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finanziata dallaFondazione Italiana Sclerosi Multipla

LA RICERCA SULLASCLEROSI MULTIPLA

2012

A cura diGabriele DatiArea Ricerca Scientifica AISM-FISM

Coordinamento editorialeSilvia ZinoArea Comunicazione e Ufficio Stampa AISM

Copyryght 2012Fondazione Italiana Sclerosi Multipla

Fondazione Italiana Sclerosi Multipla - OnlusVia Operai, 4016149 GenovaTel. 010 27 13 226Fax 010 27 13 [email protected]

Tutti i diritti sono riservati.è vietata la riproduzione con qualsiasi mezzo,anche se parziale, senza il permesso scritto dell’editore

Progetto graficoAxenso srl - Milano

Finito di stampare: maggio 2012Grafiche G7 – Genova

Pubblicato e distribuito daAssociazione Italiana Sclerosi Multipla - OnlusVia Operai, 4016149 Genova

ISBN 978-88-7148-063-3

INTRODUZIONE pag. 7La ricerca AISM: progetti centrati sulla persona pag. 8

CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA pag. 15

QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE pag. 67

VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS pag. 85

NUOVI METODI DIAGNOSTICI pag. 115

PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM pag. 157 Bando Ricerca FISM 2011 pag. 158Progetti Speciali 2011 pag. 163Bando Ricerca FISM 2010 pag. 166Progetti Speciali 2010 pag. 173Bando Ricerca FISM 2009 pag. 176Progetti Speciali 2009 pag. 181

PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM pag. 183Progetti finanziati prima del 2009presentati al Congresso nazionale 2012 pag. 184

COMITATO SCIENTIFICO FISM pag. 187Comitato Scientifico FISM 2011 pag. 188Comitato Scientifico FISM 2010 pag. 190 Comitato Scientifico FISM 2009 pag. 192

INTRODUCTION pag. 11AISM Research: projects focused on the person pag. 12

KNOWING THE CAUSES OF THE DISEASE pag. 15

QUALITY OF LIFE AND REHABILITATION pag. 67

VALIDATION OF NEW TARGETS/PATHWAYS pag. 85

NEW DIAGNOSTIC TOOLS pag. 115

FISM FUNDED RESEARCH PROJECTS AND FELLOWSHIPS pag. 157 FISM 2011 Call pag. 158Special Projects 2011 pag. 163FISM 2010 Call pag. 166Special Projects 2010 pag. 173FISM 2009 Call pag. 176Special Projects 2009 pag. 181

FISM FUNDED RESEARCH PROJECTS AND FELLOWSHIPS pag. 183Projects funded before 2009 and presented at FISM 2012 Annual Scientific Congress pag. 184

SCIENTIFIC COMMITTEE FISM pag. 187Scientific Commitee FISM 2011 pag. 188Scientific Commitee FISM 2010 pag. 190 Scientific Commitee FISM 2009 pag. 192

INDICE COMPENDIO 2012

indiceindex

«La missione di ogni uomo consiste nell’essere una forza della natura e non un grumo agitato di guai e di rancori che recrimina perché l’universo non si dedica a renderlo felice. Sono dell’opinione che la mia vita appartiene alla comunità e finché vivrò sarà un privilegio fare per questa quanto posso. È una sorta di torcia che brucia e che ho il compito di tenere per un breve momento. Voglio fare in modo che brilli il più possibile prima di passarla alle future generazioni». In questa lunga citazione di Bernard Shaw sta l’essenza della ricerca scientifica AISM: nasce da persone, i ricercatori, che accolgono la sfida di essere forze della natura, senza concedersi l’alibi delle difficoltà che, anche oggi, sono pesantemente imposte dalla società, dall’economia, dalla politica. I ricercatori AISM sono persone che costruiscono il presente pensando al futuro e alla comunità intera in cui vivono, considerando un privilegio la possibilità di dare il meglio di sé, in ogni campo promettente di studi, per consentire ad altre persone con SM, milioni nel mondo, di poter scegliere di vivere come forze della natura e non come grumi agitati di guai. La ricerca scientifica, in ogni caso, si fa con le intenzioni e i valori, ma soprattutto con i numeri. Ed è nei numeri che la ricerca AISM rivela la sua forza, la sua costante capacità di crescere di valore. Questo Compendio documenta come nel 2011 AISM abbia finanziato 38 Progetti di Ricerca, 7 Borse di studio, diversi Pro-getti Speciali, con un investimento complessivo nella ricerca superiore ai 6 milioni di euro. Cifre notevoli, in crescita anche rispetto al 2010: allora furono sostenuti 37 Progetti di Ricerca, 13 Borse di studio, altri Progetti Speciali con 4,3 milioni di euro. Ciò è stato reso possibile anche dai fondi garantiti dal 5 per mille: mentre la crisi economica taglia i fondi in tanti settori, i cittadini permettono e chiedono ad AISM e ai suoi ricercatori di intensificare la ricerca, riconoscendo l’efficacia dei suoi risultati.

Altri numeri ancora ci rendono orgogliosi di ciò che stiamo realizzando: dal 1987 a oggi AISM e FISM han-no finanziato in tutto 295 ricercatori sulla SM. Una vera e propria scuola, consolidata, che sta lasciando il segno a livello nazionale e internazionale. E il fatto che il 76% dei ricercatori finanziati continui a fare ricerca sulla SM dice di una forte capacità della ricerca AISM di attrarre, sostenere e accompagnare i migliori ricercatori durante tutta la propria carriera. È questo il valore che genera valore: come si parte dalla ricerca di base e si arriva alla fase della clinica, come AISM è in grado, insieme ai propri partner, di giungere a brevettare la proprietà intellettuale delle scoperte effettuate, così un giovane che miri all’eccellenza può iniziare con AISM a svolgere ricerca grazie a una Borsa di addestramento, continuare con Borse di ricerca e arrivare a condurre progetti di ricerca autonomi e rilevanti tramite Borse Senior, e infine il Programma «Costruisci una carriera nella ricerca», il Premio Rita Levi Montalcini.

Tornando ai numeri, con uno sguardo complessivo sulla distribuzione dei 3 milioni di euro investiti dal Bando di ricerca 2011 si nota che il 61,1% è stato utilizzato per ricerca fondamentale, il 16,9% ha riguar-dato la ricerca preclinica, il 12,3% la traslazionale, il 9,7% la clinica. Tutto nasce dalla ricerca di base, ma tutto deve arrivare a reali benefici per le persone con SM, che sono i veri titolari di un’Associazione come AISM e della sua ricerca scientifica. Sta qui, probabilmente, una sfida importante per la ricerca nel mondo, che nei prossimi anni potrà essere affrontata mettendosi insieme e coordinandosi sempre meglio a livello nazionale ma anche internazionale, come nei campi delle forme progressive, delle staminali o della SM pediatrica: si tratta di fare in modo che molti dei progetti scelti e finanziati “camminino” velocemente sulla scala della ricerca e, partendo dai primi gradini, arrivino fino in fondo, all’individuazione di cure e tratta-menti risolutivi. Il mondo libero dalla sclerosi multipla, il mondo in cui le persone con SM sono libere di scegliere la qualità della propria vita, oltre i vincoli imposti dalla malattia, viene generato anche dalle mete che la ricerca AISM, insieme a tutti i suoi ricercatori, sta individuando e raggiungendo, passo dopo passo.

Mario A. BattagliaPresidente FISM

INTRODUZIONE COMPENDIO 2012

introduzione

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La meta della ricerca che AISM finanzia tramite la sua Fondazione FISM è nel suo punto di partenza: le persone con sclerosi multipla hanno diritto ad avere risposte alle proprie domande, ad avere le migliori cure e i più efficaci trattamenti nel minor tempo possibile. In una parola: hanno diritto a una ricerca che cambi in meglio la vita, per tutti, una volta per tutte.

Ma cosa vuol dire oggi realizzare questi diritti?

La traduzione più attuale del valore della ricerca AISM, è probabilmente in due parole, o meglio in due strategie che sembrano vincenti. La prima è “partnership”. “Creazione di nuovi modelli operativi” è la seconda strategia fondamentale.

Nel 2011, in particolare, AISM si è fortemente impegnata nella messa a punto di nuovi modelli operativi, integrando non solo l’eccellenza della ricerca italiana, ma anche aprendo a nuovi soggetti, a nuove coo-perazioni internazionali, ancora ad altri referenti della ricerca universitaria pubblica, che possano diventare le basi per l’individuazione di nuovi target terapeutici. A questo proposito, possiamo evidenziare due esempi emblematici.

Modello di una ricerca che crea valoreTra gli studi finanziati FISM nel 2010 ve ne è uno che fa capo a Maria Pia Abbracchio, Università di Milano (vedi pagina 169): è la sorgente di un primo esempio di nuove partnership che danno valore alla ricerca AISM. Grazie al lavoro congiunto di ricercatori dell’Università di Milano, dell’Università di Pisa, del CNR e dell’Università di Torino, è stato individuato il nuovo recettore GPR17, un nuovo target per lo sviluppo di terapie innovative. Ora Università di Milano e FISM, insieme, hanno depositato un brevetto per proteggere questa ricerca e operare nel primario interesse delle persone con SM.

International Progressive Multiple Sclerosis CollaborativeEsiste, e il congresso FISM 2012 ne documenta una significativa parte, un consistente portfolio della ri-cerca finanziata FISM sulle forme progressive di sclerosi multipla. Ma questa eccellenza non basta ancora per la identificazione di terapie specifiche, e nemmeno per definire protocolli di studi clinici che misurino l’efficacia degli interventi per le forme progressive. Per accelerare, per colmare le lacune, occorreva creare un nuovo modello operativo di partnership. Solo coordinando le rispettive ricerche nell’ambito delle forme progressive, i soggetti attivi in tutto il mondo potranno mettere a fuoco cosa ancora manca e, soprattut-to, definire come investire per arrivare alle risposte attese. Ed ecco che AISM si è messa in prima linea, insieme alla nostra Federazione Internazionale MSIF e alle associazioni consorelle le MS Society di USA, Canada, Regno Unito e Olanda nella creazione dell’International Progressive Multiple Sclerosis Collabo-rative, che viene lanciato in Italia in occasione del Congresso FISM 2012. Ecco ancora evidenziato come un nuovo modello operativo di partnership tra soggetti differenti vuole indirizzare effettivamente la ricerca, massimizzando per tutti l’efficacia degli investimenti e accelerando i tempi necessari per ottenere i risultati attesi.

Conoscere le cause della malattia: fattori ambientali, geni e funzioneUno degli ambiti più promettenti per l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici è quello genetico. E questo è uno dei campi di eccellenza della ricerca finanziata FISM. Nell’agosto 2011 su Nature sono stati pubblicati gli esiti dello studio curato dall’International Multiple Sclerosis Genetics Consortium” (IMSGC) e dal “Wellcome Trust Case Control Consortium”, la cui parte italiana è stata co-finanziata da FISM tramite uno dei progetti speciali 2009 e coordinata da Sandra d’Alfonso (Università Piemonte orientale, Novara) e Filippo Martinelli Boneschi (Istituto Scientifico San Raffaele, Milano, pag. 181). Lo studio ha identificato 29 nuove varianti genetiche coinvolte nella SM, confermando l’implicazione di 23 associazioni già note. Uno dei geni di cui si è confermata l’associabilità al rischio di SM è il gene CBLB, identificato per la prima volta nel 2010 dal gruppo di Francesco Cucca (Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica, Cittadella Universitaria Monserrato - Cagliari, vedi Compendio 2010: Uno studio di associazione su tutto il genoma in Sardegna per svelare i fattori genetici predisponenti nei confronti della sclerosi multipla, pag. 27). Lo stesso gruppo ora ha effettuato determinanti passi avanti, sia a livello quantitativo che qualitativo, analizzando le varianti del gene e la loro funzione rispetto all’attivazione delle cellule del sistema immune implicate nella SM. Così pure lo studio coordinato da Umberto Dianzani e Sandra D’Alfonso (Università Piemonte Orientale - No-vara) ha indagato la funzione di altri geni nella risposta antivirale, producendo anche un nutrito numero di pubblicazioni (pagg. 20-21). La linea, a livello nazionale e internazionale sembra dunque tracciata: l’au-mento di conoscenza dei geni coinvolti nella SM e la loro correlazione funzionale con le cellule del sistema immune apre la via all’identificazione di nuovi target terapeutici anche per le forme progressive.

Allo sviluppo della SM, in particolare, sembrano concorrere diversi meccanismi uno tra questi, che apre nuove aspettative, è quello della funzione mitocondriale oligodendrocitaria (Paolo Pinton, Università di Ferrara, pagg. 30-33). Senza dimenticare che sta crescendo molto la comprensione dei fattori ambientali implicati nell’insorgenza della SM. Un esempio rappresentativo in questa direzione è lo studio internazio-nale sui fattori di rischio nella SM coordinato da Maura Pugliatti (Università di Sassari, pagg. 38-41). Si moltiplicano anche gli studi e le conferme sul virus Epstein Barr nella SM (Dianzani-D’Alfonso, Pugliatti e Giulietta Venturi, Istituto Superiore di Sanità, pagg. 20-29).

Una riabilitazione terapeutica per una vita di qualitàAISM da sempre investe direttamente sulla ricerca in riabilitazione, che svolge anche come ricerca intra-murale. Gli ultimi studi pubblicati a livello internazionale sempre di più vanno evidenziando il ruolo tera-peutico della riabilitazione, la sua potenziale implicazione nel mantenimento della plasticità neuronale. In questa direzione si possono collocare gli studi dedicati all’impatto della riabilitazione motoria e cognitiva sulle proprietà dinamiche della struttura cerebrale, verso la personalizzazione di interventi terapeutici in persone con sclerosi multipla. Non solo riabilitazione: la qualità di vita è legata fortemente anche alla co-noscenza sulla sclerosi multipla che le persone possono sviluppare con strumenti idonei, già dal momen-to della diagnosi. Forte rilevanza assumono dunque per AISM i progetti coordinati da Alessandra Solari e Andrea Giordano (Istituto di Ricerca Besta, Milano, pagg. 68-75) sul benessere fisico e psicologico e sulla partecipazione delle persone con SM alle decisioni su come affrontare al meglio la malattia. Una va-lutazione dell’ausilio informativo “Sapere migliora” è stata curata da Claudia Borreani (Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Milano, pagg. 76-79).

Nuovi target terapeutici e nuovi metodi diagnosticiGli studi qui riportati hanno evidenziato nuovi possibili bersagli terapeutici e biomarkers. Per limitarsi a un esempio, suscita interesse lo studio che ha portato Giuseppe Battaglia (IRCCS Neuromed, Camerelle, Pozzilli, Isernia, pagg. 90-93) a individuare la diretta interazione tra infiammazione e attività neuronale nei modelli sperimentali di SM e a ipotizzare il ruolo protettivo del glutammato nelle malattie infiammatorie e neurodegenerative. La sfida per l’Associazione è, ora, individuare come sia possibile validare tali bersagli e i biomarker individuati dagli studi finanziati, come si possa proseguire dalla ricerca di base alle altre im-portanti fasi di ricerca. Di particolare interesse sembra, tra i nuovi metodi diagnostici, la prosecuzione delle ricerche di Francesca Gilli, Premio Rita Levi Montalcini 2011 (Istituto di Neuroscienze della Fondazione Cavalieri Ottolenghi, Unità di Neurobiologia Clinica, Orbassano - TO): ha confermato l’azione di 7 geni coinvolti nei meccanismi immuno biologici tipici della gravidanza (pagg. 128-131), che potranno in futuro essere bersagli di terapie mirate. Ugualmente, anche gli studi di Massimo Filippi (Istituto San Raffaele, Milano, pagg. 144-149) rivelano substrati anatomici e funzionali responsabili della presenza e della gravità del deficit cognitivo in pazienti con SM, evidenziando nuovi meccanismi patogenetici. Tutto ciò in un pros-simo futuro potrebbe permettere di individuare nuove strategie farmacologiche e riabilitative. In questo ambito infine, a dimostrazione di come molti studi finanziati abbiano implicanze sulle forme progressive di SM, lo studio curato da Paolo Muraro (Imperial College, UK, London, pagg. 150-154) ha evidenziato che chi riceve la diagnosi tra 49 e 50 anni ha più probabilità di sviluppare SM secondaria progressiva e di arrivare ad alti livelli di disabilità rispetto a chi ha esordio di malattia a 20 anni.

Il vero capitale umano di AISM: i giovani ricercatoriTra i ricercatori finanziati e rappresentati in questo Compendio c’è anche il vincitore del Premio Rita Levi Montalcini 2012, che verrà premiato al Congresso FISM del 30 maggio 2012. È un ricercatore molto gio-vane che, pur avendo da poco iniziato il suo percorso di ricerca nella sclerosi multipla, ha già sviluppato un rilevante “publication record”. Questo è ciò che fortemente desidera la ricerca AISM: valorizzare quello straordinario capitale umano che sono i giovani ricercatori, come dice la stessa Professoressa Montalcini, Presidente onorario di AISM. Vale per quelli che vincono il Premio a lei intitolato, ma anche per coloro che possono rispecchiarsi per età, passione e competenza nei vincitori. Insieme ai ricercatori senior, da tempo preziosi per la ricerca italiana e internazionale sulla SM, sapranno sempre di più fare la differenza in un campo di ricerca dove l’Italia è ai vertici mondiali. È l’investimento sull’eccellenza dei giovani ricercatori la vera speranza per le persone con SM, che all’AISM guardano da sempre con la fiducia di chi sa che si sta giorno dopo giorno conquistando la liberà dalla sclerosi multipla.

Paola ZaratinDirettore Ricerca Scientifica AISM-FISM

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Ricerca AISM: progetti centrati sulla persona

«The mission of every man consists in being a force of nature and not an agitated clot of troubles and grudges that recriminates because the universe doesn’t devote itself to making him happy. I am of the opinion that my life belongs to the community and as long as I live it will be a privilege to do as much as I am able to for it. It is a sort of burning torch that I have the task to hold for a brief moment. I want to make it shine as much as possible before passing it on to future generations». In this long quotation from George Bernard Shaw there lies the essence of AISM scientific research: it is born of people, researchers, who welcome the challenge to be forces of nature, without allowing themselves the alibi of the difficulties that, today too, are heavily imposed by society, by the economy and by politics. The AISM researchers are people that build the present thinking about the future and the whole community in which they live, considering it a privilege to be allowed to give the best of themselves, in every promising field of studies, to allow other people with MS, millions around the world, to be able to choose to live as forces of nature and not as agitated clots of troubles. Scientific research, in any case, is done with intentions and values, but above all with figures. And it is in the figures that AISM research reveals its strength, its constant abi-lity to grow in value. This Compendium documents how in 2011 AISM financed 38 research projects, 7 fellowships, and various special projects, with a general investment in the research of over 6 million euros. These are important figures, which have also grown compared to 2010: at that time 37 research projects were supported, 13 fellowships, and other special projects with 4.3 million euros. This was also made possible by the 5 per thousand funds set aside on people’s tax declarations: while the economic crisis cuts funds in so many sectors, citizens allow and indeed ask AISM and its researchers to intensify their research, recognizing the effectiveness of its results.

Other numbers too make us proud of what we are achieving: since 1987 AISM and FISM have financed in all 295 researchers on MS. A true school, a consolidated one, which is leaving a mark at a national and an international level. And the fact that 76% of the researchers financed continue to do research on MS points to the major capacity of AISM research to attract, support and accompany the best researchers during their whole career. This is value that generates value: how one starts from basic research and arrives at the clinical phase, how AISM is able, together with its partners, to succeed in patenting the intellectual property of the discoveries made, so a young person that aims at excellence can begin with AISM to develop research thanks to a training grant, continue with research grants and go on to conduct autonomous and remarkable research projects through Senior Grants, and lastly the Programme called “Build a career in research”, the Rita Levi Montalcini Prize.

Returning to the figures, with an overall look at the distribution of the 3 million euros invested by the 2011 Research Funds, we see that 61.1% was used for fundamental research, 16.9% concerned pre-clinical research, 12.3% translational, and 9.7% clinical research. Everything starts from basic research, but everything has to attain real benefits for people with MS, that is to say the true bosses of an association like AISM and its scientific research. Here, probably, there is an important challenge for research in the world, which in the next few years can be faced by getting together and coordinating research better and better at a national but also at an international level, as in the fields of progressive forms, histamines, stem cells or paediatric MS: we have to make sure that many of the projects selected and financed move quickly up the staircase of research and, starting from the first steps, go all the way, to identification of therapies and decisive treatments. A world free of multiple sclerosis, a world in which people with MS are free to choose the quality of their own lives, over and above the constraints imposed by the illness, is also produced by the goals that AISM research, together with all its researchers, is identifying and attaining, step by step.

Mario A. BattagliaFISM Chairman

INTRODUCTION TO THE COMPENDIUM 2012

introduction

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The research goal that AISM finances through its FISM Foundation is in its starting point: people with multiple sclerosis have the right to get answers to their questions, to have the best therapies and the most effective treatments in the shortest possible time. In a word, they have the right to research that changes life for the better, for everybody, once and for all.

But what does enacting these rights mean today?

The most up-to-date translation of the value of AISM research is probably in two words, or more exactly in two strategies that seem to be winning ones. The first is ‘partnership’. ‘Creation of new operational models’ is the second fundamental strategy.

In 2011, in particular, AISM was strongly committed to setting up new operational models, not only inte-grating the excellence of Italian research, but also opening up to new people and bodies, to new forms of international cooperation, as well as to other people involved in public university research, that can become the bases for the identification of new therapeutic targets. In this connection, we can underline two symbolic examples.

Model of research that creates valueAmong the FISM studies financed in 2010 there is one that is headed by Maria Pia Abbracchio, University of Milan (see page 169): this is the source of a first example of a new partnership that gives value to AISM research. Thanks to the joint work of researchers at Milan University, Pisa University, the National Researc Council and Turin University, the new receptor GPR17 was identified, a new target for the development of innovative therapies. Now Milan University and FISM have together deposited a patent to protect this research, and to operate in the primary interest of people with MS.

International Progressive Multiple Sclerosis CollaborativeThere exists, and the FISM 2012 congress documents a significant part of it, a big portfolio of FISM finan-ced research on progressive forms of multiple sclerosis. But this excellence is not yet enough to identify specific therapies, or even to define protocols of clinical studies that measure the effectiveness of actions for progressive forms. To accelerate, to fill the gaps, it was necessary to create a new operational model of partnership. Only by coordinating the respective researches within progressive forms can the bodies active all over the world bring into focus what is still missing and, above all, define how to invest in order to attain the desired answers. And so AISM got in the front line, together with our International MSIF Fede-ration and the sister associations, the MS Societies of USA, Canada, United Kingdom and Holland in the creation of the International Progressive Multiple Sclerosis Collaborative, which was launched in Italy on the occasion of the FISM 2012 Congress. Here once again we see how a new operational model of part-nership between different bodies aims to give research an effective orientation, maximizing for everyone the effectiveness of the investments and shortening the time necessary to get the desired results.

Knowing the causes of the illness: environmental factors, genes and functionOne of the most promising spheres for the identification of new therapeutic targets is genetics. And this is one of the fields of excellence of FISM financed research. In August 2011 “Nature” published the results of the study handled by the International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC) and by the Well-come Trust Case Control Consortium, the Italian part of which was co-financed by FISM through one of the 2009 special projects and coordinated by Sandra D’Alfonso (University of Eastern Piedmont, Novara) and Filippo Martinelli Boneschi (San Raffaele Scientific Institute, Milan, page 181). The study identified 29 new genetic variants involved in MS, confirming the implication of 23 already known associations. One of the genes which it was confirmed may be associated with the risk of MS is the CBLB gene, first identified in 2010 by the group of Francesco Cucca (Institute for Genetic and Biomedical Research, Monserrato University Citadel - Cagliari, see Compendium 2010: An association study on the whole genome in Sar-dinia to reveal the predisposing genetic factors towards multiple sclerosis, page 27). The same group has now made decisive steps forward, both at a quantitative and at a qualitative level, analyzing the gene variants and their function in relation to the activation of the cells of the immune system implicated in MS. Then the study coordinated by Umberto Dianzani and Sandra D’Alfonso (University of Eastern Piedmont, Novara) has investigated the function of other genes in antiviral response, also producing a large number of publications (pp. 20-21). Thus at a national and an international level the line seems to be traced out: an increase in knowledge of the genes involved in MS and their functional correlation with the cells of the immune system opens up the way to identification of new therapeutic targets, for progressive forms too.

The development of MS, in particular, seems to involve different mechanisms. One of these, which opens up new expectations, is that of oligodendrocytal mitochondrial function (Paolo Pinton, University of Fer-rara, pp. 30-33). It must also be mentioned that there is increasing understanding of the environmental factors implicated in the onset of MS. A representative example in this direction is the international study on risk factors in MS coordinated by Maura Pugliatti (University of Sassari, pp. 38-41). There is also an increase in studies and confirmations on the Epstein Barr virus in MS (Dianzani-D’Alfonso, Pugliatti and Giulietta Venturi, Higher Institute of Health, pp. 20-29).

Therapeutic rehabilitation for quality lifeAISM has always directly invested in research on rehabilitation, which it also carries out as intramural rese-arch. The latest studies published at an international level are highlighting more and more the therapeutic role of rehabilitation, and its potential involvement in the maintenance of neuronal plasticity. This is the direction of studies devoted to the impact of motor and cognitive rehabilitation on the dynamic properties of the cerebral structure, in view of personalization of therapeutic actions in people with Multiple Sclerosis. Not only rehabilitation: the quality of life is also closely linked to knowledge of multiple sclerosis that people can develop with appropriate tools, right from the time of diagnosis. Therefore of major importance for AISM are the projects coordinated by Alessandra Solari and Andrea Giordano (Besta Research Institute, Milan, pp. 68-75) on physical and psychological wellbeing and on the participation of people with MS in decisions on how best to face the illness. An evaluation of the information aid ‘Knowing improves’ has been drawn up by Claudia Borreani (IRCCS Foundation National Tumour Institute, Milan, pp. 76-79).

New therapeutic targets and new diagnostic methodsThe studies published here have underlined new possible therapeutic targets and biomarkers. Just to give one example, of great interest is the study that has led Giuseppe Battaglia (IRCCS Neuromed, Ca-merelle, Pozzilli, Isernia, pp. 90-93) to identify the direct interaction between inflammation and neuronal activity in experimental models of MS and to hypothesize the protective role of glutamate in inflammatory and neurodegenerative illnesses. The challenge for the association now is to identify how it is possible to validate such targets and the biomarkers identified by the financed studies, and how it is possible to continue from the basic research to the other important phases of research. It seems to be of particular interest, among the new diagnostic methods, to continue the researches of Francesca Gilli, 2011 Rita Levi Montalcini Prize (Institute of Neurosciences of the Cavalieri Ottolenghi Foundation, Clinical Neuro-biology Unit, Orbassano, Turin): it has confirmed the action of 7 genes involved in the immuno-biological mechanisms typical of pregnancy (pp. 128-131), which in future can be the targets of specific therapies. Likewise, the studies by Massimo Filippi (San Raffaele Institute, Milan, pp. 144-149) reveal anatomical and functional substrata responsible for the presence and gravity of the cognitive deficit in patients with MS, highlighting new pathogenic mechanisms. In the near future all this could make it possible to identify new pharmacological and rehabilitative strategies. Lastly, in this sphere, showing how many financed studies have implications for progressive forms of MS, the study by Paolo Muraro (Imperial College, London, UK, pp. 150-154) has stressed that those who are diagnosed between 49 and 50 have a higher probability of developing progressive secondary MS and reaching high levels of disability compared to those whose illness starts at 20.

The true human capital of AISM: the young researchersAmong the financed researchers represented in this Compendium there is also the winner of the 2012 Rita Levi Montalcini Prize, which will be given at the FISM Congress on 30 May 2012. This is a very young researcher that, though having only recently begun to do research on multiple sclerosis, already has a major “track record” regarding publications. This is what AISM research greatly desires: valorising that remarkable human capital that is formed by young researchers, as Professor Montalcini, Honorary President of AISM, herself says. It is valid for those that win the prize named after her, but also for those people that for age, passion and competence can mirror themselves in the winners. Together with the senior researchers, who have always been precious for Italian and international research on MS, they will succeed more and more in making the difference in a field of research in which Italy is one of the world leaders. In investment in the excellence of young researchers lies the true hope for people with MS, who have always looked to AISM with the trust of those who know that, day by day, freedom from multiple sclerosis is being achieved.

Paola ZaratinAISM-FISM Scientific Research Director

AISM Research: projects focused on the person

conoscerele causedella malattia

ASSOCIAZIONE FRA GENI E AMBIENTE NELLA SCLEROSI MULTIPLA

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CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIA

CONCLUSIONI

Il Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis può essere considerate un patogeno ambientale in quanto è la causa della Paratubercolosi nei ruminanti, infetta numerosi animali monogastrici inclusi i primati e l’uomo e si trova con alta frequenza nell’ambiente e negli alimen-ti, soprattutto il latte. Possiamo ipotizzare che attraverso un processo di mimetismo molecolare il MAP possa fungere da agente scatenante la malattia in soggetti geneticamente predisposti.Si dovrebbe investigare se anticorpi anti-MAP2694 che cross reagiscono con il TCR dei linfociti T γδ possano portare a una deplezione delle stesse cellule precipitando gli eventi che portano alla MS.

LINKING GENES AND ENVIRONMENT IN MULTIPLE SCLEROSIS

INTRODUCTION AND AIMS

The etiology of multiple sclerosis (MS) is still unknown but is believed to be a multifactorial disease, determined by the combined action of different genetic variants in the presence of ex-posure to environmental triggers /permissive. The aim of this pilot study was to assess whether Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP, a bacterium responsible of Paratuber-culosis in ruminants which is widely disseminated in the environment) and Epstein-Bar Virus, could be among the possible candidates among the causative (non genetic) factors involved in the etiology of MS. The study wanted to see if more than one environmental factor may be associated to the disease in Sardinia. In future the same factors could be investigated if are necessary to trigger (or precipitate) the autoimmune response in genetically predisposed indi-viduals.

RESULTS This is a pilot study with limited financial resources. The little resources available were used to purchase the necessary reagents for research and support a short fellowship for a young rese-archer. In collaboration with the invaluable collaboration of Professor Maria Giovanna Marrosu and Dr. Eleonora Cocco of the University of Cagliari, we conducted two studies. In the first, 50 MS patients and 57 ethnically and demographically comparable controls free from any immu-nomodulatory or immunosuppressive drugs for at least 6 months were involved. We wanted to search, in addition to the presence of specific MAP DNA in the blood of the people involved in the study, if MAP proteins could mimic human proteins expressed in the CNS. For this, a Blast P analysis was performed and the MAP gene encoding the MAP2694 was identified. The pro-tein MAP 2694 is a species-specific transmembrane protein retained in the family Mycobacte-riaceae. The gene has been cloned and the expressed protein of about 78.5 kDa (the fusion proteins MBP of 42.5 kDa and the 36-kDa MAP2694) was used to search a humoral response in the plasma of the people involved in the study. Thirty-two percent of MS patients, but only 2% of healthy controls, also harbored Abs recognizing the MAP2694 protein, which displays a 33% homology with the C region of the T-cell receptor (TCR) γ chain expressed by γδ T cells. The γδ Tcell subset patrols gut epithelial barriers and has been called into question in clearing infectious pathogens, most notably mycobacteria. As depletion of γδ T cells in murine models of experimental autoimmune encephalomyelitis leads to disease development or exacerbation, we proposed that anti-MAP2694 Abs may cross-react with the γδ TCR, possibly leading to γδ T-cell depletion triggering increased MS susceptibility. In a second study, the number of MS patients studied was increased to 119 and 117 controls. The specie-specific MAP IS900 DNA was searched in the blood of MS patients and controls. In addition, we identified, cloned and purified a protein (MAP FprB) homologous to the human protein myelin P zero (P0) (NP_000521.2). Antibodies against this protein have been also sear-ched in the blood of patients with MS.On the same samples was also sought Epstein Barr Virus DNA (EBV) which has been asso-

RESPONSABILE DEL PROGETTOLEONARDO A. SECHIProfessore ordinarioDipartimento di Scienze Biomediche, Università di Sassari

Collaboratori:DAVIDE COSSUSPERANZA MASALADANIELA PACCAGNINI

Collaborazioni con altri gruppi:ELEONORA COCCO, MARIA GIOVANNA MARROSU, Università di Cagliari

PREMESSE E OBIETTIVI

L’eziologia della sclerosi multipla (SM) è a tutt’oggi sconosciuta, ma si ritiene che sia una pato-logia multifattoriale, determinata dall’azione combinata di diverse varianti genetiche in presenza di un’esposizione a fattori ambientali scatenanti/permissivi.Scopo dello studio pilota era quello di verificare se il Mycobacterium avium subsp. paratu-berculosis (MAP, un batterio patogeno causa della Paratubercolosi nei ruminanti, largamente disseminato nell’ambiente), ed il virus di Epstein-Bar potevano essere essere fra i principali candidati tra i fattori non ereditabili associati alla SM in Sardegna. Lo studio voleva verificare se più di un fattore ambientale fosse necessario per scatenare la risposta autoimmune in individui geneticamente predisposti.

RISULTATI

Si tratta di uno studio pilota le cui risorse sono state utilizzare per acquistare i reagenti neces-sari alla ricerca e supportare una piccola borsa per un giovane ricercatore In collaborazione con la prof. Maria Giovanna Marrosu e la dott.ssa Eleonora Cocco dell’Università di Cagliari abbiamo portato avanti due studi. Nel primo, sono stati coinvolti 50 pazienti con SM e 57 controlli etnicamente e demograficamente confrontabili liberi da qualsiasi farmaci immunomo-dulatori o immunosoppressivi per almeno 6 mesi. Abbiamo voluto ricercare oltre alla presenza di MAP anche geni del batterio che fossero in comune con il repertorio di geni espressi nel SNC umano. Dopo analisi Blast P, abbiamo identificato il gene codificante per la MAP2694. La proteina MAP 2694 è una specie-specifica proteina transmembrana conservato nella famiglia Mycobacteriaceae. Il gene è stato clonato e la proteina espressa di circa 78,5 kDa (la proteine di fusione MBP di 42,5 kDa e la MAP2694 di 36 kDa. Abbiamo inoltre osservato la presenza di DNA MAP specifico mediante IS900 PCR. In entrambi i casi una risposta più elevata statistica-mente significativa è stata riscontrata nei pazienti MS rispetto ai controlli ( 32% dei pazienti con SM rispetto al 2% dei controlli).La proteina MAP2694 ha un’omologia del 33% con la regione C del recettore della cellula T (TCR) catena γ espressa nelle cellule T γδ. Le cellule T γδ pattugliano la barriera epiteliale inte-stinale e sono importanti per il controllo di agenti patogeni infettivi, in particolare micobatteri. È stato visto inoltre che la deplezione delle cellule T γδ in modelli murini EAE porta rapidamente allo sviluppo e/o esacerbazione della malattia. In un secondo studio il numero dei pazienti MS studiati è stato portato a 119 e 117 controlli. Il DNA IS900 specie specifico di MAP è stato ricercato nel sangue dei pazienti con MS e nei controlli. Inoltre, abbiamo identificato, clonato e purificato un’ulteriore proteina di MAP (Mappa FprB) omologa alla proteina umana mielina P zero (P0) (NP_000521.2). Gli anticorpi contro questa proteina sono stati ricercati nel sangue dei pazienti con SM. Sugli stessi campioni è stato ricercato anche il DNA del virus di Epstein (EBV) che è stato recentemente spesso associato alla MS. Anche in questo caso la presenza del virus è stata ritrovata con una differenza statisticamente significativa nei pazienti con MS ri-spetto ai controlli. Tutti gli obiettivi di partenza del progetto pilota sono stati raggiunti e la ricerca merita senz’altro di essere proseguita aprendo nuovi scenari nei fattori che possono concorrere al precipitare della malattia.

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ciated with MS. Also in this case the presence of virus was found with a statistically significant difference in MS patients in comparison to controls.All initial objectives of the pilot project have been achieved and the research clearly deserve to be continued opening new scenarios in the factors that may contribute to worsening of the disease.

CONCLUSIONS Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis can be considered an environmental pa-thogen as it is the cause of Paratuberculosis in ruminants, it infects numerous monogastric animals including primates and humans and it is found with high frequency in the environment and in foods, especially milk. We may hypothesize that through a process of molecular mimicry, MAP can act as agent for triggering disease in genetically predisposed individuals.The possibility that anti-MAP2694 Abs may cross-react with the γδ T-cells, possibly leading to γδ T-cell depletion triggering MS susceptibility needs to be explored.

PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONVEGNI

Cossu D, Masala S, Cocco E, Paccagnini D, Frau J, Marrosu MG, Sechi LA. Are Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and Epstein-Barr virus triggers of multiple sclerosis in Sardinia? Mult Scler. 2012 Jan 19. [Epub ahead of print] PMID: 22261119

Sechi LA. MAP e Salute Pubblica. Seminario su invito “Paratubercolosi: prospettive per la sanita’ animale e per la salute pubblica”. Roma - Ministero della Salute – 10 novembre 2011

Sechi LA. Il Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis, un commune denominatore per il morbo di Crohn, diabete di tipo 1 e sclerosi multipla?. Lettura su invito al 39 Congresso Nazionale di Microbiologia. Riccione 3-6 ottobre 2011

Cossu D, Cocco E, Paccagnini D, Masala S, Ahmed N, Frau J, Marrosu MG e Sechi LA. Asso-ciation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis with 1 Multiple Sclerosis in Sardinian patients. PLoS ONE , 6(4): e18482. doi:10.1371/journal.pone.0018482 published 13 April 2011

PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 per un periodo di 1 anno - 25.000 €

RICERCA DI MARCATORI COINVOLTI NELLO SVILUPPO DELLA SCLEROSI MULTIPLA: CORRELAZIONE DI ALTERAZIONI GENETICHE E FUNZIONALI DELL’IMMUNITÀ CELLULO-MEDIATA CON MARCATORI DELL’INFEZIONE DA EBV

RESPONSABILE DEL PROGETTOUMBERTO DIANZANIProfessore di Immunologia Dipartimento di Scienze della Salute Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Novara

Co-Responsabile del progettoSANDRA D’ALFONSOProfessore di Genetica Medica Dipartimento di Scienze della Salute Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Novara

Collaboratori:ANNALISA CHIOCCHETTIRICCARDO MESTURINIELENA BOGGIOLUCA GIGLIOTTIGIUSEPPE CAPPELLANOELISABETTA ORILIERISARA BOCCANADIA BARIZZONELAURA BERGAMASCHILUCIA CORRADOMAURIZIO LEONECRISTOFORO COMI

Collaborazioni con altri gruppi:MARCO SALVETTI Sapienza Università di Roma, Neurologia e Centro Neurologico Terapie SperimentaliDipartimento di Neuroscienze, Salute Mentale e Organi di Senso, Roma


Il progetto ha ricercato alterazioni geniche e funzionali della risposta immunitaria coinvolte nello sviluppo della sclerosi multipla (SM), focalizzandosi su geni e funzioni coinvolte nella risposta antivirale e nello spegnimento della risposta immunitaria e ricercando correlazioni con marca-tori della infezione da virus di Epstein Barr (EBV). Infatti dati epidemiologici suggeriscono che EBV possa essere un fattore scatenante della SM e che le basi genetiche della malattia siano complesse e coinvolgano l’interazione di molteplici loci genetici capaci di influenzare la risposta immunitaria. Il progetto nasce da nostri studi precedenti che hanno dimostrato che lo sviluppo di SM può essere favorito da variazioni geniche che riducono l’efficacia della risposta immuni-taria citotossica antivirale e dei meccanismi di spegnimento della risposta immunitaria; entram-bi questi difetti possono ritardare l’eliminazione delle infezioni virali e/o prolungare la risposta immune anti-virale favorendo così lo sviluppo di cross-reazioni tra antigeni virali e antigeni self con un meccanismo di “mimetismo molecolare”. È interessante notare che variazioni deleterie di alcuni di questi geni (Fas, osteopontina, perforina, ICOS) sono anche coinvolti nello sviluppo di malattie ereditarie monogeniche, come la sindrome autoimmune linfoproliferativa (ALPS), la linfoistiocitosi emofagocitica familiare (FHL) e la immunodeficienza comune variabile (CVID), caratterizzate da linfoproliferazione (e possibile autoimmunità) dovuta a un difetto nella risposta anti-virale o nello spegnimento della risposta immune.

RISULTATI

Abbiamo esplorato il ruolo di degli alleli HLA-A*02,HLA-Cw*05 e MOG-142 nella modulazione del rischio per SM in 1273 pazienti con SM e 1075 controlli. A*02 conferiva una forte prote-

zione nei confronti di SM indipendentemente da DRB1*15,Cw*05 e MOG-142. La presenza di Cw*05 incrementava significativamente la protezione osservata nel gruppo HLA-A*02+. Estesa l’analisi agli alleli HLA-B*44 e -B*18 in 1445 pazienti e 973 controlli e in una coorte britannica di 721 pazienti con SM, 408 controlli e 480 trio familiari, sono stati identificati due effetti protettivi indipendenti tra loro e da DR15,identificati rispettivamente da A*02-Cw*05- B*44 e da A*02.Abbiamo partecipato a uno studio di replica di 12 nuovi loci di suscettibilità per SM identificati in recenti studi GWAS. I risultati confermano l’associazione per tutti i geni eccetto KIF1B. Abbia-mo replicato l’associazione del gene CBLB in una popolazione di 1435 pazienti italiani e 1466 controlli. Infine abbiamo confermato queste associazioni in un GWAS collaborativo eseguito su 9772 pazienti ottenuti da 15 diverse nazioni europee. L’analisi dei geni di IFIH1, Munc13-4, syntaxina-11, SAP, XIAP, TACI, AIRE e FOXP3 non ha identificato nessuna variazione associata a SM. Tuttavia abbiamo identificato variazioni dei geni di Munc13-4 e SAP associate alla ALPS e una variazione del gene di XIAP associata alla febbre Periodica Idiopatica. IL-17 è coinvolta nella patogenesi di SM e varianti del gene di ICOS sono associate a SM. La stimolazione di ICOS induce una potente secrezione di IL-17A e IL-10 nei linfociti T helper derivati da controlli sani, mentre induce IL-17A ma non IL-10 nelle cellule ottenute da pazienti con SM. Ciò è in parte ascrivibile alle varianti del gene di ICOS associate alla SM e all’effetto funzionale che ICOS esercita sulle cellule dendritiche attraverso la stimolazione del suo ligando B7h. Abbiamo descritto come una difettosa funzione di Fas e una iperespressione della citochina osteopon-tina sono coinvolte nello sviluppo di SM. Abbiamo dimostrato che il difetto di Fas è anche coinvolto nello sviluppo della Polineuropatia Infiammatoria Cronica Demielinizzante, mentre la iperespressione di osteopontina è anche coinvolta nella malattia di Alzheimer. L’analisi dei livelli sierici degli anticorpi contro l’antigene nucleare di EBV (EBNA) in 258 pazienti con SM e 125 controlli ha evidenziato una maggiore percentuale di soggetti anti-EBNA+ e livelli più elevati di questi anticorpi nei pazienti. Abbiamo inoltre trovato una correlazione tra livelli di anti-EBNA e varianti dei geni di SAP, IL7Ra e CD6.Infine abbiamo calcolato una misura aggregata del rischio per SM sulla base di 26 loci di suscettibilità genetica e dei livelli di anticorpi sierici anti-EBV; questa analisi ha identificato un progressivo incremento (da 2.91 a 9.2 volte) del rischio di SM con l’aumento nel numero dei fattori di rischio genetico, con un ulteriore incremento legato alla inclusione dei livelli di anticorpi sierici anti-EBNA.

