotipos 36 III.5.1.2 Estadísticos de secuencias 36 III.5.2 Análisis de sitios polomórficos 38 III.6 Diversidad de ADN entre poblaciones pre y post rociamiento III.6.1 Análisis para poblaciones Pre 39 III.6.2 Análisis para poblaciones post 39 III.6.3 Análisis para poblaciones pre y post 39 III.6.4 Flujo y diferenciación genética (por origen) 39 III.7 Discusión de resultados 40 III.7.1 Análisis filogeográfico 40 III.7.2 Genética de poblaciones 40 III.7.3 Integración de análisis filogeográfico y genética de

poblaciones 41

III.7.4 Tiempo de diferenciación 42 PARTE IV.I: CONCLUSIONES 44 PARTE IV. II: RECOMENDACIONES 45 PARTE IV.III: REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS 47 PARTE IV.IV: ANEXOS 51 PARTE V: INFORME FINANCIERO 52 INDICE DE TABLAS Tabla 1 Detalle de las poblaciones del Departamento Jutiapa 8 Tabla 2 Haplotipos encontrados para las subpoblaciones estudiadas 36 Tabla 3 Matriz de distacia de las poblaciones estudiadas 38 INDICE DE CUADROS Cuadro 1 Receta para la extracción de ADN 11 Cuadro 2 Receta para Mezcla maestra 12 INDICE DE GRÁFICOS Gráfico 1 Mapa impacto de control de la Enfermedad de Chagas 4 Gráfico 2 Análisis de agrupamiento a partir de las secuencias de T.

dimidiata 34

Gráfico 3 Análisis de agrupamiento empleando como grupo externo T. dimidiata de Petén.

35

INDICE DE FIGURAS Figura 1 Sub-unidades de la región transcrita de ADN ribosomal 24 Figura 2 Cromatograma de secuencias de ADN de T. dimidiata 33

1

PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN La Enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana, es causada por el

parásito Tripanosoma Cruzi. La infección se contrae comúnmente por medio del

contacto con un insecto Triatomino infectado (chinche besucona). La infección también

puede transmitirse de madre a hijo (congénita), por productos sanguíneos

contaminados (transfusiones), ó por un órgano trasplantado de un donante infectado.

La Enfermedad de Chagas es muy común en América Latina, donde se calcula que

entre 8 y 11 millones de personas están infectadas (JAMA, 2007).

Como se menciono existen varias rutas de transmisión de la enfermedad

entre los huéspedes vertebrados y humanos. Sin embargo, la de mayor relevancia

es la causada por insectos chupadores de la subfamilia Triatominae. Es por ello que

las estrategias de control son directa y principalmente contra estos insectos

vectores, debido a la inexistencia de una vacuna y a que, a excepción de la etapa

temprana de la infección, el tratamiento químico no es efectivo (OMS 1991 en

Bargues 2002).

Triatoma dimidiata es un artrópodo, insecto reduvido hematófago que recibe

el nombre común de chinche picuda (adulto), talaje y telepate (ninfas)

(Comunicación Personal PhD. Carlota Monroy, Solórzano 2008).

En Guatemala se reconoce a Triatoma dimidiata como el principal vector, ya que

ha sido reportado en más de 1900 localidades ubicadas en 21 de los 22 departamentos

que conforman el territorio nacional (hasta el momento Totonicapán es la excepción).

La mayoría de las localidades endémicas están ubicadas en el oriente del país,

en donde la seroprevalencia en los niños escolares varía entre 2.7-7.9% (Rizzo, et. al.,

2003). Los problemas de reinfestación del vector en el oriente del país (Nakagawa

2003a, Nakagawa 2003b), hacen que el control por medio de insecticidas no sea

eficiente provocando una inversión económica fuerte sin los resultados esperados.

Es por esto que se hace necesario buscar medidas de control estratégicas,

conocer la biología del vector mediante estudios ecológicos, morfológicos y genéticos.

2

Esto permitirá estrategias de control más eficientes y una inversión económica

adecuada.

El objetivo de este estudio fue evaluar si existía alguna diferencia a nivel

molecular entre poblaciones pre y post rociamiento utilizando el la técnica del ITS2, lo

cual podría darnos una idea de la dinámica de las poblaciones después de la aplicación

de insecticidas y la eficacia del rociamiento.

La capacidad del ITS2 para diferenciar entre poblaciones de una especie

dada de Triatominae, se ha presentado como una herramienta muy útil para estudios

en regiones en donde el mal de Chagas es endémico; de esta manera el ITS-2 es un

marcador molecular sensible para ser utilizado en la clasificación de especies,

subespecies, híbridos, variedades y poblaciones de triatominos (Marcilla et al, 2000).

Para acceder a la información deseada se realizó el análisis de 10 poblaciones

reinfestantes de Triatoma dimidiata, por medio de 13 secuencias del segmento ITS2.

En el analisis de secuencias se encontraron tres haplotipos diferentes, las

cuales corresponden a una diferenciación espacial y no temporal; el haplotipo uno

H1 pertenece a la población de El Carrizal, el haplotipo dos H2 a las diez

subpoblaciones restantes analizadas del departamento de Jutiapa y el haplotipo tres

H3 a los departamentos de Valle Abajo y Copante.

Al no observar diferencias entre poblaciones pre y post rociamiento, se

plantearon tres hipótesis que intentan explicar el fenómeno: Las poblaciones

encontradas en el domicilio después del rociamiento son poblaciones residuales

debido a deficiencias en el rociamiento, las sub-poblaciones externas que

recolonizan las viviendas son genéticamente idénticas a las poblaciones

domiciliares ó el marcador molecular ITS2 es sensible a niveles poblacionales, no

así a niveles sub-poblaciones, estas hipótesis son explicadas en la seccion de

discusión de resultados.

3

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA I.2.1 Antecedentes en Guatemala Enfermedad de Chagas

La enfermedad de Chagas es una mancha que categoriza, define pobreza, y

marca las dificultades político-administrativas de la América Latina. Su control

constituye una obligación moral y ética, ya que representa una gran deuda social que

los latinoamericanos tenemos la obligación de saldar (João Carlos Pinto Dias, 1988).

Enfermedad de Chagas en Guatemala

Durante la Asamblea Mundial de Salud celebrada en 1998, la Organización Mundial

de la Salud reconoció los logros de los países suramericanos y declaró la meta de

eliminación de transmisión de Chagas para el año 2010 y la formación de una

iniciativa similar para las subregiones centroamericana y Andina. La Iniciativa de

Chagas para Centroamérica (IPCA) tiene tres objetivos específicos (OPS, 2006).

• Eliminación de Rhodnius prolixus

• Control de Triatoma dimidiata

• Eliminación de transmisión transfusional

(OPS, 2006).

Situación nacional:

En Guatemala se estima que 730,000 personas se encuentran infectadas de

Chagas y la incidencia anual estimada es de 30,000 casos (OMS, 2000).

Triatoma dimidiata ha sido reportado en más de 1900 localidades ubicadas en

21 de los 22 departamentos que conforman el territorio nacional (hasta el momento

Totonicapán es la excepción). La mayoría de las localidades endémicas están ubicadas

en el oriente del país, en donde la seroprevalencia en los niños escolares varía entre

2.7-7.9% (Rizzo, et. al., 2003).

En el año 2002 los bancos de sangre detectaron presencia del T. cruzi en el

1.0% de las unidades de sangre colectadas, en el 2003 y 2004 el porcentaje ascendió a

1.2% y 1.6%, respectivamente. La cobertura en el tamizaje para T. cruzi también se

incrementó: en el 2002 fue de 92.7% y para el 2003 y 2004 alcanzó el 99.8%.

4

La mayoría de los casos detectados por los bancos de sangre son de la fase

crónica.

Cooperación técnica de OPS/OMS en la prevención y control del Chagas

La cooperación tripartita entre el Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social,

la Agencia de Cooperación Internacional del Japón (JICA) y la OPS/OMS inició en el

año 2000, con un proyecto de control vectorial que involucra a los tres actores.

El primer rociamiento residual del insecticida se llevó a cabo en el año 2000, con

un cubrimiento de 33.000 viviendas pertenecientes a las 294 localidades con R.

prolixus. Como resultado las localidades infestadas disminuyeron a 34.

El segundo rociamiento se realizó contra el T. dimidiata en dos ciclos separados

con el objetivo de cubrir 10 departamentos (no incluido Chiquimula). El primer rociado

se hizo en más de 84.000 viviendas ubicadas en 1.400 localidades, y el segundo en

33.000 viviendas de 381 localidades. El índice de infestación después de los dos

rociados se redujo del 1.4-19.9% al 0-5.5%.

Gráfico 1. En los mapas se observa la distribución de Triatoma dimidiata según la aplicación del rociamiento, se puede ver la reducción en la distribución, sin embargo no se erradica por completo.

Fuente: de página electrónica de OPS.

5

El enfoque de cooperación de OPS para Guatemala ha sido el fortalecimiento de

las capacidades nacionales para el control vectorial, vigilancia epidemiológica y sistema

de información, además del fomento de la cooperación sub-regional.

En el Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología –LENAP-, se comenzó

a trabajar con la Enfermedad de Chagas en 1984, y después de 12 años, la

contribución para el control de los vectores de esta enfermedad de ha vuelto

indispensable ya que se trabaja en conjunto con el Ministerio de Salud Publica y

Asistencia Social.

El LENAP cuenta en la actualidad no solo con una amplia colección de

Triatominos de las especies de mayor importancia en la región mesoamericana, sino

que también con convenios internacionales de trabajo en conjunto para el control de los

vectores de la Enfermedad de Chagas, por lo cual se tiene un compromiso como

investigadores de alto nivel, con el istmo Mesoamericano.

6

I.2.2. Justificación del Trabajo de Investigación

“Aunque la enfermedad de Chagas es relativamente desconocida, su impacto

socioeconómico (AVADS) en América Latina, ocupa el cuarto lugar después de las

infecciones respiratorias, enfermedades diarreicas y SIDA” (OPS,2006).

El éxito en el control vectorial en Suramérica redujo el número de personas

infectadas de 16-18 millones (OMS, 1991) a 10 -12 millones (Schmunis, 1999).

En Centroamérica y México, un total de 2.3 millones personas están infectadas

con una incidencia anual de 70,000 personas (OMS, 2000).

Debido a que la enfermedad de Chagas en Guatemala, es una de las

enfermedades parasitarias más importantes en salud pública y la dificultad para el

control del principal vector Triatoma dimidiata no ha sido posible, se propuso estudiar

poblaciones reinfestantes utilizando una técnica sensible a cambios en corto tiempo.