CONCLUSIONI

Questi dati suggeriscono che varianti di alcuni geni coinvolti nella risposta anti-virale possono influenzare lo sviluppo di SM e di altre malattie autoimmuni e confermano una possibile rela-zione tra infezione da EBV e sviluppo di SM. Le variazioni genetiche e l’infezione da EBV sem-brano contribuire indipendentemente alla suscettibilità a SM senza una interazione evidente.

SEARCH FOR MARKERS INVOLVED IN DEVELOPMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS: CORRELATION OF GENETIC AND FUNCTIONAL ALTERATIONS OF CELL-MEDIATED IMMUNITY WITH MARKERS OF EBV INFECTION


This project searched for genes and functional alterations of the immune response playing a role in multiple sclerosis (MS) development focusing on genes and functions involved in the antiviral response and the immune response switching off, and analysing correlations with markers of Epstein Barr virus (EBV). Epidemiological data, indeed, suggest that a MS envi-ronmental trigger may be EBV, and genetic basis is complex involving interactions of multiple loci influencing the immune response. The project stems from our previous data showing that MS development may be favoured by gene variations impairing cell-mediated cytotoxicity and 20 21


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the immune response switching off; both defects may delay clearance of the infection and/or prolong the immune response and thus favour cross-reactions between viral and self antigens by “molecular mimicry”. Intriguingly, deleterious variations of some of these genes (i.e. Fas, osteopontin, perforin, and ICOS) are also involved in inherited monogenic diseases with lym-phoproliferation (and possibly autoimmunity) due to defective anti-viral response or impaired immune response switching off, i.e autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS), familial hemophagocytitc lymphohistiocytosis (FHL), and common variable immunodeficiency (CVID).

RESULTS We explored the role of HLA-A*02, HLA-Cw*05 and MOG-142 in modulating the MS risk in 1273 MS patients and 1075 controls. A*02 conferred a strong MS protection independently of DRB1*15, Cw*05 and MOG-142. Presence of Cw*05 significantly enhanced the protection in the HLA-A*02-positive group. Moreover, we extended the analysis to HLA-B*44 and -B*18 in 1445 patients and 973 controls and in a UK cohort (721 MS patients, 408 controls, and 480 family trios). We identified at least two independent protective effects, independent of DR15, which were tagged by A*02-Cw*05- B*44 and A*02, respectively.We participated to a replication study of 12 novel MS loci identified in recently published GWAS studies. Results confirmed the association for all genes except for KIF1B. Moreover, we repli-cated the association of the CBLB gene in a population of 1435 Italian patients and 1466 con-trols. Finally, we confirmed all these association in a collaborative GWAS involving 9772 cases of European descent from 15 countries.Analysis of the IFIH1, Munc13-4, syntaxin-11, SAP, XIAP, TACI, AIRE, and FOXP3 genes did not detect MS-associated variations. However, we found Munc13-4 and SAP gene variations associated with Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome (ALPS), and a XIAP variation associated with Idiopatic Periodic Fever.IL-17 is involved in MS pathogenesis and variants of the ICOS gene are associated with MS. We found that ICOS triggering induced potent secretion of IL-17A and IL-10 in T helper cells from healthy controls, but it induced IL-17A but not IL-10 in those from MS patients. This difference was partly ascribable to the ICOS genetic variants associated with MS and to the functional effect that ICOS exerts on dendritic cells by triggering its ligand B7h. These data are intriguing since IL-17 and IL-10 exert opposite effect on the autoimmune response in MS.We previously reported that defective Fas function and osteopontin hyperexpression are invol-ved in development of MS. Now, we found that the former is also involved in Chronic Inflam-matory Demyelinating Polyneuropathy and the latter in Alzheimer disease.We analysed the serum levels of antibodies to the EBV nuclear antigen (EBNA) in 258 MS patients and 125 controls. We observed a higher percentage of anti-EBNA+ individuals and a higher anti-EBNA concentrations in the patients. We found a correlation of the anti-EBNA levels with variants of the SAP, IL7Ra, and CD6 genes. We calculated an aggregate measure of risk of MS based on 26 genetic susceptibility loci and the anti-EBV serum levels. We observed a progressive increase of the OR with the increasing number of genetic risk factors, further en-hanced by inclusion of the anti-EBNA levels (OR ranging from 2.91 to 9.2).

CONCLUSIONS These data suggest that variants of some genes involved in the anti-viral response may influen-ce development of MS and other autoimmune diseases, and confirmed a possible relationship between EBV infection and MS development. Genetic variations and EBV infection seem to contribute independently to MS susceptibility without an evident interaction.

PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI

Boggio E, Melensi M, Bocca S, Chiocchetti A, Comi C, Clemente N, Orilieri E, Soluri MF, D’Alfonso S, Mechelli R, Gentile G, Poggi A, Salvetti M, Ramenghi U, Dianzani U. The -346T polymorphism of the SH2D1A gene is associated with development of autoimmunity/lymphoproliferation in males with defective Fas function. Hum Immunol. In press 2012

International Multiple Sclerosis Genetics Conssortium (IMSGC): Esposito F, Patsopoulos NA, Ce-pok S, Kockum I, Leppä V, Booth DR, Heard RN, Stewart GJ, Cox M, Scott RJ, Lechner-Scott J, Goris A, Dobosi R, Dubois B, Rioux JD, Oturai AB, Søndergaard HB, Sellebjerg F, Sørensen PS, Reunanen M, Koivisto K, Cournu-Rebeix I, Fontaine B, Winkelmann J, Gieger C, Infante-Duarte C, Zipp F, Bergamaschi L, Leone M, Bergamaschi R, Cavalla P, Lorentzen AR, Mero IL, Celius EG, Harbo HF, Spurkland A, Comabella M, Brynedal B, Alfredsson L, Bernardinelli L, Robertson NP, Hawkins CP, Barcellos LF, Beecham G, Bush W, Cree BA, Daly MJ, Ivinson AJ, Aubin C, Compston A, D’Alfonso S, Haines JL, Hauser SL, Hemmer B, Hillert J, McCauley JL, Oksenberg J, Olsson T, Palotie A, Peltonen L, Pericak-Vance MA, Saarela J, Sawcer SJ, Stranger B, Boneschi FM, Comi G, Hafle DA, de Bakker PI, De Jager PL.. IL12A, MPHOSPH9/CDK2AP1 and RGS1 are novel multiple sclerosis susceptibility loci. Genes Immun 11:397-405, 2011

Corrado L, Bergamaschi L, Barizzone N, Fasano ME, Guerini FR, Salvetti M, Galimberti D, Be-nedetti MD, Leone M, D’Alfonso S. Association of the CBLB gene with multiple sclerosis: new evidence from a replication study in an Italian population. J Med Genet 48:210-1, 2011

Bergamaschi L, Ban M, Barizzone N, Leone M, Ferrante D, Fasano ME, Guerini FR,Corrado L, Nal-di P, Dametto E, Agliardi C, Salvetti M, Mechelli R, Galimberti D, Scarpini E, Cavalla P, Bargiggia V, Caputo D, Cordera S, Monaco F, Momigliano-Richiardi P, D’Alfonso S. Association of HLA class I markers with multiple sclerosis in the Italian and UK population: evidence of two independent protective effects. J Med Genet 48:485-92, 2011

International Multiple Sclerosis Genetics Consortium. Leppa V, Surakka I, Tienari PJ, Elovaara I, Compston A, Sawcer S, Robertson N, De Jager PL, Aubin C, Hafler DA, Oturai AB, Bach Sønder-gaard H, Sellebjerg F, Soelberg Sørensen P, Hemmer B, Cepok S, Winkelmann J, Wichmann HE, Comabella M, Bustamante MF, Montalban X, Olsson T, Kockum I, Hillert J, Alfredsson L, Goris A, Dubois B, Mero IL, Smestad C, Celius EG, Harbo HF, D’Alfonso S, Bergamaschi L, Leone M, Ristori G, Kappos L, Hauser SL, Cournu I, Fontaine B, Boonen S, Polman C, Palotie A, Peltonen L, Saarela J.The genetic association of variants in CD6, TNFRSF1A and IRF8 to multiple sclerosis: a multicenter case-control study. PLoS One, 6:e18813, 2011

International Multiple Sclerosis Genetics Consortium; Wellcome Trust Case Control Consortium 2, Sawcer S, Hellenthal G, Pirinen M, Spencer CC, Patsopoulos NA, Moutsianas L, Dilthey A, Su Z, Freeman C, Hunt SE, Edkins S, Gray E, Booth DR, Potter SC, Goris A, Band G, Oturai AB, Strange A, Saarela J, Bellenguez C, Fontaine B, Gillman M, Hemmer B, Gwilliam R, Zipp F, Jayakumar A, Martin R, Leslie S, Hawkins S, Giannoulatou E, D’alfonso S, Blackburn H, Boneschi FM, Liddle J, Harbo HF, Perez ML, Spurkland A, Waller MJ, Mycko MP, Ricketts M, Comabella M, Hammond N, Kockum I, McCann OT, Ban M, Whittaker P, Kemppinen A, Weston P, Hawkins C, Widaa S, Zajicek J, Dronov S, Robertson N, Bumpstead SJ, Barcellos LF, Ravindrarajah R, Abraham R, Alfredsson L, Ardlie K, Aubin C, Baker A, Baker K, Baranzini SE, Bergamaschi L, Bergamaschi R, Bernstein A, Berthele A, Boggild M, Bradfield JP, Brassat D, Broadley SA, Buck D, Butzkueven H, Capra R, Carroll WM, Cavalla P, Celius EG, Cepok S, Chiavacci R, Clerget-Darpoux F, Clysters K, Comi G, Cossburn M, Cournu-Rebeix I, Cox MB, Cozen W, Cree BA, Cross AH, Cusi D, Daly MJ, Davis E, de Bakker PI, Debouverie M, D’hooghe MB, Dixon K, Dobosi R, Dubois B, Ellinghaus D, Elovaara I, Esposito F, Fontenille C, Foote S, Franke A, Galimberti D, Ghezzi A, Glessner J, Gomez R, Gout O, Graham C, Grant SF, Guerini FR, Hakonarson H, Hall P, Hamsten A, Hartung HP, Heard RN, Heath S, Hobart J, Hoshi M, Infante-Duarte C, Ingram G, Ingram W, Islam T, Jagodic M, Kabesch M, Kermode AG, Kilpatrick TJ, Kim C, Klopp N, Koivisto K, Larsson M, Lathrop M, Lechner-Scott

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JS, Leone MA, Leppä V, Liljedahl U, Bomfim IL, Lincoln RR, Link J, Liu J, Lorentzen AR, Lupoli S, Macciardi F, Mack T, Marriott M, Martinelli V, Mason D, McCauley JL, Mentch F, Mero IL, Mihalova T, Montalban X, Mottershead J, Myhr KM, Naldi P, Ollier W, Page A, Palotie A, Pelletier J, Piccio L, Pickersgill T, Piehl F, Pobywajlo S, Quach HL, Ramsay PP, Reunanen M, Reynolds R, Rioux JD, Rodegher M, Roesner S, Rubio JP, Rückert IM, Salvetti M, Salvi E, Santaniello A, Schaefer CA, Schreiber S, Schulze C, Scott RJ, Sellebjerg F, Selmaj KW, Sexton D, Shen L, Simms-Acuna B, Skidmore S, Sleiman PM, Smestad C, Sørensen PS, Søndergaard HB, Stankovich J, Strange RC, Sulonen AM, Sundqvist E, Syvänen AC, Taddeo F, Taylor B, Blackwell JM, Tienari P, Bramon E, Tourbah A, Brown MA, Tronczynska E, Casas JP, Tubridy N, Corvin A, Vickery J, Jankowski J, Vil-loslada P, Markus HS, Wang K, Mathew CG, Wason J, Palmer CN, Wichmann HE, Plomin R, Willou-ghby E, Rautanen A, Winkelmann J, Wittig M, Trembath RC, Yaouanq J, Viswanathan AC, Zhang H, Wood NW, Zuvich R, Deloukas P, Langford C, Duncanson A, Oksenberg JR, Pericak-Vance MA, Haines JL, Olsson T, Hillert J, Ivinson AJ, De Jager PL, Peltonen L, Stewart GJ, Hafler DA, Hauser SL, McVean G, Donnelly P, Compston A. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nature 476:214-9, 2011

Barizzone N, Marchini M, Cappiello F, Chiocchetti A, Orilieri E, Ferrante D, Corrado L, Mellone S, Scorza R, Dianzani U, D’Alfonso S. Association of osteopontin regulatory polymorphisms with systemic sclerosis. Hum Immunol. In press 2011

Comi C, Fleetwood T, Dianzani U. The role of T cell apoptosis in nervous system autoimmunity. Autoimmunity Reviews. In press 2011

Bergamaschi L, Leone M, Fasano ME, Guerini FR, Ferrante D, Bolognesi E, Barizzone N, Corra-doL, Naldi P, Agliardi C, Dametto E, Salvetti M, Visconti A, Galimberti D, Scarpini E, Vercellino M, Bergamaschi R, Monaco F, Caputo D, Momigliano-Richiardi P, D’Alfonso S. HLA-class I markers and multiple sclerosis susceptibility in the Italian population. Genes and Immunity, 11:173-80, 2010

Ban M, McCauley JL, Zuvich R, Baker A, Bergamaschi L, Cox M, Kemppinen A, D’Alfonso S, Gue-rini FR, Lechner-Scott J, Dudbridge F, Wason J, Robertson NP, De Jager PL, Hafler DA, Barcellos LF, Ivinson AJ, Sexton D, Oksenberg JR, Hauser SL, Pericak-Vance MA, Haines J, Compston A, Sawcer S. A non-synonymous SNP within membrane metalloendopeptidase-like 1 (MMEL1) is associated with multiple sclerosis. Genes Immun 11:660-4, 2010

Bergamaschi L, Ban M, Leone M, Sawcer SJ, D’Alfonso S. No evidence of association of the rare nsSNP rs35667974 in IFIH1 with Multiple Sclerosis. J Neuroimmunology, 221:112-4, 2010

Mishto M, Bellavista E, Ligorio C, Textoris-Taube K, Santoro A, M Giordano, S D’Alfonso, F Listı`, B Nacmias, E Cellini, M Leone, LME Grimaldi, C Fenoglio, F Esposito, F Martinelli-Boneschi, D Galimberti, E Scarpini, U Seifert, M Pia Amato, C Caruso, MP Foschini, PM Kloetzel, C Franceschi. Immunoproteasome LMP2 60HH variant alters MBP epitope generation and reduces the risk to develop multiple sclerosis in Italian female population. PLoS ONE 5: e9287, 2010

Comi C, Carecchio M, Chiocchetti A, Nicola S, Galimberti D, Fenoglio C, Cappellano G, Mona-coF, Scarpini E, Dianzani U. Osteopontin is increased in the cerebrospinal fluid of patients with alzheimer’s disease and its levels correlate with cognitive decline. Journal of Alzheimer’s Disease 9:1143-8, 2010

Boggio E, Indelicato M, Orilieri E, Mesturini R, Mazzarino MC, Campagnoli MC, Ramenghi U, Dianzani U, Chiocchetti A. Role of Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 in development of au-toimmunity lymphoproliferation. Haematologica, 95:1897-904, 2010

Dianzani C, Minelli R, Mesturini R, Chiocchetti A, Barrera G, Boscolo S, Sarasso C, Gigliotti CL, Sblattero D, Yagi J, Rojo JM, Fantozzi R, Dianzani U. B7H triggering inhibits umbilical vascu-lar endothelial cell adhesiveness to tumor cell lines and polymorphonuclear cells. J. Immunol. 185:3970-9, 2010

International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC), Booth DR, Heard RN, Stewart GJ, Cox M, Scott RJ, Lechner-Scott J, Goris A, Dobosi R, Dubois B, Saarela J, Leppä V, Peltonen L, Pirttila T, Cournu-Rebeix I, Fontaine B, Bergamaschi L, D’Alfonso S, Leone M, Lorentzen AR, Har-bo HF, Celius EG, Spurkland A, Link J, Kockum I, Olsson T, Hillert J, Ban M, Baker A, Kemppinen A, Sawcer S, Compston A, Robertson NP, De Jager PL, Hafler DA, Barcellos LF, Ivinson AJ,McCauley JL, Pericak-Vance MA, Oksenberg JR, Hauser SL, Sexton D, Haines J. Lack of support for asso-ciation between the KIF1B rs10492972[C] variant and multiple sclerosis. Nat Genet 42:469-70, 2010; author reply 470-1

Comi C, Osio M, Ferretti M, MesturiniR, Cappellano G, Chiocchetti A, Carecchio M, Nascimbene C, Varrasi C, Cantello R, Mariani C, Monaco F, Dianzani U. Defective Fas-mediated T cell apopto-sis predicts acute onset CIDP. J Peripher Nerv Syst 14:101-6, 2009

Ferretti M, Gattorno M, Chiocchetti A, Mesturini R, Orilieri E, Bensi T, Sormani MP, Cappellano G, Cerutti E, Nicola S, Biava A, Bardelli C, Federici S, Ceccherini I, Baldi M, Santoro C, DianzaniI, Martini A, Dianzani U. The 423Q polymorphism of the XIAP gene influences monocyte function and is associated with periodic fever. Arthritis Rheum 60:3476-3484, 2009

PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008per un periodo di 2 anni - 120.000 €

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mento selettivo negli esosomi di alcuni RNA. Successivamente abbiamo studiato in modelli in vitro il potenziale trasferimento a cellule bersaglio, mediante gli esosomi, di componenti virali. Nei nostri esperimenti abbiamo potuto osservare la fusione degli esosomi prodotti da LCL con cellule B EBV-negative (Ramos), ma non abbiamo potuto rilevare l’espressione in queste cellule delle proteine di EBV LMP1 e LMP2a in seguito all’incubazione con gli esosomi da LCL. Infine abbiamo valutato la presenza di componenti di EBV negli esosomi presenti in campioni biologici di pazienti con SM. Abbiamo analizzato gli esosomi purificati da campioni di plasma di un piccolo gruppo di pazienti SM e di controlli sani. Sono stati eseguiti esperimenti di Western blot per l’identificazione della proteina LMP1, ed esperimenti di PCR real time per rilevare gli mRNA e i miRNA virali. Nessuno di questi componenti è stato rilevato nei campioni analizzati.

CONCLUSIONI

In conclusione, il nostro studio sugli esosomi rilasciati in vitro da cellule B EBV-infette ha con-fermato la presenza delle proteine di EBV LMP1 e LMP2a, così come già noto in letteratura. Abbiamo inoltre potuto rilevare negli esosomi la presenza di miRNA virali e di sequenze di mRNA specifici di EBV, in particolare sequenze dell’mRNA codificante per LMP2. Ulteriori studi potranno chiarire se si tratti di mRNA funzionali. Gli esperimenti condotti per studiare il potenziale trasferimento di componenti di EBV, mediate gli esosomi, a cellule bersaglio EBV-negative, non ci hanno fino a questo momento consentito di confermare questa ipotesi. Infine nessuno dei componenti di EBV analizzati è stato rilevato negli esosomi purificati da campioni di plasma dei pazienti con SM e dei controlli sani. I nostri dati non sono in grado attualmente di fornire nessuna evidenza circa un possibile ruolo di eso-somi prodotti da cellule EBV infette nella SM.

EXOSOMES, EPSTEIN-BARR VIRUS AND MULTIPLE SCLEROSIS: POTENTIAL ROLE IN DISEASE PATHOGENESIS AND AS BIOMARKERS FOR CLINICAL MONITORING OF THE DISEASE


Evidences are accumulating on the important role of exosomes as immune modulators and as a mean of communication between cells. In the case of malignancies correlated with Ep-stein-Barr virus (EBV) infection, the release of exosomes bearing viral components has been demonstrated and their role in tumor pathogenesis has been suggested. These exosomes are present in plasma samples of patients with EBV-associated tumors and may represent valuable markers for the diagnosis and monitoring of disease.EBV infection could have an important role in MS too. Intracerebral accumulation of EBV-infected B cells and plasma cells seems to be a regular feature of MS, and brain tissue damage in MS could be caused by an immunopathological response toward EBV. This pilot project was aimed at investigating if exosomes may have a role in MS, particularly exosomes bearing EBV proteins and/or nucleic acids. Our working hypothesis was that in MS patients it might be an abnormal production of exosomes from cronically activated immune cells, particularly from EBV-infected B cells; a correlation between plasma levels of exosomes and the disease state might also be possible. The presence of exosomes in MS patients could also play a significant role in the pathophysiology of the disease. For example, exosomes bearing EBV antigens could transfer them to uninfected B cells and also to cells that are not susceptible to EBV infection, making these cells a target for the immu-ne attack. Since EBV can deliver proliferative, antiapoptotic and maturation signals to B cells through expression of latency proteins and because these proteins are known to be highly expressed in the MS brain, EBV proteins loaded on exosomes could contribute to maintain intracerebral B-cell activation, which is the hallmark of MS.

RESPONSABILE DEL PROGETTOGIULIETTA VENTURIRicercatoreIstituto Superiore di Sanità, Dipartimento del Farmaco

Collaboratori:ANDREA CANITANOMARTINA BORGHISTEFANO FAIS

Collaborazioni con altri gruppi:MARCO SALVETTI, GIOVANNI RISTORI, ROSELLA MECHELLI Centro di terapie neurologiche sperimentali Ospedale S. Andrea, Sapienza Università di Roma


Sempre maggiori evidenze stanno emergendo sull’importanza degli esosomi come immuno-modulatori e come mezzo di comunicazione fra le cellule. Nel caso di tumori correlati al virus di Eptein-Barr (EBV), è stato dimostrato il rilascio di esosomi contenenti componenti del virus, ed è stato suggerito un loro ruolo nella patogenesi del tumore. Inoltre, essendo presenti nel plasma di pazienti con tumori associati all’EBV, gli esosomi potrebbero rappresentare utili marcatori per la diagnosi e per il monitoraggio della malattia. L’infezione da EBV potrebbe avere un ruolo im-portante anche nella SM. L’accumulo intracerebrale di cellule B EBV-infette e di plasmacellule sembra essere una caratteristica ricorrente della SM, e il danno tissutale cerebrale potrebbe derivare da una risposta immunopatologica verso l’EBV. Lo scopo di questo progetto pilota era investigare il possibile ruolo degli esosomi, in particolare di esosomi veicolanti proteine e/o acidi nucleici di EBV, nella SM. La nostra ipotesi era che, nei pazienti SM potesse esserci un abnor-me produzione di esosomi da parte di cellule immunitarie cronicamente attivate, in particolare EBV-infette. Abbiamo anche ipotizzato l’esistenza di una correlazione fra i livelli plasmatici di esosomi e lo stadio della malattia. La presenza di esosomi nei pazienti SM potrebbe anche svolgere un ruolo nella patogenesi della malattia. Per esempio, esosomi veicolanti antigeni di EBV potrebbero trasferirli a cellule non infette e anche non suscettibili all’infezione, rendendole un bersaglio per l’attacco da parte del sistema immunitario. Inoltre proteine di latenza di EBV veicolate dagli esosomi potrebbero contribuire, rilasciando segnali proliferativi, antiapoptotici e di maturazione alle cellule B, a mantenerne lo stato di attivazione intracerebrale, caratteristico della SM.

RISULTATI

Al fine di chiarire il ruolo potenziale degli esosomi nella SM, abbiamo per prima cosa ricercato la presenza di proteine e acidi nucleici di EBV in esosomi rilasciati in vitro da cellule B EBV-infette (una linea cellulare linfoblastoide -LCL- e i PBMC ottenuti da due donatori sani EBV-positivi). Abbiamo analizzato l’espressione delle proteine di latenza LMP1 e LMP2a, un pannello di quattro miRNA codificati da EBV, e gli mRNA virali codificanti per le proteine EBNA1, EBNA2, LMP1 e LMP2. In accordo con dati di letteratura, abbiamo potuto rilevare negli esosomi pro-dotti da LCL la presenza delle proteine LMP1 e LMP2a. Inoltre, sempre negli esosomi prodotti da LCL, abbiamo rilevato la presenza di tutti gli mRNA analizzati, eccetto quello codificante per EBNA1. Gli mRNA codificanti per LMP1 e EBNA2 erano presenti a livelli molto bassi, mentre l’LMP2 mRNA era il più abbondante. Nessun mRNA fra quelli analizzati è stato invece rilevato nei PBMC da donatori sani, né negli esosomi derivati da queste cellule. Infine, nelle LCL e negli esosomi rilasciati da queste cellule, sono stati rilevati tutti i miRNA codificati da EBV analizzati. Alcuni di questi miRNA sono stati rilevati anche nei PBMC da donatori sani e negli esosomi da PBMC (ma non nei campioni di plasma raccolti dagli stessi donatori in parallelo ai PBMC). Complessivamente si è notata una scarsa correlazione fra i livelli di EBV mRNA e miRNA negli esosomi e nelle cellule da cui gli esosomi erano rilasciati. Questo sembra suggerire un arricchi-

EXOSOMI, VIRUS DI EPSTEIN-BARR E SCLEROSI MULTIPLA: RUOLO POTENZIALE NELLA PATOGENESI E COMEBIOMARCATORI PER IL MONITORAGGIO CLINICO DELLA MALATTIA

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RESULTS In order to shed light on the potential role of exosomes in MS, we have investigated as a first task the EBV protein and nucleic acid content of exosomes released in vitro from EBV-infected cells (a lymphoblastoid cell line -LCL- and PBMC obtained from two EBV-positive healthy do-nors). We have analyzed the expression of LMP1 and LMP2a latency proteins, a panel of four EBV-encoded miRNAs, and EBNA1, EBNA2, LMP1 e LMP2 mRNAs coding sequences. In agreement with literature data, LMP1and LMP2a proteins were detected in LCL-derived exosomes. All of the EBV-mRNAs analyzed except EBNA1 were present in RNA isolated from LCL-derived exosomes. LMP1 and EBNA2 were present at very low levels, while LMP2 mRNA was the most abundant. No EBV mRNA could be detected in RNA isolated from PBMC of EBV positive healthy donors, nor from PBMC derived exosomes. All of the EBV-encoded miRNAs analyzed could be detected in LCLs and also in LCL-derived exosomes. Moreover, some of the EBV-miRNAs analyzed could be detected in PBMC, and in PBMC derived exosomes, but not in plasma samples collected together with PBMC from the same healthy donors. Overall, a poor correlation in levels of EBV mRNAs and miRNAs in the cells, compared with exosomes, was observed, suggesting selective enrichment of some RNAs in exosomes. As a second task we have investigated in in vitro models the potential delivery of EBV proteins and/or nucleic acids by exosomes to target cells. In our experiments we observed the fusion of LCL derived exosomes with an EBV-negative B cell line (Ramos), but we did not detect the expression in these recipient cells of EBV proteins LMP1 nor LMP2a following incubation with LCL exosomes. The third task has been the evaluation of the presence of exosomes loaded with EBV components in biological samples of patients with multiple sclerosis. We have analyzed exosomes purified from plasma samples of a small group of MS patients and healthy controls. Western blot experiments for LMP1 protein and real-time PCR experiments for EBV mRNAs and miRNAs have been performed. None of these EBV components could be detected in the samples assayed.

CONCLUSIONS In conclusion, our in vitro study about exosomes released from EBV-infected B cells has confir-med the presence of the EBV proteins LMP1 and LMP2a, as already reported in the literature. We could also detect in exosomes the presence of viral miRNAs and the presence of EBV mRNAs sequences, particularly LMP2 mRNA. Further studies will be necessary to understand if the mRNA sequences we have detected are actually functional mRNAs. Our experiments aimed at investigating the potential transfer of EBV components to EBV-negative target cells through exosomes did not confirmed our hypothesis.None of the EBV components analyzed could be detected in exosomes purified from plasma samples of MS patients and healthy controls. Our data so far are unable to provide any eviden-ce about a possible role of exosomes released by EBV infected cells in MS.


Canitano A, Borghi M, Fais S, Venturi G. “Characterization of Epstein-Barr virus (EBV) protein and nucleic acid content of exosomes released in vitro from EBV-infected cells.” ISEV Annual Scienti-fic Meeting, Gothenburg, Sweden, April 18-21 2012

PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009per un periodo di 1 anno - 25.000 €

OMEOSTASI INTRACELLULARE DEL Ca2+ E MITOCONDRI IN OLIGODENDROCITI DURANTE STRESS OSSIDATIVO E LORO RUOLO NELLA MORTE PER APOPTOSI

RESPONSABILE DEL PROGETTOPAOLO PINTONProfessore AssociatoDipartimento di medicina diagnostica e sperimentale, Sezione di Patologia generale Università di Ferrara

Collaboratori:ANGELA BONONISIMONE PATEGNANIELENA DEMARCHIMASSIMO BONORA


La patogenesi della sclerosi multipla (SM) è stata caratterizzata come una risposta immu-nologica contro le cellule oligodendrocitarie, che determina perdita di mielina, degenerazione assonale e morte neuronale. Diverse citochine infiammatorie, come TNF-α e IFN-γ, sembrano essere coinvolte durante lo sviluppo e la progressione della SM. Un ruolo principale è stato assegnato alla citochina TNF-α in quanto è stata individuata come principale agente scatenante la morte degli oligodendrociti appena prima della formazione delle placche, ma è stato anche ampiamente dimostrato possa ricoprire un duplice ruolo sia come induttore di apoptosi, sia come promotore di sopravvivenza cellulare, ruolo dimostrato specialmente in modelli animali dove il TNF-α è responsabile dell’in-duzione della proliferazione oligodendrocitaria e del ripristino della mielina, in seguito ad eventi demielinizzanti.Recentemente, sono state raccolte diverse evidenze di come i mitocondri siano coinvolti nella SM. Difetti nell’espressione, attività nei complessi della catena respiratoria ed alterazioni nella produzione di Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) sono stati evidenziati nei pazienti affetti da SM. In quanto è risaputo che i mitocondri ricoprano un ruolo fondamentale nella produzione di energia e nella regolazione dell’apoptosi, specialmente mediante il segnale calcio, il nostro intento è caratterizzare la fisiologia mitocondriale nei progenitori degli oligodendrociti (OPCs) in seguito a condizioni infiammatorie ed analizzare gli effetti indotti sulla sopravvivenza/morte delle cellule.

RISULTATI

Abbiamo investigato il ruolo di TNF-α e IFN-γ nell’omeostasi del calcio negli OPCs, poichè que-ste citochine sono i protagonisti principali nelle reazioni autoimmuni contro gli OPCs. Abbiamo misurato i flussi di calcio, utilizzando chimere della fotoproteina calcio-sensibile equorina, a livello del citosol e della matrice mitocondriale.Fra le citochine infiammatorie solamente il TNF-α riduce l’accumulo di calcio mitocondriale. Inoltre, l’effetto del TNF-α è esclusivo per i mitocondri (suggerendo un effetto diretto nella fisiologia mitocondriale) e esercita tali effetti solamente nei confronti degli OPCs, e non di altre cellule gliali come gli astrociti. Abbiamo eseguito misure del potenziale di membrana mitocondriale (MMP), indicatore dello stato energetico dei mitocondri, con la sonda TMRM mediante l’utilizzo di microscopia confo-cale laser. I risultati indicano che le cellule trattate con TNF-α presentano una forte riduzione dei livelli di MMP, mostrando una riduzione dell’attività della catena respiratoria. Differentemen-te, non abbiamo riscontrato alterazioni nella produzione di ROS o nella morfologia della rete mitocondriale, indicando che le cellule non sono sottoposte a danni dovuti a stress ossidativo.Il trattamento con TNF-α determina una riduzione del numero totale di cellule dello 0,89% (E.S.±9,9). Abbiamo quindi valutato anche la morte cellulare: esperimenti di “Cleaved caspa-se-3 detection” e esperimenti di TUNEL, indicano che il trattamento con TNF-α non è tossico e non aumenta i livelli di apoptosi negli OPCs.Da tali dati, è possibile ipotizzare un ruolo diretto del TNF-α durante il differenziamento oli-30 31


godendrocitario. Trattammenti con TNF-α in OPCs indotti a differenziarsi mediante l’ormone tiroideo T3, mostrano (tramite immunofluorescenza) una riduzione della popolazione di oligo-dendrociti maturi, mentre la popolazione progenitrice resta invariata. Sembrerebbe che i mitocondri ricoprano un ruolo strategico nel differenziamento degli OPCs e, quindi, potrebbero essere un bersaglio selettivo per le citochine infiammatorie come il TNF-α. Abbiamo provato ad identificare il collegamento tra fisiologia mitocondriale e differenziamento oligodendrocitario riducendo i livelli di MMP utilizzando il disaccoppiante mitocondriale FCCP. Abbiamo valutato il differenziamento in OPCs trattati con TNF-α o FCCP per 24h e indotti al differenziamento. Come risultato, il trattamento con FCCP induce una forte riduzione nel diffe-renziamento in modo analogo al TNF-α.Abbiamo effettuato uno “screening” di sostanze modulatrici i mitocondri: succinato (substrato della catena respiratoria), ciclosporina A (inibitore del mPTP, capace di alzare i livelli di MMP) e CGP37157 (inibitore dello scambiatore mitocondriale Na+/Ca2+, capace di indurre aumenti del calcio mitocondriale). Solamente in seguito a trattamento con CGP37157, la quota totale di oligodendrociti maturi non risulta più bassa rispetto a quella riscontrata in seguito a trattamento con TNF-α.

CONCLUSIONI

I nostri dati indicano come il TNF-α sia in grado di alterare la fisiologia mitocondriale, abbasan-do i livelli di MMP e i livelli di Ca2+. Questo effetto è stato riscontrato solo negli OPCs; altre linee cellulari, come astrociti, o mediatori dell’infiammazione, come IFN-γ, non sembrano coinvolti. La dinamica del segnale Ca2+ a livello mitocondriale degli OPCs esposti a TNF-α è modulata da una riduzione del MMP, effetto non dovuto all’apoptosi. Gli OPCs trattati ed indotti al dif-ferenziamento mostrano una forte riduzione nei livelli di Proteina Basica della Mielina (MBP), valutati mediante immunoblot e immunofluorescenza. In questa popolazione di OPCs, i livelli di progenitori (NG2+) non sono alterati, così come la morte cellulare. Diverse sostanze sono state testate per mimare/revertire gli effetti indotti dal TNF-α nei confronti dei mitocondri degli OPCs e solamente bloccando lo scambiatore mitocondriale Na+/Ca2+ è stato possibile revertire gli effetti negativi sul differenziamento.

INTRACELLULAR Ca2+ HOMEOSTASIS AND MITOCHONDRIA IN OLIGODENDROCYTES DURING OXIDATIVE STRESS AND THEIR ROLE IN APOPTOTIC CELL DEATH


Multiple Sclerosis (MS) pathogenesis is mostly characterized by the immunological activity ver-sus oligodendrocyte, causing myelin loss, axonal degeneration and neuronal cell death. Multi-ple cytokines, such as TNF-α or IFN-γ appear involved in development and progression of MS. TNF-α is mainly attributed as the principal initiator of oligodendrocytes death preceding plaque formation, but, its dual role as apoptotic inducer or survival promoter has been widely demon-strated, especially in animal models where it is responsible for promoting oligodendrocytes proliferation and myelin repair after demyelination events.Recently evidences for mitochondrial involvement in MS were gathered. Defects in respiratory complexes expression and activity and altered Reactive Oxidative Species (ROS) production were reported characterizing MS patients. Because of the ability of mitochondria to be key actors during apoptosis or regulator of energy production, especially in response to calcium signaling, we characterize mitochondrial physio-logy in oligodendrocytes progenitors cells (OPCs) during inflammation conditions and its con-sequences in cell death or survival.

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RESULTS We evaluated effects of TNF-α and IFN-γ on intracellular Ca2+ homeostasis in OPCs, as these inflammatory cytokines are the major players in autoimmune reaction against oligodendrocytes. We measured Ca2+ fluxes in mitochondria and cytosol, using a set of specifically targeted chi-meras of Ca2+ sensitive photoprotein aequorin: cytAEQ (localized in the cytosol), mtAEQmut (to the mitochondrial matrix).We concluded that between inflammatory cytokines only TNF-α can reduce [Ca2+] mt uptake, whereas IFN-γ does not show any effect. Moreover, TNF-α effects are restricted to mitochon-drial compartment, suggesting specific effects on mitochondrial physiology and involve exclu-sively OPC and not other glial cells types such as astrocytes. Measurements of mitochondrial membrane potential (MMP), index of mitochondrial energetic status, were performed with the potential sensitive dye TMRM and laser scanning confocal mi-croscopy. The results highlight a strong MMP reduction in cells treated with TNF-α suggesting an important decrease in respiratory chain activity, while was neither inducing an abnormal ROS production nor an alteration of mitochondrial network morphology, indicating that cells were not involved in oxidative stress damage. We observed that TNF-α exposure results in 0,89% reduction of total cell number (S.E. ±9,9). Also cell death was tested by monitoring cleavage of Caspase3 and TUNEL indicating tre-atment with TNF-α was sub-toxic and significantly increases apoptotic cell death in OPCs.Given our data, it is possible to envisage a direct effect of TNF-α during oligodendroglial dif-ferentiation. OPCs forced to differentiate with T3 thyroid hormone, pre-treated with sub-toxic doses of TNF-α, reveal a significant reduction in adult cells appearance, confirmed by immu-nostaining for the presence of adult oligodendrocytes, while no differences were found in the number of progenitors. This suggests that mitochondria could play a strategic role in OPCs differentiation, and also that could be a selective target to proinflammatory cytokines such as TNF-α in modulation of OPCs differentiation. We tried to identify an axis between mitochondrial physiology and oligo-dendrocyte differentiation by inducing pharmacological reduction of MMP using the mitochon-drial uncoupler FCCP. We tested oligodendrocyte differentiation in OPCs treated with TNF-α or FCCP for 24 hrs, then induced to differentiate. Interestingly FCCP treatment induces strong reduction in cell differentiation, in a way similar to TNF-α. We next screen between three different mitochondrial active compounds: succinate (a sub-strate for respiratory chain), cyclosporin A (an inhibitor of mPTP, able to elevate mitochondrial membrane potential) and CGP37157 (inhibitor of mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger, able to increase mitochondrial calcium content). Only in presence of CGP37157 the amount of diffe-rentiated oligodendrocytes was not significantly lower after TNFa exposure compared to con-trol.

CONCLUSIONS Our data show that TNF-α alters mitochondrial physiology, lowering mitochondrial membrane potential and Ca2+ homeostasis. This effect is only found in the interaction between TNF-α/oligodendrocytes; other cell lines, like astrocytes, or other pro-inflammatory mediators such as IFN-γ are not involved. Mitochondrial calcium dynamics in oligodendrocytes exposed to TNF-α is affected by a strong reduction in MMP. This was not due to an engagement of apoptosis as expected by absence of several apoptotic markers. Treated OPCs, induced to differentiate display reduced immunoreactivity for Myelin Basic Pro-tein (MBP) in immunostaining and a lower amount of MBP levels by immunoblotting. In the adult oligodendrocyte population levels of progenitor cells (NG2+) and cell death were not affected. Several compounds were tested to mimic or revert the effect of TNF-α in oligoden-drocyte mitochondria and only the blocker of mitochondrial Na+/Ca2+ exchange were able to revert the effect on differentiation.


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OMEOSTASI INTRACELLULARE DEL Ca2+ E MITOCONDRI IN OLIGODENDROCITI DURANTE STRESS OSSIDATIVO E LORO RUOLO NELLA MORTE PER APOPTOSI

RESPONSABILE DEL PROGETTOANGELA BONONIDipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica Sezione di Patologia Generale, Università di Ferrara

MENTORE:PAOLO PINTON


La sclerosi multipla (SM) è una malattia neurologica che colpisce il sistema nervoso centra-le (SNC), caratterizzata da demielinizzazione e neurodegenerazione. Nonostante eziologia e patogenesi della SM non siano ancora state comprese completamente, diversi studi suggeri-scono che il danno infiammatorio alla mielina e agli oligodendrociti (le cellule che generano la mielina nel SNC) siano alla base dello sviluppo e della progressione della patologia. Inoltre, in diverse patologie demielinizzanti si sono riscontrate anomalie nella funzionalità dei mitocondri, ed infatti recenti evidenze hanno messo in luce come i mitocondri siano coinvolti nella SM.I mitocondri sono organelli cellulari spesso descritti come le “centrali energetiche” della cellula; tuttavia, è noto come i mitocondri svolgano un ruolo chiave anche nel processo di morte cellu-lare. A livello mitocondriale avviene dunque l’integrazione sia di segnali di sopravvivenza che di morte, e ciò è controllato principalmente sulla base della quantità di ioni Ca2+ che i mitocondri accumulano. Questo progetto di ricerca si è avvalso di differenti approcci sperimentali volti ad una migliore comprensione della complessa relazione tra omeostasi del Ca2+ mitocondriale ed i processi di sopravvivenza e differenziamento di precursori degli oligodendrociti (OPCs), rivolgendo l’attenzione in particolare alle alterazioni causate dalle condizioni infiammatorie che si osservano in pazienti con SM. Capire come tali eventi partecipano alla patogenesi della SM potrà aprire la strada a nuovi approcci terapeutici.

RISULTATI

Inizialmente è stato ottimizzato un protocollo di isolamento e mantenimento in vitro di colture cellulari di precursori oligodendrocitari, e il loro differenziamento in oligodendrociti adulti. In seguito abbiamo indagato se durante le condizioni infiammatorie che caratterizzano la SM si osservasse un’alterazione dell’omeostasi del Ca2+. Analizzando l’accumulo transiente di Ca2+ nei mitocondri, abbiamo stabilito che il mediatore dell’infiammazione TNF-α (Fattore di necrosi tumorale-alpha) causa una significativa riduzione della risposta mitocondriale al Ca2+. Tale effetto del TNF-α è stato osservato esclusivamente a carico dei mitocondri, suggerendo dunque un interessamento specifico della fisiologia mito-condriale. Al fine di comprendere meglio come l’omeostasi mitocondriale del Ca2+ è regolata ed alterata in OPCs esposti al TNF-α, abbiamo analizzato altri parametri mitocondriali, indivi-duando così la presenza di una marcata riduzione del potenziale di membrana mitocondriale. Tale potenziale è la forza motrice sia della produzione di energia che dell’accumulo di Ca2+ nell’organello, e quest’ultima spiega quindi il perché della riduzione dell’accumulo mitocondria-le di Ca2+ da noi osservata in OPCs trattati con TNF-α. Un aspetto interessante emerso nel corso dei nostri studi è che né la morfologia dei mitocondri, né la produzione di radicali liberi sono alterate nelle nostre condizioni sperimentali, e ciò ci ha permesso di concludere che il trattamento con TNF-α non induce morte degli OPCs. Per questo siamo passati a valutare il possibile effetto del TNF-α nel differenziamento oligodendrocitario ed è emerso che il tratta-mento con TNF-α riduce in modo significativo il differenziamento di OPCs in oligodendrociti adulti. Infine abbiamo analizzato diversi composti noti per la loro capacità di modulare parame-tri mitocondriali, con l’obbiettivo di revertire le disfunzioni da noi osservate. È risultato che il composto CGP37157, una molecola che agisce aumentando l’accumulo di Ca2+ nei mitocondri, è in grado di ripristinare il differenziamento oligodendrocitario anche in presenza di TNF-α.

CONCLUSIONI

I dati da noi raccolti suggeriscono che il TNF-α pregiudica il differenziamento degli OPCs al-terandone la funzionalità mitocondriale. Abbiamo quindi usato varie molecole in grado di mo-dulare diversi parametri mitocondriali, con l’intento di revertire la compromissione del diffe-renziamento oligodendrocitario causata dal TNF-α. La molecola candidata da noi identificata è il CGP37157, una benzodiazepina che mantiene diverse caratteristiche in comune con al-tri membri di questa classe farmaceutica quali diltiazem, clonazepam e diazepam. I prossimi esperimenti saranno quindi volti a valutare se alcuni di questi farmaci già presenti in commercio sono in grado di preservare il differenziamento degli OPCs in presenza di un danno infiamma-torio, con la speranza di individuare così nuovi approcci terapeutici.