El departamento de Jutiapa ha sido sometido a una serie de rociamientos,

observando como resultados positivos; la eliminación de Rhodnius prolixus y la

disminución de Triatoma dimidiata. Sin embargo después de tres meses del

rociamiento se ha observado reinfestación de adultos y en un año nueva colonización

(Monroy 2003).

Se ha trabajado con técnicas fenotípicas para detectar el posible origen de las

poblaciones reinfestantes, obteniendo resultados un tanto confusos, debido a que

probablemente no son lo suficientemente sensibles y es necesario apoyar los

resultados en técnicas moleculares más sensibles. Es por esto que se decidió trabajar

con ITS, ya que han sido utilizadas en estudios de poblaciones muy cercanas y se

recomiendan para estudios de Triatominos a niveles supraespecíficos, específicos, sub

especificos, híbridos, variedades y poblaciones (Young y Coleman, 2004; Bargues et al,

2002; Marcilla et al 2001).

7

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1 Objetivo General:

Analizar por medio de espaciadores internos transcritos ITS, poblaciones reinfestantes

de Triatoma dimidiata colectadas pre y post rociamiento en 10 localidades del

Departamento de Jutiapa.

I.3.2 Objetivos Específicos:

1. Diferenciar molecularmente las poblaciones de T. dimidiata pre y post rociamiento

de 10 localidades del Departamento de Jutiapa.

2. Determinar el posible origen (residuales o nuevas infestaciones) de las poblaciones

colectadas post rociamiento.

3. Observar la variación genética que existe en un solo departamento, antes y después

de que las poblaciones fueran sometidas a rociamiento.

I.3.3 Hipótesis

Las poblaciones colectadas pre rociamiento se dife rencian molecularmente,

utilizando el segmento ITS2 del ADN ribosomal, de l as poblaciones colectadas

post rociamiento, en localidades del Departamento d e Jutiapa.

8

I.4 METODOLOGÍA I.4.1 Localización

Duración del proyecto: 12 meses

Especímenes

Se trabajó con especimenes domésticos colectados pre y post rociamiento en 10

localidades del Departamento de Jutiapa, Guatemala.

Tabla 1. Detalle de las 10 poblaciones del Departamento de Jutiapa en las que fueron

colectados los individuos de T. dimidiata, pre y post rociamiento y el municipio al que

pertenecen.

Localidad Municipio Coordenadas

geográficas

Metros sobre el nivel del

mar

Tunillas San José

Acatempa

Lat. 14 13’44” lon. 90

03’40”

1140

Valle Abajo San José

Acatempa

Lat. 14 14’50” lon. 90

07”18

1280

Copante San José

Acatempa

Lat. 14 15’00” lon. 90

06’40”

1350

Carpintero San José

Acatempa

Lat. 14 14’12” lon. 90

06’30”

1245

Tablón San José

Acatempa

Lat. 14 14’35” lon. 90

07’50”

1310

Calderas San José

Acatempa

Lat. 14 13’16” lon.90

04’52”

1240

La Brea Quezada Lat. 14 49’14”.Long.89

19’20”

840

El Tule Quezada Lat.14 19’35” long. 90

01’46”

1060

El Sillón Yupiltepeque Lat14 13’15” long. 989

48’25”

1300

La Perla Yupiltepeque Lat. 14 09’55” lon. 89

46’15”

800

Fuente: Diccionario geográfico nacional

9

Se decidió trabajar con estas poblaciones ya que se tienen los datos de colecta pre y

post rociamiento, además de ser localidades con problemas de reinfestación.

Los individuos se encontraban en la colección de referencia del LENAP, con un código

coincidente con el de la base de datos; en la que se tiene fecha de colecta, estadio,

procedencia y cuando el espécimen aun está fresco, si es positivo para Trypanosoma

cruzi.

I.4.2 Variables

I.4.2.1 Variables dependientes:

• Variación en el ITS2 en poblaciones de Triatoma dimidiata en Jutiapa

I.4.2.2 Variables independientes:

• Temporalidad de la elección de los especímenes (pre ó post rociamiento).

• Localidades con problemas de reinfestación en Jutiapa

I.4.3 Indicadores

• Variación en el ITS2:

o Largo de las secuencias

o Porcentaje promedio de AT

o Número de deleciones

o Número de inserciones

I.4.4 Estrategia metodológica

I.4.4.1 Población y muestra

• Población: Especímenes domésticos colectados pre y post rociamiento en

localidades del Departamento de Jutiapa, Guatemala.

• Muestra: ADN de 200 chinches de Triatoma dimidiata provenientes de 10

localidades del departamento de Jutiapa

o Extracción de ADN: 10 Especímenes colectados pre y post rociamiento en

10 localidades del Departamento de Jutiapa, Guatemala

o Secuenciación y análisis: Individuos que hayan amplificado la banda de

interés (ITS2) con éxito.

I.4.5 El Método

I.4.5.1 Análisis del espacio interno transcrito ITS2 por medio de la reacción en

cadena de la polimerasa.

10

I.4.5.1.1Extracción de ADN

La extracción de ADN se realizo cortando dos patas de cada individuo adulto o de 5to.

estadio, 3 patas si se trataba de 3er ó 4to estadio, 4 patas si era de 2do; y el individuo

entero si se era de 1er. estadio, de acuerdo al protocolo de Dorn et al. (2003), con las

modificaciones descritas en Calderón et al.(2004).

Previo a la extracción de ADN se requirió de la preparación de ciertas soluciones que

fueron utilizadas en el proceso mismo de extracción o para preparar el buffer de

extracción como se describe a continuación.

• NaCl 5M (15 ml): 4.38g de NaCl de peso formula 58.44 g/mol, se aforaron en

un balon de 15ml. El reactivo se disolvió en agua destilada estéril con ayuda de

un mezclador y calor.

• EDTA 0.5M, pH 8 (50ml): 9.31 gramos de EDTA de peso formula 372.2g/mol, se

aforan en un balon de 50 ml. El reactivo se disolvió en una cantidad menor de

agua destilada estéril, se midió el pH y se llevo al punto requerido con ayuda de

NaOH si se la solución se encontraba muy ácida o de HCl si era muy básica, se

mezclo y por ultimo se aforo al volumen deseado con agua estéril.

• Tris- HCl 1 M, pH 8 (50 ml): 7.9 gramos de Tris de peso formula 157g/mol, se

aforaron en un balón de 50 ml. El reactivo fue disuelto en una cantidad de agua

estéril menor a la buscada, se midió el pH de la solución y se llevo al pH

buscado con HCl y con ayuda de un mezclador magnético, luego la solución se

llevo al volumen deseado con agua estéril.

• Dodecil Sulfato de Sodio 10%: Se mezclaron 10 gramos de dodecil sulfato de

sodio con 100 ml de agua destilada estéril.

• Buffer de Extracción. (Para obtener a concentración 10X): Para la preparación

del buffer de extracción se mezclaron las siguientes soluciones en las

cantidades indicadas en la tabla No. 2.

11

Receta de soluciones para la extracción

Cuadro 1. Descripción de las cantidades requeridas preparar 100 ml de cada reactivo

del buffer de extracción a partir de una solución Srock.

Buffer de Extracción: Solución stock Para 100 ml

0.1 M NaCl 5M NaCl 2 ml

0.2 M sacarosa 342.3 g/mol 6.9 g

50 mM EDTA 0.5 M EDTA pH 8 10 ml

100 mM Tris-HCl, pH 8.0-9.0 1 M Tris-HCl, pH 8.0 10 ml

0.05% SDS 10%SDS 500 µl Fuente: Calderón 2004.

Una vez preparadas las soluciones, se procedió a realizar la extracción de ADN de las

extremidades de los triatominos, como se menciono anteriormente de acuerdo al

protocolo de Dorn et al. (2003), con las modificaciones descritas en Calderón et al.

(2004), como se detalla a continuación.

-Se extrajeron las patas del espécimen con pinzas estériles (las pinzas se flamearon

con ayuda de etanol y un mechero, entre cada muestra).

-Posteriormente se realizó un lavado de las extremidades con 500 µl etanol y luego con

agua.

-Las patas se colocaron en tubos de centrifuga de 1.5 ml, debidamente identificados.

-Se agregó 100µl del buffer de extracción.

-Se maceraron las muestras con pistilos estériles.

-Se centrifugaron momentáneamente para homogenizar todo al fondo del tubo de

ensayo.

-Se incubaron las muestras a 65° durante 15 -30 m inutos.

-Se agregaron 14µl de K-Acetato 8M frío para una concentración final de 1M.

-Se mezclaron e incubaron en hielo durante 15 minutos.

-Se centrifugaron en frío 10 minutos a máxima velocidad (a 14,000rpm).

-Se alicuotaron 200µl de etanol frío al 95%.

12

-Se transfirió el sobrenadante para cada muestra al tubo con etanol frío al 95%, en ese

momento se observó la formación de una sustancia blanquecina como un halo, el cual

correspondía a los fragmentos de ADN.

-Las muestras se agitaron suavemente.

-Se incubaron en hielo 10 min., luego se centrifugaron 20 min. en frío a máxima

velocidad (14,000 rpm). Después de esto se observó la formación de un precipitado

blanquecino, en el cuál se encuentra el ADN aislado.

- Se descartó el sobrenadante.

-Se lavó el precipitado (hebras de ADN) en 100 µl etanol al 70 % y después en etanol al

95%.

-Se dejo secar el precipitado por 12 horas.

-Se disolvió el precipitado en 50 µl de TE estéril con 1U ARNasa.

-Las muestras se almacenaron a -20°C.

I.4.5.2 Amplificación de ADN

Primero se preparo una mezcla maestra como se describe a continuación (ver tabla 1);

para la amplificación del ADN en estudio, se utilizaron cebadores complementarios a

las regiones colindantes al segmento del segundo espaciador interno transcrito de

Triatoma dimidiata.

Los cebadores que se emplearon presentan las siguientes secuencias:

ITS-2 delantero (F) 5’-CTAAGCGGTGGATCACTCGG-3’

ITS-2 reverso (R) 5’-GCACTATCAAGCAACACGACTC-3’

Cuadro 2. Descripción de las cantidades requeridas de cada reactivo para 1 reacción de la Mezcla Maestra. (Marcilla 2001; Bargues 2001, con las modificaciones descritas en el Informe de EPS Solórzano E., 2006).