INTRACELLULAR Ca2+ HOMEOSTASIS AND MITOCHONDRIA IN OLIGODENDROCYTES DURING OXIDATIVE STRESS AND THEIR ROLE IN APOPTOTIC CELL DEATH


Multiple sclerosis (MS) is a neurological disorder of the central nervous system (CNS) cha-racterized by demyelination and neurodegeneration. Although the pathogenesis of MS is not completely understood, various studies suggest that inflammatory damage to myelin and oli-godendrocytes (the myelin-forming cells of the CNS) is associated with the development and progression of MS. Also mitochondrial dysfunction is frequently associated with demyelinating disease, and recent evidences have pointed out the involvement of mitochondria in MS. Mitochondria are cellular organelles often described as the “powerhouses” of the cell; however mitochondria are now recognised as central players in cell death. Integration of survival and death stimuli occurs in mitochondria and is mainly controlled by accumulation of calcium ions (Ca2+). The project utilized a variety of experimental approaches aimed at obtaining a deeper insight into the complex relationship between mitochondrial Ca2+ homeostasis and the process of cell survival and differentiation in oligodendrocyte precursors (OPCs), with special attention to identify alterations caused by the inflammatory processes occurring in MS. Further understan-ding of how these events participate in the pathogenesis of MS can provide rationale for novel therapeutic approaches.

RESULTS We initially established a protocol for isolation and in vitro culture of oligodendrocytes proge-nitors as well as their differentiation into mature oligodendrocyte. Than we investigated if Ca2+ homeostasis in OPCs may be affected during the inflammatory events that characterize MS. We analysed transient Ca2+ in mitochondria and found that the inflammatory mediator tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) causes a significant reduction of mitochondrial Ca2+ responses. TNF-α effect was restricted to the mitochondrial compartment, suggesting specific effects on mitochondrial physiology. To better understand how mitochondrial Ca2+ homeostasis is regula-ted and altered in OPCs during TNF-α exposure, we analyzed other mitochondrial parameters, and found out a strong reduction of mitochondrial membrane potential (MMP). MMP is the driving force of both energy production and Ca2+ accumulation in mitochondria, so this latter function explain the reduction of mitochondrial Ca2+ responses observed in treated OPCs. Inte-restingly, neither mitochondrial morphology nor reactive oxygen species production were chan-ged, and so we performed further analysis and finally concluded that treatment with TNF-α does not induce cell death in OPCs.Therefore we evaluated TNF-α effect on OPCs differentiation, and found that TNF-α treatment 34 35


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significantly reduced the differentiation of OPCs into adult oligodendrocytes. Next we analyzed different compound able to affect mitochondrial physiology, aiming to recover the mitochondrial impairment. We found that CGP37157, a molecule capable of increasing the accumulation of Ca2+ in mitochondria is able to revert the TNF-α mediate differentiation impairment.

CONCLUSIONS Taken together our data suggest that TNF-α impairs oligodendrocyte differentiation by altering mitochondrial functions. In order to understand a causal relation we used different chemical compounds targeting selected feature of mitochondria, trying to revert the effect of TNF-α on OPCs differentiation. We identified CGP37157 as a candidate able to rescue OPCs differentia-tion. CGP37157 is a benzodiazepine that display common characteristics with members of the benzodiazepine drug family, such as diltiazem, clonazepam and diazepam. In the near future, we will test some of these drugs, already approved, to verify if they are able to preserve OPCs differentiation during inflammatory damage, and possibly find out new therapeutic approaches.


De Stefani D, Bononi A, Romagnoli A, Messina A, De Pinto V, Pinton P, Rizzuto R (2012) VDAC1 selectively transfers apoptotic Ca2+ signals to mitochondria. Cell Death Differ 19:267-273

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Patergnani S, Suski JM, Agnoletto C, Bononi A, Bonora M, De Marchi E, Giorgi C, Marchi S, Missi-roli S, Poletti F, Rimessi A, Duszynski J, Wieckowski MR, Pinton P (2011) Calcium signaling around Mitochondria Associated Membranes (MAMs). Cell Commun Signal 9(1):19

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FATTORI DI RISCHIO NELLA SCLEROSI MULTIPLA: UNO STUDIO INTERNAZIONALE CASO-CONTROLLO

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studio caso-controllo internazionale su larga scala sull’associazione tra SM e fattori di rischio ambientale. La metodologia di base dello studio trae vantaggio dall’utilizzo di registri esistenti di persone con SM basati su popolazione e su questionari autosomministrati.Obiettivo specifico dello studio è l’analisi, oltre che dell’effetto principale anche delle possibili interazioni, tra i fattori ambientali di attuale maggiore interesse (agenti infettivi tra cui EBV e mononucleosi infettiva, stato metabolico della vitamina D, fattori di stile di vita, incluso il fumo di sigaretta, l’esposizione alla luce solare, fattori occupazionali) ed il rischio per SM.

RISULTATI

Le prime attività di Progetto sono state principalmente focalizzate nel coordinamento dei 7 cen-tri partecipanti allo studio (Italia-Sardegna, Italia-San Marino, Rep. Di S. Marino, Serbia, Norve-gia, Svezia, Canada) per la definizione e produzione del questionario (EnvIMS-Q), contenuto, formato, versione linguistica, e proprietà di affidabilità e accettabilità. È stato inoltre prodotto il materiale incluso nella spedizione del questionario, e amministrate le due spedizioni previste dal disegno di studio.Un totale di 5728 questionari sono stati scannerizzati e i dati trasferiti in un database per analisi statistica: 2171 dall’Italia (733 casi e 1438 controlli), 2677 dalla Norvegia (959, 1718), 636 dalla Svezia (167, 469) e 244 dalla Serbia (121, 123). Lo studio in Canada è attualmente in corso, per la fase di test del questionario nelle versioni Inglese e Francese.I dati dello studio EnvIMS sono ora in fase di analisi per l’esposizione età-specifica a fonti di vitamina D (esposizione alla luce solare, dieta e supplementi vitaminici), al fumo di sigaretta (esposizione attiva e passiva), alla mononucleosi infettiva (MI). L’interazione tra MI (espressione dell’infezione da EBV) e fumo di sigaretta su 2125 casi e 4455 controlli ha mostrato l’impor-tanza, indipendente, dei due fattori per il rischio di SM in tutte le popolazioni prese in esame. La pooled odds ratio (OR) aggiustata per sesso ed età era 2.0 (95%CI: 1.6-2.4) per MI e 1.8 (95%CI: 1.6-2.4) per il fumo di sigaretta. L’effetto era più elevato tra i non-fumatori OR aggre-gata di 2.4 (95%CI: 1.8-3.2) che tra i fumatori OR di 1.6 (95%CI: 1.3-2.1), p=0.04 mediante regressione logistica moltiplicativa. Questa interazione negativa è stata osservata per tutte le popolazioni in studio, e senza diffe-renza per sesso. Se la condizione di non precedente esposizione a fumo di sigaretta e a mono-nucleosi infettiva costituiva il valore di riferimento (OR=1), un rischio aumentato per SM veniva osservato in coloro esposti solo al fumo (1.7, 95%CI: 1.5 - 1.9) o solo alla MI (2.4, 95%CI: 1.8 - 3.2), o ad entrambi (2.8, 95%CI: 2.1 - 3.6). Questi dati non supportano l’ipotesi per cui il rischio per SM da infezione EBV sia aumentato dall’esposizione al fumo, ma piuttosto suggeriscono due vie patogenetiche distinte.Altri risultati preliminari sono consistenti con il ruolo della bassa esposizione alla luce solare in età infantile sul rischio per SM in popolazioni europee sia meridionali che settentrionali. Nei Sardi, una bassa esposizione al sole durante tutto l’anno e all’età di 0-5 anni si associa ad un elevato rischio per SM (OR=1.5, 95%CI: 1.1-2.0, p=0.015) con effetto dose-risposta. Questo trend non è stato osservato ad un età più avanzata.EnvIMS ha presentato delle criticità in relazione sia alla natura di studio caso-controllo e multi-centrico (utilizzo di questionari, spedizione postale, approvazioni comitato etico), per cui veniva chiesta una sua estensione al mese di Settembre 2011.

CONCLUSIONI

La rilevanza dello studio giace nella possibilità di studiare il ruolo di fattori ambientali e di stile di vita nel determinismo della SM in popolazioni (europee meridionali e settentrionali, e canadese) che differiscono per frequenza di malattia e distribuzione degli stessi fattori attraverso una me-todologia comune e condivisa. I risultati finali genereranno ipotesi sul ruolo sia individuale che interattivo età-dipendente dei singoli fattori nel determinare il rischio per SM. Inoltre poiché alcuni di questi fattori di rischio dipendono largamente da stile di vita o occupazione lavorativa (es., abitudine al fumo di siga-retta, atteggiamento all’esposizione alla luce solare, dieta) potenzialmente fattori di rischio mo-dificabili, lo studio contribuirà a identificare gruppi di individui a maggior rischio e a porre in atto misure preventive con programmi di educazione sanitaria o interventi a livello di popolazione (es., fortificazione degli alimenti con vitamina D).

RESPONSABILE DEL PROGETTOMAURA PUGLIATTIProfessore Associato di NeurologiaDipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale (ex Dipartimento di Neuroscienze e Scienze Materno-Infantili), Università degli Studi di Sassari

Collaboratori:GIULIO ROSATISTEFANO SOTGIUWANDA M. SATTAALESSANDRA SANNAPAOLA COSSULESLIE PARISHSTEFANIA LEONIBETTINA MARIA GALANTI

Collaborazioni con altri gruppi:Steering CommitteeTrond Riise, Department of Public Health and Primary Health Care, University of Bergen, NorwayKjell-Morten Myhr, National MS Competence Center, Department of Neurology, Haukeland University Hospital, Bergen, NorwayChristina Wolfson, Division of Clinical Epidemiology, McGill University Health Centre, Montreal

Italylaria Casetta, Enrico Granieri, Istituto di Clinica Neurologica, Università di FerraraNorwayTrond Riise, Department of Public Health and Primary Health Care, University of BergenKjell-Morten Myhr, National MS Competence Center, Department of Neurology, Haukeland University Hospital, BergenSwedenAnne-Marie Landtblom, Department of Neuroscience and Locomotion, University of LinköpingSerbiaJelena Drulovic, Institute of Neurology, University of BelgradeTatjana Pekmezovic, Institute of Epidemiology CanadaChristina Wolfson, Division of Clinical Epidemiology, McGill University Health Centre, Montreal

Consulenti esterni:A. Ascherio, Department of Nutrition, Department. of Epidemiology, Harvard Medical School, Boston, USAMT. Kampman, Department of Neurology, University Hospital of Northern Norway and University of Tromsø, Norway T. Holmøy, Department Neurology, Ullevål University Hospital; Institute of Immunology, University of Oslo, NorwayK. Lauer, Darmstadt, Germany


I dati epidemiologici sulla sclerosi multipla (SM) (ad es. l’eterogeneità a livello microgeografico, le variazioni di incidenza e le evidenze, recenti, di aggregati spazio-temporali nell’adolescenza) suggeriscono l’azione di uno o più fattori esogeni nel determinare la malattia. Nonostante il numero di studi epidemiologici condotti, tuttavia, la causa della SM è ancora sconosciuta. La SM è una malattia polifattoriale e poligenetica caratterizzata da possibili inte-razioni tra fattori genetici e ambientali. Il disegno di studio ottimale per studiare questo tipo di associazione è lo studio di coorte, che tuttavia presenta nel caso della SM e dei fattori ambien-tali limitazioni importanti data la relativa bassa incidenza della malattia e la sua lunga latenza. Numerosi studi caso-controllo sono stati pertanto effettuati su questa associazione che tuttavia hanno prodotto risultati deludenti in relazione alla relativa bassa numerosità del campione, all’inclusione di casi prevalenti (non incidenti), il cui basso potere statistico può aver maschera-to l’effetto di specifici fattori di esposizione. A tutt’oggi, pertanto, nessun disegno ha permesso di escludere un ruolo preponderante dei fattori ambientali nel determinare la SM.Nel 2007, grazie al contributo FISM (Grants n. 2007/R/14 e 2008/R/19), è stato avviato uno

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RISK FACTORS IN MULTIPLE SCLEROSIS: AN INTERNATIONAL CASE-CONTROL STUDY


The epidemiology of multiple sclerosis (MS) (eg. heterogeneous spatial distribution at micro-geographic level, its changing incidence patterns, and evidences of recent space-time cluste-ring in adolescence) suggests the action of one or more exogenous factor(s) in determining the disease. Despite the large number of epidemiological studies conducted, however, the cause of MS is still unknown. MS has likely a polygenetic and multifactorial etiology with possible strong interactions between genetic and exogenous factors. A cohort study would be the op-timal study design to investigate the association between any risk factors and the occurrence of MS. However, important limitations to cohort study designs in MS are the disease relative low incidence in the population and the long latency. A number of case-control studies have been so far carried out with disappointing results when it comes to associate disease with spe-cific environmental agents. These studies, however, have been conducted on relatively small samples of prevalence-based cases, whose low statistical power may have hindered the effect of specific exposures. To date no studies have been able to rule out a preponderant action of environmental factors in determining MS.In 2007 with FISM financial support (Grants n. 2007/R/14 and 2008/R/19) a large-scale in-ternational case-control study on the association of MS and environmental risk factors was started. The basic methodology of the study took advantage of existing patient registries that cover large areas as a means to identify and recruit cases and to collect data on risk factors using self-administered questionnaires. The focus of such study has been the investigation of the currently most attractive etiological hypotheses for MS: (I) infectious agents (EBV, infectious mononucleosis); (II) diet with regards to vitamin D status, (III) lifestyle factors, including cigarette smoking, and sunlight exposures, and (IV) occupational exposures.

RESULTS The 1st year Project activities consisted in coordinating the 7 participating sites (Italy-Sardinia, Italy-Ferrara, Rep. of San Marino, Serbia, Norway, Sweden, Canada) for finalising the EnvIMS-Questionnaire contents and format, its reliability and acceptability in all language versions, its actual production and the mailing package, the management of the first and second mailings in the sites involved. A total of 5728 EnvIMS-Qs were scanned into a database for statistical analysis: 2171 from Italy (733 cases, 1438 controls), 2677 from Norway (959, 1718), 636 from Sweden (167, 469) and 244 from Serbia (121, 123). The Canadian substudy is currently being pilot tested (EnvIMS-Q English and French versions). The EnvIMS data are now being analysed with regards to age-related past exposure to sources of vitamin D (sunlight, diet, supplemen-tation), active/passive cigarette smoking, and infectious mononucleosis (IM). Despite Epstein-Barr virus (EBV), low levels of vitamin D, smoking and the HLADRB1 haplotype have consi-stently shown to be associated with increased MS risk, only modest associations have been found for their main effect. Interactions between these factors may explain the variation in risk. The interaction between smoking and a history of IM (proxy for EBV infection) was studied on a sample of 2125 cases and 4455 controls. Both IM and cigarette smoking, individually, were important factors in all populations considered. The age- and sex-adjusted pooled odds ratio (OR) was 2.0 (95%CI: 1.6-2.4) for IM and 1.8 (95%CI: 1.6-2.4) for smoking. The effect of IM was significantly higher among non-smokers, pooled OR of 2.4 (95%CI: 1.8-3.2) than among smokers, pooled OR of 1.6 (95%CI: 1.3-2.1), p=0.04 using multiplicative interaction term in lo-gistic regression. This negative interaction was found in all countries included and among men and women separately. When the condition of no previous exposure to neither IM nor cigarette smoking represented the reference value, an increasing risk for the disease was observed in those exposed to smoking but not to IM (1.7, 95%CI: 1.5 - 1.9), to IM but not to smoking (2.4, 95%CI: 1.8 - 3.2), and to both IM and smoking (2.8, 95%CI: 2.1 - 3.6). This observation does not support that the risk of MS related to EBV is increased by smoking, but rather suggests two

distinct pathogenetic pathways. Preliminary results are also consistent with the role of low sun exposure in early life on the MS risk in both northern and southern Europeans. In Sardinians, low sun exposure all year round at age 0-5 years was significantly associated to a higher MS risk (OR=1.5, 95%CI: 1.1-2.0, p=0.015) and with a dose-response effect. This trend was not observed at later age. EnvIMS’ criticalities were linked to both the case-control and multi-site nature of study design (i.e., use of questionnaires, post-mailing, ethical approvals), and therefore an extension of the Project timeline from January 2011 to September 2011 was obtained.

CONCLUSIONS The study relevance lies in the possibility to investigate the role of environmental and lifestyle factors in determining multiple sclerosis (MS) in populations (southern and northern Europeans, and Canadians) differing by disease frequency and distribution of risk factors (eg., sunlight exposure), with common shared methodology. The study results will generate hypotheses on both the individual and the interactive age-dependent role of the single environmental factors in determining MS (Proximity to find new pathogenic mechanism). Furthermore, as some of the risk factors investigated largely depend on individuals’ lifestyle or occupation (eg., cigarette smoking, attitude to sunlight exposure, diet), that are potentially modifiable risk factors, the study will contribute to identify groups of individuals at higher risk and possible preventive stra-tegies through health educational programs or interventions at the population level (eg. vitamin D supplementation) (Proximity to cure).


Riise T, Pugliatti M, Casetta I, Drulovic J, Granieri E, Holmoy T, Kampman MT, Landtblom A-M, Lauer, K, Myhr K-M, Pekmezovic T, Wolfson C. Negative interaction between smoking and infec-tious mononucleosis in the risk of MS. Mult Scler J 2011;17:S49 – 27th Congress of the European Committee for Treatment and Research in Multiple Sclerosis (ECTRIMS), Amsterdam, The Nether-lands, October 2011 (oral presentation)

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Pugliatti M, Casetta I, Cossu P, DeGennaro R, Drulovic J, Granieri E, Holmøy T, Kampman TM, Landtblom A-M, Lauer K, Myhr K-M, Pekmezovic T, Riise T, Wolfson C. International Case Con-trol Study on Risk Factors for Multiple Sclerosis (MS): Pilot testing the questionnaire. Mult Scler 2009;15:1403 - ACTRIMS, Atlanta, GA, USA, 30 May 2009

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SOTTOPOPOLAZIONI DI LINFOCITI T CD8 EFFETTORI E DELLA MEMORIA E DECORSO CLINICO NELLA SCLEROSI MULTIPLA

RESPONSABILE DEL PROGETTOANNA PAOLA BATOCCHIProfessore Associato di NeurologiaDipartimento di Neuroscienze, Istituto di Neurologia Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma

Collaboratori:GIOVANNI FRISULLOVIVIANA NOCITIAGATA KATIA PATANELLARAFFAELE IORIOALESSANDRO MARTI


Molti studi hanno evidenziato un ruolo importante dei linfociti T CD8+ nella patogenesi della sclerosi multipla (SM). Cellule T CD8+ sono state trovate vicino agli assoni danneggiati e demie-linizzati indicando un possibile ruolo della citotossicità cellulare nel danno tessutale nella SM. Il differente rapporto tra linfociti CD8+ della Memoria Centrale (CM), Effettori precursori della Memoria (MPEC) e Effettori a Vita Breve (SLEC) nel sangue periferico potrebbe essere impor-tante per il decorso clinico dei pazienti con SM. Lo scopo del nostro studio è stato quello di valutare la percentuale di linfociti T CD8+CCR7+IL7R alpha high(CM), CD8+CCR7- IL7R alpha high (MPEC), CD8+CCR7-IL7R alpha low (SLEC) e l’espressione di T-bet, eomesodermina e perforina in queste sottopopolazioni nei pazienti con Sindrome Clinicamente Isolata suggestiva di SM (CIS), con SM Remittente-Recidivante (SMRR) in fase acuta e di remissione, con SM Se-condariamente Progressiva (SMSP) e Controlli Sani (CS). Inoltre abbiamo correlato le percen-tuali delle diverse sottopopolazioni di linfociti CD8+ e l’espressione di T-bet, eomesodermina e perforina con il decorso clinico dei pazienti. L’identificazione di specifici pattern di sottopopola-zioni di linfociti T CD8+ può contribuire a riconoscere pazienti con CIS che svilupperanno la SM clinicamente definita e devono iniziare un trattamento precoce e ad identificare precocemente pazienti con SMRR con una malattia più grave ed un alto grado di progressione della disabilità che necessitano di un approccio terapeutico più aggressivo. Inoltre la valutazione del T-bet e della eomesodermina a livello cellulare può aiutare a definire meglio rispettivamente il ruolo dei linfociti T effettori e della memoria nella patogenesi della SM, mentre la valutazione della perfo-rina come marker di funzione citotossica dei linfociti CD8+, può aiutare a individuare i pazienti che svilupperanno un decorso più aggressivo e una maggiore disabilità.

RISULTATI

Abbiamo analizzato le percentuali di linfociti T CD8+CCR7+IL7R alpha high (Memoria Cen-trale, CM), CD8+CCR7- IL7R alpha high (Effettori Precursori della Memoria Centrale, MPEC), CD8+CCR7-IL7R alpha low (Effettori a Vita Breve, SLEC) circolanti esprimenti T-bet, eomeso-dermina e perforina in 60 controlli sani (CS) e 110 pazienti non trattati con differenti forme di SM e correlato le percentuali di queste sottopopolazioni di linfociti T CD8+ con l’età, la durata di malattia e il grado di disabilità.I pazienti con SMRR, SMSP e SM Primariamente Progressiva (PP) hanno mostrato più alte percentuali di cellule T CD8+CD56−perforina+ circolanti rispetto ai CS. I pazienti con SM e EDSS≥3 mostravano una maggiore percentuale di cellule T CD8+CD56−perforina+ dei pazienti con EDSS <3 e i CS, mentre i pazienti con EDSS <3 mostravano una maggiore percentuale di questa sottopopolazione di linfociti che i CS. I nostri dati dimostrano che la SM è caratterizzata da una disregolazione dei linfociti T CD8+CD56−perforina+ che possono avere un ruolo nello sviluppo della disabilità. I pazienti con SMRR in riacutizzazione, se comparati con i pazienti in remissione e con i CS, mostravano aumentate percentuali di linfociti T CD8+ SLEC circolanti esprimenti T-bet ed Eomesodermina che pertanto sembrano essere associati alle fasi di riacu-tizzazione della malattia. Questi sottogruppi di linfociti CD8+ con funzione citolitica potrebbero passare la barriera ematoencefalica e contribuire al danno assonale soprattutto durante le fasi

di riacutizzazione della SMRR. I pazienti con SMSP presentano un aumento dei linfociti T CD8+ SLEC esprimenti T-bet suggerendo un difetto del processo di esaurimento in questa fase della SM a esordio recidivante, che determina la persistenza in circolo di un alta percentuale di lin-fociti T CD8+ effettori completamente differenziati che possono passare attraverso la barriera ematoencefalica e contribuire al danno del SNC. I pazienti con SMRR mostravano un aumento delle percentuali di linfociti T CD8+ CM esprimenti eomesodermina sia in riacutizzazione che in remissione e un aumento dei linfociti T CD8+ MPEC esprimenti eomesodermina in remissione rispetto ai pazienti con SMSP e ai CS. Il gruppo più giovane di pazienti con SMRR mostrava una percentuale alta di linfociti T CD8+ CM e MPEC che diminuiva nel gruppo più vecchio di pazienti con SMSP. Questi dati suggeriscono che i linfociti T CD8+ CM e MPEC hanno un ruolo centrale nel determinare le riacutizzazioni nei pazienti con SMRR e che la loro riduzione sia associata con la fase secondariamente progressiva della malattia.

CONCLUSIONI

Evidenziare le eventuali ricadute dei risultati del progetto di ricerca a breve, medio e/o lungo termine sulle persone con sclerosi multipla. Evidenziare, se possibile, quanto i risultati ottenuti siano vicini alla caratterizzazione di nuovi meccanismi patogenetici della malattia (Proximity to find new pathogenic mechanism), oppure allo sviluppo di una terapia (Proximity to cure).Lo studio ha evidenziato che sia i linfociti T CD8+ esprimenti perforina che quelli della memoria ed effettori circolanti hanno un ruolo nella patogenesi della SM e influenzano il suo decorso clinico. I linfociti esprimenti perforina che sembrano essere coinvolti nello sviluppo della disa-bilità sono aumentati nei pazienti con SMRR in riacutizzazione e con SMSP e SMPP. I linfociti SLEC esprimenti T-bet sono aumentati sia nella fase recidivante che progressiva della malattia mentre i linfociti CM esprimenti eomesodermina sono implicate solo nella fase recidivante della malattia. A breve termine l’identificazione di sottopopolazioni di linfociti T CD8+ coinvolte nella patogenesi della SM potrebbe essere utile per identificare i pazienti con SM più gravi che ne-cessitano di un approccio terapeutico più aggressivo. A lungo termine nuovi farmaci che hanno come bersaglio i linfociti T CD8+ esprimenti perforina o T-bet e l’eomesodermina potrebbero essere sviluppati per il trattamento della SM.

CD8 T CELL EFFECTOR AND MEMORY SUBPOPULATIONS AND MULTIPLE SCLEROSIS CLINICAL OUTCOME


Several studies suggested an important role for CD8 T cells in the pathogenesis of multiple sclerosis (MS). CD8 T cells have been found proximal to damaged and demyelinating axons indicating a possible role for cellular cytotoxicity in tissue destruction in MS. The different ra-tio of central memory (CM), memory precursor effector (MPEC), short lived effector (SLEC) lymphocytes in peripheral blood could be important for the clinical outcome of MS patients. The aim of our study was to evaluate the percentage of CD8+CCR7+IL7R alpha high (CM), CD8+CCR7- IL7R alpha high (MPEC), CD8+CCR7-IL7R alpha low (SLEC) T cells and the expression of T-bet, Eomesodermin and Perforin in these subpopulations of CD8 T cells from peripheral blood of Clinically Isolated Syndrome (CIS) suggestive of MS patients, relapsing-re-mitting MS (RRMS) patients in acute and in remission phase of disease, secondary progressive MS (SPMS) patients and healthy controls. Furthermore we correlated the percentages of the different CD8 T cell subpopulations and T-bet, Eomesodermin and Perforin expression with pa-tients clinical outcome. The identification of specific pattern of CD8 T cell subpopulations may contribute to recognize CIS patients who will develop Clinically Defined MS (CDMS) and must begin an early treatment, and to the early individuation of RRMS patients with a more severe disease and with higher disability progression rate who need a more aggressive therapeutic approach. In addition, the evaluation of T-bet and Eomesodermin expression at single cell level 42 43


may help to better define the role of memory and effector CD8 T cell subpopulations in MS pathogenesis respectively, while the evaluation of Perforin as marker of cytotoxic function of CD8 T cells, may help to individuate patients who will develop a more aggressive course of the disease and higher disability.

RESULTS We analyzed the percentages of circulating CD8+CD56-perforin+T cells, CD8+CCR7+CD127high (Central Memory, CM), CD8+CCR7-CD127high (Memory Precursor Effector Cells, MPEC), CD8+CCR7-CD127low (Short Lived Effector Cells, SLEC) T cells expressing T-bet, Eome-sodermin and Perforin in 60 healthy subjects (HS) and 110 untreated Multiple Sclerosis (MS) patients with different forms of MS and correlated the percentages of these CD8+ T cell subpo-pulations with age, gender, disease duration and disability score. RRMS, SPMS and primary progressive (PP)MS patients showed higher percentages of circulating CD8+CD56−perforin+ T cells than HS whereas only relapsing RRMS and PPMS patients showed higher perforin expression in CD8+CD56− T cells than HS. MS patients with EDSS ≥3 showed higher percen-tage of CD8+CD56−perforin+ T cells than patients with EDSS <3 and HS whereas patients with EDSS <3 showed higher percentage of this T cell subpopulation than HS. Our data show that MS is characterized by a dysregulation of CD8+CD56−perforin+ T cells that may play a role in the development of disability. Patients with RRMS in exacerbation, as compared to HS and remitting RRMS patients, showed increased percentages of circulating CD8+ SLEC ex-pressing T-bet and Eomesodermin which thus seem to be associated to the active phases of the disease. These CD8+ T cell subsets with full cytolytic function may pass across the blood brain barrier and contribute to the axonal damage mainly during the acute phases of RRMS. SPMS patients showed increased percentages of circulating CD8+ SLEC expressing T-bet suggesting the presence of a dysfunction in the process of exhaustion in this phase of relapsing-onset MS, which determines the persistence in the circulation of high percentages of fully differentiated effector CD8+ T cells that can pass across the blood brain barrier and contribute to the CNS damage. RRMS patients showed higher percentages of CD8+ CM expressing Eomesodermin both during relapse and remission and of CD8+ MPEC expressing Eomesodermin in remission than SPMS patients and HS. The younger group of RRMS patients showed high percentages of circulating CD8+ cells CM and MPEC that decreased in the older group of SPMS patients. These data suggest that CD8+ CM and MPEC cells have a central role in determining exa-cerbations in patients with RRMS and that their reduction is associated with the secondary progressive phase.

CONCLUSIONS Our study evidenced that both perforin expressing and memory and effector circulating CD8+ T cells play a role in the pathogenesis of MS and can influence its clinical outcome. An incre-ase of circulating CD8+CD56−perforin+ T cells that seem to be involved in the development of clinical disability is present in relapsing RR, SP and PPMS patients. SLEC CD8+ T cells expressing T-bet are increased both in the relapsing and in the progressive phase of disease while CM CD8+ T cells expressing Eomesodermin play a major role only in the relapsing phase of disease. On short term the identification of specific CD8+ T cells subpopulations involved in MS clinical outcome could be useful to identify MS patients with more severe forms of the disease who need a more aggressive therapeutic approach. On long term new drugs targeting CD8+ T cells expressing perforin or specific transcription factors such as T-bet or Eomesodermin could be developed and used to treat MS patients.


Frisullo G, Plantone D, Marti A, Damato V, Iorio R, Nociti V, Patanella AK, Batocchi AP. CD8+ ef-fector and memory T cell subpopulations in relapsing-onset Multiple Sclerosis. (In preparation)

Frisullo G, Plantone D, Marti A, Iorio R , Nociti V, Patanella AK, Batocchi AP. Circulating CD8+CD56-Perforin+ T cells are increased in Multiple Sclerosis patients. J Neuroimmunol 2011 Dec 15;240-241:137-41. Epub 2011 Oct 15

Frisullo G, Plantone D, Marti A, Iorio R, Nociti V, Patanella AK, Batocchi AP. CD8+ T cell effector and memory subpopulations in relapsing onset Multiple Sclerosis. 5th Joint Triennial Congress of the European and Americas Committees for Treatment and Research in Multiple Sclerosis. Am-sterdam October 19-22/2011. P326

Plantone D, Frisullo G, Marti A, Iorio R, Nociti V, Patanella AK, Batocchi AP. CD8+ T cell effector and memory subpopulations in Multiple Sclerosis. XXI AINI Congress. Pollenzo, 22-25 settembre 2011

Frisullo G, Iorio R, Plantone D, Marti A, Nociti V, Patanella AK, Tonali P, Batocchi AP. Involvement of circulating Perforin+ CD8+ T cells and Perforin+CD8+CD56+dim NK cells in MS disability pro-gression. 10th International Congress of Neuroimmunology (ISNI), Sitges (Barcellona, Spain) 26-30 October 2010

Frisullo G, Iorio R, Plantone D, Marti A, Nociti V, Patanella AK, Tonali P, Batocchi AP. Involvement of circulating Perforin+ CD8+ T cells and NK cells in MS disability progression. XX AINI Congress. Stresa 30/9-3/10/2010


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STUDIO DEI MECCANISMI MOLECOLARI DEL DANNO NEURONALE NELLE MALATTIE NEURO INFIAMMATORIE

RESPONSABILE DEL PROGETTOLUCA MUZIODipartimento di NeuroscienzeFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Milano

Collaboratori:ROBERTA DE CEGLIAANDREA BERGAMASCHI

Collaborazioni con altri gruppi:ANDREA MENEGON GIANCARLO FERRIGNO


Diverse alterazioni neurologiche sono solitamente associate alla sclerosi multipla (SM). Queste sono associate a perdita di tessuto neuronale e alterazioni permanenti a carico di assoni. Di-verse evidenze sperimentali suggeriscono che la persistenza nel tessuto nervoso di molecole proinfiammatorie può indurre alterazioni neuronali che, in seconda battuta portano ad una disfunzione funzionale delle cellule neurali. Il primo obbiettivo che ci siamo posti è stato quello di studiare il ruolo di diverse citochine pro infiammatorie in reti neurali realizzate su dispositivo di registrazione Micro Electrode Array (MEA). In seconda battuta, abbiamo confrontato i nostri dati elettrofisiologici con il profilo di espressione genica indotto da queste molecole nei neuroni e con il profilo di espressione genica studiato in animali affetti da Encefalite Autoimmune Spe-rimentale (EAE). Durante la seconda parte del progetto ci siamo posti l’obbiettivo di estendere le nostre osservazioni cercando altri meccanismi potenzialmente coinvolti nel danno neuronale. A questo proposito abbiamo esplorato le alterazione di canali neuronali del Na+/Ca2+ che in diversi modelli di neurogenerazione sono responsabili del danno neuronale. Durante l’infiam-mazione acuta è stata ripetutamente descritta un’acidificazione della matrice extracellulare. Solitamente questa deriva da alterazioni del bilancio energetico cellulare che portano ad un accumulo di acido lattico e quindi un acidificazione della matrice extracellulare. Questo ab-bassamento del pH locale può attivare dei canali sensibili ai protoni che a loro volta inducono un esagerato ingresso di Na+/Ca2 nei neuroni. Questi protoni possono attivare proteasi che distruggono il citoscheletro dei neuroni. Nella seconda parte del progetto ci siamo occupati di studiare il loro ruolo nei processi neurodegenerativi tipici della SM.

RISULTATI

Nella prima parte del progetto abbiamo valutato il ruolo di citochine pro-infiammatorie (TH1) su reti neurali coltivate su speciali dispositivi di registrazione elettrofisiologica (MEA). La nostra ricerca ha portato alla realizzazione di nuovi algoritmi per l’analisi di queste reti neurali ed a una serie di risultati che indicano un coinvolgimento diretto delle molecole proinfiammatorie nel controllo della funzione neuronale. I dati elettrofisiologici ottenuti sono stati confrontati con dati di espressione genica fatti su neuroni trattati con queste citochine ed in topi affetti da EAE. Questi dati sono particolarmente interessanti sia per la comprensione di nuovi meccanismi patogenetici che per lo sviluppo di nuove molecole potenzialmente utilizzabili per promuovere neuroprotezione. Abbiamo poi esplorato altri meccanismi coinvolti nei processi di danno neu-ronale. Diverse evidenze sperimentali suggeriscono che durante l’episodio infiammatorio si ve-rifica anche una acidificazione della matrice extracellulare. In modelli sperimentali di SM questa acidificazione è stata misurata e raggiunge valori intorno a pH 6.6. Gli effetti della acidificazione sugli oligodendrociti e sugli astrociti sono stati studiati da diversi gruppi di ricerca, mentre gli effetti dell’abbassamento del pH sui neuroni, ed il loro contributo nel processo patologico, sono ancora poco noti. Durante il secondo anno del progetto abbiamo studiato gli effetti dell’acidi-ficazione su reti neurali coltivate su MEA. Sorprendentemente i neuroni sottoposti a pH acido mostravano una severa alterazione di molti parametri elettrofisiologici, suggerendo che l’acidi-ficazione della matrice extracellulare può interferire con il funzionamento neuronale. Confron-46 47


tando i dati ottenuti da queste reti neuronali con quelli ottenuti nella prima parte del progetto abbiamo realizzato, sorprendentemente, che il contributo dell’acidificazione è sicuramente più eclatante nel promuovere danno cellulare che quello mediato dalle citochine proinfiammatorie.

CONCLUSIONI

Il danno neuronale osservato sia nei pazienti con SM che in modelli sperimentali di SM è stato sempre considerato successivo agli episodi di demielinizzazione. Tuttavia i nostri dati sugge-riscono fortemente che citochine proinfiammatorie, secrete durante gli episodi infiammatori, possono direttamente interagire con i neuroni. Queste interazioni producono alterazioni fun-zionali dei neuroni che nel lungo termine possono portare ad una sofferenza cellulare. Un’altra causa di danno cellulare è l’acidificazione della matrice cellulare. Lo studio dell’effetto dell’aci-dificazione sui neuroni ha evidenziato come piccole riduzioni del pH producano forti alterazioni funzionali nei neuroni. In conclusione, i nostri dati mettono in evidenza che sia le molecole secrete che variazioni dell’ambiente extracellulare sono mediatori del danno neuronale. Questi dati possono contribuire allo sviluppo di piattaforme sperimentali per testare farmaci neuropro-tettori.

STUDY OF THE MECHANISM(S) OF NEURONAL DEGENERATION DURING INFLAMMATORY DEMYELINATING DISORDERS


Patients with multiple sclerosis (MS) experience acute episodes of neurological dysfunctions that are only partially recovered. Indeed, these patients accumulate disabilities during disease progression that are linked to axonal damage and loss of grey matter within the Central Nervous System (CNS). In this project we have explored the contribution of secreted pro-inflammatory cytokines to the neural derangement by using primary neural cultures and Micro Electrode Ar-ray (MEA) device. We have also explored whole transcriptome in mice affected by Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) and in neurons exposed to pro-inflammatory cytokines. Among mechanisms leading functional alterations of neurons there are specific alterations of neuronal ionic channels The over loading of Na+/Ca2+ in neurons during the inflammatory insult, induces toxicity and leads to neuronal vulnerability. The excessive Na+/Ca2+ influxes activate proteases that disrupt the cytoskeleton, causing axonal swelling and neuronal degene-ration. Blood-brain barrier leakage, excitotoxic neuronal death, oedema and inflammation are common features of MS and EAE. They can cause mitochondrial inhibition, energetic failure, as well as lactate acidification of the extracellular matrix. Because the extracellular pH in a damaged CNS may decrease by more than two pH units during tissue acidosis, the selective activation of H+-gated cation channels might result of pivotal importance to mediate neuronal derangement. In the second part of this project we have explored the contribution of specific proton sensitive channels to the neural derangement occurring in EAE.

RESULTS During the first year of this project we outlined the effects of proinflammatory cues on neuronal networks. We firstly set up methods for primary neuronal cultures plated on MEA devices and then we developed new algorithms for the analysis of these networks. Electrophysiological data derived from neurons receiving proinflammatory cytokines (TH1) were compared with gene expression obtained by whole transcriptome analysis performed in primary neuronal cul-tures and EAE mice. Recent cogent findings suggest that inflamed regions of the CNS display acidification. Indeed, mitochondrial dysfunction causes a reduction of the ATP production that leads to acidification. This occurs in inflamed lesions of EAE mice and strong evidence suggest that also patients with MS might suffer of similar phenotype. Measures performed in vivo in

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EAE mice, during acute inflammation, indicated that physiological pH values dropped to values around pH 6.6. Although, a large body of experimental evidence suggests that acidification occurring in the inflamed CNS can negatively modulate oligodendrocyte homeostasis, very few studies investigated the effects of low pH on neuronal functioning. During the second year of this project we attempted to fill this gap of knowledge. Indeed, we performed several experi-ments, in vitro, on MEA and in vivo in the chronic EAE animal model to establish the effects of low pH on neuronal networks. Interestingly, low pH treatments affected neuronal bursting acti-vity and impaired neuronal spike firing, suggesting that the acid milieu might take fundamental part to axonal and neuronal derangements.

CONCLUSIONS The central dogma of pathogenesis and neuronal derangement in MS and in its animal models, is that neurodegeneration occurs after demyelination. However, our data support the notion that proinflammatory molecules, per se, might induce significant damages in neurons. We also explored the consequence of tissue acidification on primary neuronal cultures. Because the pH of the extracellular matrix decreases during acute inflammatory insults, we investigated the effects of acidification on primary neuronal cultures. The acidification induces a significant alteration of the electrophysiological activity of neurons, that might impair neuronal survival and functioning. All in all, our data suggests that independently of demyelination, secreted molecules and reduction of pH in the extracellular matrix are trigger signals inducing neuronal derangement. Our model recapitulate in vitro same alterations that possibly occur in vivo, thus it may be of interest for testing new neuroprotective drugs.

PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI Muzio L, De Ceglia R, Biffi E, Menegon A, Comi G, Centonze D, Furlan R, Martino G. The inflam-matory milieu causes neuronal degeneration in murine neuronal networs. COST meeting (Final Management Committee and Working Groups Meeting), Dublin Ireland, June 3rd 2011

Muzio L. The inflammatory milieu causes neuronal degeneration in murine neuronal networs. Invi-ted speaker at XXI AINI congress Pollenzo (Cuneo, Italy) September 22-25, 2011

De Ceglia R, Biffi E, Comi G, Martino G, Menegon A. and Muzio L. The detrimental role of inflam-mation in neuronal networks. PhD program translational and molecular medicine DIMET (Univer-sity of Milan Bicocca, Milan, Italy)

Rossi S, Muzio L, De Chiara V, Grasselli G, Musella A, Musumeci G, Mandolesi G, De Ceglia R, Maida S, Biffi E, Pedrocchi A, Menegon A, Bernardi G, Furlan R, Martino G. and Centonze D. Im-paired striatal GABA transmission in experimental autoimmune encephalomyelitis doi:10.1016/j.bbi.2010.10.004 Brain, Behavior and Immunity 2010

PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 per un periodo di 2 anni - 100.000 €

CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DEI LINFOCITI T HELPER (TH)17 NELLA SCLEROSI MULTIPLA ED ANALISI DEI MECCANISMI DELLA LORO INATTIVAZIONE

RESPONSABILE DEL PROGETTOFRANCESCO NOVELLIProfessore AssociatoDipartimento Medicina e Oncologia Sperimentale Università di Torino

Collaboratori:SIMONA ROLLALAURA CONTIDANIELA BOSELLIVALENTINA BARDINAROBERTA CURTO

Collaborazioni con altri gruppi:Luca Durelli, Marinella Clerico, Divisione di Neurologia, Università di Torino Facoltà San Luigi Gonzaga, Ospedale S. Luigi Gonzaga, OrbassanoAntonio Uccelli, Unità di Neuroimmunologia, Dipartimento di Neuroscienze Oftalmologia e Genetica, Università di GenovaFrancesco Ria, Gabriele Di Sante, Istituto di Patologia Generale Università Cattolica del S. Cuore, RomaRaffaele De Palma, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale Seconda Università di Napoli, Napoli


I linfociti T helper (Th) 17 sono una sottopopolazione di cellule CD4+ che producono IL-17 e coinvolte nell’infiammazione e in diverse patologie autoimmuni sperimentali. Noi abbiamo precedentemente dimostrato che i linfociti Th17 si espandono nel sangue periferico (SP) nei pazienti con SM in fase attiva. La maggior parte delle informazioni sullo sviluppo e la funzione dei linfociti Th17 derivano tuttavia dallo studio di modelli murini deficitarii per le diverse com-ponenti coinvolte nel segnale delle citochine; l’immunologia clinica ha messo però in evidenza numerose differenze tra il modello sperimentale di SM e la SM nell’uomo. Infatti se da un lato il deficit del gene per l’IFNγ o la somministrazione di anticorpi anti-IFNγ esacerbava la malat-tia mentre la somministrazione di Interferone (IFN)γ curava la malattia del topo, nell’uomo la somministrazione di IFNγ ne esacerbava i sintomi. Al contrario, L’IFNβ che attiva il segnale di STAT1 così come l’IFNγ, è stato il primo farmaco approvato per il trattamento cronico della SM. A questo proposito, abbiamo osservato che i linfociti Th17, rispetto ai linfociti Th1, l’altra popolazione coinvolta nella SM, esprimono più alti livelli della catena 1 del recettore per l’IFNβ e sono molto più sensibili ai suoi effetti inibitori. Questo progetto aveva lo scopo di caratterizzare i linfociti Th17 nella SM, capire come gli interferoni ne influenzassero lo sviluppo e valutare se la modulazione del segnale IFN/STAT1 potesse costituire un approccio terapeutico in grado di controllare lo sviluppo dei linfociti Th17 nelle malattie autoimmuni. Ci siamo proposti quindi di:1) chiarire il ruolo patogenetico dei linfociti Th172) chiarire i meccanismi della terapia con IFNβ nei pazienti con SM3) dare informazioni su come la regolazione del segnale IFNγ/STAT1 potesse inibire lo sviluppo dei linfociti Th17.