Fuente: FODECYT 101-2006.

Reactivo Volumen para 1 reacción

Concentración Final

Agua ultrapura libre de ADNasas 16.6 microlitros --

MgCl2 1 microlitros 2.22mM

Termo buffer 2.5 microlitros 1.11X

Dntp´s 0.1 microlitros 0.44mM

Cebador 0.1 microlitros (de c/u, P1 y P2) 100pmol/ul

Taq Polimerasa Recombinante 0.2 microlitros 1 unidad/ul

ADN 2 microlitros ---

13

Posteriormente se agregó el ADN extraído y se amplificó en un termociclador Applied

BioSystems con los ciclos de temperatura que se describen a continuación:

94 °C durante 2 minutos

Se repite este proceso 25 veces:

94 °C – durante 30 segundos

58 °C – durante 30 segundos

72 °C – durante 30 segundos

Y por ultimo 72 °C – durante 7 minutos

Marcilla 2001 (Bargues 2001).

Debido a que durante el desarrollo de la investigación se presentaron amplificaciones

inespecíficas del segmento ITS2 (amplificación de más de un fragmento), fue necesario

realizar varias pruebas de las amplificaciones, cambiando el lote de reactivos. También

se realizaron cambios en las concentraciones de todos los reactivos en la mezcla

maestra, así como de ciclos de temperatura y equipo utilizado.

Todas las pruebas se realizaron en una campana de flujo laminar para evitar

contaminaciones.

I.4.5.3 Montaje y Corrimiento de Geles

I.4.5.3.1 Preparación de los geles.

• Se mezclaron 1.5 g. de agarosa y 150 ml. de TBE (1% de agarosa)

• Se calentó hasta que la agarosa se disolvió.

• Se enfrío más o menos a 60º C, se vertió en el molde y se colocaron los peines

para marcar los pozos.

(Almeyda-Artigas RJ et al. 2000; citado en Landaverde, 2004)

I.4.5.3.2 Montaje de los Geles.

• Se cubrió el gel con una película fina de TBE 0.5X.

• Se mezclaron 2µl de colorante con 10µl de muestra de ADN amplificado y se

deposito en uno de los pozos del gel.

• Se coloco el marcador molecular en el segundo y último pozo.

• Se corrió el gel en la cámara de electroforesis, a 110 voltios por 1 hora.

14

• Se coloco el gel en un recipiente con bromuro de etidio a una concentración de

10 mg/ml. por más o menos de 20 a 30 minutos, para colorear las bandas.

(Almeyda-Artigas RJ et al. 2000; citado en Landaverde, 2004)

I.4.5.3.3 Registro de resultados de electroforesis

• Se observo si se obtuvo la banda de ADN de interés en un transiluminador a una

longitud de onda de luz UV 256 nm, y cuando fue posible (por el tiempo en el

que el Bromuro de etidio permitió visualizar la banda de interés) se capturó la

imagen por medio de fotografía digital.

• Los resultados se fueron anotando en hojas de registro especiales (ver anexo 3).

En los casos posibles, posteriormente las fotografías fueron analizadas en el programa

Gene Profiler v 4.5 y con ayuda del marcador molecular se buscó el peso de la banda

obtenida para asegurar que se trataba del producto buscado.

I.4.5.3.4 Purificación de los productos de PCR

Una vez que se tuvo la certeza de que la amplificación había sido exitosa para un

espécimen particular fue necesario purificar el ADN amplificado con ayuda de un kit

comercial de purificación, el cuál utiliza un proceso de purificación por medio de

arrastre a través de columnas.

La purificación se realizó para eliminar el exceso de cebadores, sales y otros reactivos

utilizados en la amplificación y que pudieran causar interferencia en el proceso de

secuenciación.

La purificación de ADN se realizó siguiendo el protocolo de manufactura contenido en

el kit de purificación para productos de PCR PureLink, Invitrogen ®, como se describe a

continuación:

Procedimiento:

-Se añadieron 10 ml. de isopropanol al 100% a 54 ml. de buffer de Unión.

-Se añadieron 32 ml. de etanol 96-100% a 8 ml de buffer de lavado.

-Se añadieron 4 volúmenes del buffer de unión con isopropanol a 1 volumen de

producto de PCR (50-100ul).

-Se mezcló bien.

15

-A un tubo en una columna giratoria se le añadió la muestra con el buffer.

-Se centrifugó la columna a temperatura ambiente a 1,000 rpm por 1 minuto.

-Luego se descartó el fluido y se coloco de nuevo la columna en el tubo colector

-Para lavar el ADN se añadieron 650 ul de buffer con etanol a la columna.

-Más tarde se centrifugo la columna a 10,000rpm /g/1min.

-Se descartó el fluido del tubo colector y se colocó la columna en el tubo.

-Se centrifugó la columna a máxima velocidad, a temperatura ambiente por 2 a 3

minutos para remover cualquier residuo del buffer de lavado.

-Se descartó el tubo colector.

-Para eluir el ADN se colocó la columna giratoria en un tubo de elusión.

-Se añadieron 50 ul de buffer de elusión o agua destilada estéril (pH>7) al centro de la

columna.

-Se incubó la columna en un cuarto a temperatura ambiente por 1 minuto.

-Se centrifugó la columna a máxima velocidad por 2 minutos.

-Del tubo de elusión que contenía el producto de PCR purificado se retiro y descartó la

columna.

-Y se recuperó un volumen de aproximadamente 48 microlitros.

-Posteriormente se almaceno el purificado a -20 °C.

I.4.5.3.5 Secuenciación del ADN extraído de Triatoma dimidiata

Ya con el ADN purificado, el siguiente paso fue la secuenciación. Sin embargo por

carecer de un secuenciador, debido a lo costo del equipo, mantenimiento y desarrollo

de los procesos realizados en este, fue necesario enviar el material biológico a

secuenciar fuera del país con la empresa Inbiotec de Guatemala. Los resultados

fueron obtenidos como cromatogramas de las secuencias nucleotidicas para cada una

de las muestras (dos secuencias por muestra una en sentido 3´-5´y la otra en sentido

5´-3´) y a partir de estas se realizaron los análisis.

I.4.5.3.6 Análisis de secuencias obtenidas del ITS2 (ADN de Triatoma

dimidiata):

Obtención de Secuencias Consenso

Una vez obtenidos los cromatogramas se introdujeron al paquete Chromas Pro versión

1.41 en el cual los cromatogramas fueron revisados base por base y comparadas las

dos lecturas para cada muestra, posteriormente de la comparación de ambas lecturas

16

se obtuvo la secuencia consenso para cada muestra en el software DNAMAN versión

5.2.9, con este último se realizó la alineación de todas las secuencias obtenidas junto

con el grupo externo seleccionado Triatoma mexicana a nivel poblacional. Para

observar el comportamiento de las sub-poblaciones de Jutiapa de decidió incluir la

población de Triatoma dimidiata de Petén, como grupo externo a nivel de sub

población.

I.4.6 Técnica estadística para análisis de Secuencia

En 1993 Wright mostro que la variación en la frecuencia génica entre subpoblaciones

puede ser analizada por índices de fijación o estadísticos F, derivando la formula (Nei,

1973)

1- itF = (1- ISF ) (1- stF )

Donde ITF y ISF son correlaciones entre dos gametos unidos para producir individuos

relativos a la subpoblación total y relativos a la subpoblación respectivamente, mientras

que STF es la correlación entre dos gametos tomados aleatoriamente de cada

subpoblación (Nei, 1973).

Así es el grado de diferenciación genética entre subpoblaciones y puede ser medido

utilizando STF (Nei, 1973).

ITF y ISF pueden ser negativos pero el STF no puede ser negativo (Nei, 1973).

A partir de los aportes de Wright muchas modificaciones, correcciones y

adaptaciones han sido incorporadas a la forma de calcular estadísticos para estimar el

nivel medio de flujo genético (Weir and Cockerham, 1984; Lynch and Crease 1990;

Jukes and Cantor; Nei, 1973, 1982; Takahata and Palumbi, 1985; Hudson et al 1992,

1997, 2000).

Edición, Análisis y Obtención de Secuencias Consenso

Una vez realizada la secuenciación se obtuvieron archivos que contenían los

cromatogramas (Ver figura 2) de cada uno de los individuos secuenciados (dos

cromatogramas por individuo en dos direcciones 3´-5´y 5´-3´).

17

I.4.7 Instrumentos a utilizar

Utilizando el paquete de cómputo Chromas Pro versión 1.41 (Technelysium,

2003--2007), las secuencias contenidas en los cromatogramas fueron revisadas,

cortadas y editadas, además se realizó la trasformación de dirección de lectura de

las secuencias reversas, para posteriormente realizar un ensamblaje (unión de

lecturas de la secuencia en ambas direcciones) en el paquete de cómputo

DNAMAN versión 5.2.9 (Lynnon Bio Soft, 1994- 2001), en este último también se

realizó la obtención de secuencias consenso para cada individuo y posteriormente

todas las secuencias consenso obtenidas, de todos los especímenes analizados,

fueron alineadas.

Como una forma de verificación y para trasformación de formato de las secuencias,

se realizo la alineación también en el paquete de cómputo Clustal X versión 1.83

(Higgins, 1988, 1989); ambas alineaciones fueron revisadas manualmente.

A partir de la alineación de secuencias se realizaron los análisis filogeográficos y de

distancias genéticas (Saitou, 1987).

18

PARTE II II. MARCO TEORICO

II.1 La Enferemdad de Chagas

La enfermedad de Chagas es una de las enfermedades parasitarias más importantes

en Latinoamérica (Monroy, 2003). En Guatemala esfuerzos conjuntos entre grupos de

investigadores y el Ministerio de Salud Pública y Asistencia social, han logrado ejercer

cierto control de los vectores de esta enfermedad que ataca a los sectores más pobres del

país, tiene un diagnóstico difícil y un tratamiento con consecuencias secundarias severas.

El control de los vectores de la enfermedad de Chagas requiere estudios de su

biología, comportamiento, ambiente y movilidad (Schoofield 2000). Ya que según el lugar

de origen, presentan diferentes características que deben estudiarse para proponer

estrategias de control efectivas (Monroy 2003).