RISULTATI

Lo scopo di questo progetto era quello di caratterizzare funzionalmente i linfociti Th17 nella SM e di valutare se l’attivazione del segnale di STAT1 da parte dell’IFNβ o dell’IFNγ potesse efficacemente inibire l’espansione dei linfociti Th17. Per fare questo, abbiamo studiato le cellule mononucleate del sangue periferico ottenute da 50 pazienti con SM e 30 volontari sani. Lo svolgimento di questo studio ci ha permesso di:1) identificare una nuova popolazione coinvolta nella SM costituita da linfociti T CD4+ produ-centi IL-22. Abbiamo osservato che nel sangue periferico dei pazienti con SM l’aumento dei Th17 è accompagnato da quello di cellule CD4+ producenti IL-22 (linfociti Th22) che sono distinte dai Th17. Il legame dell’IL-22 prodotta dai linfociti Th22 ai recettori espressi sulla bar-riera emato-encefalica risulta nell’interruzione di questa e permette ai linfociti T infiammatori di

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raggiungere il sistema nervoso centrale.2) identificare il recettore per le chemochine CCR6, e non il CCR4, come marcatore dei linfociti Th17 nella SM. I linfociti Th17 autoreattivi esprimono alti livelli del CCR6, il quale media il reclu-tamento di questi al sistema nervoso centrale.3) chiarire i meccanismi attraverso i quali l’IFNβ inibisce i linfociti Th17. Abbiamo dimostrato che l’IFNβ è in grado di inibire direttamente i linfociti Th17 già differenziati. vi) identificare la catena 2 del recettore per l’IFNγ e la sua kinasi associata JAK2 come fattori chiave nell’inibizione dei linfociti Th17 da parte dell’IFNγ. Entrambi le molecole sono essenziali per la trasmissione del segnale dell’IFNγ. Abbiamo osservato che l’espressione della catena 2 del recettore per l’IFNγ e della sua chinasi associata JAK2 aumentano nei linfociti Th17 dei pazienti con SM in fase attiva, ma non in quelli in fase stabile o nei soggetti sani. A causa dell’aumento dell’espressione della catena 2 del recettore per l’IFNγ e della sua kinasi associata JAK2, il trattamento in vitro con IFNγ riduce significativamente la proliferazione dei linfociti Th17.

CONCLUSIONI

I dati ottenuti in questo programma di ricerca insieme alle nostre precedenti osservazioni (Durelli et al., Ann Neurol 2009) suggeriscono che i segnali antiproliferativi dipendenti da STAT1 sono inducibili nei linfociti Th17 sia dagli Interferoni di tipo I (IFNβ) che di tipo II (IFNγ) e dipendono dall’espressione dei loro recettori che varia durante lo sviluppo dei linfociti Th17. Così, l’espan-sione e la contrazione dei linfociti Th17 potrebbe essere strettamente controllata dai linfociti Th1 o dalle cellule NK attraverso la produzione di IFNγ, e dalle cellule dendritiche attraverso la produzione di IFN di tipo I. Sia JAK2 che la catena 2 del recettore per l’IFNγ potrebbero essere considerati come marcatori della fase attiva della SM e potrebbero funzionare come marcatori prognostici della sensibilità agli Interferoni. Questo studio potrebbe così essere un trampolino di lancio per l’identificazione di nuovi marcatori prognostici per gestire la terapia con IFNsy nei pazienti con SM.

FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF T HELPER (TH) 17 LYMPHOCYTES IN MULTIPLE SCLEROSIS AND ANALYSIS OF THE MECHANIMS OF THEIR INACTIVATION


T helper (Th)17 is a subset of IL-17-producing CD4+ cells that induce tissue inflammation and have been associated with many experimental autoimmune diseases and human inflammatory conditions. We have demonstrated that peripheral blood (PB) Th17 cells were expanded in the active phase of multiple sclerosis. So far, most of the information on Th17 development and function has been obtained from murine models knocked out for genes of various compo-nents of the cytokine signalling pathway. Coming to clinical immunology, a surprising difference between a human disease and its animal model, the experimental autoimmune encephalomye-litis, was evident. While Interferon (IFN)γ administration greatly worsened clinical signs of disea-se activity in multiple sclerosis, the administration of IFNγ ameliorates experimental autoimmu-ne diseases and administration of antibodies to IFNγ or knocking out IFNγ gene exacerbated this disease. By contrast, IFNβ, which activated dowstream STAT1 signalling pathway as IFNγ, was the first drug approved for chronic multiple sclerosis treatment. We showed that Th17 cells expressed higher level of the chain 1 of the receptor for IFNβ and are more susceptible than Th1 cells, the other Th subset involved in multiple sclerosis, to its inhibitory effects. In this project we carried out studies aimed to characterize Th17 lymphocytes in multiple scle-rosis, investigate the role of IFNs in their development and evaluate whether the modulation of the IFNs/STAT1 pathway constitute a therapeutic strategy to control Th17 involvement in autoimmune diseases. We intended to: 1. clarify the pathogenic role of Th17 cells in multiple sclerosis

G. Contessa, S.De Mercanti, M. Clerico, A. Di Liberto, A Giai Via, S. Rolla, V. Bardina, A. Uccelli, M. Zaffa-roni, P. Cavalla, L. Rinaldi, C. Comi, R. Cavallo, L. Sosso, F. Novelli, L. Durelli. T-helper (Th) 22 as an early marker that could anticipate disease activity in multiple sclerosis. 5th joint triennial congress EC TRIMS, 19 – 22 October 2011, Amsterdam, NL, published on Multiple Sclerosis Journal, 17(Suppl.10), 345

S. Rolla, V. Bardina, M. Clerico, P. Bonaventura,P. Quaglino, G. Contessa, L. Durelli and F. Novelli. A new T helper subset producing Interleukin 22 increases in multiple sclerosis patients. 2011 Joint Annual Meeting SIICA DGfl, Sept 28-Oct 1 2011, Riccione

S. Rolla, G. Di Sante, M. Clerico, C. Nicolò, A.K. Patanella, A. Amoroso, M.E. Fasano, A.P.Batocchi, F. Ria and F. Novelli. Characterization Of Autoreactive TCR Repertoire In Patients Affected By Multiple Sclerosis. 2011 Joint Annual Meeting SIICA DGfl, Sept 28-Oct 1 2011, Riccione

De Palma R, Conti L, Rolla S, Boselli D, Rodolico G, Silveinnonen O, Clerico M, Contessa G, Durelli L, Novelli F. JAK2 is overexpressed in human multiple sclerosis Th17 cells and stabilizes cell surface ex-pression of IFN-gammaR2. 2011 Joint Annual Meeting SIICA DGfl, Sept 28-Oct 1 2011, Riccione

G. Contessa, S.De Mercanti, M. Clerico, A. Di Liberto, A Giai Vai, S. Rolla, V. Bardina, A. Uccelli, M. Zaffaroni, P. Cavalla, L. Rinaldi, C. Comi, R. Cavallo, L. Sosso, F. Novelli, L. Durelli. T-helper (Th) 22 as an early marker that could anticipate disease activity in multiple sclerosis. XLII Congress of the Italian Neurological Society, Torino, October 22-25, 2011, published on Neurological Sciences, 32 (Suppl), 179

S. Rolla , M. Clerico, V. Bardina, P. Bonaventura,P. Quaglino, G. Contessa, L. Durelli and F. Novelli. Cir-culating T helper 22 cells increase in multiple sclerosis patients: phenotypical and functional characteri-zation. 5th International Conference on Autoimmunity: Mechanisms and Novel Treatments, Sept. 23-28, 2011,Crete, Greece

F. Novelli, R. De Palma, S. Rolla, L. Conti, M. Clerico, G. Contessa, O. Silveinnonen and L. Durelli. JAK2 is overexpressed in human multiple sclerosis Th17 cells and stabilizes cell surface expression of IFN-gammaR2. Immunology 2001,98th Annual Meeting of AAI, San Francisco, May 13-17 2011, published on J Immunol 2011 186:114

L. Durelli, M. Clerico, S. Rolla, G. Contessa, S. De Mercanti, A.Cucci, V. Bardina, A. Di Liberto, A. Uc-celli, M. Zaffaroni, P. Cavalla, L. Rinaldi, C. Comi, L. Sosso, R. Cavallo, P. Quaglino, F. Novelli. T-helper (Th)22, a newly identified lymphocytes subset, increases 1-3 months before an MS relapse and it is not sensitive to IFNβ. 63rd AAN Annual Meeting, Honolulu, April 9-16, 2011, published on Neurology, 76(9), Suppl.4, 374

S .Rolla, V. Bardina, M. Clerico, L. Durelli and F. Novelli. T helper 22 cells increase in multiple sclerosis patients: phenotypical and functional characterization. 8th Joint Conference of the ICS and ISICR, Chi-cago, October 3-7 2010, published on Cytokine,2010: 52(1-2), doi:10.1016/j.cyto.2010.07.053

S. Rolla, L. Conti, R. De Palma, D. Boselli, V. Bardina, G. Rodolico, O.Silveinnonen, M. Clerico, L. Durelli, and F. Novelli. In human multiple sclerosis, T helper 17 lymphocytes display increased levels of JAK2 that stabilize cell surface IFN-gR2 chain. 8th Joint Conference of the ICS and ISICR, Chicago, October 3-7 2010, published on Cytokine,2010: 52(1-2), doi: 10.1016/j.cyto.2010.07.362

S. Rolla, L. Conti, M. Clerico, L. Durelli and F. Novelli. Longitudinal analysis of IL-17 and/or IL-22 produ-cing CD4+ T lymphocytes in relapsing remitting multiple sclerosis. WIRM 2010, Davos, March 29 –April 1 2010

L. Durelli, M. Clerico, S. Rolla, G. Contessa, S. De Mercanti, A. Uccelli, M. Zaffarono, P. Cavalla, L. Rinal-di, C. Comi, R. Cavallo, L. Sosso, F. Novelli. Can the increase of T-helper 17 lymphocyte percentage in peripheral blood anticipate a relapse in relapsing remitting multiple sclerosis? 2010 AAN Annual mee-ting, Neurology 2010; 74; 9 (supplement 2)

G. Contessa, M. Clerico, S. Rolla, S. De Mercanti, A. Uccelli, M. Zaffarono, P. Cavalla, A. Mattioli, E. Romagnolo, L. Rinaldi, G. Comi, R. Cavallo, L. Sosso, F. Novelli, L. Durelli. Can the increase of T-helper 17 lymphocyte percentage in peripheral blood anticipate a relapse in relapsing-remitting multiple scle-rosis? Mult. Scler. 2010; 16 (suppl.10)


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2. clarify the mechanisms of the IFNβ-based therapy in multiple sclerosis.3. provide information on how the regulation of IFNγ/STAT1 signaling and of IFNγ receptor would inhibit the development of Th17 lymphocytes.

RESULTS The aim of this research program was to functional characterize human Th17 cells in multiple sclerosis and to evaluate whether the activation of the IFNs/STAT1 pathway could efficiently inactivate Th17 expansion. We collected peripheral blood mononuclear cells from 50 patients with relapsing-remitting multiple sclerosis and 30 age- and gender-matched healthy volunteer subjects. The accomplishment of this project allowed us to:1) identify IL-22 producing CD4+ T cells as a new T cells subset involved in multiple sclerosis. We observed that in the peripheral blood of multiple sclerosis patients the increasing number of Th17 cells is paralleled by that of IL-22-producing CD4+ cells (Th22 cells), distinct from Th17 cell. The binding of IL-22 secreted by Th22 to its receptor expressed on the blood brain barrier results in its disruption and allows to inflammatory T cells to reach the central nervous system.2) identify the chemochine receptor CCR6, and not CCR4, as a marker of self-reactive Th17 cells in multiple sclerosis. Autoreactive Th17 cells expresses high levels of CCR6 that serves to recruit them in the central nervous system.3) elucidate the mechanism through IFNβ inhibits Th17 cells. We have found that IFNβ acts directly to inhibit differentiates humanTh17 cells. 4) to identify IFNγ receptor2 and its cognate kinase JAK2 as key factors in the inhibition of Th17 cells by IFNγ. Both components are essential to transmit the signal of IFNγ to the nucleus. We have found a increased expression of IFNγ receptor 2 and its cognate kinase JAK2 on Th17 cells in the peripheral blood of multiple sclerosis patients in the active phase of the disease, but not in patients in inactive phase or healthy subjects. Because of the increased expression of IFNγ receptor 2 and JAK2 in Th17 cells, the in vitro IFNγ treatment induced significant decrease of their proliferation.

CONCLUSIONS Overall, the data obtained from this research program together with our previous results (Durelli et al., Ann Neurol 2009) suggest that STAT1-dependent antiproliferative signals are always in-ducible in Th17 cells by type I (IFNβ) or II (IFNγ) IFNs, depending on their receptor expression, which varies during their life. Thus, expansion and contraction of Th17 cells could be strictly controlled by Th1 and NK cells, through IFNγ production, and by activated dendritic cells, through type I IFN production. Either JAK2 and IFNγ receptor 2 could be both markers of the active phase of multiple sclerosis and could be used as predictor of the sensitivity to IFNs. This study provides a springboard for the assessment of new prognostic markers for the indication of IFNβ management in multiple sclerosis patients.


Conti L, De Palma R, Rolla S, Boselli D, Rodolico G, Kaur S, Silvennoinen O, Niccolai E, Amedei A, Ivaldi F, Clerico M, Contessa G, Uccelli A, Durelli L, Novelli F. Th17 Cells in Multiple Sclerosis Express Higher Levels of JAK2, Which Increases Their Surface Expression of IFN-γR2. J Immunol. 188(3):1011-8, 2012

Rolla S, Clerico M, Bardina V, Quaglino P, Durelli L and. Novelli F. Phenotypical and functional characte-rization of T Helper 22 cells in Multiple Sclerosis patients. Keystone Symposia: Th17 Cells in Health and Disease, February 5 - 10, 2012 • Keystone, Colorado

Boselli D, Ragimbeau J, Orlando L, Cappello P, Capello M, Ambrogio C, Chiarle R, Marsili G, Battistini A, Giovarelli M, Pellegrini S, Novelli F. Expression of IFNγR2 mutated in a dileucine internalization motif reinstates IFNγ signaling and apoptosis in human T lymphocytes. Immunol Lett. 134(1):17-25; 2010

Di Sante G, Patanella AK, Rolla S, Nicolò C, Migliara G, Piermattei A, Valentini M, Novelli F, Batocchi AP, Ria F. MBP 85-99-specific TCR repertoire in DR2+ patients affected by multiple sclerosis. 5th joint triennial congress EC TRIMS, 19 – 22 October 2011, Amsterdam, NL, published on Multiple Sclerosis Journal, 17(Suppl.10), 128

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CONOSCERE LE CAUSE DELLA MALATTIASTUDIO PILOTA PER DETERMINARE IL CONTRIBUTO DEI NEUTROFILI NELLO SVILUPPO DI MALATTIA IN DUE MODELLI ANIMALI PER LA SCLEROSI MULTIPLA CHE MIMANO LA FORMA ACUTA E RECIDIVANTE-REMITTENTE DI MALATTIA

RESPONSABILE DEL PROGETTOROBERTA RIGOLIOAssegnista di Ricerca Dipartimento di Neuroscienze e Tecnologie BiomedicheUniversità di Milano-Bicocca

Collaboratori:GUIDO CAVALETTI PAOLA PALESTININORBERTO OGGIONICHIORAZZI ALESSIA CRISTINA MEREGALLIELISA BALLARINIFEDERICA AVEZZA

Collaborazioni con altri gruppi:LUCA CRIPPA, DVM - ISTOVET


La sclerosi multipla (SM) è una patologia infiammatoria cronica neurodegenerativa e, come nel caso del suo modello animale, l’Encefalomielite Autoimmune Sperimentale (EAE), si ritiene che le cellule T dell’immunità adattativa giochino un ruolo chiave nello sviluppo della malattia stessa. Le cellule dell’immunità innata sono poco considerate sia nell’eziopatogenesi che nel decorso della SM e dell’EAE. All’interno di questa popolazione spesso dimenticata, i neutrofili costituiscono la sottopopolazione più abbondante ed in grado di influenzare attivamente la risposta adattativa così come di essere sensibili alle modificazioni citochimiche sia nella SM che nell’EAE. Lo scopo del nostro lavoro è stato quello di chiarire il potenziale ruolo dei neu-trofili nell’attivazione delle cellule T e nel decorso cronico dell’EAE indotta e valutata nei ratti Dark Agouti (DA). L’EAE sviluppata nel ratto DA è caratterizzata dalla comparsa dei primi segni clinici 10-11 giorni dopo l’immunizzazione (dpi) con un peggioramento dei segni neurologici fino a 14dpi e un andamento remittente recidivante fino almeno a 40dpi mimando, almeno in parte, la forma più frequente di malattia tra i pazienti con SM. Per verificare il coinvolgimento dei neutrofili nella fase cronica o di induzione dell’EAE i neutrofili sono stati depletati dal sangue impiegando un siero specifico (aNEU) somministrato a giorni alterni A) iniziando al picco di malattia (13dpi) fino a 35dpi oppure B) iniziando il giorno precedente quello dell’induzione fino a otto dpi, periodo di tempo necessario perché si sviluppino le cellule T autoreattive. Abbiamo quindi valutato l’andamento di malattia fino a 35 o 28dpi rispettivamente. Inoltre, per escludere un potenziale effetto confondente sull’andamento di malattia dovuto alle IgG presenti nel siero o allo stress da manipolazione, un gruppo di animali è stato trattato con un siero di controllo (NRS) ottenuto dalla stessa specie animale in cui è stato prodotto l’aNEU.

RISULTATI

La somministrazione di siero aNEU iniziata a 13dpi non migliora l’andamento di malattia. Al contrario quando i ratti ricevono il siero durante la fase di induzione, si osserva un sorprendere-te ed inaspettato miglioramento del decorso dell’EAE già a partire dai giorni seguenti il 14dpi, così che la malattia stessa sembra assumere un andamento acuto-monofasico. D’altro canto questo effetto non è genericamente dovuto al siero, dal momento che esso il NRS non sortisce alcun effetto sull’andamento di malattia.Per comprendere i meccanismi attraverso cui il siero aNEU abbia agito, abbiamo quindi deciso di analizzare diversi parametri noti per essere modificati nel corso dell’EAE acuta-monobasica indotta nei ratti Lewis.

Ci siamo quindi focalizzati inizialmente su parametri macroscopici, i.e. la formula ematica ed il peso corporeo. Sorprendentemente il numero di neutrofili circolanti nei ratti trattati con quattro dosi di siero aNEU è paragonabile a quello degli animali affetti da EAE. D’altra parte sia negli animali tratti con aNEU che NRS si osserva un recupero più veloce del peso corporeo rispetto agli animali EAE.Abbiamo valutato di seguito alcuni parametri cellulari e molecolari che caratterizzano l’anda-mento monofasico nei ratti Lewis e che in letteratura, sono alterati in una forma acuta di EAE indotta nei DA. Perciò la nostra analisi è incentrata sulla milza e sulle tre porzioni di midollo spinale. Così rileviamo che il siero aNEU non è in grado di contrastare l’ipoplasia della sostanza bianca né la riduzione nella frequenza delle cellule T regolatorie indotta da EAE nella milza a 14 e 28dpi né di modificare il grado di infiltrazione leucocitaria del midollo spinale a 14dpi. A 14dpi tuttavia i osserva negli animali trattati con aNEU un aumento nel grado di distribuzione delle cellule macrofagiche ED1+ nel tratto cervicale di midollo spinale, mentre a 28dpi il siero aNEU non ha alcun effetto né sull’eterogeneo grado di distribuzione di cellule ED1+ né sull’espressio-ne della chemochina MCP-1 (monocytes chemoattractive cytokine 1) tra i differenti tratti indotti dalla malattia. Più interessante invece è l’azione del siero aNEU a 28dpi sull’espressione genica delle citochine indotte da EAE nel midollo. Sebbene infatti il siero aNEU contrasti la variazione dell’espressione delle citochine pro-(INFγ and TNFα) e anti-infiammatorie (TGFβ and IL10) in-dotta dalla EAE,in ogni tratto di midollo considerato, i cambiamenti più rilevanti si osservano a livello del tratto cervicale dove l’espressione di entrambe le tipologie di citochine è addirittura raddoppiata negli animali trattati con siero aNEU rispetto agli EAE.A 28dpi abbiamo considerato infine l’effetto che il siero aNEU potesse avere sui processi di demielinizzazione a carico del midollo spinale. Tuttavia i nostri dati preliminari mostrano che il trattamento con aNEU non è in gardo di interferire con il grado di espressione dell’RNA della proteina basica della mielina (MBP).

CONCLUSIONI

I neutrofili non sembrano essere strettamente necessari né nella fase cronica né per l’induzione dell’EAE e il loro significativo incremento nel sangue sembra essere per lo più dovuto a fattori legati all’andamento naturale della malattia.Tuttavia il siero aNEU modifica il decorso di malattia quando viene somministrato durante la fase di induzione della stessa trasformando una forma cronica di EAE una acuta-monofasica. Il siero aNEU non modifica né l’ipoplasia della sostanza bianca e la frequenza di cellule Treg nella milza né il grado di infiltrazione leucocitaria nel midollo spinale a picco di malattia. Inoltre il siero aNEU sembra modificare principalmente il grado di distribuzione di cellule macrofagiche al picco di malattia e l’effetto maggiore è a carico del tratto cervicale a 28dpi. Infine il siero aNEU non sembra avere alcun effetto sull’espressione genica della MBP rispetto agli animali EAE.

A PILOT STUDY TO INVESTIGATE THE CONTRIBUTION OF NEUTROPHILS TO TWO MULTIPLE SCLEROSIS RAT MODELS DEVELOPMENT WHICH MIMIC RESPECTIVELY THE ACUTE AND THE RELAPSING-REMITTING FORM OF THE DISEASE


Multiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory neurodegenerative disease and, as it happens for its animal model, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), it’s believed to be mainly sustained by the action of T cells which belong to the adaptive immunity. Thus the innate immune system cells are poorly considered both in MS and EAE etiopathogenesis and clini-

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cal disease course. Among this neglected immune system arm, the neutrophils are the most abundant subpopulation and have been showed to shape the adaptive immune response as well as to be responsive to environmental changes during the disease course. Only few data are present in literature on the neutrophils involvement in both MS and EAE. Thus our founded work dealt with the potential role of neutrophils in shaping the T cell activa-tion or in sustaining EAE chronic course as it has been induced and evaluated in Dark Agouti (DA) rat chronic model. DA EAE model is characterized by the clinical signs appear on 10-11days post EAE induction (dpi) with the disease worsening up to 14 dpi while the animals experience a series of subse-quent relapses and remissions up to at least 40 dpi. DA EAE animal model mimics at least in part the most frequent MS form, the relapsing remitting one. To test the neutrophil involvement in induction and chronic phase of the disease, we depleted the circulating neutrophils by in-traperitoneally injection of specific anti-neutrophil serum (aNEU) every other day starting the treatment A) around the disease peak, on 13dpi, and up to 35dpi or B) the day before EAE induction up to eight dpi that means depletion of neutrophils was effective during the time reasonably necessary to the induction of autoreactive T cells. Thus we evaluated the clinical course up to 35 or 28 dpi respectively. Moreover to exclude the confounding effect on clinical course due to the serum IgG and manipulation stress, a group of EAE DA rats receive normal rabbit serum (NRS), where the aNEU serum was obtain from.

RESULTS While aNEU administration started on 13dpi did not improve the mean clinical score, when DA rats received a presyntomatic aNEU-treatment the results was unexpected and surprising. In fact while there were no differences between EAE and aNEU-treated rats up to the peak of the disease (14dpi), a quite complete remission of the clinical signs occurred soon after it so that the clinical course seemed to acquired an acute-monophasic course profile. This effect could not just be referred to serum itself since the clinical course of NRS- treated animals was indistinguishable from that observed in EAE rats.To elucidate the potential mechanisms induced by aNEU in DA rats we investigated the chan-ges occurring in several parameters already known to be involved in the acute monophasic EAE course in Lewis rat.Thus we considered the main macroscopic changes that aNEU treatment can induce, i.e. blo-od formula and body weight changes. Surprisingly even after receiving four aNEU doses, the circulating absolute neutrophil number increased with the same extent in both aNEU–treated and EAE rats while the body weight gain was faster in aNEU as well as in NRS treated rats compared to EAE rats.We then deepened our investigation focusing on those cellular and molecular parameters which generally characterize the monophasic course in the acute Lewis rat and that in literature are referred to an acute form of EAE induced in DA rats as well. Therefore we considered the changes occurring in the spleen, and in the three different sections of the spinal cord. As shown by our results, aNEU did not neither affected the white pulp hypoplasia induced by EAE nor the reduction in the naturally occurring regulatory T cells frequency in the spleen on both 14 and 28dpi. At the same time aNEU did not influence the spinal cord infiltrating leukocytes degree at the peak of the disease whereas an interesting increase in the distribution degree of ED1+ macro-phagic cells occurred in the cervical spinal cord section. On the other hand on 28dpi we observed heterogeneity in ED1+ cells distribution degree as well as in the gene expression of the monocytes chemoattractive cytokine 1 (MCP-1) among the three different spinal cord sections in EAE animals and no effect of aNEU on both of them.More interestingly on 28dpi aNEU seemed to alter the gene expression section-dependent profile induced by EAE. Although it counteracted the effect of EAE on both the pro- (INFγ and TNFα) and anti-inflammatory (TGFβ and IL10) cytokines gene expression, the most interesting changes occurred in the cervical section where the relative expression level of both the kind of cytokines even doubled in aNEU-treated rats compared to the EAE ones.On 28dpi we also considered the potential effect of aNEU on the EAE-induced demyelination

process in the spinal cord. Nevertheless our preliminary results pointed out aNEU could not affect the myelin basic protein (MBP) mRNA expression.

CONCLUSIONS The neutrophils neither seem to be strictly important for EAE induction nor for EAE chronic pha-se and their relevant increase seem to be mostly a results of the disease natural course since the repeated depletion performed has no effect on their circulating number.Nevertheless aNEU treatment affects the clinical course when it is administered during the induction phase of EAE transforming a chronic form of EAE into an acut- monophasic one. aNEU doesn’t affect neither EAE occurring changes in spleen structure and Treg presence, nor the spinal cord leukocyte infiltration degree at the disease peak. Moreover aNEU-treatment seems mainly to affect the macrophagic cells distribution degree at the peak of the disease and although aNEU affects heterogeneously pro- and anti-inflammatory cytokine expression in the spinal cord, the main differences are evident in the cervical section on 28dpi. Finally aNEU does not seem to affect MBP expression in comparison with the EAE animals.


Rigolio R, Magni A, Ballarini E, Meregalli C, Chiorazzi A, Sala B, Carozzi V, Canta A, Avezza F, Oggioni N, Crippa L, Cavaletti G. Preventive treatment with anti-rat neutrophil serum affects the relapsing phase in Dark Agouti EAE rats. XXI AINI congress 2011 (22nd-25th September, Pollenzo, Italy) Abstract book

Ballarini E, Carozzi V, Canta A, Chiorazzi A, Meregalli C, Avezza F, Crippa L, Oggioni N, Cavaletti G, Rigolio R. Neutrophil contribution and immunoglobulin effect in Dark Agouti Experimental Au-toimmune Encephalomyelitis. XX AINI congress 2010 (30th September – 3rd October, Stresa, Italy) Abtract book


RUOLO DELLE CELLULE NATURAL KILLER CD56bright NELLA SCLEROSI MULTIPLA

RESPONSABILE DEL PROGETTOALICE LARONIDipartimento di Neuroscienze Oftalmologia e Genetica, Università di Genova

MENTORE:ANTONIO UCCELLI


Un insufficiente controllo della risposta autoimmune da parte di cellule regolatorie del sistema immunitario potrebbe essere alla base della sclerosi multipla (SM).Le cellule natural killer (NK) sono una parte del sistema immunitario innato capaci di interagire con componenti del sistema immunitario regolandone l’attivazione. Le cellule NK si dividono nella sottopopolazione CD56dim, predominante nel sangue periferico (90-94%) e nella piccola sottopopolazione CD56bright, con funzione immunoregolatoria. Le cellule CD56bright secerno-no grandi quantità di citochine e fattori di crescita. Un funzionamento difettivo delle cellule CD56bright è stato chiamato in causa per la patogenesi dell’autoimmunità, anche se il loro ruolo nella SM non è chiaro.Non è noto, ad esempio, quali sottopopolazioni NK infiltrino il sistema nervoso centrale (SNC) nella SM. Le cellule CD56bright sono significativamente espanse nei pazienti con SM trattati con interferone beta e con daclizumab (DAC), anticorpo monoclonale attualmente in fase di sperimentazione per la SM. In un trial con DAC, l’aumentato numero di CD56bright correlava positivamente con la diminuzione di lesioni attive alla risonanza magnetica e con la diminuzione di cellule T CD4 e CD8 circolanti. Gli studi in vitro avevano dimostrato che le cellule NK espan-se durante la terapia con DAC inibivano la sopravvivenza delle cellule T in modo contatto-dipendente. Scopo di questo studio è definire il ruolo delle cellule NK nella patogenesi della SM. Un sottostudio ha valutato il fenotipo e la funzionalità delle cellule NK in pazienti trattati con natalizumab. Tale terapia, indicata per la SM aggressiva e altamente efficace, può portare a complicanze infettive e neoplastiche che potrebbero essere causate da un’alterata funziona-lità delle cellule NK, dato il ruolo centrale di tale popolazione cellulare nell’immunosorveglianza contro infezioni virali e tumori.

RISULTATI

La caratterizzazione delle cellule NK nel liquido cefalorachidiano ha dimostrato la presenza di un’aumentata percentuale di cellule CD56bright CCR7 positive nei soggetti con SM rispetto ai controlli con altre malattie neurologiche. Questo potrebbe rappresentare un meccanismo di compenso della risposta autoimmune centrale. È stata studiata la funzionalità delle cellule NK in persone con SM precoce non trattate ed in controlli sani. Difficoltà metodologiche relative al basso numero di cellule CD56bright nel sangue periferico sono state affrontate e risolte. Le cel-lule CD56bright di persone con SM e controlli sani, purificate e stimolate sono state coltivate con linfociti T autologhi. Abbiamo dimostrato che le cellule CD56bright di controlli sani, sottoposte ad attivazione con citochine, sopprimono la proliferazione di linfociti autologhi; tale funzione è difettiva nei pazienti con SM. Esperimenti di real-time PCR e studi funzionali sono in corso per spiegare il meccanismo molecolare alla base di tale osservazione. Lo studio di real-time PCR su cellule NK purificate in pazienti con SM all’esordio ha dimostrato una diminuita espressione di Granzyme K da parte delle cellule CD56bright di persone con de-corso aggressivo. Sottostudio su cellule NK e natalizumab. Il recettore di natalizumab, a4 integrina, è risultato espresso in misura analoga dalle cellule CD56bright e CD56dim. Le cellule CD56dim, coltivate in presenza di natalizumab, diminuiscono in modo significativo l’espressione di alfa4 integrina; tale diminuzione è molto più marcata per le cellule NK attivate, che svolgono funzione citotos-sica. Questo potrebbe causare un diminuito passaggio attraverso la barriera ematoencefali-ca delle cellule in grado di contrastare infezioni virali, come la leucoencefalopatia multifocale

progressiva, che può complicare il trattamento con natalizumab. Natalizumab inoltre tende a diminuire la proliferazione delle cellule NK attivate. Esperimenti di cocoltura di cellule CD56dim con cellule di melanoma hanno dimostrato una conservata citotossicità per le cellule tumorali in presenza di natalizumab anche ad alte concentrazioni.

CONCLUSIONI

Nelle persone con SM una compromissione della funzione immunoregolatoria delle cellule CD56bright potrebbe essere alla base della disregolazione della risposta immune e di perdita della tolleranza immunologica che caratterizzano la patologia. La comprensione del mecca-nismo patogenetico alla base di tale deficit permetterà di sviluppare terapie mirate. La terapia con natalizumab potrebbe portare a complicazioni virali e neoplastiche a causa di un’alterata immunosorveglianza delle cellule NK CD56dim.

DISSECTION OF THE ROLE OF CD56bright NATURAL KILLLER CELLS IN MULTIPLE SCLEROSIS


MS pathogenesis may be associated with a defect in the control of autoreactive immune cells. Natural Killer (NK) cells are a key component of innate immune system (IS), interacting with cells of the innate and adaptive immune system regulating their activation. Circulating NK cells can be divided in the predominant (90-95%) CD56dim NK cell subset, strongly cytotoxic, and in the small CD56bright NK cell subset, which displays significant “immunoregulatory” properties. CD56bright NK cells, indeed, are able to secrete different cytokines and growth factors like GM-CSF. The possible role of CD56bright NK cells in the pathogenesis of autoimmunity in general, and MS in particular, has been hypothesized but is not known. While a few scattered NK cells could be observed in MS lesions, nothing is known about their phenotype and their presence in the central nervous system.CD56bright NK cells were reported to expand significantly in MS patients treated with interferon beta and with the anti-CD25 monoclonal antibody daclizumab (DAC). In a trial with DAC, the increased number of CD56bright NK cells correlated with a decreased number of Gad+ lesions on MRI as well as with the decline of circulating CD4+ and CD8+ T cells. The in vitro studies showed that NK cells expanded during DAC therapy limit the survival of activated T cells in a contact-dependent manner. Aim of this work is to characterize the role of NK cells in the pa-thogenesis of MS. A substudy was aimed to evaluate the phenotype and function of NK cells in subjects treated with natalizumab. Such therapy, highly effective for the treatment of aggressive MS can lead to infective and neoplastic complications which could be caused by an impaired functionality of NK cells, central players in the immunosurveillance against viral infections and neoplasms.

RESULTS The characterization of NK cells in the cerebrospinal fluid has demonstrated an increased per-centage of CD56bright NK cells compared to controls with other neurologic diseases. This might represent a compensative mechanism of the autoimmune response in the central nervous system (CNS). The functionality of NK cells in patients with early MS and healthy controls has been investigated. Methodological pitfalls concerning the low number of circulating CD56bright

NK cells have been addressed and resolved. CD56bright from MS patients and health controls have been purified, stimulated and cultured with autologous T lymphocytes. We have observed a suppressive capacity of CD56bright on autologous T cells in healthy controls, which was impai-red in MS. Real-time PCR experiments and functional assays are currently ongoing to explain such difference. A real-time PCR study on CD56bright NK cells in early MS has shown a decreased expression of Granzyme K in CD56bright NK cells of subjects with aggressive disease. 58 59


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Substudy on NK cells and natalizumab. The receptor of natalizumab, is expressed by both CD56bright and CD56dim with a similar pattern. CD56dim NK cells, cultured in presence of nata-lizumab, decrease significantly the expression of alpha-4 integrin; such decrease is significantly more marked in activated NK cells, which perform the cytotoxic function. This might cause an impaired transit through the blood brain barrier to the CNS of cells capable of blocking viral infections, such as the multifocal progressive leukoencelphalopathy, which can be a complica-tion of natalizumab treatment. Moreover, natalizumab decreases the proliferation of activated NK cells. Experiments of coculture of CD56dim NK cells and melanoma cells have shown that treatment with natalizumab does not alter CD56dim-mediated cytotoxicity.

CONCLUSIONS In patients with MS an impairment of the immunoregulatory function of CD56bright NK cells might cause a dysregulation of the immune response and the loss of immunological tolerance that characterize the disease. Understanding the pathogenetic mechanism causing such impai-rment will permit to develop therapies targeting NK cells functions. Natalizumab might lead to viral and neoplastic complications due to an impaired immunosurveillance of CD56dim NK cells.

BORSA DI RICERCA FINANZIATA CON IL BANDO FISM 2009per un periodo di 2 anni - 44.000 €

TOPI CD1 - TRANSGENICI COME NUOVO MODELLO SPERIMENTALE PER LO STUDIO DELLA SM

RESPONSABILE DEL PROGETTOLUCIA MORIExperimental ImmunologyDepartment of Biomedicine, University Hospital Basel, Switzerland

Collaboratori:GENNARO DE LIBERO, Prof. M.D., Ph.D. Scientific advisor, University of Basel, SwitzerlandHUESEYIN DUYAR, M.D. Research collaborator, University Hospital Basel, SwitzerlandFEDERICA FACCIOTT, Ph.D. Research collaborator, University Hospital Basel, SwitzerlandHANS LASSMANN, Prof. M.D. Scientific advisor, Medical University of Vienna, Austria


La sclerosi multipla (SM) è una malattia molto complessa, caratterizzata dalla progressiva di-struzione delle guaine dei neuroni del sistema nervoso centrale, che sono essenziali per la conduzione dell’impulso nervoso. Le cellule del sistema immunitario sono responsabili della risposta autoimmune. Mentre la risposta immunitaria diretta verso la componente proteica di queste guaine è stata studiata in dettaglio, solo recentemente si è cominciato a studiare la risposta immunitaria diretta verso la componente lipidica che rappresenta il 70 % della guaina mielinica. In studi precedenti avevamo riscontrato nel sangue periferico di pazienti con SM un aumento della frequenza di cellule T specifiche per glicolipidi self e prospettato un loro possibile ruolo nella patogenesi della malattia. La maggior parte degli studi volti a capire le cause della SM e quelli per valutare l’attività di nuovi farmaci e composti terapeutici, sono basati sull’uso di modelli sperimentali in animali da laboratorio. L’encefalomielite autoimmune nel topo (EAE) è il modello sperimentale piu’ frequentemente utilizzato perché presenta molte caratteristiche in comune con la SM, sebbene non riproduca perfettamente tutti gli aspetti clinici della malattia umana. Allo scopo di studiare in vivo il ruolo delle cellule T autoreattive e specifiche per glico-lipidi self nella patogenesi della malattia, abbiamo generato topi geneticamente modificati che esprimono molecole CD1b umane che presentano questi lipidi. Il nostro scopo è di utilizzare le peculiarità di questi topi transgenici per ottenere un nuovo modello sperimentale di EAE che ci permetta di studiare i meccanismi con cui le cellule T lipide-specifiche contribuiscono allo sviluppo della SM ed anche al controllo di questa malattia.

RISULTATI

Le risorse disponibili hanno permesso di ottenere i seguenti risultati. Topi transgenici che espri-mono la molecola CD1b umana (CD1B tg) sono molto piu’ suscettibili allo sviluppo di EAE rispetto ai topi non-tg. La malattia si sviluppa infatti precocemente dopo la classica immuniz-zazione e con aumentate severità ed incidenza. Solo negli animali CD1B tg sono stati osservati episodi di recrudescenza della malattia. Analisi istopatologiche preliminari effettuate su tessuto nervoso centrale e periferico hanno tuttavia evidenziato che i topi CD1B tg sviluppano un qua-dro infiammatorio e di demielinizzazione meno accentuato rispetto ai topi di controllo. Questa discrepanza sarà oggetto di ulteriori approfondimenti. Allo scopo di studiare i motivi per cui i topi CD1B tg sviluppano una forma di malattia diversa dai topi di controllo, abbiamo studiato lo sviluppo della EAE in due ulteriori modelli transgenici: topi Lck-CD1B tg che esprimono le mo-lecole CD1b esclusivamente nel timo e topi Eα-CD1B tg che esprimono queste molecole nelle cellule periferiche. Nessuno di questi due tipi di animali ha sviluppato una malattia significativa-mente diversa da quella di animali di controllo, confermando la nostra ipotesi che il fenomeno osservato nei topi CD1B tg richiede l’espressione contemporanea delle molecole CD1b sia negli organi linfoidi centrali che in quelli periferici. Un’importante implicazione dei nostri risultati è che i topi CD1B tg sviluppano una risposta autoreattiva diretta contro molecole lipidiche self a seguito della reazione infiammatoria e demielinizzante che si sviluppa dopo la classica immu-nizzazione con peptidi MOG in adiuvante. Per dimostrare la presenza di cellule T specifiche per lipidi della mielina, abbiamo stimolato linfociti di topi CD1B tg con malattia con estratti lipidici di mielina. Queste cellule hanno proliferato ed hanno rilasciato citochine pro-infiammatorie in vitro

dopo stimolazione con i lipidi e cellule presentanti l’antigene che esprimevano molecole CD1b. Gli obiettivi di partenza di questo progetto pilota sono stati raggiunti.

CONCLUSIONI

I risultati ottenuti suggeriscono un ruolo attivo delle cellule T lipide-specifiche nella patogenesi della EAE e confermano i dati precedentemente pubblicati dal nostro gruppo in pazienti con SM. L’isolamento di cellule T specifiche per molecole lipidiche e la caratterizzazione della strut-tura di tali molecole permettera’ di prospettare nuove strategie terapeutiche e sarà fondamen-tale per l’identificazione di eventuali marcatori biologici caratteristici di questa malattia.

TRANSGENIC MICE TO STUDY GLYCOLIPID-SPECIFIC IMMUNE RESPONSE IN MS


In multiple sclerosis (MS) an immune response against myelin-derived self lipids is generated. We have previously observed an increased frequency of CD1b-restricted T cells specific for glycolipid components of myelin, in the peripheral blood of MS patients. These T cells release proinflammatory lymphokines. To study in vivo the role of these autoreactive cells in the pa-thogenesis of autoimmunity, we have generated transgenic (tg) mice expressing human CD1b antigen-presenting molecules. Our aim is to exploit these tg mice as a new animal model for experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) to understand the contribution of lipid-specific T cells to immunopathogenesis and/or immunoregulation of the disease.The aim of our studies is to investigate the relevance of lipid-specific T cells in the autoimmu-ne response leading to brain tissue damage and MS. We studied EAE in a new humanized transgenic mouse model. The clinical and histopathological disease progression, the presence of self-glycolipid-specific T cells and the nature of self-lipids involved in brain autoimmune at-tack is being investigated. This model may provide new insights into the disease pathogenesis revealing novel associated antigens and new possible therapeutic options of MS.

RESULTS Transgenic mice expressing human CD1b molecules (CD1B tg) are more susceptible to EAE than non-tg mice. After immunization with MOG35-55 peptide in complete Freund’s adjuvant, CD1B tg mice develop a clinical disease with earlier onset, increased incidence and severity. In addition, CD1B tg mice have disease relapses 30-40 days after immunization, which were never described in C57BL/6 mice. Histopathological analyses of nervous system tissues from CD1B tg and non-tg mice were performed to evaluate: I) the number of perivascular inflamma-tory infiltrates in spinal cord, II) the number of T cells in spinal cord, III) the score of demyelina-tion of spinal cord, IV) the percentage of demyelinated areas in spinal cord, v) the topography of inflammatory lesions within different brain areas, and vi) peripheral nervous system lesions (spi-nal roots, trigeminal ganglia and sciatic nerve). The results obtained in a small series of animals at two different disease time points, showed that CD1B tg mice have milder histopathological signs of EAE with moderate inflammation and demyelination when compared to non-tg mice. Thus, a discrepancy between clinical and histopathological results was observed. To evaluate whether the observed differences in clinical EAE between CD1B tg and non-tg mice required the expression of CD1b in particular organs and cell types, EAE was induced in the other two transgenic mouse lines which we have previously generated. In Lck-CD1B tg, CD1b is exclu-sively expressed in immature thymocytes, thus, presentation of CD1b-restricted lipids in the periphery is not possible. In Eα-CD1B tg, CD1b in only expressed on antigen-presenting cells like dendritic cells, macrophages, and B cells, but not in the thymus, where CD1b-restricted T cells are supposed to be selected. Disease was compared to that developing in CD1B tg (derived from intercrossing Lck-tg with Eα-CD1B tg) expressing CD1b both in the thymus and 62 63


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in the periphery. EAE developed with significantly earlier onset, higher incidence and severity in CD1B tg mice. The other two groups develop instead a disease which is not significantly diffe-rent from the one observed in C57BL/6 mice. The results indicate that proper tissue expression of CD1b is necessary for disease aggravation and suggest that autoreactive T cells need a selection event in the thymus and proper stimulation in the periphery. One possible explanation of our results is that in CD1B tg mice following MOG-peptide immunization, self-lipids become target of specific T cells. To demonstrate that spreading of lipid antigens occurs during EAE, T cells were isolated from CD1B tg mice with disease and tested for their reactivity by using antigen-presenting cells expressing CD1b and myelin-derived glycolipids. Preliminary studies showed that in CD1B tg mice T cells specific for self-glycolipids are present, proliferate and release pro-inflammatory, but not anti-inflammatory cytokines.

CONCLUSIONS The results described here provide a basis for further understanding the mechanisms of EAE and MS pathogenesis. The isolation of T cells specific for lipids and the characterization of the structures of immunogenic lipids will be instrumental for the design of new therapeutic strate-gies and for the identification of lipids as disease-specific biomarkers.

PUBBLICAZIONI E COMUNICAZIONI A CONGRESSI Duyar H, Facciotti F, De Libero G. and Mori L. Humanized CD1B-transgenic mice to study glyco-lipid-specific immune responses in EAE. Abstract for ECTRIMS, 19-22 October 2011 Amsterdam, The Netherlands

Duyar H, Facciotti F, Lassmann H, De Libero G. and Mori L. Human CD1B-transgenic mice to study glycolipid-specific immune responses in EAE. Poster at FISM Research Meeting 2010, 26-27 May 2010, Rome, Italy

Duyar H, Facciotti F, Lassmann H, De Libero G. and Mori L. Humanized CD1B-transgenic mice to study glycolipid-specific immune responses in EAE. Abstract and oral presentation at the Swiss MS Society Researcher Meeting, 3 September 2010, Zurich, Switzerland


qualità della vita e riabilitazione

INDAGINE POSTALE DI AUTO-VALUTAZIONE DEL BENESSERE FISICO E PSICOLOGICO NEGLI ADULTI CON SM E NELLE PERSONE A LORO VICINE: FOLLOW-UP A LUNGO TERMINE (STUDIO POSMOS)

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QUALITÀ DELLA VITA E RIABILITAZIONE

RESPONSABILE DEL PROGETTOALESSANDRA SOLARINeurologoUnità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano

Collaboratori:ANDREA GIORDANO, GIUSI FERRARI, Unità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano

Collaborazioni con altri gruppi:DAVIDE RADICE, Divisione di Epidemiologia e Biostatistica, Istituto Europeo di Oncologia, MilanoLUIGI BISANTI, Servizio di Epidemiologia, Azienda Sanitaria Locale, MilanoGIORGIA RANDI, Servizio di Epidemiologia, Azienda Sanitaria Locale, Milano


L’indagine postale sullo stato di salute degli adulti con sclerosi multipla (SM) ed i loro cari (Stu-dio POSMOS) è uno studio di popolazione longitudinale, condotto nella provincia di Milano. Nel 1999 abbiamo estratto un campione casuale di 400 adulti con SM dall’Archivio Sanitario della Regione Lombardia, e abbiamo spedito loro il Multiple Sclerosis Quality-of-Life-54 (MSQOL-54), un questionario demografico e clinico, ed una lettera illustrativa dello studio (partecipazione del 65%). Nel 2004 abbiamo ricontattato la coorte, inviando loro gli stessi questionari ed il Chicago Multiscale Depression Inventory (CMDI). Inoltre, abbiamo inviato lo Short Form-36 (SF-36) ed il CMDI alla persona vicina al paziente (SO). Quattordici (6%) persone con SM sono morte nei 5 anni, 32 (13%) non hanno restituito i questionari, mentre 205 hanno partecipato. La parteci-pazione delle persone vicine al paziente è stata pari al 74%. Lo studio attuale (2010) si è rivolto alle 237 persone con SM che erano viventi, le quali hanno ricevuto gli stessi materiali del 2004. Inoltre, 300 persone non affette da SM hanno ricevuto gli stessi materiali inviati ai SO. Questa popolazione di controllo è stata estratta casualmente dal database dei residenti nella provincia di Milano, ed appaiata per sesso ed età (decadi) ai SO. Gli obiettivi principali dello studio erano: (A) Valutare prospetticamente i cambiamenti nello stato di salute e nella qualità di vita (QDV) nel corso di 11 anni in una coorte di persone con SM di popolazione; (B) Valutare la qualità di vita e i sintomi depressivi nelle persone vicine ai pazienti, confrontandoli con una popolazione di controllo di analoga età, sesso e area di residenza.

RISULTATI

Hanno partecipato all’indagine del 2010 205 persone con SM: 14 (6%) della coorte originaria sono decedute, mentre 32 (13%) non hanno re-inviato i questionari compilati. Hanno parteci-pato 142 SO (età media 53.1 anni; 50% donne). I SO erano: partner in 92 (65%), figlio in 18 (13%), genitore in 17 (12%), ed altro familiare in 6 (4%). Dei 300 controlli di SO contattati, 120 (40%) hanno restituito i questionari completati. Poiché nessuno dei controlli nella classe di età più giovane (18-30) ha partecipato, l’età dei controlli è risultata in media 5 anni più elevata di quella dei SO (p=0.005). Le altre caratteristiche demografiche dei controlli partecipanti erano simili a quelle dei SO e dei controlli che non hanno partecipato all’indagine. L’analisi longitudi-nale della coorte delle persone con SM (1999/2004/2010) è in corso. L’analisi di SO e controlli è stata completata, e viene sintetizzata di seguito. Le variabili associate ad un peggior punteg-gio alla scala vitalità dell’SF-36 nel modello di regressione logistica ordinale erano: essere un SO (proportional odds ratio, POR 0.45; 95%CI 0.28–0.70), sesso femminile (POR 0.41; 95%CI 0.27–0.64) ed età (POR 0.98; 95%CI 0.97–0.99), controllando per il grado di scolarità. Le variabili associate ad un peggior punteggio alla scala salute mentale dell’SF-36 erano: essere un SO (POR 0.62; 95%CI 0.40–0.96), sesso femminile (POR 0.43; 95%CI 0.28–0.67) ed età (POR 0.98; 95%CI 0.97–0.99), controllando per il grado di scolarità. Le variabili associate ad un punteggio patologico al CMDI “sintomi depressivi” (modello logistico) erano:essere un SO (OR 2.42; 95%CI 1.14–5.15) ed avere un punteggio patologico al CMDI “sintomi vegetativi” (OR

2.01; 95%CI 1.02–3.99) controllando per sesso, età e grado di scolarità. Il sesso femminile (OR 3.24; 95%CI 1.63–6.44) e l’età (OR 1.04; 95%CI 1.01–1.07) erano predittivi anche di un pun-teggio patologico al CMDI “sintomi svalutativi”. I SO dei pazienti più compromessi (EDSS au-to-determinata > 6.5) avevano punteggi significativamente peggiori all’SF-36 “funzione fisica” (p=0.02) e “limitazioni di ruolo fisiche” (p=0.02). Tuttavia, questo effetto non era più presente nel modello di regressione logistica ordinale, ove la presenza di un punteggio patologico al CMDI “sintomi depressivi” nella persona con SM si associava a valori significativamente più bassi in gran parte delle scale dell’SF-36 dei SO. Altre variabili predittive di peggiore QDV erano l’età anziana (associata ad un punteggio significativamente più basso in tutte le scale dell’SF-36) ed il sesso femminile nei SO (SF-36 “vitalità”, POR 0.32; 95%CI 0.15—0.67 e “salute generale”, POR 0.42;95%CI 0.19—0.92). L’unico predittore di punteggio alterato al CMDI “sintomi de-pressivi” dei SO era un punteggio alterato alla stessa scala dei rispettivi cari con SM (OR 8.24; 95%CI 3.16—21.54). Questo aveva un effetto indipendente sul CMDI “sintomi vegetativi” (OR 9.25; 95%CI 3.33—25.68) e CMDI “sintomi svalutativi” (OR6.27; 95%CI 2.38—16.50).

CONCLUSIONI

Le persone vicine ai pazienti con SM hanno un punteggio significativamente più basso in SF-36 “vitalità” ed una tendenza a valori più bassi in SF-36 “salute mentale”, ed un aumento signifi-cativo dei sintomi depressivi rispetto ai controlli. Questi dati sono stati confermati nei modelli multivariati, dopo controllo per sesso, età e studi. In questi modelli è emerso un aumento si-gnificativo di peggior QDV (domini mentale e vitalità) ed un aumento significativo (pari a circa due volte) di valori patologici per scale depressiva e vegetativa del CMD. Il carico psicologico dei SO è risultato particolarmente elevato per le donne e gli anziani, e non è parso influenzato dalla gravità della SM quanto dalla presenza di sintomi depressivi nella persona con SM. I nostri risultati sono consistenti con gli studi che indicano la necessità di interventi mirati a ridurre lo stress e la depressione nei caregiver delle persone con SM.

A POSTAL SURVEY OF SELF-ASSESSED HEALTH OF ADULTS WITH MULTIPLE SCLEROSIS AND THEIR SIGNIFICANT OTHERS: LONG-TERM FOLLOW-UP (POSMOS STUDY)


The postal survey of self-assessed health of adults with multiple sclerosis (MS) and their signifi-cant others (POSMOS Study) is a longitudinal population-based survey, being carried out in the Province of Milan, Italy. In 1999 a random sample of 400 MS adults was identified from the Lom-bardy Region Health Register, and sent the Multiple Sclerosis Quality-of-Life-54 (MSQOL-54), a general and clinical questionnaire, and a letter explaining the study and soliciting participation; 65% responded. We re-assessed the cohort in 2004, sending the same questionnaires plus the Chicago Multiscale Depression Inventory (CMDI). Health-related quality of life (Short Form-36) and CMDI were also assessed in a significant other. Fourteen (6%) people with MS had died and 32 (13%) did not return the questionnaires; thus 205 participated. A significant other was available for 74% of responders. The present, most recent (2010) study cohort was made of the 237 people from POSMOS Study who were alive: they received the same materials as in 2004. In addition, 300 persons without MS received the same questionnaires as controls for the MS patients’ significant others. This control population was selected at random from people living in the province of Milan, and matched by sex and age (decade) to the significant others. We had two main objectives: (A) To prospectively assess changes in self-perceived health status and health-related quality of life (HRQOL) over 11 years in our community cohort

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Giordano A, Ferrari G, Radice D, Randi G, Bisanti L, and Solari A on behalf of the POSMOS study. Health-related quality of life and depressive symptoms in significant others of people with multiple sclerosis: A community study. Eur J Neurol 2012 Jan 10. doi: 10.1111/j.1468-1331.2011.03638.x. [Epub ahead of print]

Giordano A, Ferrari G, Radice D, Bisanti L, and Solari A on behalf of the POSMOS study. Depres-sive symptoms in people with multiple sclerosis and their significant others: a population-based study. 16th Annual Conference of RIMS, 13-14 May 2011, Turku, Finland

Giordano A, Ferrari G, Radice D, Bisanti L and Solari A on behalf of the POSMOS study. Significant others of people with multiple sclerosis have low SF-36 energy and mental health scores. 16th Annual Conference of RIMS, 13-14 May 2011, Turku, Finland


of MS adults; (B) To assess health-related quality of life and depressive symptoms in patients’ significant others, in comparison to a contemporaneous age and sex-matched control group from the same community.

RESULTS A total of 205 people participated to the 2010 assessment: 14 (6%) of the original MS cohort had died and 32 (13%) did not return the questionnaires. Overall, 142 SOs (mean age 53.1 years; 50% women) participated. The SO was the partner in 92 (65%) cases, a son/daughter in 18 (13%), a parent in 17 (12%), and a relative in 6 (4%). Of 300 SO controls contacted, 120 (40%) sent back completed questionnaires, none in 18-30 year class, so that on average controls were five years older than SOs (p=0.005). The remaining characteristics of responder controls were similar to those of SOs (and of non-responder controls).A. The longitudinal analysis of the cohort of MS patients (1999/2004/2010) is ongoing.B. The cross sectional analysis of SOs and controls is reported below.Variables independently associated with worse SF-36 vitality scale score (ordered logistic re-gression models) were: being SO (proportional odds ratio, POR 0.45; 95% CI 0.28–0.70), female sex (POR 0.41; 95% CI 0.27–0.64) and older age (POR 0.98; 95% CI 0.97–0.99) after controlling for education. Predictors of poor SF-36 mental health score were: being SO (POR 0.62; 95% CI 0.40–0.96), female sex (POR 0.43; 95% CI 0.28–0.67) and older age (POR 0.98; 95% CI 0.97–0.99) after controlling for education. Variables independently associated with pathologic CMDI mood (logistic model) were: being SO (OR 2.42; 95% CI 1.14–5.15) and vegetative score (OR 2.01; 95% CI 1.02–3.99) after controlling for sex, age, and education. Being a woman (OR 3.24; 95% CI 1.63–6.44) and older age (OR 1.04; 95% CI 1.01–1.07) were also independently associated with pathologic CMDI vegetative score. Patient characteristics affecting SOs’ wellbeing - Effect of MS severity on SO HRQOL and depressive symptoms SOs differed in SF-36 physical function (p=0.02) and physical role limitation score (p=0.02) in relation to the severity of compromise of their MS companions (assessed by self-determined EDSS score), such that score for these scales were worse in SOs whose companions had more severe MS. However, this difference was not present in the ordered logistic regression models. In these models, EDSS > 6.5 did not retain any effect on the SF-36 scale scores, while pathologic CMDI mood of the MS companion was associated with a worse score in most SF-36 scales. Other independent variables were older SO age (associated with a worse score in all SF-36 scales) and female sex of the SO (associated with worse SF-36 vitality [POR 0.32; 95% CI 0.15—0.67] and general health [POR 0.42; 95% CI 0.19—0.92]).The only predictor of pathologic CMDI mood in the SO was pathologic CMDI mood in the MS companion (OR 8.24; 95% CI 3.16–21.54). The latter also had an independent effect on pathologic vegetative (OR 9.25; 95% CI 3.33–25.68) and evaluative score (OR 6.27; 95% CI 2.3816.50).

CONCLUSIONS We found that SOs of people with MS had a worse SF-36 vitality scale score and tended to have a worse SF-36 mental health score than controls; they also had significantly more de-pressive symptoms than controls. These findings were confirmed by the multivariable models adjusted for sex, age and education, in which SOs had a significantly increased risk of lower HRQOL for vitality and mental health domains, and significantly greater (two-fold) risk of pa-thologic CMDI mood and vegetative scores. The psychological burden of SOs was particularly high in women and in the elderly. This burden seemed not to be influenced by disease severity but by the presence of depressive symptoms in their MS companions. Our results are consistent with research suggesting a need for interventions to reduce stress and depression for the caregivers of people with MS, and indicate that such interventions should not be limited to the SOs of severely compromised MS people.

PREFERENZE INDIVIDUALI E PARTECIPAZIONE ALLE DECISIONI MEDICHE NELLA SM

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RESPONSABILE DEL PROGETTOANDREA GIORDANOUnità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano

MENTOREALESSANDRA SOLARI


La mia borsa di ricerca è parte di un progetto collaborativo internazionale chiamato “Prefe-renze di ruolo, conoscenza del rischio e decision-making nelle persone con SM” (AutoMS–ww.automsproject.org). Nell’ambito dello studio AutoMS, sono valutate prospetticamente le preferenze delle persone con SM riguardo la partecipazione alle decisioni mediche in 7 paesi europei (Germania, Italia, Francia, Belgio, Serbia, Estonia e UK), con un partner associato in Australia, usando metodologie condivise e strumenti validati. Il focus è posto maggiormente sui trattamenti disease-modifyng, e vi sono 3 linee di sviluppo:AutoMS-Preferenze: l’obiettivo era quello di validare linguisticamente il Control Preference Sca-le (CPS) nelle lingue dei paesi partecipanti, rivedere le immagini e “migrare” la versione su carta del CPS su una versione elettronica auto-somministrata (eCPS).AutoMS-Conoscenza del rischio: lo scopo era quello di produrre e validare linguisticamente nelle lingue dei paesi partecipanti un questionario sulla conoscenza del rischio per le persone con SM recidivante-remittente (RRMS-IRKQ).AutoMS-decision making: l’obiettivo era quello di valutare la relazione medico-paziente nel-le prime visite audio-registrate, utilizzando la scala Observing Patient Involvement (OPTION). Inoltre, sono state valutate l’influenza delle caratteristiche del medico e del paziente, e la prefe-renza di ruolo del paziente, sul punteggio ottenuto con l’OPTION. L’OPTION è una scala a 12 item, che valuta l’abilità del medico nel coinvolgere il paziente nel processo di decision-making. Le risposte a ciascun item sono disposte su una scala Likert a 5 punti, da 0 (min) a 4 (max); il punteggio totale è 0–48, ed è trasformato su una scala 0–100. Per impiegare l’OPTION è richiesta una formazione specifica. L’OPTION è disponibile in tedesco, italiano, francese, ingle-se e olandese. Nell’ambito dell’AutoMS, il mio impegno si è concentrato particolarmente sui sotto-studi AutoMS-Preferenze e Decision-making.

RISULTATI

AutoMS-Preferenze: un disegnatore professionista ha prodotto le nuove immagini del CPS, prendendo spunto dagli input degli autori italiani del CPS e dai commenti delle persone con SM che hanno preso parte alla fase pilota (J Neurol Sci 2008;275:86–91). Le nuove immagini sono state rifinite in una serie di fasi che hanno visto la partecipazione dei centri coinvolti nello studio AutoMS. Sono state poi valutate da 26 pazienti con SM italiani e tedeschi: 12 (46 %) erano donne, l’età mediana era 37 anni, la durata mediana di malattia era 9.3 anni e l’EDSS mediano 2.5 (range 0–6.0). Tre pazienti italiani hanno dato risposte incongruenti. I punteggi erano quindi disponibili per 23 pazienti (88%): di questi, 10 (44%) preferivano un ruolo collaborativo, 9 (39%) un ruolo attivo e 4 un ruolo passivo (17%). Le preferenze differivano tra i paesi, con i pazienti tedeschi che pre-ferivano maggiormente un ruolo attivo (p=0.02). Le nuove immagini sono state ben accettate da tutti i pazienti. La migrazione dalla versione cartacea del CPS a quella elettronica è stata effettuata in Italia, in modo che la versione elettronica corrispondesse, in termini di dimensioni del testo e immagini, di orientamento e di presentazione, alla versione cartacea. È in corso uno studio di equivalenza che confronta le due versioni utilizzando un disegno crossover.

CONCLUSIONI

Grazie al finanziamento della mia borsa di ricerca e al prezioso contributo dei ricercatori dello studio AutoMS, sono ora disponibili per le persone con SM, per le comunità scientifica e per il sistema sanitario, 5 strumenti.Il CPS è ora disponibile in una nuova forma elettronica auto-somministrata, che non richiede la presenza di un operatore per la somministrazione e che può essere impiegata sul web.Il vasto numero di registrazioni delle prime visite, fornirà a breve informazioni uniche sulla qualità delle visite presso i centri SM italiani e offrirà uno spaccato della capacità dei neurologi italiani di coinvolgere le persone con SM nelle decisioni mediche. I nostri risultati costituiranno la base per lo sviluppo di interventi atti a migliorare le abilità comunicative e di coinvolgimento dei neu-rologi durante le visite con i pazienti.

DECISION-MAKING PREFERENCES AND INVOLVEMENT IN CARE OF PEOPLE WITH MS


My research fellowship was part of an international collaborative project named “Autonomy Preferences, Risk Knowledge and Decision-making Performance in MS Patients” (AutoMS–www.automsproject.org). AutoMS prospectively evaluates preferences of MS patients regar-ding participation in medical decisions and their determinants across 7 European countries (Germany, Italy, France, Belgium, Serbia, Estonia, and UK) with an associated partner in Au-stralia, using shared methodologies and validated assessment tools. We focussed on most relevant decisions about disease-modifying treatment and we are pursuiting three lines: AutoMS-Preference: To linguistically validate the Control Preference Scale (CPS) in the parti-cipating countries, revise cartoons and migrate the interview-based version into an electronic self-administered version (eCPS). AutoMS-Risk knowledge: To produce and validate cross-culturally, a risk knowledge question-naire for RRMS patients (RRMS-IRKQ).AutoMS-Decision making: To assess the patient-physician relationship on audio-recorded first out-patient consultations using the Observing Patient Involvement (OPTION) scale. To assess the influence of patient’s and physician’s characteristics and of patient’s preferred involvement role (as assessed by the CPS) on the OPTION score. OPTION is a 12-item scale that assesses physicians’ ability to involve patients in decision-making. Each item is rated on a 5-point Likert scale ranging from 0 (min) to 4 (max); the total OPTION score range is thus 0–48, and is tran-sformed into a 0-100 score. OPTION rating requires a formal training. German, Italian, English, French and Dutch versions of the scale are available (www.optioninstrument.com). My commitment was to all sub-studies, with more specific focus in the AutoMS-Preference and Decision-making sub-studies.

RESULTS AutoMS-Preference: a professional cartoonist produced new CPS cartoons based on input from the authors of the Italian CPS and comments of people with MS who took part in the Ita-lian pilot testing (J Neurol Sci 2008;275:86–91). The new cartoons were refined in an iterative process which involved all the AutoMS centers, and then pilot tested on 26 Italian and German MS patients: 12 (46 %) were women; median age was 37 years; median disease duration 9.3 years; median EDSS score 2.5 (range 0–6.0). Three Italian MS patients gave incongruent answers. CPS scores were therefore available for 23 patients (88%): of these 10 (44%) prefer-red a collaborative role, 9 (39%) an active role; and only 4 (17%) a passive role. Role preference differed between countries with German patients preferring a more active role (p=0.02). The new cartoons were well received by all the patients (cognitive debriefing).

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Giordano A, Ferrari G, Radice D, Randi G, Bisanti L, and Solari A, on behalf of the POSMOS study. Health-related quality of life and depressive symptoms in significant others of people with multiple sclerosis: A community study. Eur J Neurol. 2012 Jan 10. doi: 10.1111/j.1468-1331.2011.03638.x. [Epub ahead of print]

Borreani C, Giordano A, Falautano M, Lugaresi A, Martinelli V, Granella F, Tortorella C, Plasmati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Bianchi E, Acquarone N, Miccinesi G, Solari A, on behalf of the SIMS-Trial group. Experience of an information aid for newly-diagnosed multiple sclerosis patients: a qualitative study on the SIMS-Trial. Health Expect 2011 Nov 1. doi: 10.1111/j.1369-7625.2011.00736.x. [Epub ahead of print]

Giordano A, Granella F, Lugaresi A, Martinelli V, Trojano M, Confalonieri P, Radice D, Solari, on behalf of the SIMS-Trial group. Anxiety and depression in multiple sclerosis patients around diagnosis. J Neurol Sci 2011; 307:86-91

Heesen C, Solari A, Giordano A, Kasper J, Köpke S. Decisions on multiple sclerosis immunotherapy: New treatment complexities urge patient engagement. J Neurol Sci 2011; 306: 192–197

Giordano A, Ferrari G, Radice D, Bisanti L, and Solari A on behalf of the POSMOS study. Depressive symptoms in people with multiple sclerosis and their significant others: a population-based study. Presented as poster at RIMS 2011 Conference, May 13-14 Turku, Finland

Giordano A, Ferrari G, Radice D, Bisanti L and Solari A on behalf of the POSMOS study. Significant others of people with multiple sclerosis have low SF-36 energy and mental health scores. Presented as poster at RIMS 2011 Conference, May 13-14 Turku, Finland

Heesen C, Köpke S, Kasper J, Giordano A, Van Nunen A, Vahter L, Drulovic J, Clanet M, Sharrack B, Fulcher G, Solari A, on behalf of the AutoMS-group. Risk knowledge and planned bEhavior que-stionnaires – new tools to assess decision-making in MS. Presented as poster at RIMS 2011 Confe-rence, May 13-14 Turku, Finland

Solari A, Falautano M, Giordano A, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Trojano M, Acquarone N, Tortorella C, Plasmati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Bianchi E, Miccinesi G, Borreani C, on behalf of the SIMSQual and SIMS-Trial groups. Health professionals’ perspective on information aid for newly-diagnosed MS patients: the SIMS-QUAL study. Neurol Sci 2010; 31: Suppl. (Abstract) S469-470

Solari A, Giordano A, Trojano M, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Confalonieri P, Tortorella C, Plasmati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Maggi L, Messmer Uccelli M, Pucci E, Borreani C, D’Alessandro R. Information preference of newly-diagnosed MS patients: Prospective assessment within the SIMS-Trial. Neurol Sci 2010; 31: Suppl. (Abstract) S469

Borreani C, Falautano M, Giordano A, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Trojano M, Acquarone N, Tortorella C, Plasmati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Bianchi E, Miccinesi G, Solari A, on behalf of the SIMS-Qual and SIMS Trial groups. Participants’ perspective on information aid for newly-diagnosed MS patients: the SIMS-Qual study. Mult Scler 2010; 16: Suppl.10 (Abstract) S21

Solari A, Giordano A, Trojano M, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Confalonieri P, Tortorella C, Pla-smati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Maggi L, Messmer Uccelli M, Pucci E, Borreani C, D’A-lessandro R, on behalf of the SIMS-Trial group. Information preference of newly-diagnosed MS pa-tients: Prospective assessment within the SIMS-Trial. Mult Scler 2010; 16: Suppl.10 (Abstract) S328

Solari A, Giordano A, Trojano M, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Confalonieri P, Tortorella C, Pla-smati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Messmer Uccelli M, Pucci E, Borreani C, D’Alessandro R, on behalf of the SIMS-Trial group. Anxiety and depression symptoms In newly-diagnosed multiple sclerosis patients. Mult Scler 2010;16: Suppl.10 (Abstract) S328

BORSA DI STUDIO FINANZIATA CON IL BANDO FISM 2009per un periodo di 2 anni - 42.000 €

Migration from interview-based to eCPS was performed in Italy so that the latter matched the paper cards in terms of size (cartoons and text), orientation and presentation (simultaneous administration of the five cards). Equivalence of the electronic and interview-administered CPS is now being assessed using a test-retest crossover design (plus cognitive debriefing in a subsample of patients assigned to receive eCPS after the interview CPS). AutoMS-Decision Making: I participated in translation and cultural adaptation of the PICS from the original US English into Italian, and coordinated/revised the corresponding procedure for the Dutch for Belgium, French, Estonian and Serbian versions. I coordinated/revised the translation and cultural adaptation of the OPTION from the original UK English into Estonian and Serbian. In September 2010 I was certified OPTION rater at the University of Verona. In October 2011 the 3rd AutoMS Investigators’ Meeting was held at AISM Casa Vacanze “I Girasoli” (Lucigna-no, Italy). The meeting was almost entirely dedicated to OPTION training in MS consultations: participants were 13 investigators from 5 AutoMS countries. Between April-December 2011 we audio-recorded 92 first consultations at the following MS Centers: Foundation Neurological Institute C. Besta–Milan (n=37), University G D’Annunzio, Chieti-Pescara (n=29), University of Sassari (n=6), and University of Bari (n=20). Verbatim transcripts of each consultation were produced. OPTION rating is ongoing.

CONCLUSIONS Thanks to my research fellowship, and to the valuable contribute of AutoMS investigators, five instruments are now available to the people with MS of Europe and to the research and health care community. The CPS is now available in a patient self-assessed, use-friendly electronic version that does not require involvement of any operator/personnel, and can be used also on the web.The large number of first consultations recorded will shortly provide unique information on the quality of the consultations in Italian MS centers and the aptitude of Italian neurologist to involve MS patients in medical decision making. Our results will be the basis to the devise of interven-tions to improve physicians’ communication and patients’ involvement skills.

VALUTAZIONE QUALITATIVA DI UN AUSILIO INFORMATIVO (CD E BOOKLET “SAPERE MIGLIORA”) PER LE PERSONE CON SCLEROSI MULTIPLA (SIMS-QUAL)

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RESPONSABILE DEL PROGETTOCLAUDIA BORREANIDirettore Unità di Psicologia, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, Milano

Collaboratore:ELISABETTA BIANCHI

Collaborazioni con altri gruppi:ALESSANDRA SOLARI, ANDREA GIORDANO, Unità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, MilanoMICHELE MESSMER UCCELLI, Area Servizi e Progetti Socio Sanitari AISM, Genova VITTORIO MARTINELLI, MARTA RADAELLI, Dipartimento di Neurologia, IRCCS Istituto San Raffaele, MilanoALESSANDRA LUGARESI, DEBORAH FARINA, Dipartimento di Oncologia e Neuroscienze Università G. D’Annunzio, ChietiMARIA TROJANO, CARLA TORTORELLA, IMMA PLASMATI, Dipartimento di Scienze Neurologiche e Psichiatriche, Università di BariFRANCO GRANELLA, ELEONORA DALLA BELLA, Dipartimento di Neuroloscienze, Unità di Neurologia, Università di ParmaGUIDO MICCINESI, Unità di Epidemiologia, Centro Studi e Prevenzione sul Cancro, FirenzeMONICA FALAUTANO, Unità di Neuropsicologia, Dipartimento di Neurologia, IRCCS Istituto San Raffaele, MilanoNICOLA ACQUARONE, Dipartimento Organizzazione e Sviluppo, Provincia di Genova


L’impiego degli ausili decisionali dedicati ai pazienti nella pratica clinica è in aumento. Vi è evidenza che questi strumenti migliorino la conoscenza della malattia, il coping, e facilitino la partecipazione del paziente alle decisioni mediche. A fronte di questa valutazione positiva, manca una documentazione sul loro impiego nell’ambito della SM. Il SIMS-Trial (Efficacia di un supplemento informativo nelle persone con SM di nuova diagnosi; ISRCTN81072971, FISM 2007/R/19) è una sperimentazione clinica controllata che ha dimostrato l’efficacia, in termini di conoscenza e soddisfazione rispetto alle cure ricevute, del supplemento informativo “Sapere Migliora” (libretto di auto consultazione e colloquio informativo con navigazione di CD) rispetto alla comune pratica clinica in 120 persone con SM di nuova diagnosi. Il SIMS-Qual è uno studio qualitativo finalizzato ad approfondire le esperienze dei partecipanti al SIMS-Trial. L’integrazione dell’approccio quantitativo con la ricerca qualitativa aveva lo scopo di arrivare a un approfondimento degli effetti derivanti dall’ausilio informativo.

RISULTATI

Abbiamo condotto (I) nove colloqui individuali semi-strutturati con un campione selezionato di persone che hanno ricevuto, nell’ambito del SIMS trial, l’ausilio informativo “Sapere Migliora”, (II) un focus group (FG) dei medici che hanno condotto i colloqui informativi, ed (III) un FG dei neurologi che seguivano i pazienti. Le esperienze dei pazienti sono risultate globalmente positive: l’ausilio informativo ha aumenta-to la loro consapevolezza di malattia, ed è stato percepito come un “percorso guidato” nell’am-bito della loro malattia. Anche la valutazione da parte dei medici che partecipavano ai colloqui informativi è stata nel complesso favorevole, a parte una iniziale difficoltà nell’impiego del CD. I neurologi curanti hanno prodotto pochi dati esperienziali, ed il loro contributo si è limitato a considerazioni generali di apprezzamento dell’ausilio.Sintesi dei dati qualitativi raccolti:Aspetti positivi: L’ausilio migliora il trasferimento di informazioni, l’atteggiamento del paziente verso la malattia, la sua comprensione e la comunicazione con il personale sanitario dedicato alla SM e con i familiari. Tutte le componenti dell’ausilio informativo sono state considerate necessarie. Aspetti negativi: Il timing del colloquio informativo può non tenere conto dei bisogni e dei

desideri del singolo paziente. L’ausilio non è adatto per le persone con forma primariamente progressiva. L’integrazione del colloquio informativo con le attività del centro SM può risultare difficile, per limiti strutturali e di personale: ciò si applica particolarmente ai centri più grandi.Proposte: Migliorare la formazione del personale sanitario all’impiego del CD nell’ambito del colloquio informativo. Rivedere alcuni contenuti di CD⁄libretto (eliminazione di immagini raf-figuranti bambini malformati a seguito di esposizione prenatale a talidomide, inserimento di informazioni sulla dieta). Messa a punto di un ausilio informativo dedicato alle persone con sindrome clinicamente isolata, ed a quelle con SM primariamente progressiva.

CONCLUSIONI

Tutti i partecipanti hanno considerato essenziale la combinazione di colloquio informativo, na-vigazione del CD e consultazione del libretto, ma hanno sottolineato l’utilità di programmare il colloquio informativo in modo più flessibile. Altri aspetti emersi sono stati la necessità di rive-dere alcuni contenuti e la non adeguatezza dell’ausilio per i pazienti con forma primariamente progressiva.I risultati ottenuti supportano ulteriormente il valore dell’ausilio e forniscono indicazioni im-portanti per migliorarne contenuti e modalità di utilizzo. Nella terza fase del progetto (SIMS-Practice, FISM 2010/S/1), attualmente in corso, è verificata l’utilità dell’ausilio nel suo insieme (aggiornati e rivisti) vs. il solo libretto nella pratica clinica corrente presso 30 centri italiani.

PARTCIPANTS’’ PERSPECTIVE ON INFORMATION AID FOR NEWLY DIAGNOSED MS PATIENTS: A QUALITATIVE STUDY WITHIN THE SIMS-TRIAL (SIMS-QUAL)


Patient information aids are increasingly regarded as important components of clinical practi-ce. They improve adaptive coping, sense of control, and enable shared decision making with physicians. Despite broad acceptance of their value, there is little evidence of their successful implementation in the MS. The SIMS-Trial (Effectiveness of a structured information interview in people with newly-diagnosed MS; ISRCTN81072971, FISM 2007/R/19) is a multicenter randomized controlled trial assessing the effectiveness, in terms of patient knowledge and sa-tisfaction with the information received, of an add-on information aid in comparison with usual practice in 120 newly diagnosed MS patients. We undertook a qualitative study (SIMS-Qual), nested within the SIMS-Trial, aiming to scrutinize the experience of participants to the SIMS-Trial. Integrating quantitative and qualitative research methods, we aimed to gain deeper understanding of the effectiveness of the information aid.

RESULTS We performed (I) nine individual semi-structured interviews with a purposeful sample of SIMS-Trial patients who received the information aid, (II) focus group meeting (FGM) with the physi-cians who conducted the personal interview, and (III) FGM with patients’ caring neurologists. Patients’ experience with the information aid was positive as it enhanced their understanding of their disease, being viewed as a guided tour of their medical condition. The physicians who conducted the personal interviews were also positive in their overall evaluation but noted an initial difficulty in using the CD. The caring neurologists had limited direct experience of the aid, and their views were confined to utility of the information aid in general.Main study findings are summarised as follows:Positive: The aid improved information delivery, patient understanding and communication with

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MS team and significant others, as well as attitude to the disease. All components of the aid were considered necessary. Negative: Timing of the personal interview can be insensitive to patient wishes. The aid is un-suitable for patients with primary progressive MS. It can be difficult to integrate the personal interview within working practice of MS centres (particularly high-volume ones) for structural and personnel limitations.Proposals: To improve training on CD use in the personal interview. To revise the CD⁄booklet contents by removing images of thalidomide children, and adding information on diet in MS.To develop a specific aid for patients with clinically isolated syndrome/possible MS, and for primary progressive MS.

CONCLUSIONS All participants considered the combination of personal interview, CD navigation and take-home booklet essential, but urged a more flexible scheduling of the personal interview. It also emerged that some content required revision and that the aid was unsuitable for patients with primary progressive MS.The results of the study further support the value of the aid and also provide important indica-tions for improving it and refining indications for use. Further work is necessary to clarify the value of the information aid as a whole and its components in routine clinical practice: in the next (third) phase of the SIMS project (SIMS-Practice, FISM 2010/S/1), the effectiveness of the personal interview plus the information materials (updated and revised based on results of the first two phases) is now being compared with the information materials alone in 30 Italian MS centres.

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Borreani C, Giordano A, Falautano M, Lugaresi A, Martinelli V, Granella F, Tortorella C, Plasmati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Bianchi E, Acquarone N, Miccinesi G, Solari A, on behalf of the SIMS-Trial group. Experience of an information aid for newly-diagnosed multiple sclerosis patients: a qualitative study on the SIMS-Trial. Health Expect 2011 Nov 1. doi: 10.1111/j.1369-7625.2011.00736.x. [Epub ahead of print]

Solari A, Falautano M, Giordano A, Martinelli V, Lugaresi A, Granella F, Trojano M, Acquarone N, Tortorella C, Plasmati I, Radaelli M, Farina D, Dalla Bella E, Bianchi E, Miccinesi G, Borreani C, on behalf of the SIMS-Qual and SIMS-Trial groups. Health professionals’ perspective on information aid for newly-diagnosed ms patients: the SIMS-QUAL study. Neurol Sci 2010; 31: Suppl. (Abstract) S469-470


VALUTAZIONE E TERAPIA MEDIANTE ROBOT NEL TRATTAMENTO DEL DEFICIT DELL’ARTO SUPERIORE NELLA SCLEROSI MULTIPLA: UNO STUDIO MULTI-CENTRO, RANDOMIZZATO E CONTROLLATO

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RESPONSABILE DEL PROGETTOCLAUDIO SOLARODirigente medico I° livelloUO Neurologia Dipartimento Testa-Collo ASL3 Genovese, Genova

Collaboratori:MARGIT MUELLER

Collaborazioni con altri gruppi:DAVIDE CATTANEO, Fondazione Don Gnocchi IRCCS, Centro S. Santa Maria Nascente, MilanoILARIA CARPINELLA, Fondazione Don Gnocchi IRCCS, Centro S. Santa Maria Nascente, MilanoMAURIZIO FERRARIN, Fondazione Don Gnocchi IRCCS, Centro S. Santa Maria Nascente, MilanoANGELO BASTERIS, NeuroLab DIST, Universita di Genova (DIST)VITTORIO SANGUINETI, NeuroLab DIST, Universita di Genova (DIST)


Nel 2010 abbiamo pubblicato (Vergaro et al J Neuroeng Rehabil. 2010 Jul 29;7:37) i dati relativi ad un precedente studio pilota nel quale otto persone con sclerosi multipla (SM) e affette da sintomi cerebellari agli arti superiori erano state trattate con otto sedute di riabilitazione robotica mediante Braccio di Ferro (PhysioAssistant, Celin srl, Follo). Il risultato, seppur su un piccolo campione, era stato molto promettente, in quanto quattro degli otto soggetti trattati presentava un significativo miglioramento una volta valutati al Nine Hole Peg Test (9HPT, test di destrezza manuale). Questo studio rappresenta a tutt’oggi uno dei pochissimi esempi di trattamento dell’arto superiore mediante robot in soggetti con SM.Per tale motivo abbiamo valutato l’efficacia della terapia robotica su soggetti con deficit a cari-co dell’arto superiore con uno studio randomizzato, doppio cieco, multicentrico.Scopo dello studio è confrontare il trattamento robot-guidato rispetto al trattamento con robot “spento”. Lo scopo è quello di valutare la reale specificità del trattamento e di escludere l’effetto legato all’uso di una macchina in un ambiente sperimentale.Il protocollo riabilitativo prevedeva otto sessioni (due sessioni alla settimana), durante le quali i pazienti eseguivano movimenti di reaching center-out (ampiezza dieci cm) in tre diverse di-rezioni (0°,60°,120°), impugnando un manipolatore robotico planare a due gradi di libertà. Il soggetto veniva randomizzato ad eseguire il trattamento attivo, in cui il robot adatta la difficoltà dell’esercizio applicando forze di ampiezza variabile a seconda dei risultati raggiunti dal pazien-te (T) o a robot “spento” (C). In questo caso il paziente svolgeva un movimento planare sem-plice e valutato mediante scale cliniche. Prima e dopo la terapia (T0 e T1), anche i partecipanti del gruppo T hanno svolto lo stesso esercizio (valutazione cinematica).

RISULTATI

I soggetti sedevano di fronte allo schermo afferrando l’impugnatura del robot con la mano dominante. Le spalle e il polso erano mantenuti fissi mediante opportuni sistemi di vincolo. L’altezza del sedile era impostata in modo da avere la spalla all’altezza del piano di lavoro del robot. Il robot è in grado di misurare grandezze caratteristiche del movimento (quali durata e ampiezza, ad esempio) che forniscono un’indicazione oggettiva dell’efficacia della terapiaCriteri di inclusione: età maggiore di 18 anni; assenza di esacerbazioni o peggioramenti di un punto negli ultimi tre mesi nella scala EDSS (“Expanded Disability Status Scale”); EDSS < 7.5; Scripps Neurological Rating Scale almeno un punteggio funzionale (piramidale, cerebellare, sensitivo) < 5; Scala di Ashworth < 2 all’arto superiore; 9HPT compreso tra 30 e 180. Ogni soggetto è stato valutato dallo stesso esaminatore che ha somministrato tutte le scale ed i test. I pazienti sono stati valutati tramite: 9HPT, EDSS, ARAT (Action Research Arm Test), Tremor severity scale (zero-dieci); Ataxia scale punteggio da zero (normale) a quattro (massimo grado di compromissione), Modified Fatigue Impact Scale (MFIS); SF-36 Quality of Life; Effetto gene-

rale percepito su un punteggio da uno a sette, VAS; ai soggetti é stato chiesto di attribuire un valore da zero a dieci sulla capacita di svolgere attività della vita quotidiana (relativamente all’ar-to superiore). Outcome primario: numero di soggetti con variazione >20% al 9HPT. Outcome secondari clinici: variazioni alle scale ARAT, MFIS, GIC, VAS. Outcome secondari cinematica: lunghezza e durata del movimento. Sono state reclutate 43 persone con SM. 19 soggetti (su 20) inclusi nel gruppo T e 18 (su 21) del gruppo C hanno partecipato a tutte le otto sessioni previste. Gruppo T: nove maschi e dieci femmine; età media: 52 anni; EDSS medio: 6; durata media della malattia: 14 anni; decorso: nove primariamente progressive (PP), otto secondariamente progressive (SP), tre recidivante-remittente (RR). Gruppo C: sette maschi e 12 femmine; età media: 46 anni; EDSS medio: 5.3; durata media della malattia: 14 anni; decorso: cinque PP, sette SP, sette RR.Il trattamento è risultato efficace per otto persone, mentre solamente tre pazienti nel gruppo di controllo hanno raggiunto lo stesso risultato. Complessivamente, il valore medio del 9HPT è stato ridotto da 73.6 (±9.6) s a 60.4 (±7.9) s nel gruppo T e da 48.2 (±6.0) s a 43.2 (±5.5) s nel gruppo C. Lo stesso miglioramento è consistente con l’incremento osservato nel punteggio ARAT, da 47.1 (±1.3) a 50.3 (±1.2) per il gruppo T e da 50.9 (±1.4) a 52.9 (±1.2) per il gruppo C. Concordemente con i miglioramenti osservati nelle scale cliniche, anche i movimenti osservati durante la valutazione cinematica mostrano che i pazienti si muovono con una migliore accu-ratezza (significativa riduzione della lunghezza della traiettoria) e minor durata.