II.2 Triatoma dimidiata

II.2.1 Características

Triatoma dimidiata, es una especie bastante grande, con un color distintivo en el

cuerpo, que va desde café obscuro hasta negro. El conexivo y el corium tienen una

coloración que va desde amarillo pálido hasta amarillo naranja ó rojo. La cabeza es

alargada, un tanto cónica, el protórax se hace angosto hacia el frente, las alas se cruzan

en forma plana sobre el dorso y tienen de dos a tres celdas en la membrana. La orilla del

abdomen parecen placas planas a los lados de las alas; estas placas están marcadas con

barras de color rojo o anaranjado. El macho mide entre 24.5 a 32.0 mm, mientras que la

hembra mide entre 24.5 a 35.0 mm (Lent & Wygodzinsky 1979).

II.2.2 Clasificación Taxonómica de Triatoma dimidiata

Reino: Animalia.

Phylum: Artropoda.

Clase: Insecta.

Orden: Hemíptera.

Familia: Reduviidae.

19

Sub Familia: Triatominae.

Género: Triatoma.

Especie: T. dimidiata

(Latreille 1811)

Sinonimia de Triatoma dimidiata

Triatoma dimidiata es un artrópodo, insecto reduvido hematófago que recibe el nombre

común de chinche picuda (adulto), talaje y telepate (ninfas) (Comunicación Personal

PhD. Carlota Monroy, Solórzano 2008).

II.2.3 Control Vectorial

En Guatemala, antes de 1995, no existían políticas de fumigación para áreas

endémicas de Chagas, únicamente las regiones que se traslapaban con Malaria o Dengue

eran fumigadas (Rodas 1995). Se iniciaron estudios de la efectividad antitriatomínica de

insecticidas órgano fosfatados, piretroides y carbamatos, tanto en condiciones de campo

como de laboratorio, los resultados obtenidos contribuyeron a presentar una propuesta

formal del control de los vectores de la enfermedad de Chagas (Rodas 1995).

Estudios socio – culturales relacionados a la enfermedad de Chagas, han permitido

conocer los factores de riesgo que contribuyen con una alta colonización de los vectores a

las viviendas (Yamaguchi 1995). Con éste conocimiento se ha trabajado en la búsqueda

de vectores dentro de las casas utilizando el método hombre/hora (Monroy 1998), la

búsqueda es realizada por técnicos expertos. Se encontró una cercana relación, al

comparar en número de triatominos colectados por el método hombre/hora, con el número

de manchas de excremento de los vectores en un papel blanco colocado sobre las

paredes, por una semana o más (Monroy 1998).

Los esfuerzos de control han sido varios, desde educación, que incluye el

mejoramiento de las paredes con emplastos y pintura, rociamiento con insecticidas

efectivos, evaluaciones post mejora y rociamiento. Hasta estudios de las sub-poblaciones

de los vectores colectados (tanto domésticos, como silvestres), utilizando diferentes

técnicas. Con el trabajo realizado durante años se ha observado una disminución en el

20

número de vectores dentro de las viviendas, en la república Guatemalteca (Menes 2004;

Díaz 2003; Monroy 2003; Monroy 1998).

En enero del 2000, el Ministerio de Salud en conjunto con la Cooperación

Internacional de Japón (JICA), iniciaron una operación de control de los vectores de la

enfermedad de Chagas en el oriente del país. Este programa tenía como objetivo la

eliminación de Rhodnius prolixus y la reducción de las subpoblaciones de Triatoma

dimidiata en cinco departamentos: Zacapa, Chiquimula, Jutiapa, Santa Rosa y Jalapa. Se

les dio entrenamiento a los técnicos del área de entomología de estos departamentos por

parte de expertos de la USAC, UVG y JICA, para conseguir un control a largo plazo.

(Nakagawa et al 2003)

Debido a la importancia del control vectorial en la interrupción de la transmisión de

la enfermedad se han realizado estudios que monitorean la efectividad de la aplicación de

insecticidas en el interior de las viviendas permitiendo observar que hay una re- infestación

de Triatoma dimidiata cuatro meses después de la aplicación de los insecticidas

(Dumonteil, et al 2004); sin embargo el origen de estos especimenes re- infestantes es

desconocido, pudiendo tratarse de organismos que se encontraban en los primeros

estadios de vida y que sobrevivieron al rociamiento y que de esta forma pasados cuatro

meses pudieron colectarse por ser más conspicuos o puede tratarse de organismos

procedentes de los ecotopos silvestres o peridomésticos que se encuentran en constante

movimiento y que pasados cuatro meses de la aplicación del insecticida son capaces de

recolonizar la vivienda, para cada uno de los casos las implicaciones en el control vectorial

son diferentes pues tratándose del primer caso podría tratarse de una mala aplicación del

insecticida o en el segundo caso el flujo migratorio de poblaciones de los ecotopos

mencionados seria el responsable. Para acceder a dicha información resulta necesaria

una comparación de las poblaciones pre y post aplicación de insecticida que permita

establecer si se trata o no de individuos pertenecientes a la misma población una forma

para establecer tal comparación es a partir de un estudio de genética poblacional por

medio de una diferenciación genética del ADN ribosomal que permita establecer distancias

genéticas entre tales poblaciones.

21

II.2.4 Reinfestación

El control de la enfermad de Chagas se ha visto afectado por las subpoblaciones

reinfestantes de T. dimidiata, que se han observado después de seis meses o un año de

fumigación dentro de las viviendas, en su estadio adulto (Monroy 2003). Estudios

realizados en los departamentos de Jutiapa y Zacapa, y en la Península de Yucatán,

muestran la misma tendencia a la reinfestación, después de la fumigación con insecticidas

como Deltametrina (Nakagawa 2003a, Nakagawa 2003b).

El impacto de las operaciones de control en contra de las subpoblaciones de

Triatoma dimidiata en el departamento con la más alta infestación, Jutiapa, fue evaluado

pre y post rociamiento. En las casas evaluadas en la etapa basal se encontró un 18.3% de

infestación y en 12.1% de las aldeas más de la mitad de las viviendas se encontraron

infestadas. En los resultados de esta ronda de fumigaciones, la media estadística de las

casas infestadas en cada aldea encuestada dos veces, bajó de 36.0% a 8.9%. Después

del rociamiento, el porcentaje de casas infestadas en cada aldea que fue fumigada nunca

fue mayor del 50%. La reinfestación y la colonización se observó en el interior de las

viviendas, esto probablemente indica que los insectos sobrevivieron al rociamiento.

(Nakagawa 2003b).

Otras especies como Triatoma infestans han presentado reinfestación en el área

rural del noreste de Argentina (Cecere 2002), lo que nos índica que un buen modelo de

movimiento se podría aplicar a varias especies que tienden a este fenómeno.

II.2.5 Genética de Poblaciones

La genética de poblaciones es el estudio del comportamiento de los genotipos y

alelos en una población, los cuales son la base de la estructura poblacional de las

comunidades animales que conforman los ecosistemas y su diversidad biológica. Los

cambios que puedan darse en las frecuencias génicas de las poblaciones, a causa de

diversos factores ecológicos, son los causantes a través del tiempo de “la evolución” (Hartl

& Clark, 1989; Hedrick, 1983; Falconer, 1981).

22

Los datos provistos por la genética de poblaciones son necesarios para la

optimización/adaptación de los programas de control que se dirigen a la reducción del

riesgo de la transmisión natural de la enfermedad de Chagas (Dumonteil, et al. 2002). La

información obtenida permite conocer si existe una estructuración genética, establecer el

nivel de flujo genético entre diferentes poblaciones y ecotopos para acceder a establecer

los riesgos epidemiológicos que esto representa en la transmisión del mal de Chagas

(Ramírez, et al. 2004).

II.2.6 Estudios con Marcadores Moleculares como herramientas para el

Control Vectorial de la Enfermedad de Chagas

La gran variabilidad morfológica que presenta el principal vector de la

enfermedad de Chagas en Centroamérica, Triatoma dimidiata, y su gran adaptabilidad

a diversos ecotopos, provocan un problema en cuanto a la clasificación taxonómica y la

delimitación de sus poblaciones; suponiendo esto a su vez dificultades en el control

vectorial; debido a que es necesario conocer la dinámica poblacional del vector, para

establecer estrategias de control vectorial regionales que sean efectivas.

Para acceder a dilucidar la dinámica poblacional de T. dimidiata, el principal

vector de la enfermedad de Chagas en Centro América, en el Laboratorio de

Entomología Aplicada y Parasitología -LENAP- han sido utilizados marcadores tanto

genéticos como fenéticos, entre los marcadores fenéticos, se han utilizado la

morfometría de cabezas, alas, genitalia, y huevos de chinches, hidrocarburos, análisis

de proteínas salivares, sensillas en antenas y asimetrías en estructuras relacionadas

con el movimiento como lo son alas y patas (Comunicación personal Licda. Marianela

Menes, citado en Solórzano 2008).

Entre los marcadores moleculares únicamente se ha utilizado la amplificación

aleatoria de ADN Polimórfico (RAPD´S- PCR). Sin embargo aunque éste último ha

brindado importantes aportes en cuanto al conocimiento de la dinámica poblacional de

T. dimidiata, su carácter aleatorio limita sus resultados y conclusiones. Además de

implicar posibles errores en sus deducciones, debido a problemas como:

- Homología de bandas (que consiste en analizar como homólogas bandas del mismo

tamaño aunque no procedan de una misma secuencia –no homólogas-), esto sucede

23

debido a que en la técnica no se buscan secuencias especificas sino que se buscan

secuencias al azar en todo el genoma)

- Efecto de dominancia entre alelos (lo cual introduce un sesgo en cuanto al cálculo

de las frecuencias genotípicas y por lo tanto de las génicas pues en una técnica

dominante como RAPD´S no se puede distinguir a los heterocigotos que contienen

enmascarados alelos recesivos)

- Falta de reproducibilidad de la técnica (lo cual implica que no son comparables los

resultados de estudios que no se llevaron a cabo utilizando exactamente las mismas

condiciones) (Hedrick, 1983; Hartl y Clark, 1989, Comunicación personal Licda Patricia

Landaverde, citado en Solórzano, 2008).

Por lo que resulta necesaria la complementación con una técnica molecular

más precisa y reproducible, como por ejemplo alguna que implique la secuenciación

de segmentos informativos no codificantes del ADN.