CONCLUSIONI

Questo progetto conferma i benefici del trattamento robotico del deficit motorio dell’arto su-periore. Sebbene l’outcome primario non abbia raggiunto la significatività si osserva un chiaro trend (beneficio in otto su 18 vs. tre su 20 soggetti) a vantaggio della terapia con robot attivo. Anche la valutazione delle caratteristiche cinematiche del movimento hanno mostrato una su-periorità del trattamento attivo verso i controlli. Il trattamento è stato inoltre ben tollerato con un numero assai basso di drop-out. Inoltre non è stato osservato un effetto certo. In conclusione questo rappresenta il primo studio randomizzato di terapia robotica in persone con SM e apre importanti orizzonti sulla terapia riabilitativa dell’arto superiore.

ROBOT-BASED ASSESSMENT AND THERAPY IN THE TREATMENT OF UPPER LIMB IMPAIRMENT IN MULTIPLE SCLEROSIS: A MULTI-CENTRE, RANDOMISED CONTROLLED TRIAL


In 2010 we pubblished data related to a previous pilot study (Vergaro et al J Neuroeng Rehabil. 2010 Jul 29;7:37) in which eight cerebellar persons with MS on upper limb. The patients have been treated with eight sections of robot therapy using a robotic device “Braccio di Ferro” (PhysioAssistant, Celin srl, Follo). Out of eight treated subjects four showed a significantly im-provement on 9HPT. Following the reported results we design a double-blind parallel arm multicentres study on robot-therapy for treating upper limb impairment in MS. Aim of the study was to evaluate the efficacy of active robot-therapy versus sham treatment. The aim is to show a specific effect of the therapy based on robot and related to the experimental setting. Moreover was double-blind in both the patient and the evaluator were blind and the reliability of the therapy when admini-stered using the same device in two centers. The subjects underwent to eight sections in four weeks during which patients performed a reaching center-out movements in three directions (0-60 and 120).

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RESULTS Inclusion criteria: age > 18 year-old; no clinical exacerbation or worsening of one point in the last there month at the EDSS (“Expanded Disability Status Scale”); EDSS < 7.5; Scripps Neuro-logical Rating Scale greater than one at pyramidal, cerebellar or sensitivity level < five; Ashworth scale < two at upper limb; 9Hole Peg Test (9HPT) between 30 and 180. Any subject have been evaluated by the same examiner. The patients have been evaluated by 9HPT, EDSS, ARAT (Action Research Arm Test), Tremor severity scale (zero-ten); Ataxia scale, Modified Fatigue Impact Scale (MFIS); SF-36 Quality of Life; global impression change from one to seven, VAS for daily activity related to upper limb use. The primary outcome: a difference > 20% at 9HPT. Secondary clinical outcomes: variation at ARAT, MFIS, GIC and VAS. Secondary kinematic outcomes: movement length and duration. Forty-three MS subjects (both genders and ages) were recruited for this study. Nineteen subjects (out of the 20 who started) in group T and 18 (out of 21 who started) in group C practiced in all the eight sessions. Group T: nine males and ten females, mean age 52 years, mean EDSS six; mean disease duration: 14 years; disease course: nine primary progressive PP, eight secondary progressive SP, three relapsing-remitting RR. Defining a response to treatment as a reduction of 20% in this score, we had eight re-sponding patients in T group and only three in C group. As regards the average 9HPT score, this decreased from 73.6 (±9.6) s to 60.4 (±7.9) s for group T and 48.2 (±6.0) s a 43.2 (±5.5) s for group C. According to this improvement, ARAT score increased from 47.1 (±1.3) to 50.3 (±1.2) for T group and from 50.9 (±1.4) to 52.9 (±1.2) for C group. The robot-based kinematic evaluation confirmed that trajectory length and movement duration when asked to perform fixed-length, as fast as possible reaching movements, were reduced, thus meaning higher accuracy and speed.However, statistical analysis confirmed efficacy of both type of therapy, without significant group effects.

CONCLUSIONS This study confirms benefits of robot-therapy in the treatment of upper limb impairment in MS patients. The primary outcome show a trend in favor of active treatment, a benefit was demonstrated in eight of 18 (active) versus three out 20 patients (sham). Also the kinematic parameters showed a significant difference between the two groups. Moreover the treatment was well tolerated and very low number of drop-out were observed. In conclusion the study represent the first randomized double-blind parallel arm multicentres study on robot-therapy for upper limb in MS and future study are needed to assess the best rehabilitation robotic protocol for such patients.


Basteris A, De Luca A, Boehmker M, Bertoni R, Cattaneo D, Carpinella I, Ferrarin M, Solaro C, Sanguineti V. (2011) A tailored exercise program of manipulation of virtual tools to treat upper limb impairment in Multiple Sclerosis in International Conference on Rehabilitation Robotics (ICORR2011), June 29 – July 1, 2011, Zurich, Switzerland

PROGETTO FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2008per un periodo di 2 anni - 60.000 €

validazione di nuovi targets-pathways

FUNZIONE DI TRKB SUGLI ASTROCITI REATTIVI NELLE PLACCHE DI SCLEROSI MULTIPLA

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VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS-PATHWAYS

Per studiare l’interazione astrocita-neurone abbiamo sviluppato un modello in vitro in cui i neu-roni spinali venivano esposti a mezzo di coltura condizionato dagli astrociti generato sotto sti-molazione con BDNF, e li abbiamo paragonati ai neuroni esposti a mezzi di coltura astrocitaria generati sotto stimolazione con IL1, una tipica citochina infiammatoria. La disgregazione della rete neuronale e la morte per apoptosi avevano luogo in entrambe le condizioni, e l’ossido nitri-co (NO) era il mediatore neurotossico rilasciato dagli astrociti in risposta a BDNF ed IL1. Inoltre, in maniera simile al BDNF, anche gli altri ligandi di TrkB (NT3 ed NT4) attivavano gli astrociti in modo da indurre neurodegenerazione, indicando varie possibilità di attivazione di TrkB negli astrociti. Questi effetti erano dipendenti da TrkB astrocitario, poiché gli astrociti isolati dai topi transgenici (quindi privi di TrkB) non producevano NO e non inducevano morte neuronale in risposta a BDNF. Inoltre, la rapida cinetica del fenomeno neurodegenerativo, documentata mediante esperimenti di videomicroscopia, era iniziata da NO di origine astrocitaria ed amplificata da NO neuronale. Per misurare lo stress nitrosativo, dovuto alla deregolata produzione di NO in seguito all’attiva-zione dell’enzima iNOS, abbiamo misurato la nitrosilazione delle proteine a livello dei residui di tirosina. Mediante esperimenti di immunoistochimica abbiamo confermato la forte espressione di iNOS e la deposizione di nitrotirosine in vivo nel midollo spinale di topi controllo con EAE. In accordo con i dati in vitro ottenuti dagli astrociti privi di TrkB, i segnali per iNOS e per le nitro-tirosine erano grandemente ridotti nel SNC dei topi transgenici immunizzati, dimostrando che la trasduzione del segnale tramite TrkB negli astrociti è cruciale per la sintesi di NO in vivo. Di rilievo per la patologia umana è stato rilevare nelle lesioni SM aree di diffusa nitrosilazione ed assoni nitrosilati circondati dalla rete gliotica TrkB positiva.

CONCLUSIONI

Gli astrociti sono importanti regolatori della neuroinfiammazione e neurodegenerazione. Qui, descriviamo per la prima volta un nuovo processo patologico che sottolinea il contributo dell’a-strocita alla sclerosi multipla. Infatti, come in un tipica reazione infiammatoria, la risposta astroci-taria alle neurotrofine tramite il recettore TrkB favorisce l’espressione clinica nel modello animale di sclerosi multipla promuovendo un ambiente permissivo all’infiltrazione di cellule immunitarie ed alla neurodegenerazione. Analisi in vitro ed in vivo dimostrano come l’ossido nitrico sia il mediatore cruciale responsabile della neurodegenerazione. Quindi, è verosimile immaginare che nella SM la forte espressione di TrkB sugli astrociti contribuisca al danno neuronale tramite la produzione di ossido nitrico. Strategie volte a bloccare questo processo neurodegenerativo potrebbero condurre allo sviluppo di una nuova terapia neuroprotettiva per la sclerosi multipla.

ROLE OF TRKB ON REACTIVE ASTROCYTES IN MS LESIONS


Neurotrophins (NTs) are growth factors fundamental for development and maintenance of the vertebrate nervous system. They may promote survival as well as death of defined neuronal populations. NTs exert their pleiotropic actions by two structurally unrelated classes of recep-tors: the p75NTR receptor and the Trk receptors. NT receptors may be detected also in non-neuronal cell types, however the biological significance of such expression is mostly unknown. Published studies suggest that astrocytes may bear NT receptors after activation.Astrocytes are the most abundant glia cells in the central nervous system (CNS) and are funda-mental for brain structure and function. They offer trophic support to neurons, regulate synaptic transmission, control homeostasis of ions and metabolites. Furthermore, astrocytes are thou-ght to play a central role in the immune surveillance of the CNS, as their end-feet ensheath most of the cerebrovasculature. A hallmark of CNS injury is formation of scar tissue composed of activated (“reactive”) astrocytes and microglia. An inflammatory response takes place within this clearly demarcated area. This phenomenon is commonly regarded as harmful and respon-sible for the block of axonal regrowth within the lesion. Activated astrocytes may either inhibit

RESPONSABILE DEL PROGETTOCINTHIA FARINAResponsabile del Laboratorio di Immunobiologia delle malattie neurologicheDipartimento di Neuroscienze, Istituto di Neurologia SperimentaleFondazione Centro S. Raffaele del Monte Tabor, Milano

Collaboratori:EMANUELA COLOMBOCHIARA CORDIGLIERI

Collaborazioni con altri gruppi:GIORGIA MELLI, Istituto neurologico Carlo Besta, Milano ENZO MEDICO, IRCC, TorinoJIA NEWCOMBE, UCL, Institute of Neurology, LondraMARKUS KRUMBHOLZ, REINHARD HOHLFELD, EDGAR MEINL, Max-Planck-Institute of Neurobiology e Institute of Clinical Neuroimmunology, MonacoLUIS PARADA, Center for Developmental Biology, University of Texas, Dallas


Le neurotrofine (NT) sono fattori di crescita fondamentali per lo sviluppo ed il mantenimento del sistema nervoso centrale (SNC). Possono promuovere la sopravvivenza così come la morte di popolazioni neuronali definite. Le NT esercitano la propria azione pleiotropica mediante due classi di recettori: il recettore p75NTR o i recettori Trk. Questi recettori sono stati rilevati anche in tipi cellulari non-neuronali, tuttavia il loro significato biologico è per lo più sconosciuto. Studi pubblicati suggeriscono che gli astrociti possono esprimere i recettori delle neurotrofine in seguito ad attivazione. Gli astrociti sono la popolazione gliale più abbondante nel SNC e sono importanti per la struttura ed il funzionamento del SNC. Offrono supporto trofico ai neu-roni, regolano la trasmissione sinaptica, controllano l’omeostasi di ioni e metaboliti. Inoltre, gli astrociti hanno un ruolo centrale nella sorveglianza immunologica del SNC, considerato che le loro estremità avvolgono i vasi sanguigni cerebrali. Una caratteristica propria del danno cere-brale è la formazione di tessuto gliotico composto da astrociti e microglia reattivi. Una reazione infiammatoria ha luogo in quest’area. Questo fenomeno è comunemente considerato dannoso e responsabile del blocco della crescita assonale nella lesione. Gli astrociti reattivi possono promuovere o inibire questa reazione infiammatoria. Infatti, da una parte possono produrre fattori che alterano la permeabilità della barriera emato-encefalica e attrarre cellule immunitarie all’interno del tessuto neurale. Dall’altra parte, modelli in vivo dimostrano che gli astrociti reattivi demarcano l’area danneggiata, promuovono la sopravvivenza neuronale ed il recupero delle funzioni della barriera emato-encefalica.Lo scopo del progetto è stato di capire se le neurotrofine promuovono l’attività neuroinflam-matoria o neuroprotettiva degli astrociti e di declinare queste nuove conoscenze nel contesto della sclerosi multipla.

RISULTATI

L’osservazione iniziale di questo progetto è stata la forte espressione di trkB sugli astrociti nelle lesioni SM e nel suo modello animale (EAE). Esperimenti di PCR quantitativa sul tessuto cerebrale umano hanno mostrato un notevole aumento nei livelli dell’isoforma troncata TrkB-T1 nella sostanza bianca SM rispetto al controllo. Questo dato è stato confermato a livello di pro-teina mediante immunoistochimica con un anticorpo specifico. La stessa isoforma è risultata indotta anche sugli astrociti nelle lesioni EAE. Abbiamo quindi analizzato il ruolo del TrkB astrocitario in vivo nella neuroinfiammazione spe-rimentale. Sorprendentemente, topi condizionali privi di TrkB sugli astrociti mostravano una diminuzione nella suscettibilità e nella gravità della EAE. Analisi istologiche hanno evidenziato che gli infiltrati infiammatori erano significativamente meno presenti nel midollo spinale degli animali transgenici immunizzati e la neurodegenerazione era assente.

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or promote this inflammatory reaction. In fact, on one hand, they are able to produce factors that alter the blood-brain barrier (BBB) permeability and attract immune cells into the neural tissue. On the other hand, in vivo models demonstrate that reactive astrocytes demarcate the damaged area, promote BBB repair and sustain neuronal survival. Aim of this proposal was to understand whether neurotrophins promote the neuroinflammatory or the neuroprotective side of astrocytic reactivity and to decline this knowledge in the context of multiple sclerosis.

RESULTS The initial observation for this project was the robust expression of TrkB on astrocytes in both EAE and MS lesions. Quantitative PCR experiments on human cerebral tissue showed that there was marked up-regulation of the truncated isoform TrkB-T1 in MS tissue compared to control white matter, which was confirmed at the protein level by immunohistochemistry with a specific antibody directed to the non-catalytically active isoform. TrkB-T1 was upregulated on astrocytes in EAE lesions as well. Then, we analysed the role of astrocyte TrkB in vivo in expe-rimental neuroinflammation. Surprisingly, conditional mice lacking TrkB on GFAP positive cells showed strong impairment in EAE susceptibility and severity. Histological analyses indicated that immune infiltrates were present in the spinal cord white matter of the EAE knockout mice, although significantly less than in control EAE littermates. Moreover, neurodegeneration was almost absent in knockout mice. To study astrocyte-neuron interaction we developed an in vitro model in which spinal neu-rons were exposed to astrocyte conditioned media generated under BDNF stimulation, and compared them to media generated under IL1 stimulation, a typical inflammatory pathway. Disruption of the neuronal network and apoptosis took place under both conditions, and nitric oxide was the common neurotoxic mediator released by astrocytes in response to both BDNF and IL1. Moreover, our in vitro data showed that, similarly to BDNF, also the TrkB ligands NT3 and NT4 activated the astrocytes so that neurodegeneration was induced, indicating multiple options for TrkB activation in astrocytes. These effects were dependent on astrocyte TrkB, as astrocytes from transgenic mice did not produce NO and induce neuronal death. Furthermore, we demonstrated that the fast kinetics of the neurodegenerative phenomenon, highlighted by time-lapse imaging experiments, was driven by the release of astrocyte NO, and amplified by neuronal NO. Nitrosative stress has been well documented in several neurodegenerative disorders. Here, NO is produced in excess following activation of iNOS. A marker of nitrosative stress is the nitrosylation of proteins at the level of tyrosine residues. We confirmed iNOS upre-gulation and deposition of nitrotyrosine in vivo in the spinal cord of control EAE mice. Consi-stent with the in vitro data obtained from TrkB deficient astrocytes, both iNOS and nitrotyrosine signals were greatly reduced in the CNS of transgenic EAE mice, indicating that TrkB signalling in astrocytes is crucial for NO synthesis in vivo. Interestingly, in MS lesions areas with diffuse nitrosylation were detected and nitrosylated axons were surrounded by the TrkB positive glial network.

CONCLUSIONS Astrocytes are important regulators of neuroinflammation and neurodegeneration. Here, we describe for the first time a novel pathological process underlying astrocyte contribution to multiple sclerosis. In fact, as in a typical inflammatory pathway, the TrkB-mediated astrocytic re-sponse towards neurotrophins supports EAE expression by fostering a permissive environment for immune cell infiltration and neurodegeneration. In vitro and in vivo analyses demonstrated that nitric oxide is the crucial mediator triggering neurodegeneration. Thus it may be specula-ted that in MS the upregulated expression of TrkB on astrocytes contributes to the neuronal damage via NO production. Strategies to blockade this neurodegenerative pathway could lead to the development of a novel neuroprotective therapy for MS.


Colombo E, Cordiglieri C, Melli G, Newcombe J, Krumbholz M, Parada L, Medico E, Hohlfeld R, Meinl E and Farina C. Stimulation of the neurotrophin receptor TrkB on astrocytes drives nitric oxide production and neurodegeneration. J.Exp. Med., 2012 in press

Cordiglieri C, Melli G, Newcombe J, Krumbholz M, Medico E, Hohlfeld R, Lassmann R, Meinl E and Farina C. A neurodegenerative role for astrocytic TrkB in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. X International Congress of Neuroimmunology, Sitges, 26-30 Ottobre 2010

Cordiglieri C and Farina C. Astrocytes exert and control immune responses in the brain. Current Immunology Reviews 6 (3) 2010

Cordiglieri C, Melli G, Newcombe J, Krumbholz M, Medico E, Aloisi F, Hohlfeld R, Meinl E and Farina C. Role of TrkB on reactive astrocytes in MS lesions. 19th Congress of Italian Society of Neuroimmunology, Arzachena, 1-4 Ott 2009


RUOLO DEI RECETTORI METABOTROPICI DEL GLUTAMMATO IN MODELLI SPERIMENTALI DI SCLEROSI MULTIPLA

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munizzati, suggerendo che la delezione genetica dei recettori mGlu4 (un particolare sottotipo dei recettori mGlu accoppiato a proteine Gi/Go) aumenta la gravità dell’EAS. Il trattamento farmacologico sistemico di topi con EAS con un modulatore allosterico positivo dei recettori mGlu4 era in grado di attenuare significativamente i sintomi neurologici nell’EAS, quando il trattamento iniziava un giorno dopo l’immunizzazione con MOG, ma non dopo la comparsa dei sintomi neurologici. Benché il trattamento farmacologico con un modulatore allosterico positivo dei recettori mGlu4 non aveva effetti sull’EAS dopo che i sintomi si erano sviluppati, i dati in un modello di EAS cronica remissiva indicavano una efficacia significativa del farmaco nel ridurre il numero e la severità delle ricadute quando somministrato durante il primo attacco clinico. Sorprendentemente, tali effetti erano mediati da recettori mGlu4 presenti nelle cellule del siste-ma immunitario, in particolare nelle cellule dendritiche, che influenzano criticamente il decorso dell’EAS nei topi. L’attivazione dei recettori mGlu4 nelle cellule che presentano l’antigene orien-ta il differenziamento delle cellule T naive verso le cellule T regolatorie (Treg) responsabili della tolleranza immunologica, a discapito delle cellule autorattive Th17. L’attivazione dei recettori mGlu4 nella sinapsi immunologica contribuisce al cross-talk e al condizionamento reciproco delle cellule T e cellule accessorie. Questi dati forniscono la prima evidenza di un recettore per un neurotrasmetittore in grado di influenzare il programma differenziativo delle cellule T naive nella sinapsi immunologica. Quindi aprono nuove prospettive nel trattamento sperimentale del-la sclerosi multipla, basate sull’attivazione di un particolare sottotipo dei recettori metabotropici del glutammato (il recettore mGlu4) presente nelle cellule della sinapsi immunologica, che può far variare il rapporto tra le cellule TH17 dannose e le cellule Treg “protettive”.

CONCLUSIONI

Alti livelli di glutammato sono presenti nel cervello di pazienti con sclerosi multipla dove contri-buisce alla neurotossicità. Quì abbiamo dimostrato un possibile ruolo alternativo: il glutammato guida la risposta delle cellule T regolatorie che migliorano la neuroinfiammazione nell’EAS. L’aumento delle cellule T regolatorie è mediato dai recettori mGlu4 espressi sulle cellule dendri-tiche che sono cruciali per il mantenimento della risposta immunitaria. La nostra ipotesi è che il glutammato possa avere un ruolo protettivo nelle malattie infiammatorie neurodegenerative. Il trattamento sistemico dei topi con EAS con un modulatore allosterico positivo dei recettori mGlu4 attenua la malattia ed è associato con un aumento delle cellule T regolatorie nei linfo-nodi. Quindi, i modulatori allosterici positivi dei recettori mGlu4, che sono attualmente in studio per la malattia di Parkinson, potrebbero fornire un’opportunità per sfruttare quello che sembra essere un effetto protettivo del glutammato nei pazienti con sclerosi multipla.

ROLE OF METABOTROPIC GLUTAMATE RECEPTORS IN EXPERIMENTAL MODELS OF MULTIPLE SCLEROSIS


Neurotransmitters such as monoamines and acetylcholine contribute to regulating the magni-tude and quality of immune responses. The recent discovery of interleukin (IL)-17-producing T helper (TH17) cells as a distinct subset of effector cells has provided novel insight into the intri-cacies of immunopathology. TH17 cells have important roles in inflammation and autoimmunity and develop under bidirectional influence by regulatory T (Treg) cells. Although TH17 cells act as mediators of autoimmunity in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and mul-tiple sclerosis, several reports raise the question of whether TH1 or TH17 cells are the promi-nent pathogenetic T cells, suggesting that each population contributes specific nuances to the disease. Glutamate, the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system, may represent a chemical messenger common to neural and immune cells, and therefore could be implied in the coordinated action of the two systems in danger conditions. Glutamate activates ligand-gated ion channels (ionotropic glutamate receptors) as well as G-protein coupled meta-

RESPONSABILE DEL PROGETTOGIUSEPPE BATTAGLIADirigente Medico Istituto Neurologico Mediterraneo - Neuromed, Neuroscienze, NeurofarmacologiaPozzilli, Isernia

Collaboratori:FRANCESCO FAZIOSERENA NOTARTOMASOCARLA BUSCETIVALERIA BRUNOFERDINANDO NICOLETTI

Collaborazioni con altri gruppi:FRANCESCA FALLARINO, CLAUDIA VOLPI, CARMINE VACCA, PAOLO PUCCETTI, MARIA C. FIORETTI, URSULA GROHMANN, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche, Università di Perugia ROBERTO DI MARCO, Dipartimento di Scienze della Salute, Università del Molise, CampobassoSIMONA BONAVITA, Università di Napoli


I neurotrasmettitori come le monoamine e l’acetilcolina contribuiscono a regolare la magnitudo e la qualità delle risposte immunitarie. La scoperta recente delle cellule T helper (TH17) che pro-ducono interleukina 17 (IL-17), come un distinto set di cellule effettrici, ha fornito nuove infor-mazioni nella complessità dell’immunopatologia. Le cellule TH17 hanno importanti ruoli nell’in-fiammazione e nell’autoimmunità e si sviluppano sotto l’influenza delle cellule T regolatorie (Treg). Sebbene le cellule TH17 agiscono come mediatori dell’autoimmunità nell’encefalomielite autoimmunitaria sperimentale (EAS) e la sclerosi multipla, parecchi report sollevano la questio-ne se le cellule TH1 o TH17 sono le principali cellule T patogenetiche, suggerendo che ogni popolazione contribuisce a specifici aspetti della malattia. Il glutammato, principale neurotra-smettitore eccitatorio del sistema nervoso centrale, può rappresentare un messaggero chimico comune per le cellule nervose ed immunitarie, e quindi potrebbe essere implicato nell’azione coordinata dei due sistemi in condizioni patologiche. Il glutammato attiva canali ionici (recettori ionotropici al glutammato) e recettori metabotropici (mGlu) accoppiati a proteine G. I recettori mGlu modulano la neurotrasmissione glutammatergica, regolando il rilascio di glutammato dai terminali presinaptici, quindi sono considerati potenziali bersagli per farmaci neuroprotettivi nel trattamento dei disturbi neurodegenerativi. Le connessioni temporali e causali tra le cellule im-munitarie e le citochine solubili da un lato, e la trasmissione sinaptica e la neurodegenerazione, dall’altro rimangono elusive. Il principale obiettivo del progetto è stato l’identificazione di nuove strategie terapeutiche per il trattamento sperimentale della sclerosi multipla attraverso l’iden-tificazione di meccanismi coinvolti nei processi neuroinfiammatori e la valutazione degli effetti neuroprotettivi in topi con EAS di ligandi sottotipi selettivi dei recettori mGlu.

RISULTATI

I recettori accoppiati a proteine G stanno emergendo come “targets” alternativi per il trattamento farmacologico della sclerosi multipla. Benchè i recettori mGlu siano tradizionalmente associati alla regolazione della trasmissione sinaptica nel sistema nervoso centrale, la loro espressione in cellule periferiche, incluse le cellule del sistema immunitario, suggerisce l’esistenza di mec-canismi d’azione aggiuntivi. Diversi sottotipi di recettori mGlu sono espressi nei timociti, e i livelli di espressione variano in rapporto al grado di maturazione cellulare. Abbiamo usato il modello murino di encefalite autoimmune sperimentale (EAS) come modello di sclerosi multipla ottenuto mediante l’immunizzazione di topi con la proteina oligodendrocitaria, MOG. L’immunizzazione di topi wild-type e topi knockout per i recettori mGlu4 (Grm4-/-) con MOG ha indotto la malattia più precocemente ed in forma più grave nei topi Grm4-/-. Segni di demielinizzazione e infiltrati infiammatori nella sostanza bianca del midollo spinale erano più evidenti nei topi Grm4-/- im-

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botropic glutamate (mGlu) receptors. mGlu receptors modulate glutamatergic neurotransmis-sion, by regulating glutamate release from presynaptic terminals and therefore are considered as potential targets for neuroprotective drugs in the treatment of neurodegenerative disorders. The temporal and causal connections between immune cells and soluble cytokines on one hand, and synaptic transmission and neurodegeneration, on the other hand remain elusive. The principal objective of the project has been the identification of new therapeutic strategies for the experimental treatment of multiple sclerosis through the identification of mechanisms involved in the control of neuroinflammatory processes and the evaluation of neuroprotective effects in mice subjected to EAE exerted by subtype selective ligands of mGlu receptor.

RESULTS G-protein coupled receptors are emerging as alternative targets for the treatment of multi-ple sclerosis. Although mGlu receptors are traditionally linked to the regulation of synaptic transmission in the central nervous system, they are widely expressed in peripheral cells, in-cluding immune cells. Individual mGlu receptor subtypes are expressed in thymocytes, and the expression pattern varies in relation to the maturation stage of T lymphocytes. We have used the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mouse model of multiple sclerosis obtained by immunization of mice with the oligodendrocyte protein, MOG. Immunizzation of wild-type and mGlu4 receptor knockout (Grm4-/-) mice with MOG induced an earlier onset and more severe disease in mGlu4-/- mice. Signs of demyelination and inflammatory infiltrates in white matters from spinal cords were more evident in immunized Grm4-/- mice, suggesting that the absence of the mGlu4 receptor (a particular mGlu receptor subtype coupled to Gi/Go proteins) enhances the severity of EAE. Systemic pharmacological treatment of EAE mice with a selective positive allosteric modulator of mGlu4 receptors was able to significantly attenuate the neurological score in EAE, when treatment started one day after MOG immunization, but not after the onset of neurological signs. Although pharmacological treatment with a selective allosteric modulator of mGlu4 receptors had no effect on EAE once neurological symptoms had developed, parallel data in a model of relapsing-remitting EAE revealed significant efficacy of the drug in reducing the number and severity of relapses when administered during the first clinical attack. To our surprise, it was the mGlu4 receptor present in immune cells (particularly in dendritic cells) that critically influenced the outcome of MOG-induced EAE in mice. Activation of mGlu4 receptors in antigen-presenting cells within the immunological synapse drives the differentiation of naive T cells towards the immune tolerant Treg cells at the expenses of auto-reactive TH17 cells. Our data suggest that the use of a selective allosteric modulator of mGlu4 receptors sustains Treg development, whose regulatory activity mostly affects TH17 cells. To our knowledge, this if the first evidence of any conventional neurotransmitter receptor that can affect the differentiation program of naive T cells towards a specific phenotype. These findings can pave the way to a novel strategy in the treatment of autoimmune disorders of the CNS targeting mGlu receptors present in immune cells, which can shift the ratio between harmful TH17 cells and “protective” Treg cells.

CONCLUSIONS High amounts of glutamate are found in the brain of individuals with multiple, and whereas this is widely thought to contribute to neurotoxicity, here we have shown an alternative possibility - a role for glutamate in driving a regulatory T cell response that ameliorates neuroinflammation in the EAE. This increase in regulatory T cells is mediated by mGlu4 receptors expressed on den-dritic cells, which are crucial for supporting an immune response. We suggest that glutamate may have a protective role in inflammatory neurodegenerative diseases. Systemic treatment of mice with EAE with a positive allosteric modulator of mGlu4 receptors attenuated disease and was associated with an increase in Treg cells in the lymph nodes. Thus, allosteric modulators of mGlu4 receptors, which are currently under investigation for Parkinson’s disease, might provide an opportunity to harness what seems to be a protective effect of glutamate in patients with multiple sclerosis.


Fallarino F, Volpi C, Fazio F, Notartomaso S, Vacca C, Busceti CL, Bicciato S, Battaglia G, Bruno V, Puccetti P, Fioretti CM, Nicoletti F, Grohmann U, Di Marco R. Metabotropic glutamate recep-tor 4 impacts adaptive immunity restraining neuroinflammation. Nat. Med., 2010, 16(8):897-902. (Questo lavoro è stato evidenziato da Hansen A.M. and Caspi R.R. Glutamate joins the ranks of immunomodulators. Nat. Med., 2010, 16(8):856-858; e da Kingwell K. Putting a dampener on in-flammation. Nat. Neurosci. Rev., 2010, 9)

Notartomaso S, Fallarino F, Volpe C, Fazio F, Busceti CL, Battaglia G, Bruno V, Vacca C, Scarselli P, D’amore V, Puccetti P, Fioretti MC, Nicoletti F, Grohmann U, Di Marco RM. Beneficial effect of mGlu4 receptor activation on animal models of experimental autoimmune encephalomyelitis on da rats and experimental autoimmune neuritis in lewis rats. Soc. Neurosci. Abs., 2010, 642.27

Fazio F, Fallarino F, Notartomaso S, Busceti CL, Volpi C, Vacca C, Battaglia G, Bruno V, Nicoletti F, Grohmann U, Di Marco R. mGlu4 metabotropic glutamate receptor negatively regulates TH17 cell-driven immune responses: a new target for the experimental treatment of neuroinflammatory autoimmune disorders. 34° SIF Meeting, Rimini, 2009

Fallarino F, Notartomaso S, Fazio F, Busceti CL, Volpi C, Battaglia G, Bruno V, Nicoletti F, Grohmann U, Di Marco R. mGlu4 metabotropic glutamate receptor negatively regulates TH17 cell-driven im-mune responses: a new target for the experimental treatment of neuroinflammatory autoimmune disorders. Soc. Neurosci. Abs., 2009, 334.4


STUDIO SUL RUOLO FUNZIONALE DI RANTES SULLA TRASMISSIONE GLUTAMATERGICA NEL CERVELLO UMANO ED IN TOPI EAE

RESPONSABILE DEL PROGETTOERNESTO FEDELEProfessore Associato di FarmacologiaDipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Farmacologia e TossicologiaUniversità degli Studi di Genova

Collaboratori:ANNA MARIA PITTALUGAMARCO MILANESESILVIA DI PRISCOELISA MEREGA


La sclerosi multipla (SM) è una patologia autoimmune demielinizzante che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC), ad eziologia ignota, ma che si sviluppa in individui geneticamente pre-disposti, esposti a fattori ambientali in grado di scatenare una cascata di eventi infiammatori diretti verso auto-antigeni. A lungo si è pensato che il sistema immunitario fosse indipendente dal sistema nervoso. Di recente è stata invece dimostrata l’esistenza di una stretta correlazione tra i due sistemi, fonda-mentale nei disturbi centrali neurodegenerativi e infiammatori. In particolare, è stato dimostrato come da una parte citochine proinfiammatorie siano in grado di controllare la neurotrasmissio-ne e, dall’altra parte, la sintesi e il rilascio di citochine/chemochine selettive venga regolata, a livello cerebrale, da classici neurotrasmettitori. Queste osservazioni aggiungono nuovi risvolti al ruolo delle chemochine nella neuroinfiammazione. Infatti, secondo tale ipotesi, l’espressione aberrante delle chemochine che si riscontra nella SM potrebbe causare modificazioni profonde alla neurotrasmissione centrale, rappresentando quindi un meccanismo alla base dei sintomi neuropsichiatrici osservati in pazienti con SM. Tra le varie citochine, la chemochina proinfiammatoria RANTES viene considerata un marca-tore della SM in quanto nei pazienti si osservano modifiche riguardanti la sua produzione e l’espressione dei suoi recettori. Con questo studio si è voluto verificare se RANTES potesse comportarsi come modulatore della neurotrasmissione centrale e valutare se tale funzione potesse essere modificata in topi affetti da Encefalomielite Autoimmune Sperimentale (EAE), un modello animale che mostra trat-ti comuni con la SM umana. A partire dall’osservazione che la trasmissione glutammatergica risulta alterata in pazienti con SM, il nostro studio si è focalizzato sull’impatto di RANTES sul rilascio di tale neurotrasmettitore in differenti aree cerebrali in topi controllo ed EAE.

RISULTATI

Abbiamo valutato se RANTES potesse modulare il rilascio di glutammato in diverse aree cere-brali del cervello di topo, in condizioni non patologiche. I dati da noi ottenuti hanno dimostrato che la chemochina RANTES era in grado di controllare la liberazione di glutammato e che questa modulazione avveniva con modalità differente a seconda dell’area cerebrale studiata. Infatti, a livello corticale, in condizioni basali, RANTES provocava il rilascio di glutammato, ma ne inibiva l’esocitosi causata da stimolo depolarizzante. Al contrario, il rilascio spontaneo di glutammato a livello spinale sembrava non essere influenzato da concentrazioni nanomolari della chemochina, mentre le stesse concentrazioni di RANTES erano in grado di indurre un potenziamento dell’esocitosi evocata da stimolo depolarizzante. La discrepanza tra gli effetti causati dalla chemochina nelle due diverse aree del sistema nervoso centrale (midollo spinale e corteccia) poteva suggerire il coinvolgimento di diversi sistemi recettoriali. In accordo con questa ipotesi, abbiamo dimostrato come le modificazioni del rilascio di glutammato siano correlate al legame di RANTES a diversi recettori delle chemochine. In particolare, l’azione potenziante indotta da RANTES sulla liberazione di glutammato dipendeva sempre dall’intera-zione della chemochina con i sottotipi recettoriali CCR1 e CCR5, mentre l’effetto inibente coin-94 95


volgeva anche il sottotipo recettoriale CCR3. Abbiamo quindi valutato come e in che misura questi effetti potessero essere modificati in animali EAE. I dati ottenuti da sinaptosomi isolati da terminazioni glutammatergiche del midollo spinale di topi EAE al 13° e al 21° giorno dall’im-munizzazione (d.p.i.) hanno dimostrato come non fosse evidente alcuna variazione significativa né nell’esocitosi di glutammato evocata da stimolo depolarizzante (ossia da elevate concen-trazioni di KCl) né nell’aumento mediato da RANTES del rilascio di tale neurotrasmettitore. Al contrario, in sinaptosomi corticali di topi EAE (13 e 21 d.p.i.), si osservava una marcata ridu-zione dell’esocitosi di glutammato. Questa riduzione era accompagnata da una modificazione dell’effetto inibente di RANTES sul rilascio di glutammato osservato su animali controllo che diveniva potenziante nei terminali corticali ottenuti da topi al 13 d.p.i. per poi scomparire a 21 d.p.i.. È interessante notare come parallelamente i livelli endogeni di RANTES nella corteccia e nel midollo spinale di topo EAE fossero drammaticamente aumentati e correlassero con la gravità della patologia, suggerendo che il rilascio di RANTES potrebbe avere un ruolo chiave nelle variazioni qui riportate.Le modifiche indotte da RANTES sul rilascio di glutammato non erano accompagnate da cam-biamenti nella composizione del repertorio recettoriale coinvolto negli effetti descritti, bensì era-no correlabili a modifiche dei sistemi di trasduzione intraterminali coinvolti nell’effetto inibente che la chemochina provoca sull’esocitosi di glutammato.

CONCLUSIONI

Il nostro studio indica che nell’animale EAE si hanno modifiche nella modulazione della tra-smissione centrale del glutammato da parte di RANTES. Esse presentano una buona corri-spondenza con il livello di gravità della patologia e possono dunque rappresentare processi molecolari specifici alla base della patologia autoimmune. Tali risultati inoltre svelano nuove informazioni riguardanti l’interazione tra i sistemi immunitario e neuronale e potrebbero divenire potenzialmente utili nel rivelare i processi molecolari mediante i quali nuove terapie possano ripristinare funzioni centrali e risultare rilevanti per l’evoluzione della SM. Considerando che i recettori delle chemochine costituiscono un bersaglio per l’approccio terapeutico della SM e che l’industria farmaceutica e biotecnologica ha affrontato sforzi sostanziali per modulare la loro attività, le nostre osservazioni potrebbero sottolineare nuovi aspetti dell’importanza clinica delle chemochine nei disturbi neuroinfiammatori.

STUDIO SUL RUOLO FUNZIONALE DI RANTES SULLA TRASMISSIONE GLUTAMATERGICA NEL CERVELLO UMANO ED IN TOPI EAE


Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune demyelinating disorder of the central nervous sy-stem (CNS) of unknown aetiology that could emerge when genetically susceptible individuals encounter environmental triggers that initiate an inflammatory cascade of events against self-antigens. As to the immune system, for many decades it was thought to be independent from central nervous system. Recently, however, the two systems have been proposed to communica-te and to play a role in central neurodegenerative and inflammatory disorders. In particular, proinflammatory cytokine were reported to control neurotransmission and, on the other side, classic neurotransmitters were shown to regulate the synthesis and the release of selective cytokines/chemokines within the brain. These observations have several implications and add new aspects of interest to the role chemokines in neuroinflammation. Indeed, accordingly to this thesis, an aberrant expression of the chemokine in MS patients could have profound mo-difications to central neurotransmission and may account for neuropsychiatric symptoms that often are observed in MS patients.Among all the cytokines pathologically produced in CNS, the proinflammatory chemokine

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RANTES is considered an hallmark of MS, because of its modified production and of the chan-ges in the expression of chemokine receptors observed in MS patients. The principal aims of our study, was to evaluate whether RANTES could behave as a fine mo-dulator of central neurotransmission and whether this function could be modified in Experimen-tal Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) mice, an animal model that share some aspects with human MS. Starting from the observation that glutamate transmission is altered in MS subjects, our study was focused on the impact of RANTES on the release of this neurotransmitter in dif-ferent brain areas in control and EAE mice.

RESULTS As a first approach, we investigated whether RANTES could modulate the release of glutamate in different mouse brain areas in healthy condition. Our first finding was that the chemokine-mediated control of glutamate release occurs in an area-specific manner. Indeed, at the cortical level, RANTES elicits the release of glutamate in basal condition but inhibits glutamate exocyto-sis caused by mild depolarizing stimuli. Differently, the spontaneous release of glutamate from spinal cord glutamatergic nerve termi-nals was unaffected by nanomolar concentration of chemokine, while the depolarization-evo-ked glutamate exocytosis was potentiated. The discrepancy in the effects elicited by the che-mokine in the two mouse CNS regions (namely the spinal cord and the cortex) was predictive of the involvement of different receptor repertoires. Accordingly to this hypothesis, we found that RANTES-induced modification to glutamate release always relied on the binding of RANTES to chemokine receptor 1 (CCR1) or CCR5 subtypes, with the exception of RANTES. We then investigated whether and to what extent the above described RANTES-induced effects could be modified in EAE mice. As to the impact of MOG-immunization on RANTES-mediated con-trols of glutamate exocytosis, glutamate overflow evoked by a classic depolarizing stimulus (i.e. high KCl concentration) as well as RANTES-induced facilitation of glutamate exocytosis from synaptosomes isolated from the spinal cord of EAE mice at 13 and 21 days post immunization (d.p.i.) was not significantly modified. On the contrary, at the cortical level, a persistent reduc-tion of glutamate exocytosis was observed in cortical synaptosomes from EAE mice at 13 and 21 d.p.i. Inasmuch, RANTES-induced inhibition of glutamate exocytosis turned to facilitation at 13 d.p.i. then disappearing at 21 d.p.i.. Interestingly, endogenous RANTES in the cortex and in the spinal cord of EAE mice was dramatically increased and well correlated with animal score suggesting that pathologically released RANTES could have a role in the modification described above to glutamate release. Changes in RANTES-induced modification to glutamate release were not accompanied by modification of the receptor repertoire, but were paralleled by modification in the intraterminal pathway accounting for the inhibitory effect the chemokine causes on glutamate exocytosis, i.e. the adenylyl cycalse- cAMP- protein kinase A-mediated enzymatic pathway.

CONCLUSIONS In conclusion, our study indicates that changes in RANTES-induced control of central glu-tamate transmission well correlate with EAE gravity a could therefore represent a molecular processes specifically targeted in autoimmune processes. Furthermore, these results could provide novel information on the cross talk between immune and neuronal systems that may be relevant to the evolution of MS.They might also be useful in unveiling the molecular processes through which new therapeutic intervention could restore central functions. Considering that chemokine receptors are targets for therapeutic approach to the cure of MS, and that biotechnology and pharmaceuticals indu-stry has mounted substantial efforts to modulate their activity, our observation could help to hi-ghlight new aspects of the medical importance of chemokines in neuro-inflammatory diseases.