II.2.7 Reacción en Cadena de la Polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa también conocida como PCR (Ver

Anexo 13), es una tecnología desarrollada para la producción de millones de copias de

ADN a partir de una pequeña cantidad, a un menor costo y en un proceso más rápido

que la clonación genética en bacterias. El proceso se basa en las propiedades de la

enzima polimerasa que se une a una hebra molde de ADN y a partir de ésta, forma una

hebra nueva utilizando la complementariedad de las bases, para que el proceso se

lleve a cabo in Vitro, es necesaria la utilización de cebadores oligonucleotidos que

permiten la unión de una enzima polimerasa (que en este caso es la que proviene de la

bacteria termófila Thermus aquaticus, debido a que ésta resiste los cambios de

temperatura necesarios para el desarrollo del proceso), nucleótidos, un cofactor de la

enzima (Cloruro de Magnesio), agua y el ADN objetivo. Durante el proceso se utiliza un

termociclador que produce ciclos de temperatura que permiten la desnaturalización del

ADN, unión de cebadores y por último la elongación de la cadena (Audesirk, 1997).

24

II.2.8 Secuenciación de ADN

Durante la década de los ochenta se desarrollaron máquinas automatizadas

que permiten analizar la secuencia de genes bastante largos (de hasta algunos cientos

de miles de nucleótidos de longitud). Basados en la clonación de segmentos de ADN y

utilizando diversos procesos de marcaje de nucleótidos (Sanger, Maxam-Gilbert), las

máquinas automatizadas proveen un cromatograma que presenta picos de colores que

se interpretan cómo la presencia de un nucleótido específico. El proceso no es barato,

y 50,000 nucleótidos representan menos del 10 por ciento de los 60 millones de

nucleótidos en un cromosoma humano promedio, por lo que es importante determinar

el lugar preciso de los genes (Audesirk, 1997, citado en Solórzano 2008).

II.2.9 ADN ribosomal

(Segundo Espaciador Interno Transcrito – ITS2-) como Marcador Molecular para el

estudio Genético de las variaciones de Triatoma dimidiata

Los organismos eucariotas presentan el ADN ribosomal nuclear organizado

en agrupaciones que contienen las subunidades 18S, 5.8S y 28S. Los genes que

codifican para dichas subunidades son separados por dos espaciadores internos

transcritos (ITS): El ITS1 que se encuentra separando los genes de las subunidades

18S y 5.8S, y el ITS2 separa los genes de las subunidades 5.8S y 28S como se

muestra en la siguiente figura:

Figura 1: Sub unidades de la región transcrita de ADN ribosomal

(Collins, 1990)

Estas agrupaciones de genes se encuentran en bloques repetitivos en todo el

genoma (Gómez- Zurita, et al 2000, citado en Solórzano 2008).

25

Como se mencionó los ITSs se presentan usualmente en bloques repetitivos

o microsatélites (Almeida-Artigas, et al., 2000), cuya unidad de repetición es entre 1 y 5

pares de bases y el cual es muy buen marcador molecular polimórfico para la

diferenciación de poblaciones entre especies (Jarne and Lagoda, 1996).

La hipótesis de la existencia de un reloj molecular asume que la substitución

de nucleótidos en una secuencia dada ocurre a un rango constante, proveyendo un

método como medida del tiempo de divergencia de las diferencias entre dos

secuencias , el cual ha sido establecido para Triatominae, como un reloj molecular

inferido del segundo espaciador interno transcrito del ADN ribosomal nuclear de estos

reduviidae, siendo estimado este en alrededor de 0.4%- 1% de cambio en pares de

bases en un millón de años (Bargues, et al 2000, Marcilla, et al. 2001). La región de

estas repeticiones más apropiada para comparaciones a nivel de género y especie es

el ITS2 (Bargues, et al. 2002).

La resolución provista por la secuenciación del Segundo Espaciador Interno

Transcrito -ITS2- ha permitido realizar análisis de especies cercanamente relacionadas

como las del complejo Triatoma phyllosoma. (Bargues 2002). Además dicha técnica

presenta muchas ventajas sobre el marcador molecular anteriormente utilizado en el

LENAP (RAPD´S- PCR), por ejemplo: la falta de aleatoriedad respecto a los segmentos

amplificados del ADN que elimina errores en los análisis como la homología de bandas,

el proceso es reproducible y por lo tanto comparable con resultados provistos por otros

estudios con el mismo marcador, además de ser un marcador codominante (Solórzano,

2008).

Estudios previos indicaron que el ITS2, muestra que Triatoma dimidiata se

encuentra en proceso de especiación en diferentes regiones de su distribución

geográfica (Marcilla et al, 2000).

La capacidad del ITS2 para diferenciar entre poblaciones de una especie

dada de Triatominae, se ha presentado como una herramienta muy útil para estudios

en regiones en donde el mal de Chagas es endémico; de esta manera el ITS-2 es un

marcador sensible para ser utilizado en la clasificación de especies, subespecies,

híbridos, variedades y poblaciones de triatominos (Marcilla et al, 2000).

26

Según Young (2004) el El ITS-2 presenta una longitud típica de 200 a 400

pares de bases y puede ser amplificado por la Reacción en Cadena de la Polimerasa a

partir de una pequeña cantidad de ADN y posteriormente ser secuenciado. (Young y

Coleman, 2004).

Otro aspecto importante de la técnica es que puede ser útil para resolver

problemas taxonómicos como el que se observa en el complejo de especies T.

phyllosoma que ha presentado cruces entre especies en condiciones de laboratorio, y

cuya descendencia (F1) ha resultado viable (Mazzoti y Osorio, 1942). Por lo que,

estudios que utilicen herramientas moleculares para clarificar la validez de las

designaciones de especie/subespecie, y para estudios eco-epidemiológicos de la

importancia de los diferentes miembros del complejo en la transmisión de la

enfermedad de Chagas, se hacen necesarios. (Marcilla et al.2000)

De hecho, la relación entre las subpoblaciones de triatominos de diferentes

ambientes no es siempre completamente entendida, aun pensando que esto tiene

implicaciones considerables en la transmisión del parásito (Dumonteil et al., 2002).

La secuenciación de solo uno de los marcadores resultantes de los

espaciadores ínter génicos es suficiente para el desarrollo de los estudios mencionados

(Marcilla et al, 2001).

II.2.10 Ventajas de la utilización del ITS-2 frente a RAPD´S y Técnicas

Fenotípicas en el Estudio de Triatoma dimidiata

Debido a que la secuenciación de solo uno de los espaciadores es suficiente

para el desarrollo de los estudios filogenéticos y de genética de poblaciones, esto

presenta al ITS 2 como un marcador muy confiable; y debido a su carácter no aleatorio,

es claramente ventajoso respecto a la técnica utilizada anteriormente en el LENAP, de

la Amplificación de ADN Aleatorio (RAPD´S, PCR), ya que la secuenciación de la

sección del ITS 2 que, no solo ha probado ser útil en estudios previos para Triatoma

dimidiata (Marcilla et al, 2001), sino que, además presenta la gran ventaja de evitar los

27

errores supuestos en el marcador utilizado anteriormente, por la implicación de la

homología de bandas (Solórzano, 2008).

Otra clara ventaja del análisis del ITS-2 frente a RAPD´S, es el hecho de que

el primero se trata de un marcador codominante, permitiendo diferenciar organismos

heterocigotos dominantes de los homocigotos dominantes, mientras que RAPD´S por

tratarse de un marcador dominante, reduce la percepción de la variabilidad real por

considerar a los heterocigotos dominantes y los homocigotos dominantes como lo

mismo. (Solórzano, 2008)

Además el nuevo marcador molecular presenta reproducibilidad,

característica de la cuál carecía el marcador anteriormente utilizado, lo que permite el

intercambio de información entre diferentes laboratorios, y de esta forma la posibilidad

de desarrollar estrategias de control vectorial regionales y lo cuál implicaría la

justificación del costo del desarrollo de la técnica; ya que no es necesario el intercambio

de material biológico, pues una vez conocidas las secuencias, los resultados pueden

enviarse fácilmente por correo electrónico. Además de la ventaja que representa el

que otras secuencias ya se encuentran disponibles en el Banco electrónico de

secuencias genéticas (GeneBank) y esto permite hacer alineaciones (“Blast”) con las

secuencias más semejantes de otras especies del mismo género (Solórzano, 2008).

Por otro lado el método presenta ventajas respecto a los marcadores

fenéticos, ya que la especie presenta variabilidad fenotípica en diferentes aspectos, lo

cual puede hacer incurrir en conclusiones falsas cuando únicamente se considera el

fenotipo (Marcilla, et al 2001).

II.2.11 Análisis Filogeográficos

Parámetros Evolutivos de Kimura

Los parámetros de Kimura permiten a partir de una simple fórmula, la

estimación de las distancias evolutivas, en términos del número de substituciones

28

nucleotídicas (y también los rangos evolutivos cuando el tiempo de divergencia es

conocido) (Kimura, 1980).

Cuando se compara un par de secuencias nucleotídicas es posible distinguir

entre dos tipos de diferencias encontradas; si los sitos homólogos son ocupados por

diferentes bases nucleotídicas, pero ambos son purinas o ambos son pirimidinas, estas

diferencias se conocen con el nombre de trancisiones; mientras que si el cambio es de

purina a pirimidina o de pirimidina a purina, las diferencias se conocen con el nombre

de transversiones (Kimura, 1980).

Dejando a P y Q respectivamente como la fracción de sitios nucleotidicos que

muestran trancisiones y transversiones, entre dos secuencias comparadas, la distancia

evolutiva por sitio es K= (1/2)ln{(1-2P-Q √1-2Q}. El rango evolutivo por año está dado

por k= K/(2T), donde T es el tiempo desde que divergieron dos secuencias (Kimura,

1980).

II.2.12 Estimadores e Índices de Diversidad Genética

La diversidad genética y el flujo genético dentro y entre poblaciones puede

ser evaluada utilizando los siguientes índices y estimadores:

Análisis de Haplotipos

Diversidad de secuencias y su varianza de muestreo (Nei 1987; ecuaciones 8.4 y 8.2

pero reemplazando 2n por n).

Diversidad Haplotípica

La diversidad haplotípica es un parámetro que indica la probabilidad de que dos

haplotipos seleccionados al azar en una población sean diferentes, y puede estimarse

a partir de:

1−=

n

nh

−∑=

k

iip

1

21 Nei y Tajima (1981)

29

Donde n es el número de copias génicas en la muestra, k es el número de haplotipos y

pi es la frecuencia del haplotipo i en la muestra. La diversidad haplotípica da una

medida de diferentes tribus matriarcales en una población, y en una población

monomórfica su valor es cero (Nei y Tajima, 1981 citados en Vera 2006).