Di Prisco S., Summa M., Merega E., Pittaluga A. RANTES-glutamate interaction in central ner-vous system Congresso Nazionale Società Italiana di Neuroscienze, to be held in Catania, 19-22 Aprile 2012

Di Prisco S, Summa M, Merega E, Pittaluga A. RANTES-mediated control of glutamate release in mouse brain occurs in a area-specific manner and involves distinct chemokine receptor repertoi-res. 8th FENS Forum of Neuroscience, Barcelona, to be held in July 14-18, 2012

Marte A, Cavallero A, Morando S, Uccelli A, Raiteri M, Fedele E. 2010. Alterations of glutamate release in the spinal cord of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuro-chem. 2010 Oct;115: 343-52

Di Prisco S, Summa M, Cherllakudam V, Rossi PIA, Pittaluga A. RANTES-mediated control of excytatory amino acid release in mouse spinal cord. Accepted with minor revision, 2012 Februa-ry, 24 on J. Neurochemistry

Fedele E, Raiteri M, Summa M, Di Prisco S, Cavallero A, Gardella E, Pittaluga A Study on the functional roles of RANTES on glutamate transmission in human and EAE mice brains Convegno scientifico Fondazione Italiana Sclerosi Multipla, Roma, 26-27 maggio 2011

Di Prisco S, Summa M, Chellakudam V, Pittaluga A RANTES-glutamate interaction in Central Nervous System : a glial to neuron cross-talk relevant to central neuroinflammation35° Congresso Nazionale Società Italiana di Farmacologia, Bologna, 14-17 settembre 2011

Musante V, Summa M, Severi P, Raiteri M and Pittaluga A. RANTES modulates the release of glutamate in human and mouse neocortexSociety for Neuroscience, Chicago, 2009 October 16-19

Musante V, Summa M, Kalfas F, Severi P, Raiteri M, Pittaluga A. RANTES controls the release of glutamate in human and mouse neocortex36° Colloque de Neuroendocrinologie, Nizza, Septembre 15-18 2009

Summa M, Musante V, Severi P, Raiteri M, Pittaluga A. RANTES modulates central glutamatergic neurotransmission in human and mouse neocortex34° Congresso Nazionale della Società Italiana di Farmacologia, Rimini 14-17 Ottobre 2009

Di Prisco S, Summa M, Severi P, Marchi M and Pittaluga A. The pro-inflammatory chemokine RANTES controls glutamate bioavailability in human and mouse neocortex New Therapies for Inflammation September 24, 2010, IIT Central Research Lab Genova


STUDIO DELL’EFFICACIA TERAPEUTICA DI NUOVI MODULATORI DEL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE NELLA SCLEROSI MULTIPLA

RESPONSABILE DEL PROGETTOANNA MARIA MALFITANODipartimento di Scienze Farmaceutiche e BiomedicheUniversità di Salerno

MENTOREMAURIZIO BIFULCO


In questi ultimi anni la ricerca ha evidenziato il ruolo chiave del sistema endocannabinoide come promettente bersaglio terapeutico nella sclerosi multipla (SM). Questo sistema comprende i recettori dei cannabinoidi (CB1, CB2), gli endocannabinoidi e gli enzimi responsabili della loro sintesi ed inattivazione. Il recettore CB2 è espresso quasi esclusiavemente dalle cellule del sistema immunitario e può avere un ruolo funzionale importante nel sistema nervoso centrale con il vantaggio di non causare gli effetti psicoattivi dovuti al recettore CB1. Il sistema endocan-nabinoide esercita un ruolo protettivo durante la neuroinfiammazione dovuto almeno in parte alla ridotta attivazione ed infiltrazione delle cellule immuni. Gli agonisti dei recettori dei canna-binodi migliorano il decorso della SM sia nell’uomo che nei topi con encefalite sperimentale autoimmune (EAE) e hanno un favorevole profilo farmacologico di sicurezza, sebbene il loro uso sia limitato dagli effetti psicoattivi. Recentemente è stato dimostrato il ruolo protettivo del recettore CB2 nell’EAE, i topi deficienti del recettore CB2 presentano un peggioramento della malattia rispetto ai topi normali ed una selettiva attivazione farmacologica di questo recettore riduce i sintomi della malattia. Inoltre le cellule T encefalitogeniche deficienti del recettore CB2 proliferano e producono citochine infiammatorie in misura maggiore rispetto alle cellule T nor-mali e sono più resistenti all’apoptosi. Per chiarire l’importanza dell’attivazione del recettore CB2 nella patogenesi della SM, gli effetti di nuovi agonisti altamente selettivi per il CB2, in par-ticolare i derivati 1,8-naftiridinici, piridinici e chinolinici sono stati esaminati sulla proliferazione, sull’attivazione, sulla produzione di citochine, sulla sopravvivanza e sul ciclo cellulare nonchè sulle principali vie di attivazione, sulla migrazione e sugli enzimi coinvolti nell’infiammazione dei linfociti isolati sia da donatori sani che da pazienti con SM.

RISULTATI

Gli effetti immunomodulatori e antiinfiammatori di nuovi agonisti del recetto-re CB2, in particolare di derivati 1,8-naftiridinici, piridinici e chinolinici [N-ciclopen-til 7-metil-1-(2-morfolin-4-iletil)-1,8-naftiridin-4(1H)-one-3-carbossiammide (CB13), N-(4-metilcicloesil)-1-benzil-1,8-naftiridin-2(1H)-one-3-carbossiammide (CB74) N-cicloesil-1-benzil-7-metossi-1,8-naftiridin-4(1H)-one-3- carbossiammide (CB82) N-(4-metilcicloesil)-1-(p-fluorobenzil)-1,8-naftiridin-2(1H)-one-3-carbossiammide (CB91), N-ciclo-eptil-4-idrossi-1-(2-morfolin-4-iletil)-2-osso-1,2-diidro-1,8-naftiridin-3-carbossiammide (VL15), N-cicloeptil-1-(2-morfolin-4-iletil)-chinolin-2(1H)-one-3-carbossiammide (VL23), N-cicloep-til-1-(p-fluorobenzil)-1,2-diidro-2-osso-piridin-3-carbossiammide (AF4), N-(4-metilcicloesil)-1-(2-morfolin-4-iletil)-chinolin-2(1H)-one-3-carbossiammide (VL8), N-(4-metilcicloesil)-1-(p-fluorobenzil)-4-idrossi-2-osso-1,2-diidro-1,8-naftiridin-3-carbossiammide (LV8), N-cicloeptil-1-butyl-1,8-naftiridin-2(1H)-one-3-carbossiammide (LV24), N-(4-metilcicloesil)-1-pentil-chinolin-2(1H)-one-3-carbossiammide (CF6trans) and N-cicloeptil-5-(p-metossifenil)-1-(p-fluorobenzil)-1,2-diidro-2-osso-piridin-3-carbossiammide (MC21)] sono stati valutati sui linfociti isolati dal sangue periferico (PBL) di donatori sani e di pazienti con SM. Nei PBL di donatori sani questi composti a concentrazioni micromolari bloccavano in alcuni casi in modo dose dipendente la proliferazione indotta con proteina mielina basica, riducevano la vitalità, la produzione di TNF-α e di IL-10, l’espressione di marcatori di attivazione, CD69, CD25, CD54 e CD49d, in alcuni casi la migrazione, la transizione di fase G1/S del ciclo cellulare e inducevano apoptosi. L’effetto antiproliferativo di molti composti era revertito dall’antagonista del recettore CB2 questo dato suggeriva un meccanismo mediato dal recettore. È stata osservata anche 98 99


una ridotta espressione di proteine fosforilate NF-kB, IKKαβ, ERK, Akt e dell’enzima Cox-2 (il CB74 non aveva effetto su Cox-2). Alcuni composti, selezionati per l’efficacia e per l’effetto mediato dal recettore CB2 sono stati usati su PBL isolati da pazienti con SM non in trattamento con farmaci immunosoppressori. Il CB74 è stato selezionato per la attività agonista dimostrata anche da altri studi, il VL23 come derivato chinolinico e l’AF4 come composto piridinico con affinità paragonabile per i recettori CB1 e CB2. Gli effetti sulla proliferazione, sulla vitalità e sull’espressione di Akt e Cox-2 sono stati confermati, in più il CB74 riduceva l’espressione di Cox-2. Il CB74 e il VL23 erano più efficaci nel ridurre l’attivazione nei PBL dei pazienti rispetto ai donatori sani, in particolare il CB74 riduceva CD69 e il VL23 riduceva CD69, CD54 e CD25, l’AF4 non aveva effetto sull’attivazione, quindi una maggiore selettività per il recettore CB2 determinava una maggiore riduzione dell’attivazione nei PBL dei pazienti. I risultati ottenuti soddisfano gli obiettivi proposti.

CONCLUSIONI

Questi risultati suggeriscono il potenziale utilizzo dei derivati 1,8-naftiridinici, piridinici e chino-linici nella terapia della SM. Questi composti altamente selettivi per il recettore CB2 riducono la proliferazione, la produzione di citochine, l’attivazione, la migrazione e l’infiammazione nei linfociti isolati da donatori sani. Effetti simili sono stati riscontrati nei linfociti isolati da pazienti con SM, con un effetto inibitorio addirittura maggiore sull’attivazione rispetto ai donatori sani all’aumentare della selettività per il recettore CB2. Questi risultati suggeriscono l’importanza del recettore CB2 nella SM, in particolare i derivati 1,8-naftiridinici, piridinici e chinolinici che agiscono attraverso questo recettore e che hanno il vantaggio di non avere effetti psicoattivi dovuti al recettore CB1, considerati i loro effetti immunomodulatori ed antiinfiammatori potreb-bero essere utilizzati per futuri studi clinici e portare alla sviluppo di una nuova terapia per la SM.

STUDY OF THE THERAPEUTIC EFFICACY OF NOVEL MODULATORS OF THE ENDOCANNABINOID SYSTEM IN MULTIPLE SCLEROSIS


The research of the last years has highlighted the key role of the endocannabinoid system as a promising therapeutic target in multiple sclerosis (MS). This system includes cannabinoid re-ceptors (CB1, CB2), endocannabinoids and enzymes for their production and inactivation. The CB2 receptor is almost exclusively expressed by the immune cells and may play a functionally relevant role in the central nervous system with the advantage to be unrelated to psychoactive effects due to the CB1 receptor. The endocannabinoid system has a protective role during neuroinflammation exerted, at least in part, by decreasing immune cell activation and infiltration. Cannabinoid receptor agonists improve clinical disease in humans with MS and in rodents with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and have a favorable drug safety profile, although their use in the clinic is severely limited by their psychoactivity. Recent works highlighted the protective role of CB2 receptors in EAE, CB2 receptor knock-out mice showed an exacerbated clinical score of the disease when compared with their wild-type littermates and selective pharmacological CB2 activation markedly reduced EAE symptoms. Furthermore, CB2-/- encephalitogenic T cells exhibited higher rates of proliferation, reduced apoptosis and increased inflammatory cytoki-ne production as compared to wild-type T cells. In order to better clarify the relevance of the CB2 receptor activation in MS pathogenesis, in this project the effects of novel CB2 agonists, 1,8-naphthyridine, pyridine and quinoline derivatives, showed to be highly selective for CB2 receptors were investigated on lymphocytes isolated from healthy donors and MS patients. In particular proliferation, activation, cytokine production, cell survival and cycle and main activa-tion pathways were examined as well their effects on cell migration and enzymes associated to inflammation.

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RESULTS The immunomodulatory and antiinflammatory effects of novel CB2 agonists, in par-ticular 1,8-naphthyridine, pyridine and quinoline derivatives, N-cyclopentyl-7-methyl-1-(2-morpholin-4-ylethyl)-1,8-naphthyridin-4(1H)-on-3-carboxamide (CB13), N-(4-methylcyclohexyl)-1-benzyl-1,8-naphthyridin-2(1H)-on-3-carboxamide (CB74) N-cyclohexyl-1-benzyl-7-methoxy-1,8-naphthyridin-4(1H)-on-3-carboxamide (CB82) N-(4-methylcyclohexyl)-1-(p-fluorobenzyl)-1,8-naphthyridin-2(1H)-on-3-carboxamide (CB91), N-cycloheptyl-4-hydroxy-1-(2-morpholin-4-ylethyl)-2-oxo-1,2-dihydro-1,8-naphthyridine-3-carboxamide (VL15), N-cyclohepthyl-1-(2-morpholin-4-ylethyl)-quinolin-2(1H)-on-3-carbo-xamide (VL23), N-cyclohepthyl-1-(p-fluorobenzyl)-1,2-dihydro-2-oxo-pyridine-3-carboxamide (AF4), N-(4-methylcyclohexyl)-1-(2-morpholin-4-ylethyl)-quinolin-2(1H)-on-3-carboxamide (VL8), N-(4-methylcyclohexyl)-1-(p-fluorobenzyl)-4-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydro-1,8-naphthyri-dine-3-carboxamide (LV8), N-cycloheptyl-1-butyl-1,8-naphthyridin-2(1H)-on-3-carboxamide (LV24), N-(4-methylcyclohexyl)-1-pentyl-quinolin-2(1H)-on-3-carboxamide (CF6trans) and N-cycloheptyl-5-(p-methoxyphenyl)-1-(p-fluorobenzyl)-1,2-dihydro-2-oxo-pyridine-3-carboxami-de (MC21) were investigated on peripheral blood lymphocytes (PBL) isolated from healthy donors and MS patients. In PBL of healthy donors, these compounds at micromolar concen-trations, inhibited in some cases in a dose dependent manner the proliferation of myelin basic protein activated PBL reduced vitality, inhibited TNF-α and IL-10 production, the expression of T cell activation markers CD69, CD25, CD54 and CD49d, in some cases cell migration, blocked the G1/S transition phase of the cell cycle and induced apoptosis. The antiproliferative effect of many compounds was reverted by the CB2 antagonist, finding suggesting a CB2 receptor mediated mechanism. Furthermore, we found down-regulation of phosphorylated proteins NF-kB, IKKαβ, ERK, Akt and the enzyme Cox-2 (CB74 did not affect Cox-2 levels). Some of these compounds, selected for their efficiency and for their CB2 receptor mediated effects were used on PBL isolated from MS patients not in therapy with currently administered immune-suppressive medicines. CB74 was selected for its agonist activity showed also by previous studies, VL23 was selected as quinoline derivative and AF4 as pyridine compounds with similar affinity at both the CB1 and CB2 receptor. The effects on proliferation, vitality and the expression of Akt and Cox-2 were maintained, indeed CB74 inhibited Cox-2 expression. CB74 and VL23 were more efficient to inhibit activation in PBL of MS patients than of normal subject, in particular, CB74 reduced CD69 levels and VL23 reduced CD69, CD54 and CD25 levels, AF4 did not inhibit activation in PBL of patients, thus suggesting that enhanced selecti-vity at the CB2 receptor determines higher inhibition of activation in PBL from patients. These findings reported satisfy the objectives proposed.

CONCLUSIONS These findings suggest the potential use of 1,8-naphthyridine, pyridine and quinoline derivati-ves in MS therapy. These highly selective CB2 compounds reduce proliferation, cytokine pro-duction, activation, migration and inflammation in lymphocytes isolated from healthy donors. Similar effects were observed in lymphocytes from MS patients, in these cells a higher inhibitory effect on activation was observed with respect to healthy donors when compounds with higher CB2 selectivity were used. These findings suggest the relevance of the CB2 receptor in MS, in particular 1,8-naphthyridine, pyridine and quinoline derivatives acting through this receptor, having the advantage to be unrelated to CB1 receptor psycoactivity, and considering their im-munomodulatory and anti-inflammatory effects might be used in future clinical studies to lead to the development of a new therapy of MS.


Manera C, Saccomanni G, Malfitano AM, Bertini S, Castelli F, Laezza C, Ligresti A, Lucchesi V, Tuccinardi T, Rizzolio F, Bifulco M, Di Marzo V, Giordano A, Macchia M, Martinelli M. Rational design, synthesis and antiproliferative properties of new CB2 selective cannabinoid receptor ligands: an investigation of the 1,8-naphthyridin-2(1H)-one scaffold. Sottomesso a European Journal of Medicinal Chemistry

Malfitano AM, Laezza C, D’Alessandro A, Procaccini C, Saccomanni G, Tuccinardi T, Manera C, Matarese G, Gazzerro P, Bifulco M. CB2 receptor mediated immunomodulation by 1,8-naphthy-ridine, quinoline and pyridine derivatives in multiple sclerosis. Sottomesso a Journal of Neuro-science

Malfitano AM, Laezza C, Bifulco M. “Studio dell’efficacia terapeutica di nuovi modulatori del sistema endocannabinoide nella sclerosi multipla” CONVEGNO SCIENTIFICO FISM 2011 Roma, 25 - 26 maggio 2011 centro Congressi di Roma Eventi Piazza di Spagna (via Alibert 5a)

Malfitano AM, Manera C, Laezza C, Martinelli A, Dittel B. Bifulco M. “Design, synthesis and study of the therapeutic efficacy of novel modulators of the endocannabinoid system in multiple sclerosis”. CONVEGNO SCIENTIFICO FISM 2011 Roma, 25 - 26 maggio 2011 centro Congressi di Roma Eventi Piazza di Spagna (via Alibert 5a)

Malfitano AM, Manera C, Laezza C, Larocca C, Matarese G, Martinelli A, Bifulco M. “Studio dell’efficacia terapeutica di nuovi modulatori del sistema endocannabinoide nella sclerosi multipla”CONVEGNO SCIENTIFICO FISM 2010 Roma, 26 - 27 maggio 2010 Istituto Superiore di Sanità

Malfitano AM, Manera C, Basu S, Laezza C, Larocca C, Matarese G, Martinelli A, Dittel B. Bifulco M. “Design, synthesis and study of the therapeutic efficacy of novel modulators of the endocan-nabinoid system in multiple sclerosis”. CONVEGNO SCIENTIFICO FISM 2010 Roma, 26 - 27 maggio 2010 Istituto Superiore di Sanità

BORSA DI STUDIO FINANZIATA CON IL BANDO FISM 2009per un periodo di 2 anni - 40.000 €

DEMIELINIZZAZIONE ANTICORPALE NELLA SCLEROSI MULTIPLA: UNO STUDIO TRANSLAZIONALE DALL’UOMO AL TOPO CON ANTICORPI PURIFICATI DA PAZIENTI CON SM IN RELAPSE CLINICA

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RESPONSABILE DEL PROGETTOROSETTA PEDOTTINeurologo RicercatoreUnità di Neuroimmunologia, Istituto Neurologico Fondazione Carlo Besta

Collaboratori:CARLO ANTOZZISILVIA MUSIOMASSIMO COSTANZAABOU-HAMDAN

Collaborazioni con altri gruppi:LUIGI POLIANI, Dipartimento di Patologia, Università di Brescia, Spedali Civili di BresciaUO Riabilitazione Specialistica, Brescia CINTHIA FARINA, PhD. Istituto di Neurologia Sperimentale, Fondazione Centro S. Raffaele del Monte TaborBERNHARD HEMMER, Department of Neurology, Heinrich Heine University, Dusseldorf, Germany


Il ruolo degli anticorpi (IgG) nella sclerosi multipla (SM) è ancora dibattuto. Alcuni pazienti con SM con recente recidiva rispondono favorevolmente a plasmaferesi, procedura che rimuove anticorpi ed altri componenti del plasma. La terapia con Rituximab, che depleta i linfociti B, è efficace nel migliorare la malattia. Queste evidenze cliniche supportano un ruolo per le cellule B e per le IgG nella SM.Negli ultimi anni abbiamo impiegato l’immunoassorbimento degli anticorpi su proteina A (PAI) in diverse malattie autoimmuni del sistema nervoso periferico e centrale. Tra questi, abbiamo trattato pazienti con SM che non rispondono a terapia standard con corticosteroidi ad alto dosaggio per via endovenosa. La disponibilità di PAI, trattamento che consente la rimozione selettiva e massiccia di IgG da plasma umano, ci ha fornito IgG purificate da pazienti con SM.Lo scopo del progetto era di fare uso di queste IgG umane ottenute da pazienti con SM nel modello animale di malattia, per trovare ulteriori evidenze riguardo all’ipotesi di un ruolo pato-genico degli anticorpi nella SM.Il design del progetto consisteva nel trasferire passivamente in topi con encefalomielite au-toimmune sperimentale (EAE), IgG purificate da un paziente con SM recidivante-remittente in relapse clinica, significativamente migliorato dopo rimozione degli anticorpi con PAI. Gravità cli-nica dell’EAE, infiammazione e demielinizzazione nel sistema nervoso centrale (SNC) sarebbero stati valutati in topi con EAE trattati con IgG di questo paziente e confrontati con quelli dei topi trattati con IgG di controllo di diversi pazienti. Sarebbero stati poi valutati sia la specificità della reattività IgG contro diversi autoantigeni mielinici, sia potenziali differenze di autoreattivita’ tra il paziente responsivo e uno non-responsivo a PAI. Questo studio aveva lo scopo di identificare possibili target antigenici delle risposte anticorpali potenzialmente patogenetiche nella SM.

RISULTATI

La ricerca che abbiamo condotto puo’ essere riassunta come segue. Abbiamo usato anti-corpi IgG purificati da un paziente con SM che ha presentato un miglioramento significativo dei sintomi neurologici nel corso di due relapse consecutive dopo rimozione selettiva di IgG mediante immunoassorbimento su proteina A (PAI). Questa procedura consente la rimozione selettiva di IgG circolanti. Il miglioramento clinico dopo PAI era strettamente correlato con la rimozione IgG, suggerendo così l’ipotesi di un ruolo delle IgG nella comparsa o persistenza di sintomi neurologici in questo paziente. Abbiamo trasferito passivamente questi anticorpi IgG purificati nel modello animale di sclerosi multipla, la encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Abbiamo usato il modello murino di EAE recidivante-remittente indotto con myelin pro-teolipid protein 139-151 (PLP 139-151). Questi topi immunizzati sono stati trattati con IgG del paziente purificate all’inizio della EAE. Come controlli, i topi sono stati trattati con IgG purificate

da pazienti con altre malattie disimmuni neurologiche o non-neurologiche, oppure solo con soluzione fisiologica. Abbiamo osservato un significativo peggioramento clinico dell’ EAE in topi trattati con IgG dal paziente SM rispetto ai topi di controllo. In linea con questi risultati clinici, i topi trattati con IgG del paziente con SM hanno presentato infiammazione e demielinizzazione del sistema nervoso centrale (SNC) più gravi rispetto ai topi di controllo. Analisi di microscopia confocale e a doppia immunofluorescenza hanno rivelato una reattività diffusa contro le IgG umane negli oligodendrociti della sostanza bianca del SNC dei topi con EAE trattati con IgG dal paziente con SM. Utilizzando un saggio biologico ad alta sensibilità che permette di rilevare an-ticorpi contro la parte extracellulare della myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), uno degli autoantigeni piu’ implicati nella SM, abbiamo osservato reattività contro questo antigene nel siero e nelle IgG purificate da questo paziente. Nessuna reattività contro la MOG è stata rilevata nelle IgG purificate dai pazienti di controllo. Non abbiamo tuttavia evidenze che suggeriscono che la MOG sia l’antigene bersaglio unico e patogenico di queste IgG. Abbiamo ottenuto IgG da un altro paziente con SM in ricaduta che non rispondeva al trattamento con PAI e le abbia-mo trasferite nei topi con EAE. Questo trattamento non aggravava l’EAE, come faceva invece il trattamento con IgG dal paziente responsivo all’immunoassorbimento con PAI, osservazione che suggerisce che il miglioramento dei sintomi clinici dopo PAI potrebbe riflettere la presenza di anticorpi patogeni circolanti nel paziente responsivo a tale trattamento. Presi insieme, questi dati forniscono una prova importante a sostegno dell’ipotesi di un ruolo patogenetico degli autoanticorpi nella SM.

CONCLUSIONI

Questi dati supportano l’ipotesi di un ruolo importante per gli anticorpi nella patogenesi della SM, almeno in un sottogruppo di pazienti. È ragionevole ipotizzare che l’efficacia della rimozio-ne degli anticorpi in alcuni pazienti con SM rifletta la presenza di anticorpi circolanti con un ruolo patogenetico. Tale ruolo potrebbe essere dimostrato, come abbiamo fatto nel nostro studio, mostrando la capacità delle IgG circolanti di indurre peggioramento dell’EAE, incremento del danno nel SNC, e binding delle IgG alla sostanza bianca del SNC. L’implicazione terapeutica più importante di questo studio è che questi risultati potrebbero contribuire allo sviluppo della medicina personalizzata per la SM. Infatti, questo lavoro potrebbe aprire la strada a studi volti a capire se pazienti con SM che hanno IgG il cui ruolo patogenetico può essere dimostrato in vivo nel modello EAE, possono beneficiare di procedure volte a depletare o interferire con le IgG

ANTIBODY MEDIATED DEMYELINATION IN MULTIPLE SCLEROSIS: A TRANSLATIONAL STUDY FROM MAN TO MOUSE WITH PURIFIED IGG FROM RELAPSING MS PATIENTS


The role of antibodies (IgG) in multiple sclerosis (MS) is still debated. A subset of MS patients with recent relapse respond favourably to plasmaexchange, a procedure that removes antibo-dies, as well as other plasma components. Further, B cell depleting therapy with Rituximab has been shown to ameliorate disease. These clinical evidence support a role for IgG and B cells in MS. Over the last fifteen years, we employed at our Institution IgG immunoadsorption on protein A (PAI) in several autoimmune disorders of the peripheral and central nervous system. Among these, we treated MS patients that did not respond to standard high dose intravenous corticosteroids. The availability of PAI, a treatment that allows the selective and massive remo-val of IgG from human plasma with negligible interaction with other plasma components, pro-vided us a considerable amount of purified IgGs from MS patients. The aim of our project was to make use of these precious and unique human IgG derived from MS patients in the animal

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model of this disease to find additional proof of the pathogenic role of IgG in MS. The design of our project was to passively transfer into mice with experimental autoimmune encepha-lomyelitis (EAE), an animal model of MS, IgG purified from a patient with relapsing-remitting MS in acute clinical exacerbation who significantly improved after antibody removal with PAI. Severity of EAE and central nervous system (CNS) inflammation and demyelination would have been evaluated in mice with EAE treated with IgG from this patient and compared with those of EAE mice treated with control IgG from different patients. Specificity of IgG reactivity against several autoantigens would have also been investigated. We also planned to compare reactivity against myelin autoantigens of the PAI-responder patient with that of a PAI-non responder MS patient to identify potential target/s of pathogenic IgG response.

RESULTS The research that we performed can be summarized as follows. We used IgG antibodies pu-rified from a patient with MS that presented a striking amelioration of neurological symptoms during two consecutive relapses after selective IgG removal with immunoabsorption on Protein A (PAI). This procedure allows the selective removal of circulating IgG. The clinical improvement after PAI was strictly time-related with IgG removal, thus suggesting a role for IgG in the appe-arance and/or persistency of neurological symptoms in this patient. We passively transferred these purified IgG antibodies in the animal model of MS, experimental autoimmune encepha-lomyelitis (EAE). We used the relapsing-remitting mouse model of EAE induced with myelin proteolipid protein 139-151 (PLP 139-151). These immunized mice were treated with patient’s purified IgG at the onset of EAE. As controls, mice were treated with IgG purified from patients with other dysimmune neurological or non-neurological diseases, or with vehicle alone. We observed a significant exacerbation of clinical expression of EAE in mice treated with IgG from the MS patient compared to control treated mice. In line with these clinical findings, mice trea-ted with IgG from the MS patient presented more severe inflammation and increased demye-lination in the CNS compared to control treated mice. Double immunofluorescence and con-focal microscopy studies revealed a diffuse reactivity against human IgG in oligodendrocytes of CNS white matter of mice treated with IgG from the MS patient. By using a high-sensitivity bioassay, which allows detecting autoantibodies that bind to the extracellular part of native myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), one of the most implicated autoantigen in MS, we observed reactivity against this antigen in serum and purified IgG of this patient. No reactivity against MOG was detected in IgG purified from control patients. However, we don’t have evi-dence that MOG is the unique and pathogenic target antigen of these IgG, that thus remains to be determined. We obtained IgG from another MS patient in relapse that did not respond to PAI treatment and transferred those IgG in EAE mice. This treatment did not exacerbate EAE, an observation suggesting that amelioration of clinical symptoms after PAI might reflect the presence of pathogenic antibodies. Taken together, these data provide an important evidence in support of the hypothesis of a pathogenic role of autoantibodies in MS.

CONCLUSIONS Taken together, these data strongly support the hypothesis of an important role for antibodies in the pathobiology of MS, at least in a subset of patients. It is conceivable to speculate that the efficacy of antibody removal in certain MS patients might reflect the presence of circulating antibodies with a pathogenic role. Such a role could be demonstrated, as we did in our study, by showing the capacity of these circulating IgG to induce worsening of EAE, increased CNS damage, and staining of CNS white matter. The most important therapeutic implication of this study is that these results might be of importance for the development of personalized medici-ne in MS. Indeed, this work might open up future studies aimed at understanding whether MS patients having IgG whose pathogenic role can be demonstrated in vivo in the EAE model, can benefit of procedures aimed at depleting or interfering with IgG.


Piconese S, Costanza M, Tripodo C, Sangaletti S, Musio S, Pittoni P, Poliani PL, Burocchi A, Passafaro AL, Gorzanelli A, Vitali C, Chiodoni C, Barnaba V, Pedotti R, Colombo MP. The matri-cellular protein SPARC supports follicular dendritic cell networking toward Th17 responses. J Autoimmunity. 2011 Dec; 37(4):300-10. Epub 2011 Sep 29

Piconese S, Costanza M, Musio S, Tripodo C, Poliani PL, Gri G, Burocchi A, Pittoni P, Gorza-nelli A, Colombo MP and Pedotti R. Exacerbated experimental autoimmune encephalomyelitis in mast cell-deficient KitW-sh/W-sh mice. Laboratory Investigation 2011 Feb 14;91,627–641. *Equally contributing authors

Pedotti R., Scabeni S., Poliani P. L., Farina C., Costanza M., Musio S., Berzi A., Castellucci F., Confalonieri P., Hemmer B., Mantegazza R. and Antozzi C. Demielinizzazione anticorpale nella sclerosi multipla: uno studio translazionale dall’uomo al topo con anticorpi purificati da pazienti con SM in relapse clinica. FISM Meeting Roma, 25-26 Maggio 2011

Pedotti R., Scabeni S., Poliani P. L., Farina C., Costanza M., Musio S., Berzi A., Castellucci F., Confalonieri P., Hemmer B., Mantegazza R. and Antozzi C.. Demielinizzazione anticorpale nella sclerosi multipla: uno studio translazionale dall’uomo al topo con anticorpi purificati da pazienti con SM in relapse clinica. FISM Meeting Roma, 26-27 maggio 2010


RUOLO DI ANTICORPI ANTI OSTEOPONTINA NELLA SCLEROSI MULTIPLA

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RESPONSABILE DEL PROGETTOELISABETTA ORILIERIDipartimento di Scienze Mediche, Laboratorio di Immunologia, Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Novara

MENTOREUMBERTO DIANZANI


Il nostro laboratorio ha contribuito a dimostrare il coinvolgimento di osteopontina (OPN), una ci-tochina coinvolta nella risposta immunitaria e infiammatoria, nella sclerosi multipla (SM). Elevati livelli di OPN sono stati osservati nel siero, nel liquor e nelle placche demielinizzanti di pazienti con SM e di topi con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello animale di SM. Inoltre, variazioni del gene di OPN contribuiscono alla produzione di elevati livelli di OPN e rappresentano fattori di suscettibilità alla malattia. Nel corso della EAE vengono prodotti anticorpi anti-OPN. Inoltre, la somministrazione di un vaccino a DNA diretto contro OPN, ne aumenta ulteriormente il titolo. Tale vaccinazione si è dimostrata inoltre capace di migliorare il decorso della malattia in questi animali. Nel complesso, questi dati suggeriscono che la rispo-sta anti-OPN potrebbe antagonizzare gli effetti di questa citochina sullo sviluppo della malattia. Gli obiettivi specifici del progetto erano: ricercare anticorpi anti-OPN nei pazienti SM dosandoli con metodica ELISA utilizzando una forma ricombinante di OPN da produrre nel nostro labo-ratorio; clonare anticorpi anti-OPN tramite selezione di librerie e valutare il loro effetto sull’atti-vazione immunitaria in vitro; costruire un vaccino per la forma murina di OPN al fine di indurre la produzione di anticorpi anti-OPN nei topi, valutare la loro sicurezza a lungo termine in topi di controllo e confermare la loro efficacia nel trattamento della EAE.

RISULTATI

Abbiamo prodotto nel nostro laboratorio la proteina OPN ricombinante, sia umana che murina; le proteine sono state purificate mediante cromatografia di affinità e la loro funzionalità è stata testata in vitro. Inoltre, da librerie fagiche anticorpali abbiamo isolato un anticorpo monoclonale anti-OPN diretto contro la porzione C-terminale della proteina. Con un duplice approccio, il Western Blot e l’ELISA abbiamo ricercato anticorpi anti-OPN in pazienti con SM. 53 pazienti con SM sono stati valutati in Western Blot: 25 (47%) sono risultati positivi per anticorpi anti-OPN e 28 (53%) sono risultati negativi; sono stati testati anche 38 controlli sani: 12 sono risultati positivi (32%) e 26 (68%) sono risultati negativi. Abbiamo quindi valutato in ELISA la presenza di auto anticorpi anti-OPN in 71 pazienti con SM e 38 controlli: la quantità media di anticorpi anti-OPN prodotti è risultata più alta nei pazienti rispetto ai con-trolli. Al fine di indurre la produzione di anticorpi anti-OPN nei topi abbiamo eseguito una vac-cinazione a DNA utilizzando femmine di topo C57BL/6 di 8 settimane di vita alle quali è stata successivamente indotta l’EAE. Non sono state riscontrate differenze significative tra i topi trattati con il vaccino OPN rispetto a quelli non trattati in termini di sintomi clinici, abbiamo quindi deciso di ricorrere ad altri proto-colli di vaccinazione utilizzando le proteine ricombinanti da noi prodotte. Tali esperimenti sono ancora in corso.

CONCLUSIONI

Nel complesso questi dati dimostrano l’esistenza di anticorpi anti-OPN nel siero di pazienti con SM. L’aver riscontrato tali anticorpi anche in soggetti sani conferma i dati riportati in letteratura, che indicano che auto-anticorpi anti citochine infiammatorie (come la IL-1 e il TNF) rappresen-tano una risposta fisiologica coinvolta nello spegnimento della risposta infiammatoria. La pre-senza di questi autoAb nei controlli sani è confortante alla luce del loro possibile utilizzo in vivo per antagonizzare le funzioni di OPN, in quanto indica che sono ben tollerati dall’organismo.

ROLE OF ANTI-OSTEOPONTIN ANTIBODIES IN MULTIPLE SCLEROSIS


Our laboratory contributed to demonstrate the involvement of osteopontin (OPN), a cytokine involved in inflammatory and immune response in multiple sclerosis (MS). Elevated levels of OPN were observed in serum, CSF and demyelinating plaques of MS patients and mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of MS. Morover, variations of the OPN gene contribute to the production of high levels of OPN and represent susceptibility factors for disease development.During EAE anti-OPN antibodies are produced, morover, the administration of a DNA vaccine directed against OPN increases the titer. Such vaccination has been shown to be able to im-prove the course of the disease in these animals. In complex these data suggest that the anti-OPN response may antagonize the effects of this cytokine on the development of the disease.The specific objectives of the project were: to search for anti-OPN antibodies in MS patients performing ELISA using a recombinant form of OPN to be produced in our laboratory; to clone anti-OPN antibodies by selecting libraries and testing their effect on immune activation in vitro; to construct a vaccine for the murine form of OPN in order to induce the production of anti-OPN in mice, to assess their long-term safety in control mice and confirm their effectiveness in the treatment of EAE.

RESULTS In our laboratory we produced the recombinant protein OPN, both the human and the murine ones; those proteins were purified by affinity chromatography and their function was tested in vitro. By screening a antibody phage libraries we isolated a monoclonal anti-OPN antibody directed against the C-terminal fragment of the protein. By a dual approach, Western Blot and ELISA, we searched for anti-OPN antibodies in MS patients. 53 MS patients were evaluated by Western blot: 25 (47%) were positive for anti-OPN antibodies and 28 (53%) were negative, we also tested 38 healthy controls: 12 were positive (32%) and 26 (68%) were negative. By ELISA, we evaluated 71 MS patients and 38 controls: the average amount of anti-OPN titer was higher in patients than in controls. In order to induce the production of anti-OPN antibodies in mice we performed a DNA vaccination using C57BL/6 female mice of 8 weeks old to induce EAE. No significant differences between mice treated with the OPN vaccine compared with those not treated were found concerning of clinical symptoms. For this reason we decided to set up other vaccination protocols using recombinant proteins produced in our laboratory. These experiments are still ongoing.

CONCLUSIONS These data demonstrate the presence of anti-OPN antibodies in MS patients with MS. The finding that anti-OPN autoAb are detectable in healthy controls is in line with the notion that production of autoAb to inflammatory cytokines (such as also IL-1 and TNFα) is a physiologic response involved in downmodulatiion of the inflammatory response. Presence of these auto-Ab in healthy controls is comforting at the light of their possible use in vivo to antagonize OPN function, since it indicates that they should not have toxic effects.

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Soluri MF, Orilieri E, Cappellano G, Dianzani U, Chiocchetti A. “Functional mapping of osteopon-tin activity in EAE and MS” “Role of anti-osteopontin antibodies in Multiple Sclerosis”; Roma 25-26 Maggio 2011-Congresso annuale FISM

Dianzani U, D’Alfonso S, Chiocchetti A, Mesturini R, Orilieri E, Bergamaschi L, Barizzone N, Cor-rado L. “Searching for markers involved in multiple sclerosis development: correlation of genetic and functional alteration of cell-mediated immunity with markers of EBV infection”; Roma 25-26 Maggio 2011-Congresso annuale FISM

Orilieri E, Chiocchetti A, Soluri MF, Boggio E, Dianzani U. “Role of anti-osteopontin antibodies in Multiple Sclerosis”; Roma 25-26 Maggio 2011-Congresso annuale FISM

Gigliotti L, Soluri MF, Boggio E, Orilieri E, Buttini S, Comi C, Chiocchetti A, Dianzani U. “Analysis of the role of osteopontin and B7H on dendritic cell development and function in multiple sclero-sis”; Parigi 12-13 maggio 2011- The 20th ARSEP Foundation on Multiple Sclerosis

Cappellano G, Aricò M, Cetica V, Melensi M, Orilieri E, Soluri MF, Clemente N, Boggio E, Chioc-chetti A, Ramenghi U, Dianzani U. “Variations of MUNC13-4 gene in patients with autoimmunity/lymphoproliferation and defective FAS function”; Riccione 28 Settembre-1 Ottobre 2011- 2011 Joint Annual Meeting Italian Society of Immunology (SIICA) and German Society of Immunology (DGfl)

Gigliotti L, Mesturini R, Chiocchetti A, Orilieri E, Dianzani U. “Icos triggering induces il-17 secre-tion in human naive T helper cells”; Gubbio 20-22 Ottobre 2011- Joint National PhD Meeting

BORSA DI RICERCA FINANZIATA CON IL BANDO FISM 2009per un periodo di 2 anni - 40.000 €

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una migrazione preferenziale delle mNS iPSCs confrontando topi trapiantati e topi controllo. Da queste analisi è emersa una disregolazione di geni appartenenti alla cascata di Wnt nei topi trapiantati con mNS iPSCs. Dal momento che la famiglia dei geni Wnt è coinvolta sia nella regolazione del differenziamento e della maturazione di OPCs che nella regolazione della formazione della cicatrice gliale a seguito di un danno ed è riportato in letteratura che la disre-golazione di questi geni causa un rallentamento sia nella mielinizzazione durante lo sviluppo che nel processo di rimielinizzazione dopo un danno, crediamo sia fondamentale focalizzare la nostra attenzione su esperimenti mirati per capire se l’effetto terapeutico che noi associamo al trapianto delle mNS iPSCs sia dovuto alla loro capacità di modulare la cascata dei geni Wnt in modo da promuovere la rimielinizzazione delle aree demielinizzate.

CONCLUSIONI

Per poter rendere il trapianto di aNPCs e/o OPCs un’alternativa reale per la terapia della SM, è necessario avere a disposizione una fonte autologa ed amplificabile di queste cellule. Per rag-giungere questo obiettivo abbiamo proposto in questo progetto l’utilizzo di iPSCs, una nuova fonte di cellule staminali ottenute mediante riprogrammazione di cellule somatiche. A nostro parere, le iPSCs rappresentano lo strumento più appropriato per rispondere a queste necessi-tà. Questa tecnologia offre la possibilità di generare, a partire dalle cellule del paziente stesso, una fonte illimitata di NPCs e OPCs autologhe che possono venire utilizzate per le terapie cel-lulare senza causare problemi di rigetto. Lo sviluppo e il miglioramento di questa tecnologia e i test preclinici in modelli animali risultano fondamentali per un più immediato trasferimento nella pratica clinica di uno strumento come le iPSCs.

GENERATION OF MOUSE IPSCS AND HUMAN IPSCS FROM MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS AND THEIR IN VITRO DIFFERENTIATION INTO OLIGOGLIAL AND NEURONAL PROGENITORS


The development of cell-based therapies aimed at repairing damaged myelin producing cells in multiple sclerosis (MS) patients has been pursued in the last 30 years. Although successful in promoting site-specific repair in focal myelin disorders, most of these therapeutic approaches have failed to foster repair in multifocal myelin disorders, such as MS, where the anatomical and functional inflammation-induced cell damage is widespread. Neural stem cell-based the-rapies might represent in the near future a plausible alternative cell-based therapeutic strategy in this disorder. We have been working to address the safety and the efficacy of the transplan-tation of different sources of neural stem cells in animal models of MS. Results obtained so far indicate that adult neural stem cells can be safely and efficaciously transplanted into animal model of multifocal myelin disorders. As a matter of fact, these cells support widespread myelin repair by inhibiting inflammation-induced cell damage and by promoting neuropotection. Although these results open new per-spectives for neural stem cell-based therapies in MS, so far the only available source of neural stem cells for human studies is of fetal origin. Thus, concomitant immunosuppression is requi-red to avoid cell rejection after transplantation. A new source of stem cells recently obtained by genetic reprogramming of somatic cells – induced pluripotent stem cells (iPSCs) – may represent the appropriate tool to overcome this problems since they can be derived directly from patient own cells. This project is aimed at deriving neural stem cells from iPSCs obtained from mice and humans, including MS patients and sex and age matched healthy subjects and testing their therapeutic efficacy in promoting, both in vitro and in vivo, neuroprotection via im-munomodulation and remyelination. If successful our project could represent a further crucial step to foster clinical translation of stem cell-based therapies in MS patients.

RESPONSABILE DEL PROGETTOCECILIA LATERZADipartimento di Neuroimmunologia, Università Vita-Salute San Raffaele

MENTOREVANIA BROCCOLI


Lo sviluppo di terapie cellulari volte a riparare le cellule mielinizzanti danneggiate nella sclerosi multipla (SM) ha avuto un enorme sviluppo negli ultimi 30 anni. La maggior parte di questi approcci terapeutici risulta molto efficace in malattie demielinizzanti focali, ma non altrettanto in malattie multi focali come la SM, in cui si ha un danno cellulare diffuso. Il trapianto di cellule staminali neurali rappresenta pertanto una possibile alternativa terapeutica per questa pato-logia. I risultati fino ad ora ottenuti nel nostro laboratorio, in modello animale, indicano che il trapianto di cellule staminali neurali adulte (aNPCs) risulta una pratica sicura ed efficace nel trattamento di malattie demielinizzanti multifocali. In particolare, il trapianto di queste cellule riesce a supportare una rigenerazione diffusa della mielina promuovendo la neuroprotezione tramite il rilascio di fattori neurotrofici (effetto by stander). Tuttavia l’unica fonte disponibile per gli studi sull’uomo risulta di tipo fetale e questo richiede una concomitante immunosoppressione per evitare rigetto a seguito del trapianto. Recentemente è stata generata una nuova fonte di cellule staminali mediante la riprogrammazione di cellule somatiche, chiamate cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che potrebbe risolvere i problemi legati alle fonti eterologhe di cellu-le in quanto generate a partire dalle cellule stesse dei pazienti e differenziate in vitro ed espanse come cellule staminali neurali. Questo progetto si prefigge lo scopo di derivare cellule staminali neurali a partire da iPSCs ottenute da fibroblasti di topo e da fibroblasti umani di pazienti con SM e da controlli sani, e di testarne, in vitro e in vivo, la capacità di indurre neuroprotezione mediante immunomodulazione ed effetto by stander. I risultati ottenuti da questo progetto possono rappresentare un passo cruciale che avvicina le terapie cellulari alla pratica clinica nel trattamento della SM.