II.2.13 Diversidad Nucleotídica Pi

Es el promedio del número de diferencias nucleotídicas por sitio entre dos secuencias

(Rozas, 2006)

La diversidad nucleotídica es un indicador del grado medio de divergencia nucleotídica

entre los individuos presentes en la población y se pueden estimar como:

L

dpp

dij

k

iji∑∑

== 1 Nei (1987)

Donde dij es una estimación del número de sustituciones nucleotídicas entre los

haplotipos i y j, mientras que k es el número de haplotipos, pi es la frecuencia del

haplotipo i, y L es la longitud en pares de base de la secuencia analizada (Nei, 1987;

Rozas, 2006).

Diversidad Nucleotídica (Jukes and Cantor) Pi (JC)

El promedio del número de substituciones nucleotídicas por sitio entre dos secuencias

(Lynch and Crease 1990, ecuaciones 1-2).

xyδ = -4

3 ( 1 -

3

4∧∏xy )

∧

iv = )1(

2

−ii nn

yx<∑ ixn iyn xyδ

A diferencia de las estimaciones previas (Nei 1987, ecuaciones 10.5 o 10.6), esta ha

sido obtenida utilizando las correcciones de Jukes and Cantor (1969). La corrección ha

sido desarrollada en la comparación de cada par, el Pi (π) estimado fue obtenido como

el promedio de los valores para todas las comparaciones.

II.2.14 Análisis de Flujo Genético

La información de flujo genético puede ser accesada con el cálculo de las siguientes

medidas de la información provista por los datos de la secuencia nucleotídica:

30

Hudson et al. 1992b:

Fst (ecuación 3) y Nm (ecuación 4).

STF = 1 - Hb

H w

FmN = 2

1

wb

w

HH

H

−

Lynch and Crease1990:

Nst (ecuación 36) y Nm.

STN = ∧∧

∧

+ bw

b

vv

v

El estimador Nst es casi el mismo que el Fst (Hudson et al. 1992b). La diferencia es

que el Nst utiliza la corrección de Jukes and Cantor (1969).

II.2.15 Estadísticos de Secuencia

Índices de Fijación FST y NST

Wright (1943, 1951, 1965) mostró que la variación en la frecuencia génica entre

subpoblaciones podía ser analizada por índices de fijación o estadísticos F; el derivó la

formula:

1-FIT = (1-FIS) (1- FST) (a)

Donde FIT y FIS , son correlaciones entre dos gametos unidos para producir los

individuos relativos a la población total y relativos a las subpoblaciones,

respectivamente, mientras que el FST es la correlación entre dos gametos arrastrados

al azar de cada subpoblacion (Nei 1973). De esta forma el grado de diferenciación

genética entre subpoblaciones puede ser medido por el estadístico FST.

31

Desde el desarrollo de este estadístico, múltiples correcciones o variaciones del mismo

han sido desarrolladas para acoplarse a las características de los datos a utilizar (Weir

and Cockerman, 1984; Lynch and Crease, 1990; Jukes and Cantor, 1969; Nei,

1973,1982); debido a las características de los datos a partir de los cuales se obtuvo la

información genética (secuencias de ADN ribosomal, de un organismo diploide),

utilizando el programa DNAsp se calculó el valor del FST a partir de la fórmula

desarrollada por Hudson y su colaboradores en 1992.

(FST) = 1 – Hw/Hb b)

Donde, Hw es la media de las diferencias, entre diferentes secuencias muestreadas de

la mima subpoblación, y Hb es la media de las diferencias, entre secuencias

muestreadas de dos diferentes subpoblaciones muestreadas.

El supuesto de la fórmula desarrollada por Hudson es el mismo que el ∧θ de Weir and

Cockernham (1984), para el caso de la unión aleatoria de gametos con iguales

tamaños de muestras de cada subpoblación, y donde la información de cada sitio

polimórfico es combinada como Weir y Cockerham recomiendan para información

combinada de diferentes loci; lo que varía es la forma de calcularlo, ya que en la

fórmula de Hudson, esta se acopla a datos provenientes de secuencias.

También, el estimador de Hudson es casi el mismo que el NST de Lynch and Crease

(1190), diferenciándose sólo en que no se desarrolla la corrección de Jukes and

Cantor, porque Hudson asume un modelo de sitios-infinito, el cual no requiere ninguna

corrección para uniones múltiples (Hudson, 1992b). El estimador de Hudson es

levemente diferente del yST de Nei´s (1982) porque en el valor Hw no se incluye una

comparación de la secuencia muestra con ella misma, ambos estimadores, Nei´s y

Takahata and Palumbi´s difieren de la ecuación de Hudson en términos de 1/n donde n

es el número de secuencias muestreadas para cada subpoblación (Hudson, 1992b).

En 1978 Wright sugirió rangos para la interpretación de los valores de FST obtenidos:

De 0 – 0.005→ Indicador de poca diferenciación genética.

De 0.005 – 0.15 Indicador de diferenciación genética moderada.

De 0.15 – 0.25 → Indicador de diferenciación genética grande

Valores superiores a 0.025 → Indicador de diferenciación genética muy grande

(Wright, 1978 en Landaverde, 2004)

32

II.2.16 Número Efectivo de Migrantes

Además de los FST otro método para estimar los niveles promedio de flujo genético a

partir de datos de secuencias de ADN, es el que se basa en el cómputo del número

mínimo de eventos de migración consistente con el árbol genético inferido de sus

secuencias.

(Nm)F = wb

w

HH

H

−−

2

1

Donde Hw es una estimación del promedio del tiempo de divergencia de pares de

genes muestreados dentro de la subpoblación y Hb es una estimación del tiempo

promedio de divergencia de los genes muestreados de diferentes subpoblaciones. Si

Hb es menor o igual que Hw, entonces (Nm)F es negativo o infinito, en este caso el

estimador es indefinido para la muestra.

33

PARTE III III. RESULTADOS Young y Coleman, 2004; Bargues et al, 2002 y Marcilla et al 2001, aclaran que el ITS2

es útil para resolver relaciones a nivel supra específico, específico, sub específico,

híbridos, variedades y poblaciones en Triatominos. Por lo que en este estudio se

pretendía analizar diferencias a nivel sub poblacional, los resultados que se obtuvieron

se detallan a continuación.

Se realizó el análisis de 10 poblaciones reinfestantes de Triatoma dimidiata, por medio

de 13 secuencias del segmento ITS2. A estas poblaciones se les aplicó el

procedimiento detallado en la metodología.

III. 1 Cromatogramas:

Las secuencias de cada individuo se obtuvieron como cromatogramas en los

cuales fue posible revisar base por base para luego editarlos en el programa Chromas

pro. En la figura 2 puede observarse un cromatograma de la sub población del sillón,

Jutiapa.

Figura2: cromatograma obtenido de las secuencias de nucleótidos para

individuos de Triatoma dimidiata.

Fuente FODECYT 101-2006

III.2 Características de las secuencias

El largo de las secuencias varió entre 476 -477 pb, con un porcentaje promedio

de 77% de AT, se habla de un genoma diploide, cromosoma autosómico.

Se seleccionó la secuencia de la base 1 a la 477, para un total de 477 sitios

nucleotídicos analizados, en cuya alineación se encontró 1 grieta la cual fue excluida

para el análisis.

Dentro de los 476 sitios se encontraron 2 sitios variables o segregados (S), que

corresponden a mutaciones (Eta).

34

III.3 Análisis filogeográfico:

Al analizar 10 poblaciones reinfestantes del Departamento de Jutiapa se observó

diferenciación entre las sub-poblaciones de El Carrizal, Copante y Valle Abajo del resto

de las sub-poblaciones estudiadas empleando la técnica de ITS2. Sin embargo no fue

posible observar diferenciación entre las sub-poblaciones pre y post rociamiento, estos

resultados pueden observarse en la gráfica número 2, en la que se presenta el

dendrograma del análisis de agrupamiento con parámetros evolutivos de Kimura, a una

escala de 0.05.

III.4 Análisis de Agrupamiento:

Se analizaron 13 secuencias provenientes de 8 poblaciones del Departamento de

Jutiapa, las cuales revelaron 3 grupos.

Las secuencias analizadas revelan tres grupos como se puede observar en la

gráfica 2.

• Grupo 1: El Carrizal

• Grupo 2: (Casas Viejas)2, (La Brea post)2, El sillón Post, (El Sillón pre)3, La

Perla pre, El Tablón Pre.

• Grupo 3: Valle abajo y Copante post.

Gráfica 2. Análisis de agrupamiento a partir de 13 secuencias obtenidas de 8

poblaciones del Departamento de Jutiapa.

Fuente: FODECYT 101-2006

35

Es posible observar en la gráfica 3, que la variación detectada a nivel sub-

poblacional con el ITS2 es muy pequeña, únicamente se distinguen en una rama

aparte las poblaciones de El carrizal, Valle Abajo y Copante.

Grafica 3: análisis de agrupamiento a partir de 13 secuencias obtenidas de 8

poblaciones del Departamento de Jutiapa, utilizando como grupo externo a nivel de

sub- poblaciones a Triatoma dimidiata de Petén.

Fuente: FODECYT 101-2006

Debido a que los análisis de agrupamiento utilizando parámetros evolutivos no

permitieron observar ningún tipo de patrón en la poblaciones analizadas respecto a la

escala temporal (pre y post rociamiento) se procedió a realizar análisis estadísticos y

análisis de distancia genética para detectar diferencias entre subpoblaciones, estas

pruebas se basan en las variaciones moleculares de las secuencias de ADN de los

especímenes estudiados (Hudson 1192b).

III.5 Genética de poblaciones

Por consiguiente dos grupos de análisis estadísticos fueron considerados, el

primero denominado “estadísticos de haplotipo”, los cuales se basa en las frecuencias

haplotipicas de la muestra, para estas pruebas no importa que dos haplotipos difieran

por uno o cientos de nucleótidos. Y el segundo agrupa los denominados “estadísticos

36

de secuencias” los cuales utilizan información del número de diferencias nucleotídicas

entre secuencias (Hudson 1992b).

III.5.1 Estimadores é índices de Diversidad Genética

La diversidad genética y el flujo genético dentro y entre las poblaciones

de Triatoma dimidiata estudiadas fue evaluada utilizando el paquete de

cómputo DnaSP versión 4.10.9 (Rozas et al, 2006), calculando los siguientes

índices y estimadores: Haplotipos (Nei ,1987); Diversidad Haplotípica (Nei y

Tajima, 1981 en Vera 2006); Diversidad Nucleotídica, Pi (Nei, 987);

Diversidad Nucleotídica con las correcciones de Jukes and Cantor, Pi (Jukes

and Cantor, 1969).

III.5.1.1 Estadístico de Haplotipos

Utilizando el paquete de computo DnaSP se procedió a la

asignación de haplotipos para la totalidad de las secuencias

analizadas. El análisis de diversidad haplotípica y nucleotídica permitió

observar 3 h, haplotipos, con una diversidad haplotípica Hd: 0.4103,

una varianza de diversidad haplotípica 0.02368, desviación estándar

de Diversidad Hplotípica 0.154 y un índice de diversidad necleotídica

(por sitio), Pi: 0.00092

Para el índice de diversidad nucleotídica (por sitio), Pi: 0.00092,

se obtuvo una varianza de muestreo Pi: 0.0000001, una desviación

estándar de Pi: 0.00037, número promedio de diferencias

nucleotídicas, k: 0.43590 y un índice Theta (por secuencia) de S,

Theta-W: 0.64449 y un índice Theta (por sitio) de S, Theta-W: 0.00135.

Tabla No. 2: Haplotipos encontrados para las sub poblaciones estudiadas.

Haplotipo Sub poblaciones Hap_1:1 [A2833 El Carrizal ]

Hap_2: 10 [ c834 Casas Viejas , c717 Breapost , c519 El Sillon post , c139 El

SillonPre , C30 Perla pre , A2959 Tablon pre , A2812 El Sillonpre , c829 casas viejas , C222 El Sillon Pre , C884 La Brea ]

Hap_3: 2 [3-4, A3106 Valle abajo , A4458 Copante post ] Fuente FODECYT 101-2006

37

III.5.1.2 Estadísticos de secuencias

• Análisis de Flujo Genético

El flujo genético se cómputo en el programa DnaSP y se calcularon las

siguientes medidas de flujo genético:

De la información provista por los datos de la secuencia nucleotídica, se

calcularon índices de fijación (Fst) (Hudson et al, 1992b) y Nst (Jukes and Cantor,

1969; Lynch and Crease, 1990) y número de migrantes por generación (Nm)

(Hudson et al, 1992b; Lynch and Crease 1990, Wright 1951)

La estimación del Nm se basa en el modelo de islas de estructura

poblacional, existen distintas formas para el calculo del Nm dependiendo del tipo de

información del segmento de ADN utilizado, para este caso se utilizaron

especificaciones de un organismo diploide, para un locus autosómico: Fst, st, Nst

= 1 / (1 + 4Nm).

Para el desarrollo de este estudio se utilizaron las modificaciones y adaptaciones

contenidas en Hudson 1992ª, para estimar el nivel medio de flujo genético a partir de

los valores de STF y mN .

Se realizó el índice de Hudson, Slatkin and Maddison (1992) y se obtuvieron

los siguientes valores:

Fst: -0.11765 Nm: -2.38

III.5.1.2.2 Análisis de polimorfismo

Para acceder a la información de polimorfismo de las secuencias

correspondientes al segmento ITS 2 del ADN ribosomal de los especímenes

analizados, utilizando el paquete de computo DNASP versión 4.1., se realizaron tres

tipos de análisis de polimorfismo para las 22 secuencias obtenidas, se realizo un

análisis de sitios polimórficos, de datos intraespecíficos y graficas de polimorfismo,

estos tres análisis permitieron obtener información acerca del número y ubicación

de sitios invariables, polimórficos, parsimonicamente informativos, con grietas en la

alineación, así como número total de sitios variables, número total de mutaciones,

contenido de citosina-guanina, diversidad haplotípica y nucleotídica, número de

mutaciones por secuencia y por sitio, además las graficas permitieron observar la

38

distribución espacial (posiciones en pares de bases en la secuencia) de la

mutaciones, sitios polimórficos y diversidad nucleotídica.

• Distancia genética

Utilizando el paquete de cómputo DNAMAN versión 5.2.9 se construyó una matriz de

distancia a partir de la alineación.

Esta matriz muestra las distancias relacionadas entre todos los pares de secuencias en

la alineación. Los valores bajos presentan baja divergencia (alta homología) entre dos

secuencias.

El método utilizado para el cálculo de las distancias en la matriz (ver tabla No 3) fue el

de Kimura. Este método utiliza la Divergencia Observada, y aplica

los dos parámetros de corrección de Kimura. (Kimura, 1980; DNAMAN, 1994-2001).

Tabla No 3. Matriz de distancia de 13 secuencias utilizando parámetros de Kimura, realizada en el

programa ADNman.

Fuente: FODECYT 101-2006

III.5.2 Análisis de Sitios Polimórficos

Al realizar el análisis de polimorfismo de las 13 secuencias se encontraron 474 sitios

invariables o monomórficos, 2 sitios variables o polimórficos los cuales

correspondían a mutaciones, de los cuales uno correspondía a sitios variables

únicos (singleton variable sites) y el otro es un sitio parsimónicamente informativos.

A2833 Carrizal Pre

C717cBreaPost

A3106cValleAbajo

A4458cCopantePos

C834cCasasViejas

C884cLaBrea

C519cElSilonPost

C222cEl_SillonPr

C139cElSillonPre

C30cPerlaPre

A2959cTablonPre

A2812cElSillonpr

C829cCasasviejas

A2833cCarrizalPr 0

C717cBreaPost 0.002 0

A3106cValleAbajo 0.004 0.002 0

A4458cCopantePos 0.004 0.002 0.000 0

C834cCasasViejas 0.002 0.000 0.002 0.002 0

C884cLaBrea 0.002 0.000 0.002 0.002 0.000 0

C519cElSilonPost 0.002 0.000 0.002 0.002 0.000 0.000 0

C222cEl_SillonPr 0.002 0.000 0.002 0.002 0.000 0.000 0.000 0

C139cElSillonPre 0.002 0.000 0.002 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0

C30cPerlaPre 0.002 0.000 0.002 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0

A2959cTablonPre 0.002 0.000 0.002 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0

A2812cElSillonpr 0.002 0.000 0.002 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0

C829cCasasviejas 0.002 0.000 0.002 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0

39

El sitio variable único presentó dos variantes, y se encontraba en la

posición 25 de la secuencia alineada. El sitio parsimónicamente informativo

se encontró en la posición 441

III.6 Diversidad de ADN entre poblaciones pre y post

Para obtener la información de la diversidad pre y post se realizaron análisis

independientes para las secuencias de las poblaciones pre y post (temporalidad)

rociamiento.

III.6.1 Análisis para poblaciones pre

Para lo que se obtuvieron 7 secuencias con 2 sitios polimórficos con un

total de 2 mutaciones y un número promedio de diferencias nucleotídicas, k:

0.571,un índice de Diversidad Haplotípica, Hd: 0.52381, un índice de

diversidad Nucleotídica, Pi(1): 0.00120, un índice de diversidad Nucleotídica

de Jukes yCantor, Pi(1)JC: 0.00120 y un valor de desviación estándar de

Pi(1)JC: 0.00054

III.6.2 Análisis para poblaciones post:

Se obtuvieron 6 secuencias con 1 sitio polímorfico el cual corresponde

a 1 mutación, el promedio de las diferencias nucleotídicas, k: 0.333, un índice

de diversidad nucleotídica, Pi(2): 0.00070, un índice de diversidad

Nucleotídica de Jukes y Cantor, Pi(2)JC: 0.00070 y un valor de desviación

estándar de Pi(2)JC: 0.00045

III.6.3 Análisis Entre poblaciones pre y post:

El número promedio de diferencias nucleotídicas entre

poblaciones fue 0.405

III.6.4 Flujo Genético y Diferenciación Genética, análisis por origen.

En este análisis solo fue posible incluir las poblaciones de Casas Viejas,

El Sillon y La Brea, debido a que el resto de poblaciones no contaban con el

número mínimo de secuencias requeridas por el mismo. Sin embargo no se

pudo realizar el análisis debido a que no existen sitios polimórficos en la región

del ITS2 para estos grupos.

40

III.7 Discusión de resultados

Estudios recientes sugieren que el ITS2 es un buen marcador a niveles sub

específico (Young y Coleman 2004; Burgués et al. 2002; Marcilla et al. 2001); sin

embargo, las diferencias que se esperaban encontrar en este estudio pueden ser

relaciones de diferenciación más reciente, por lo que no fue posible observar

diferenciación entre estas. Este marcador ha probado ser útil como reloj molecular

para la estimación de eventos recientes, proveyendo información de taxas que han

evolucionado en los últimos 50 millones de años (Mas-Coma 1999 en Bargues et al

2000), esto podría respaldar que se trata de poblaciones muy recientes que no

pudieron ser detectadas por el marcador.

III.7.1 Análisis filogeográfico

Al observar los clados formados en el análisis de agrupamiento

utilizando parámetros evolutivos, no fue posible distinguir un patrón en cuanto

al origen temporal de los especímenes (pre y post rociamiento), las

agrupaciones formadas parecen corresponder más a diferencias genéticas en

un tiempo remoto.

III.7.2 Genética de poblaciones

Aunque se observaron tres diferentes haplotipos, estos no

correspondían a una diferenciación temporal sino espacial (geográfica), que a

su vez coincidían con los clados formados en el análisis filogeográfico. En los

estadísticos de haplotípos se observó que la varianza para la diversidad

haplotípica fue de 0.02368 lo que índica muy poca variación, además la

diversidad nucleotídica registró un valor muy bajo 0.00092, lo que sugiere que

el segmento de ADN analizado es altamente constante entre las secuencias

analizadas.

En los estadísticos de secuencia se observaron valores de índices de

fijación Fst de -0.11765 y de numero efectivo de migrantes Nm de -2.38, lo

cual corresponde a valores indefinidos para estos índices (Hudson),

indicando que las características de las poblaciones analizadas, no

permitieron la estimación de flujo y diferenciación genética, lo que

probablemente indica que no hay estructuración en estas poblaciones.

41

III.7.3 Integración de análisis filogeográfico y genética de poblaciones

El estudio pretendía distinguir si las poblaciones de chinches

encontradas después del rociamiento eran o no diferentes a las encontradas

antes del rociamiento, sin embargo durante el análisis filogeográfico no hubo

una respuesta ante tal origen (ver gráfica 2), por lo que se realizó el análisis

de genética poblacional el cual respaldó la tendencia observada en el análisis

de agrupamiento (no se observó estructuración poblacional con el marcador

utilizado), estos resultados pueden deberse a más de una causa.

Las poblaciones encontradas en el domicilio después del rociamiento

son poblaciones residuales debido a deficiencias en el rociamiento.

Las sub-poblaciones externas que recolonizan las viviendas son

genéticamente idénticas a las poblaciones domiciliares: en el intento de

aclarar la hipótesis que las sub- poblaciones reinfestantes difieren de las sub-

poblaciones previas al rociamiento genéticamente, por el hecho de tratarse

de nuevas colonizaciones; surgió la pregunta “si la movilidad entre los

refugios silvestres perimetrales a las comunidades y las viviendas humanas”,

ayudaban a mantener un flujo genético constante entre estas, lo cual no

permitiría establecer diferencias entre las mismas.

En lugares como Jutiapa donde se registra la re infestación se han

observado en áreas perimetrales a las aldeas, refugios naturales para las

chinches, y estas en períodos de apareamiento y colonización se mueven a

sitios de alimentación seguros (viviendas humanas) (Schoofield, 2002;

Pentanta, 1971).

Por lo tanto se podría sugerir que el rociamiento no es un factor (o

barrera) relevante que permita observar diferencias genéticas en un período

de tiempo relativamente corto.

El marcador molecular utilizado detecta diferencias a niveles

poblacionales, sin embargo no es sensible a una escala menor, como sub-

poblaciones.

El ITS2 es un fragmento del genoma no codificante, que separa dos

segmentos de ADN que codifican para la formación de las subunidades 5.8S

y 28S de los ribosomas con funciones específicas. Por lo que, aunque el ITS2

se trata de un segmento no codificante que colinda con segmentos con

funciones específicas y esta sujeto a mayor variación, los cambios en este

42

segmento no son tan irrelevantes como podría parecer, de manera que existe

cierta tendencia a conservar las secuencias de estos, provocando que no

exista mucha variación a escalas temporales cortas, haciendo así que no se

logre encontrar diferenciación a niveles de clasificación menores al

poblacional, si las hubieran. Por lo que se concluye que no es un marcador

tan sensible para detectar variaciones entre sub poblaciones cercanas. De

manera que se recomienda realizar cruces experimentales entre las

poblaciones antes y después del rociamiento, con las poblaciones de áreas

perimetrales de las comunidades y luego aplicar técnicas fenéticas y

genéticas a la F1 para observar diferenciación en el caso que existiera.

Se observan diferencias entre las poblaciones colectadas en El

Carrizal, Valle Abajo, Copante y el resto de las poblaciones sin importar su

procedencia temporal (si se colectaron pre o post rociamiento). El Carrizal es

una población que con otras técnicas fenéticas (Bustamante, Pineda) y

genéticas (Solórzano 2004.) se ha diferenciado del resto de las poblaciones

dentro del Departamento de Jutiapa. Para el análisis de agrupamiento con

ITS2 se observo que la población de El Carrizal se coloca en un clado más

antiguo que el resto de las poblaciones lo que puede indicar que esta

población es una de las que ha sufrido menos variaciones por las

características propias del lugar. Sin embargo las poblaciones de Valle Abajo

y Copante se colocan en un clado más nuevo lo que puede estar indicando

nuevas variaciones que fueron detectadas con esta técnica.

III.7.4 Tiempo de Diferenciación

La hipótesis de la existencia de un reloj molecular asume que la

substitución de nucleótidos en una secuencia dada ocurre a un rango

constante, proveyendo un método como medida del tiempo de divergencia de

las diferencias entre dos secuencias , el cual ha sido establecido para

Triatominae, como un reloj molecular inferido del segundo espaciador interno

transcrito del ADN ribosomal nuclear de estos reduviidae, siendo estimado

este en alrededor de 0.4%- 1% de cambios en pares de bases en un millón

de años (Bargues, et al 2000, Marcilla, et al. 2001). La región de estas

repeticiones más apropiada para comparaciones a nivel de género y especie

es el ITS2 (Bargues, et al. 2002). Basado en esta hipótesis, fue posible

observar en este estudio, una sustitución lo que probablemente equivale a

43

0.02% de cambios nucleotídicos esto correspondería a una separación de

hace aproximadamente 50,000 años; Esta hipótesis tendría que verificarse

basada en futuros estudios propuestos por retro cruces ya que

probablemente brinden mayor claridad al discriminar entre grupos.

El resto de las poblaciones no muestran diferencias en las secuencias

de ITS2 lo que puede sugerir que se comparten hábitat en estas regiones

geográficas tan cercanas, tomando en cuenta que las barreras políticas no

son indicadores para la naturaleza. Por consiguiente se sugiere establecer

diferentes límites para el muestreo de las poblaciones como altitud, tipo de

vegetación (cuando sea posible), barreras naturales (ríos, montañas, etc.),

barreras artificiales (carreteras), ya que esto permitiría relacionar las

diferencias encontradas con variables que pueden controlarse un poco más ó

por lo menos conocerse.

Se integró la población de Petén en los análisis de agrupamiento, lo

que permitió observar que se separa en un clado aparte del resto de las

poblaciones de Jutiapa y se coloca además como una población ancestral,

estos resultados son compatibles con otros estudios en los que se ha incluido

a esta población (Panzera 2002, Bargues 2001; Moguel, 2006; Solorzano

2004; Diaz 2008)

44

PARTE IV

IV.1 Conclusiones

1. Al analizar por medio de espaciadores internos transcritos ITS, poblaciones

reinfestantes de Triatoma dimidiata, no fue posible distinguir un patrón en

cuanto al origen temporal de los especímenes (pre y post rociamiento), esto

pudo deberse a que son poblaciones con diferenciación muy reciente.

2. Al diferenciar molecularmente las poblaciones de T. dimidiata pre y post

rociamiento, se encontraron tres haplotipos diferentes en las secuencias

analizadas, las cuales corresponden a una diferenciación espacial; el

haplotipo uno (H1) pertenece a la población de El Carrizal, el haplotipo dos

(H2) a las diez subpoblaciones analizadas del Departamento de Jutiapa y el

haplotipo tres (H3) a las Comunidades de Valle Abajo y Copante.

3. Se intentó determinar el posible origen (residuales o nuevas infestaciones) de

las poblaciones colectadas post rociamiento, lo cual al no ser posible ya que

no se observaron diferencias entre poblaciones pre y post rociamiento; se

plantearon tres hipótesis que intentan explicar el fenómeno observado: Las

poblaciones encontradas en el domicilio después del rociamiento son

poblaciones residuales debido a deficiencias en el rociamiento, las sub-

poblaciones externas que recolonizan las viviendas son genéticamente

idénticas a las poblaciones domiciliares ó el marcador molecular ITS2 es

sensible a niveles poblacionales, no así a niveles sub-poblaciones.

4. La población de El Carrizal se diferenció claramente del resto de las

poblaciones, observándola en un clado ancentral.

5. Al observar la variación genética que existe en un solo Departamento, antes y

después de que las poblaciones fueran sometidas a rociamiento, permitió

establecer poca variación genética dentro del Departamento de Jutiapa

empleando el marcador molecular ITS2, por lo que se propone la hipótesis de

poblaciones recientes con pocas diferencias entre si y difíciles de detectar.

6. Se rechaza la hipótesis ya que no fue posible observar diferencia molecular

utilizando como marcador el ITS2, en las poblaciones de Triatoma dimidiata

colectadas antes y después del rociamiento en el Departamento de Jutiapa.

Sn embargo, se obtiene información valiosa como base para continuar con

estudios poblacionales en esta especie.

45

PARTE V IV.II Recomendaciones

1. Al analizar por medio de espaciadores internos transcritos ITS, poblaciones

reinfestantes de Triatoma dimidiata, no fue posible distinguir un patrón en

cuanto al origen temporal de los especímenes (pre y post rociamiento), esto

pudo deberse a que son poblaciones con diferenciación muy reciente. Sin

embargo es importante tomar en cuenta al utilizar la técnica de ITS2 a nivel

poblacional trabajar con por lo menos 10 individuos de cada población.

2. Se intentó determinar el posible origen (residuales o nuevas infestaciones) de

las poblaciones colectadas post rociamiento en el Departamento de Jutiapa,

lo cual al no ser posible ya que no se observaron diferencias entre

poblaciones pre y post rociamiento; se plantearon tres hipótesis que intentan

explicar el fenómeno observado: Las poblaciones encontradas en el domicilio

después del rociamiento son poblaciones residuales debido a deficiencias en

el rociamiento, las sub-poblaciones externas que recolonizan las viviendas

son genéticamente idénticas a las poblaciones domiciliares ó el marcador

molecular ITS2 es sensible a niveles poblacionales, no así a niveles sub-

poblaciones. El Departamento de Jutiapa a presentado dificultad en el control

de los triatominos debido a la reinfestación, al observar que probablemente

no existe mucha diversidad dentro del área, se recomienda continuar con los

esfuerzos de control por medio de vigilancia comunitaria y mejora de

vivienda, y respaldar este estudio muestreando a diferentes altitudes,

haciendo cruces experimentales y utilizando tanto marcadores genéticos

como fenéticos.

3. Al observar la variación genética que existe en un solo Departamento, antes y

después de que las poblaciones fueran sometidas a rociamiento, permitió

establecer poca variación genética dentro del Departamento de Jutiapa

empleando el marcador molecular ITS2, por lo que se propone la hipótesis de

poblaciones recientes con pocas diferencias entre si y difíciles de detectar.

Por lo que, si el estudio requiere diferenciar entre sub poblaciones cercanas

se recomienda hacer cruces experimentales y emplear una técnica fenética

junto a una genética para obtener resultados que permitan una mejor

diferenciación de las mismas.

46

4. Se rechaza la hipótesis ya que no fue posible observar diferencia molecular

utilizando como marcador el ITS2, en las poblaciones de Triatoma dimidiata

colectadas antes y después del rociamiento en el Departamento de Jutiapa.

Sn embargo, se obtiene información valiosa como base para continuar con

estudios poblacionales en esta especie. Por lo que se recomienda hacer un

estudio que permita la estandarización de la secuenciación de ITS2 para

triatominos en conjunto con la Universidad Mariano Gálvez, quienes poseen

el equipo, ya que esto permitiría minimizar costos, unir esfuerzos y establecer

lazos inter universitarios.

47

PARTE VI IV.III Referencias Bibliográficas

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51

PARTE IV

IV.IV ANEXO

Reacción en cadena de la Polimeraza

52

PARTE V

V.I INFORME FINANCIERO