RISULTATI

Abbiamo raccolto 40 biopsie cutanee di pazienti con diversi tipi di SM. I fibroblasti ottenuti da queste biopsie sono stati riprogrammati mediante l’utilizzo di vettori retrovirali e di un vettore lentivirale. Tuttavia l’utilizzo di questi vettori è risultato molto inefficiente, generando solo poche linee di iPSCs. Alla luce di questo, abbiamo recentemente iniziato una collaborazione per gene-rare iPSCs mediante vettori non integranti creati a partire dal Sendai virus. In parallelo abbiamo riprogrammato con gli stessi vettori anche fibroblasti murini ottenuti da topi transgenici. La pluripotenza delle linee umane e murine ottenute è stata valutata mediante diverse metodiche. Una volta generate linee di miPSCs e di hiPSCs, sono state differenziate in cellule staminali neurali che hanno mostrato caratteristiche molto simili alle aNPCs. Per quanto riguarda le cel-lule murine, siamo riusciti a generare una linea stabile di cellule staminali neurali (mNS iPSCs) in grado di differenziare in neuroni, astrociti ed oligodendrociti. Per ciò che concerne invece le cel-lule umane, non siamo ancora riusciti ad ottenere una linea stabile. Ci siamo quindi focalizzati sull’analisi in vivo delle proprietà rimielinizzanti e immunomodulanti delle mNS iPSCs mediante trapianti in un modello di demielinizzazione congenita e nel modello murino di sclerosi multipla. Da questi esperimenti è emerso che le mNS iPSCs trapiantate in topi shiverer sono in grado di differenziare in oligodendrociti maturi. In oltre, le mNS iPSCs trapiantate nella cisterna magna (ics) di topi EAE sono in grado di migliorare la clinica di questi animali. Dal momento che solo l’1% delle cellule trapiantate persiste all’interno del sistema nervoso centrale, pensiamo che il meccanismo d’azione associato al miglioramento clinico osservato sia dovuto alla secrezione di molecole neuro protettive che agiscono favorendo la rimielinizzazione endogena e riducendo il danno tissutale. Abbiamo effettuato quindi un microarray sul tessuto in cui abbiamo osservato

GENERAZIONE DI CELLULE STAMINALI RIPROGRAMMATE DA CELLULE MURINE E DA CELLULE DI PAZIENTI CON SCLEROSI MULTIPLA E DIFFERENZIAMENTO IN PRECURSORI NEURONALI E OLIGOGLIALI

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RESULTS We have collected skin fibroblasts from 40 MS patients with different disease courses. Low passage human fibroblasts have been infected both with three retroviral and with a lentiviral vector. However, we had few problems concerning the efficiency of human fibroblast repro-gramming. Given this we start to generate hiPSCs using a new non integrating reprogramming viral vector. We obtain only few lines from a couple of MS patients and from an healthy controls. In parallel, in mouse embryo fibroblasts have been reprogrammed into miPSCs by the same techniques. The pluripotent state of both miPSC and hiPSC lines so far have obtained have been confirmed by different techniques. Once generated, miPSCs and hiPSCs have been also induced to differentiate toward neural and oligoglial lineages. Higly enriched population of NS iPSCs can be obtained from both miPSCs and hiPSCs and share the vast majority of features with adult NPCs (aNPCs). Moreover we obtained a stable mNS iPSC line able to differentiate in all the three neural lineages (neurons, astrocytes and oligodendrocytes). Concerning hiPSCs oligoglial induction, hNS iPSCs were subjected to conditions previously established and we obtained a considerable number of mature oligodendrocytes and OPCs. We focalized on the analysis of the in vivo remyelination capacity and anti-inflammatory properties of mNS iPSCs, performing transplantation experiments respectively in a genetic model of demyelination and in a mouse model of multiple sclerosis. We found that mNS iPSCs transplanted in shiverer mice pups are able to regenerate MBP+ fibers, confirming their myelinating ability. Moreover, we found that mNS iPSCs transplanted intracisternally EAE mice are able to ameliorate the clinical severity of transplanted animals. Given that only 1% of transplanted mNS iPSCs persisted along the entire neuraxis, the therapeutic efficacy of our cells could be related to the secretion of neuroprotective molecules. We focused on the molecules promoting the bystander effect by performing a microarray analysis on injured tissue in which transplanted cells preferentially migrated and we found significant differences among transplanted vs sham treated groups. The Wnt pathway-related genes were the most dysregulated ones in mNS iPSC-treated mice. Since it is well know that the Wnt family is involved in the regulation of OPCs differentiation/maturation and glial scar formation after injury and there is solid evidence showing that dysre-gulation of Wnt pathway results in profound delay of both developmental myelination and adult remyelination, it is worthwhile to perform further experiments in order to understand whether or not the therapeutic potential of ics transplanted mNS iPSCs is due to the capability of such cells to modulate the expression of the members of the Wnt pathway so to promote remyeli-nation of demyelinated areas.

CONCLUSIONS In MS, bench to bedside translation of transplantation protocols using aNPCs and/or OPCs requires an expandable autologous source of human aNPCs and OPCs. This would avoid con-comitant immunosuppression thus rendering such therapeutic strategy more straightforward. To reach this goal we propose to use iPSCs, a new source of pluripotent stem cells. In our view, iPSCs represent the most appropriate tool since they are derivable from adult somatic cells of different origin. This technology offers the opportunity to obtain from the patient own cells an unlimited expandable source of autologous aNPCs and OPCs which, in turn, may be used for therapies without any concern for the patient immune response. The development and the improvement of such a strategy and preclinical testing in animal models on MS have a conside-rable relevance not also for the health service, representing the basis for a rapid transferability of such therapeutic approaches to assistance.


Laterza C. “Induced pluripotent stem cells as a potential source of autologous neural stem cells for multiple sclerosis therapy”. NMSS international congress (New York, USA)JANUARY 10-14 2011 Poster presentation

Laterza C. “Induced pluripotent stem cells as a potential source of autologous neural stem cells for multiple sclerosis therapy”. Scientific congress FISM (Rome, Italy)MAY 25-26 2011 Poster presentation

Laterza C. “Induced pluripotent stem cells as a potential source of autologous neural stem cells for multiple sclerosis therapy”. Stem cells research italy (Pescara, Italy)JUNE 10-12 2011 Oral and poster presentation (Best poster award)

Laterza C. “Induced pluripotent stem cells as a potential source of autologous neural stem cells for multiple sclerosis therapy”. 11th ESNI course (Glasgow, Scottland)JULY 4-7 2011 Oral presentation

Laterza C. “Generation of iPS cells from MS patients and their in vitro differentiation into oligoglial and neuronal progenitors”. Multiple Sclerosis Scientific retreat (Pieve a salti)JANUARY 21-23 2010 Oral presentation

Laterza C. “Generation of iPS cells from MS patients and their in vitro differentiation into oligoglial and neuronal progenitors”. Scientific congress FISM (Rome, Italy)MAY 26-27 2010 Poster presentation

Laterza C. “Induced pluripotent stem cells as a potential source of autologous neural stem cells for multiple sclerosis therapy”. 10th International congress of autoimmunology, ISNI (Sitges, Spain) OCTOBER 26-30 2010 Poster presentation

Laterza C. “Generation of iPS cells from MS patients and their in vitro differentiation into oligoglial and neuronal progenitors”. The myelin project annual meeting (Toronto) OCTOBER 22-25 2009. Oral presentation

Laterza C. “Generation of iPS cells from MS patients and their in vitro differentiation into oligo-glial and neuronal progenitors”. Reprogramming cell fate basic biology and medical perspectives (SEMM, Milan)DECEMBER 11-13 2009 Poster presentation

BORSA DI ADDESTRAMENTO FINANZIATA CON IL BANDO FISM 2009 per un periodo di 2 anni - 38.000 €

nuovi metodi diagnostici

APPROCCIO PROTEOMICO PER L’IDENTIFICAZIONE DI AUTOANTIGENI LIQUORALI RICONOSCIUTI DALLE IGG NELLA SCLEROSI MULTIPLA (2008/R/4)

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NUOVI METODI DIAGNOSTICI

RESPONSABILE DEL PROGETTOBRUNO BONETTIProfessore AssociatoDipartimento di Scienze Neurologiche e della Visione, Sezione di NeurologiaUniversità di Verona, Verona

Partecipanti dell’unità di Verona: SILVIA MARCONI, ELENA ANGHILERI, ERMANNA TURANOAssegnista: ALESSIA FARINAZZO

Collaboratori:BEATRICE GINI ERMANNA TURANOSILVIA MARCONI ELENA BAZZOLI ELENA ANGHILERI STEFANO ANGIARIBARBARA ROSSI

Collaborazioni con altri gruppi:LUCA BINI, RICCARDO CIANTI e ALESSANDRO ARMINI Dipartimento di Biologia Molecolare, Università di Siena Partecipanti dell’unità di Siena: LUCA BINI, ALESSANDRO ARMINI


La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune cronica, infiammatoria e demielinizzante che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). Presenta un quadro clinico e un decorso di malattia eterogenei. Molti studi hanno dimostrato come nella SM la risposta immunitaria coin-volga l’attivazione sia di linfociti T che B con conseguente produzione di autoanticorpi. Tuttavia, sebbene a livello sperimentale siano stati fatti molti tentativi per caratterizzare l’intero pattern di anticorpi, gli antigeni bersaglio di tale risposta rimangono ancor oggi non ben identificati. Inol-tre, la presenza di bande oligoclonali (OBs) nel liquido cerebrospinale (CSF) ma non nel siero di pazienti con SM, rappresenta un chiaro esempio di una continua stimolazione locale di cloni di cellule B in grado di riconoscere antigeni neurali tuttora sconosciuti. Al fine di identificare questi targets molecolari coinvolti nella risposta autoimmune nella SM, abbiamo condotto una serie di studi proteomici su pazienti con SM e sul modello sperimentale di malattia (EAE). Utilizzando un approccio immunomico-bidimensionale, abbiamo inizialmente identificato una complessa autoreattività nei pazienti SM nei quali diversi autoanticorpi riconoscevano un’ampia gamma di proteine neurali. Tra queste, l’enzima transketolase (TK) era particolarmente espresso nel 50% dei pazienti e non nei controlli risultando così il principale target liquorale delle immunoglobuline (IgG) (Lovato et al. Mol Cell Proteomics 2008). L’identificazione di tali proteine neurali sugge-riva il coinvolgimento di diversi meccanismi quali l’attivazione di numerosi cloni di cellule B o l’espressione del fenomeno di “inter-molecular mimicry” da parte di auto-antigeni. Per appro-fondire meglio questo aspetto, abbiamo analizzato la risposta autoimmune in modelli murini di SM dopo immunizzazione con un singola proteina mielinica (MBP totale, peptide 89-104 della proteina MBP o omogenato cerebrale).

RISULTATI

L’analisi mediante tecniche ELISA e 2D immunoblotting ha evidenziato una reattività verso la proteina MBP solo nei topi immunizzati con la proteina MBP intera; a parte tale dato, nei sieri di tutti i topi EAE gli autoanticorpi erano in grado di riconoscere altre proteine neurali di-verse dalla proteina MBP. In seguito allo studio comparativo delle sequenze amminoacidiche di queste proteine con la proteina MBP, la presenza di epitopi con una parziale omologia di sequenza suggeriva che un processo di “inter-molecular mimicry” poteva essere responsabile

della reattività immunitaria (Farinazzo et al. J Neuroimmunol 2011). Un ulteriore argomento del nostro studio ha riguardato l’analisi della risposta autoimmune nel CSF di pazienti con SM, in particolare sulle due principali frazioni di IgG ottenute dopo separazione elettroforetica: OB e non-OB IgG. Lo scopo del lavoro era di identificare mediante 2D-PAGE e immunoblotting i targets molecolari delle IgG espresse nella frazione OB, comparando la reattività degli anticorpi contenuti in questa frazione e quelli nella parte intera del liquor nei confronti di antigeni della sostanza bianca cerebrale normale.Per analizzare la risposta immunitaria nel liquor di pazienti con SM, abbiamo innanzitutto ese-guito una separazione elettroforetica delle due principali frazioni liquorali, OB e non-OB, esami-nando campioni liquorali di 15 pazienti con SM clinicamente definita e 5 soggetti sani. L’appli-cazione combinata di 2D-PAGE e immunoblotting ha permesso di confrontare la risposta delle frazioni liquorali di IgG precedentemente separate verso antigeni presenti nella sostanza bianca cerebrale normale. L’analisi ha mostrato che numerose proteine neurali erano riconosciute da IgG autoreattive in entrambe le frazioni di CSF pur con differenze quali-quantitative in termini di segnale. In particolare, nei pazienti con SM la reattività delle IgG nella frazione OB per le proteine cerebrali era maggiore rispetto a quella riscontrata nelle non-OB. Lo studio compara-tivo degli autoantigeni riconosciuti esclusivamente dalle IgG della frazione OB ha selezionato un ristretto numero di proteine neurali con intensità variabile e differentemente espresse nei pazienti SM. I dati di spettrometria di massa condotti su questi autoantigeni hanno identificato molte delle proteine come enzimi coinvolti in meccanismi di trasduzione del segnale, in proces-si immunitari o con funzioni metaboliche/regolatorie. Per capire il significato degli autoantigeni identificati e quali processi potessero essere responsabili dell’autoreattività, abbiamo messo a confronto la loro sequenza amminoacidica con quella di autoantigeni noti (MOG, CNPase, MBP), analogamente a quanto eseguito nel precedente studio nella EAE. La presenza di una parziale omologia di sequenza supporta l’ipotesi che un fenomeno di “molecular mimicry” pos-sa avere un ruolo importante nella patogenesi della SM.

CONCLUSIONI

Il presente studio 2D-immunomico della reattività delle IgG espresse nelle frazioni liquorali OB e non-OB su campioni di sostanza bianca cerebrale in pazienti con SM ha rivelato che entrambe le frazioni riconoscono un ampio pannello di proteine neurali. Analizzando più specificatamente l’autoreattività anticorpale della sezione OB, questo studio ha evidenziato un eterogeneo pat-tern di separazione tra i pazienti con SM, la maggior parte dei quali presentava un ristretto nu-mero di spots dopo separazione bidimensionale. L’applicazione del metodo 2D-immunomico assieme ad altre tecniche complementari potrebbe favorire l’identificazione di set di proteine tali da distinguere la frazione OB da quella non-OB in pazienti con SM. Inoltre questi approcci metodologici potrebbero aiutare a trovare nella porzione liquorale OB potenziali autoantigeni il cui ruolo potrebbe chiarire molti aspetti della risposta autoimmune nella SM.

PROTEOMIC APPROACH FOR THE IDENTIFICATION OF CEREBRO-SPINAL FLUID IGG-REACTIVE AUTOANTIGENS IN MULTIPLE SCLEROSIS (2008/R/4)


Multiple Sclerosis (MS) is a chronic inflammatory, demyelinating autoimmune disease of the central nervous system (CNS) with heterogeneous clinical presentation and course. A number of evidences have demonstrated that the autoimmune response in MS involves the activation of both T and B lymphocytes with the production of autoantibodies. Despite enormous efforts and the use of different experimental approaches, the target antigens of such autoreactive an-

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tibodies have not been clearly identified to date. Moreover, the presence of oligoclonal bands (OB) in the cerebrospinal fluid (CSF) but not in serum of MS patients represents a clear example of intratecal immune activation of local B-cell clones raised against yet unknown neural anti-gens. In order to highlight the molecular target(s) of the autoimmune response in MS, we have previously performed a series of proteomic studies on MS patients and the experimental model of MS, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Firstly, we have demonstrated by 2D immunomics the presence of a complex autoreactivity in MS patients where multiple autoantibodies were able to recognize a large spectrum of neural proteins. Among them, the oligodendroglial enzyme transketolase (TK) was the major target of CSF IgG being present in 50% of MS patients but not in control (Lovato et al. Mol Cell Proteomics 2008). The identifica-tion of such neural proteins suggested that different mechanisms could be involved such as the activation of multiple B cell clones or a process of inter-molecular mimicry by autoantigens. To have further information on this regard, we have analyzed the autoantibody response in EAE mice upon the immunization with a single myelin antigen [peptide89-104 of the myelin basic protein (MBP)], total MBP or spinal cord homogenate (SCH).

RESULTS The analysis by ELISA assay and 2D immunomics showed the presence of anti-MBP IgG only in mice immunized with total MBP; in addition, in all EAE mice seric autoantibodies targeted other neural proteins different from MBP. Moreover, the sequence analysis of these proteins and of MBP has identified epitopes with partial homology, suggesting a process of inter-mole-cular mimicry (Farinazzo et al. J Neuroimmunol 2011).In addition, we have explored the autoimmune response in the CSF of MS patients, focusing on the IgG fractions separated by electrophoretic technique (OB and non-OB IgG). The aim of stu-dy was to identify the targets of OB IgG comparing such CSF IgG repertoires against antigens derived from CNS normal white matter by 2D-PAGE and immunoblotting assay.To analyze the reactivity of IgG in the CSF from patients with clinically defined MS and controls we have first separated by horizontal electrophoresis CSF IgG samples from 15 MS patients and 5 controls in two main IgG fractions: OB and non-OB IgG. Combining 2D-PAGE and im-munoblotting assay we have matched the reactivity of separated CSF IgG fractions against antigens derived from normal human white matter. The analysis showed that several neural proteins were recognized by autoreactive IgG from both set of fractions (OB and non-OB), although with relevant quantitative and qualitative differences of signals. In particular, the reacti-vity to the white matter proteins by OB IgG was higher than non-OB IgG fraction in MS patients. Further, the comparative analysis of autoantigens recognized only by CSF OB IgG revealed the presence of a restricted number of neural proteins with variable intensity and differently ex-pressed among MS patients. The preliminary data by mass spectrometry of such autoreactive OB IgG have identified several proteins as enzymes involved in signal transduction or immune processes or with metabolic/regulatory functions. To understand the significance of identified autoantigens and which processes could be responsible for such autoreactivity, we compared their aminoacidic sequence with those of known MS autoantigens (e.g. MOG, CNPase, MBP). The presence of a partial sequence homology suggested that a process of inter-molecular mimicry could be involved in MS disease.

CONCLUSIONS The present 2D-immunoblotting study of the reactivity of OB and n-OB IgG from CSF of MS patients tested on human white matter revealed that both fractions recognized a wide range of neural proteins. Focusing on the fine autoreactivity of OB IgG, we evidenced a heteroge-neous expression profile among MS patients, with a restricted number of spots present in most MS patients. The application of 2D immunomics in association to complementary approaches could help to identify set of proteins able to discriminate OB and n-OB fractions in MS patients and to find putative autoantigens in CSF OB fraction, whose role could shed light on the au-toimmune repertoire present in MS patients.


Farinazzo A. Proteomic approach for the Identification of autoantigens recognized by CSF oligo-clonal IgG bands in Multiple Sclerosis. Oral communication at XXI AINI Congress, 2011

Farinazzo A, Gini B, Ruffini F, Milli A, Cecconi D, Furlan R, Bonetti B. 2D immunomic approach for the study of IgG autoantibodies in the experimental model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 2011 Mar; 232(1-2): 63-7. Epub 2010 Nov

Farinazzo A. Oral communication at XX AINI Congress, 2010 and at Italian Proteomics Association (ItPA) V National Congress, 2010

Gini B, Farinazzo A, Ruffini F, Cecconi D, Furlan R, Bonetti B. Immunomic analysis of the autoan-tibody response in EAE following immunization with different encephalitogenic autoantigens. Oral communication at XIX AINI Congress, 2009

Bonetti B. Immunomic approach in CNS autoimmune diseases. Invited lecture at XIX AINI Con-gress, 2009


VIE ADRENERGICHE/DOPAMINERGICHE NEI LINFOCITI CIRCOLANTI COME MARCATORI PRECOCI NELLE SINDROMI CLINICAMENTE ISOLATE CHE PROGREDISCONO IN SCLEROSI MULTIPLA

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RESPONSABILE DEL PROGETTOMARCO COSENTINOProfessore Dipartimento di Clinica Medica Sezione di Farmacologia Sperimentale e Clinica Università dell’Insubria, Varese

Collaboratori:FRANCA MARINOLAURA SCHEMBRIEMANUELA RASINIMASSIMILIANO LEGNAROPAOLA SPAGNUOLORAFFAELLA BOMBELLIGIORGIO BONO

Collaborazioni con altri gruppi:MAURO ZAFFARONI, Centro di ricerca sulla Sclerosi Multipla, Gallarate, VareseANGELO GHEZZI, Centro di ricerca sulla Sclerosi Multipla, Gallarate, VareseMARIO GUIDOTTI, Ospedale Valduce, ComoRAFFAELLA CLERICI, Ospedale Valduce, Como


L’obiettivo principale del progetto consisteva nello studio delle eventuali alterazioni delle vie adrenergiche/dopaminergiche nei linfociti di individui con sindromi cliniche isolate (clinically iso-lated syndromes - CIS) e della loro associazione con la successiva progressione a sclerosi mul-tipla (SM). Esistono solide evidenze sul ruolo di meccanismi adrenergici e dopaminergici nella SM, tuttavia i tentativi di utilizzare agenti farmacologici attivi su di essi si sono rivelati fino ad ora deludenti. Diversi gruppi tra cui il nostro hanno documentato alterazioni di questi meccani-smi nei linfociti dei pazienti con SM, e soprattutto la capacità di trattamenti immunomodulanti come l’IFN-beta di restaurarne il funzionamento. Di fatto, i cambiamenti recettoriali e metabolici adrenergici/dopaminergici sono dinamici e specifici per le diverse sottopopolazioni linfocitarie, e riteniamo che la loro comprensione sia la chiave per massimizzare i benefici clinici del tratta-mento con agenti adrenergici/dopaminergici. La comprensione del network catecolaminergico che regola la risposta immunitaria potrebbe fornire, in questo senso, prospettive originali e innovative per la farmacoterapia della SM.

RISULTATI

Abbiamo realizzato uno studio longitudinale in soggetti con sindromi cliniche isolate (clinically isolated syndromes - CIS), includendo un gruppo di soggetti sani come confronto healthy controls (HC). I soggetti con CIS sono stati studiati al momento della manifestazione clinica e dopo 12 mesi, oppure al momento della progressione a SM. Ad ogni visita, è stato ottenuto un campione di sangue venoso e sono stati valutati i seguenti parametri:nelle cellule mononucleate circolanti (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) stimolate con PHA, l’espressione di mRNA per i beta2-adrenocettori (AR), i recettori dopaminergici (do-paminergic receptors, DR) D2 e D5 e per la tirosina idrossilasi (TH) nei linfociti T regolatori CD4+CD25+ (Treg), l’espressione di mRNA per i beta2-AR, i DRD2 e D5, la TH e il FoxP3Fino ad ora sono stati arruolati 15 soggetti con CIS e 10 HC. Le cellule dai soggetti con CIS mostrano numerose differenze rispetto ai HC: la più evidente è l’aumentata espressione di mRNA per TH nelle PBMC, sia non stimolate che dopo stimolo con PHA. Come atteso, l’e-spressione di mRNA per DRD2 era in prevalenza non rilevabile, mentre gli mRNA per DRD5 e beta2-AR mRNA erano espressi e mostravano un notevole incremento dei livelli dopo PHA, sia nelle cellule dei soggetti con CIS che in quelle da HC. Le PBMC dei soggetti con CIS tuttavia mostravano una capacità significativamente ridotta di incrementare i livelli di mRNA per beta2-AR dopo PHA.Inoltre, le Treg dei soggetti con CIS mostravano una chiara tendenza verso una ridotta espres-

sione di mRNA per FoxP3 e verso un’espressione incrementata di mRNA per TH, DRD5 e beta2-AR, che raggiungeva la significatività statistica nel caso di DRD5.I soggetti con CIS inclusi nello studio verranno monitorati almeno fino a 12 mesi dalla prima manifestazione per verificare se l’espressione di mRNA per beta2-AR, DRD5, e TH nella PBMC e nelle Treg e per FoxP3 nelle Treg possano costituire indicatori utili a identificare precocemente soggetti a più alto rischio per la progressione a SM conclamata.

CONCLUSIONI

I soggetti con CIS presentano una elevata espressione di mRNA per TH nelle PBMC, con ridot-ta capacità di incrementare l’espressione di beta2-AR mRNA dopo attivazione; una aumentata espressione di mRNA per DRD5 nelle Treg, che mostrano pure una tendenza verso ridotta espressione di mRNA per FoxP3, TH e beta2-AR.Queste differenze sono in accordo con la di-sregolazione delle vie adrenergiche/dopaminergiche ben caratterizzata nei linfociti dei pazienti con SM conclamata. L’incrementata espressione di mRNA per DRD5 è in linea con il ruolo di questi recettori nella riduzione della funzione regolatoria delle Treg. L’insufficienza funzionale delle Treg è implicata nella patogenesi della SM. Il monitoraggio di questa coorte di soggetti con CIS consentirà di stabilire se l’espressione di mRNA per DRD5 nelle Treg possa risultare utile per identificare i soggetti a maggior rischio di progressione a SM.

ADRENERGIC/DOPAMINERGIC PATHWAYS IN CIRCULATING LYMPHOCYTES AS EARLY MARKERS OF CLINICALLY ISOLATED SYNDROMES PROGRESSING TO MULTIPLE SCLEROSIS


The main aim of the project was to investigate the possible occurrence of dysregulations of adrenergic/dopaminergic pathways in circulating lymphocytes from subjects with clinically iso-lated syndromes (CIS) and to assess their possible relationship with subsequent progression to clinically established multiple sclerosis (MS). Extensive evidence suggests that adrenergic/dopaminergic mechanisms may play a role in MS, however attempts to exploit the therapeutic potential of adrenergic/dopaminergic drugs have been so far disappointing. We and others have extensively documented the occurrence of dysregulated adrenergic/dopaminergic recep-tor-mediated mechanisms in lymphocytes from MS patients, which are partially restored by immunomodulating treatments e.g. with IFN-beta. Dynamic changes indeed occur to receptor expression and function (and to endogenous catecholamine production) in circulating lym-phocytes during treatment with immunomodulatory drugs such as IFN-beta, and we believe that this the key to maximize the clinical benefits from adrenergic/dopaminergic agents. Com-prehensive understanding of the catecholaminergic network regulating the immune response is therefore mandatory and is likely to provide novel and exciting perspectives in pharmacothe-rapy of MS.

RESULTS We performed a longitudinal study in subjects with CIS. A cohort of healthy controls (HC) was included for comparison. CIS subjects were studied at the time of clinical manifestations and after 12 months (or at the time of progression to MS). At each visit, a sample of venous blood was taken and the following parameters were evaluated:in cultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) stimulated with PHA, mRNA expres-sion of beta2-adrenoceptors (AR), of dopaminergic receptors (DR) D2 and D5 and of tyrosine hydroxylase (TH).

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in purified CD4+CD25+ T regulatory lymphocytes (Treg), mRNA expression of beta2-AR, DRD2 and D5, TH and FoxP3.The study included so far 15 subjects with CIS and 10 HC. Cells from CIS subjects showed a number of significant differences in comparison to cells from HC, the most prominent being increased expression of TH mRNA in PBMCs, both at rest as well as after PHA. As expected, DRD2 mRNA expression was usually undetectable, while DRD5 and beta2-AR mRNA were expressed and underwent strong upregulation after PHA in cells from both CIS subjects and HC. PBMCs from CIS subjects however showed significantly impaired ability to upregulate beta2-AR mRNA expression.In addition, Treg from CIS subjects showed a clear trend to decreased expression of FoxP3 mRNA and increased expression of TH, DRD5 and beta2-AR mRNA, which reaches statistical significance in the case of DRD5 mRNA.CIS subjects included in the study will be monitored for at least 12 months to assess whether expression of mRNA for beta2-AR, DRD5, and TH in PBMCs and in Treg and for FoxP3 in Treg may reveal a suitable marker to identify subjects at higher risk for progression to established MS.

CONCLUSIONS This study was to provide a “proof of concept” that lymphocyte adrenergic/dopaminergic dysregulation could be an “early marker” of CIS subjects at major risk for progression to MS. Subjects with CIS have higher expression of TH mRNA in PBMCs, which however show im-paired ability to upregulate beta2-AR mRNA expression upon activation and have higher ex-pression of DRD5 mRNA in Treg, as well as a trend to impaired expression of FoxP3, TH and beta2-AR mRNA in these cells. Such differences are in line with the well-established dysregu-lation af adrenergic/dopaminergic pathways in lymphocytes of patients with established MS. Upregulation of DRD5 mRNA in Treg is in line with the notion that DRD5-operated pathways reduce Treg regulatory function. Impairment of Treg function has been implicated in the pa-thogenesis of MS. Follow up of this cohort of CIS subjects will allow to assess whether DRD5 mRNA expression in Treg may be useful in identifying subjects at high risk to progress to MS.


Schembri L, Spagnuolo P, Zaffaroni M, Guidotti M, Bono G, Marino F, Cosentino M. Adrenergic and dopaminergic pathways in circulating lymphocytes of subjects with Clinically Isolated Syndro-me (CIS). Abstracts del XXI Congresso dell’Associazione Italiana di Neuroimmunologia, Pollenzo (CN), 22-25 settembre 2011

Schembri L, Spagnuolo P, Zaffaroni M, Guidotti M, Bono G, Marino F, Cosentino M. Adrenergic and dopaminergic pathways in circulating lymphocytes as early markers of clinically isolated syndro-mes progressing to multiple sclerosis. Congresso Scientifico Annuale FISM - Fondazione Italiana Sclerosi Multipla, Roma, 25-26 maggio 2011

Spagnuolo P, Loraschi A, Zaffaroni M, Guidotti M, Bono G, Marino F, Cosentino M. Adrenergic and dopaminergic pathways in circulating lymphocytes as early markers of clinically isolated syn-dromes progressing to multiple sclerosis. XX Riunione annuale SIN-SNO lombarda, Como, 25-26 marzo 2011. Update in Clinical Neurology (G. Comi, M. Arnaboldi, M. Guidotti, eds.), New Maga-zine, Trento (I), 201: p. 54

Spagnuolo P, Loraschi A, Bombelli R, Rasini E, Legnaro M, Luini A, Lecchini S, Bono G, Marino F, Zaffaroni M, Cosentino M. Adrenergic and dopaminergic pathways in circulating lymphocytes as early markers of clinically isolated syndromes progressing to multiple sclerosis. Società Italiana di Neuroscienze, Riunione nazionale dottorandi e borsisti italiani in neuroscienze e materie affini, Busto Arsizio (VA), 27-28 maggio 2010


IDENTIFICAZIONE DI BIOMARCATORI E NUOVI BERSAGLI TERAPEUTICI NELLA SCLEROSI MULTIPLA MEDIANTE L’UTILIZZO DI APPROCCI DI BIOLOGIA DEI SISTEMI COMPLESSI

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RESPONSABILE DEL PROGETTOMARIA FOTIRicercatore Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze Laboratorio di medicina molecolare e immunologia Università degli Studi di Milano-Bicocca, Milano

Collaboratori:SAMANTHA BALDASSARRIANNA TORRISILVIA FUMAGALLICHIARA RIPAMONTISTEFANIA CITTERIO

Collaborazioni con altri gruppi:DOMENICO CAPUTO, MARCO ROVARIS, Fondazione Don Gnocchi, MilanoFABIO STELLA, Dipartimento di Informatica, Università di Milano-BicoccaFRANCESCA ZOLEZZI, Consorzio Genopolis, Università di Milano-Bicocca


La sclerosi multipla (SM) è caratterizzata dalla presenza di elementi cellulari nelle lesioni del sistema nervoso centrale appartenenti sia all’immunità innata che a quella acquisita. Recente-mente, è stato ipotizzato un maggior coinvolgimento dell’immunità adattativa prevalentemente nella forma remittente-recidivante (RRMS) mentre disfunzioni del sistema innato sembrano es-sere coinvolte nella forma progressiva (PPMS) della malattia. Quindi, l’identificazione di mole-cole bersaglio in cellule del sistema immunitario è un obiettivo importante per lo sviluppo di test immunologici innovativi per la diagnosi e la prognosi della malattia stessa. L’espressione genica di monociti provenienti da sangue periferico da pazienti SM non è stata ancora studiata come possibile predittore di attività di malattia, anche se è stata dimostrata una correlazione positiva tra la presenza di monociti fortemente attivati e l’insorgenza di recidive nel modello murino di SM (i topi EAE).Pertanto, abbiamo studiato i geni modulati nei monociti provenienti da pazienti con SM allo scopo di monitorare l’attività della malattia, la progressione e il grado di infiammazione. Per questo, abbiamo utilizzato un modello attraverso il quale l’analisi di specifici trascritti possa aumentare il valore predittivo delle misure di risonanza magnetica che sono normalmente utiliz-zate per monitorare la malattia e la risposta al trattamento farmacologico.Lo scopo del progetto di ricerca è stato quello di sviluppare test diagnostici innovativi basati su impronte genetiche. In particolare, abbiamo cercato di identificare marcatori molecolari in grado di differenziare le forme RRMS dalla forme PPMS. Accanto allo sviluppo di biomarcatori, sono stati identificati nuovi geni potenzialmente coinvolti nella patogenesi della SM. Per questi analisi abbiamo impiegato approcci genomici di ultima generazione per lo studio del trascritto-ma, per la generazione del profilo di microRNA e di strumenti bioinformatici avanzati.

RISULTATI

In questo progetto abbiamo studiato la risposta trascrizionale dei monociti di pazienti con SM mediante analisi microarray e di microRNA. I nostri criteri di selezione sono stati molto selettivi in quanto l’espressione genica delle cellule circolanti è fortemente influenzata dalla terapia far-macologica in corso o dalla presenza di altre condizioni infiammatorie (ad es. malattie infettive). Per questo motivo, nessuno dei pazienti reclutati per questo studio, era in terapia immuno-modulante o immuno-soppressiva al momento del reclutamento.In una prima serie di analisi, abbiamo esaminato i campioni provenienti da 14 donatori sani, 11 pazienti RRMS e 10 pazienti PPMS. Abbiamo utilizzato l’array più recente che contiene le informazioni di più di 30000 geni ben annotati. Sorprendentemente, abbiamo osservato una forte down-modulazione dei geni nei monociti RRMS rispetto alle cellule sane di controllo. L’analisi dei monociti da pazienti PPMS ha mostrato un modello completamente differente di 125


regolazione genica, il numero di geni up-regolati risulta maggiore rispetto ai monociti di con-trollo. Questi dati hanno indicato che lo stato di attivazione dei monociti di pazienti RRMS è diverso sia dai pazienti PPMS che dai controlli. Alcuni campioni non sono risultati appartenere alla classe fenotipica corretta e sono stati quindi rimossi dall’analisi statistica. Tuttavia, l’analisi dei dati clinici ha rivelato che questi pazienti avevano avuto una ricaduta recente (una o due settimane prima della raccolta del sangue) che ha quindi giustificato la scorretta assegnazione della classe fenotipica di appartenenza.L’analisi delle componenti principali ha rivelato che i profili di espressione genica di campioni SM sono chiaramente distinguibili da quelli dei donatori sani indicando che la selezione di una lista di geni con potere classificatorio e predittivo è raggiungibile.La seconda strategia che abbiamo seguito per scoprire nuovi biomarcatori e target terapeutici è stato quello di studiare i profili dei microRNA. I microRNA sono ormai ampiamente ricono-sciuti, come nuovi regolatori genici importanti in molte malattie autoimmuni. Infatti, non sono stati ancora descritti studi di caratterizzazione di queste molecole nello specifico in monociti da pazienti SM. In un primo studio pilota, abbiamo analizzato il profilo di circa 834 microRNA nei monociti di cinque controlli sani, sei pazienti PPMS e tre pazienti RRMS. Siamo stati in grado di selezionare circa 23 microRNA modulati che potrebbero essere potenzialmente coin-volti nell’attività della malattia. La convalida di questi risultati su singoli microRNA è in corso di studio su un set di campioni indipendenti. Inoltre, stiamo aumentando il numero di campioni da includere in entrambe le analisi in maniera tale da poter estendere i nostri risultati ai diversi fenotipi di malattia.

CONCLUSIONI

Abbiamo osservato che i monociti provenienti da sangue periferico di pazienti RRMS presen-tano profili diversi di attività rispetto a pazienti PPMS e ai soggetti di controllo. I dati indicano che i monociti sono coinvolti nell’attività della malattia. Inoltre, sono stati selezionati un insieme di geni in grado di distinguere i campioni SM dai controlli. È interessante notare, che abbiamo trovato anche una deregolazione delle molecole di microRNA nei monociti di pazienti SM indi-cando che anche queste molecole possono essere adatte alla selezione di nuovi biomarcatori. Inoltre, i dati ottenuti da questo studio suggeriscono che i cambiamenti nell’attività dei monociti in pazienti con SM possono essere considerati un meccanismo patogenetico aggiuntivo che può contribuire a sostenere lo stato infiammatorio osservato nella malattia. Per questo motivo, proponiamo i monociti come nuovo bersaglio cellulare per monitorare l’attività della malattia e per individuare nuovi target terapeutici.

A SYSTEMS BIOLOGY APPROACH TO IDENTIFY BIOMARKERS AND THERAPEUTIC TARGETS INMULTIPLE SCLEROSIS


Key actors of the multiple sclerosis (MS) pathogenesis are elements of the innate and acqui-red immune system present in the Central Nervous System (CNS) lesions. In this respect, as increasing evidence implicates peripheral immunity changes in disease stages, a new notion that adaptive immunity may be involved in relapsing-remitting disease, while specific innate immunity dysfunction may relate to disease progression, is arising. The elucidation of the target molecules of the immune system in MS is a relevant goal for the development of innovative dia-gnostic and prognostic immunological tests. The gene expression of MS peripheral monocytes has never been studied as a predictor of disease activity although inflammatory monocytes have been shown to correlate with relapses in the mouse model of MS (EAE mice).Systems analysis of the transcriptional activity of circulating immune effectors cells could be used beside biomarker discovery, to identify conserved elements in the host response to syste-mic chronic inflammation and to gain insight into the fisiopathological process. Therefore, we

sought to prospectively identify and validate peripheral blood monocyte genes that could mark disease activity, progression and inflammation using a model by which RNA transcripts could increase the predictive value of magnetic resonance (MR) measures that are used to monitor treatment outcomes in MS trials. The aim of the research project was the development of innovative diagnostic tests based on genetic signatures for disease activity and progression in MS. Specifically, we sought to iden-tify molecular markers that are able to differentiate the RRMS and PPMS samples subtypes. Beside biomarkers development, novel therapeutic targets and genes involved in MS pathoge-nesis have been identified. We employed state-of-the-art genomic approaches to study whole genome transcriptomics, to generate microRNA profiling and advanced bioinformatics tools.

RESULTS In this project we studied the gene transcriptional response of MS patients monocytes by mi-croarray and microRNA analysis. All patients were recruited at the Multiple Sclerosis Unit of the Fondazione Don Gnocchi, Milan in collaboration with Dott. Caputo and Rovaris. Our selection criteria were very selective because gene expression of circulating cells is influenced by drug therapy or other inflammatory conditions (infectious diseases) as we observed from previous studies from our laboratory. For this reason, none of MS patients were under immuno-modula-ting or immuno-suppressive therapy at the time of recruitment. In a first set of analysis, we profiled samples from 14 healthy donors, 11 relapsing remitting (RRMS) and 10 primary progressive (PPMS) patients. We used the most recent array con-taining the information of more than 30000 well annotated genes. Strikingly, we observed a strong down-modulation of genes in RRMS monocytes compared to healthy controls cells. The analysis of PPMS monocytes displayed a completely different pattern of gene regulation, here an higher number of up-regulated genes was observed compared to controls which in-dicated an increase in monocytes activity. Few samples did not fall in the correct phenotypic class and were therefore removed from the statistical analysis. A deep look on clinical data indeed revealed that those patients experienced a recent relapse (one or two weeks before blood collection) making the wrong assignment on the phenotypic class rational. To determine whether it was possible to classify the MS disease, we performed a supervised analysis. Principal component analysis revealed that gene expression profiles of MS samples are clearly distinct from those from healthy donors indicating that the selection of a predicting MS signature is feasible, and we are currently selecting and validating the minimal list of genes with classification power. The second strategy that we followed to find out novel biomarkers and therapeutic targets was to study the microRNA profiling in MS monocytes samples. MicroRNA are now widely recognized, as important gene regulators in many autoimmune diseases. Indeed, currently no studies yet have described these molecules specifically on MS monocytes. In a pilot study, we profiled five healthy controls, six PPMS and three RRMS for microRNA gene expression. We were able to select about 23 microRNA genes modulated in MS that could be potentially involved in disease activity. The validation of these results on individual microRNAs is on going on an independent set of samples. Moreover, we are extending the analysis to more patients in the group of RRMS and we are increasing the number of samples in the whole analysis to be able to extend these results to the different disease phenotypes.

CONCLUSIONS In conclusion, we observed that peripheral blood monocytes in RRMS present different acti-vity profile compared with PPMS and control cells. The data strongly indicate that monocytes maybe implicated in disease progression and activity. A set of genes that are able to distinguish MS samples from controls have been selected. Interestingly, we found also dysregulation of microRNA genes in RRMS monocytes compared to controls and PPRM samples pointing out that also these molecules represent suitable targets for biomarker selection. The data obtained

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from this study suggested that changes in monocytes activity in MS may be considered as an additional pathogenic mechanism that may contribute to sustain the inflammatory state of MS. For this reason, we propose the monocytes as a new cellular target for monitoring disease activity and to identify novel therapeutic targets.


Baldassarri S, Torri A, Fumagalli S, Ripamonti C, Caputo D, Rovaris M and Foti M. A systems bio-logy approach to identify biomarkers and therapeutic targets in Multiple sclerosis. 2011 XXI AINI Congress, September 22th – 25th, Pollenzo - Bra, Cuneo, Italy

Baldassarri S, Torri A, Fumagalli S, Ripamonti C, Caputo D, Rovaris M and Foti M. A systems biology approach to identify biomarkers and therapeutic targets in Multiple sclerosis. 2011 Joint Annual Meeting SIICA-DGFL, September 28th – October 1st, Riccione, Italy

PROGETTO DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009 per un periodo di 1 anno - 50.000 €

I MECCANISMI IMMUNO-BIOLOGICI DELLA GRAVIDANZA: COME POSSONO INDURRE UNA SPONTANEA REMISSIONE NELLA SCLEROSI MULTIPLA

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RESPONSABILE DEL PROGETTOFRANCESCA GILLIRicercatore a contrattoIstituto per le Neuroscienze Cavalieri Ottolenghi, c/o Ospedale Universitario San Luigi Gonzaga, Orbassano, Torino

Collaboratori:ANTONIO BERTOLOTTO SIMONA PERGANICOLE NAVONE SIMONA MALUCCHI MARCO CAPOBIANCO


La gravidanza è uno stato fisiologico transitorio di tolleranza immunitaria atta ad evitare il rigetto del feto ed è frequentemente associata ad una riduzione dell’attività di malattia nella sclerosi multipla (SM). Tra i principali meccanismi associati al controllo della SM durante la gravidanza vi è una modulazione della risposta pro-infiammatoria (Th1) verso un fenotipo anti-infiamma-torio (Th2). I fattori immunoregolatori coinvolti in questa modulazione sono proteine sieriche e molecole di varia natura che promuovono la tolleranza. Inoltre, gli ormoni che derivano dalla placenta possono direttamente agire sulla funzione delle cellule immunitarie che esprimono i recettori estrogenici.Con lo scopo di comprendere i meccanismi di adattamento immunologico durante la gravidan-za, abbiamo recentemente comparato i profili di espressione genica nelle cellule mononucleate di pazienti con SM e volontari sani, prima e durante la gravidanza. I risultati di tale studio hanno evidenziato nelle pazienti analizzate prima della gravidanza, un’alterata espressione di trascritti coinvolti nella regolazione negativa dell’infiammazione; la gravidanza per contro, induceva una “normalizzazione” dei livelli di espressione, in particolar modo in sette trascritti genici.Il progetto qui presentato ha la finalità di analizzare nel dettaglio i sette trascritti precedente-mente identificati. In particolare ci si è focalizzati sullo studio dei sette trascritti in diverse coorti di pazienti con SM, sull’identificazione dei fattori (ormoni gravidanza specifica quali prolattina, estrogeni e progesterone o altri fattori immuno-modulatori) che determinano la modificazione nell’espressione dei trascritti durante la gravidanza, sulla caratterizzazione delle differenti sotto-popolazioni cellulari eventualmente coinvolte nell’espressione dei sette trascritti e sull’indagine dei livelli di citochine circolanti specifiche per i pattern Th1/Th2/Th17, prima, durante e dopo la gravidanza.

RISULTATI

Il progetto è stato focalizzato all’indagine dei sette trascritti in diverse coorti di pazienti con SM. Le analisi hanno confermato la deregolazione genica identificata nel nostro precedente studio genome-wide. Degno di nota è il fatto che i trascritti trovati sotto-espressi nei pazienti con SM codificano per molecole coinvolte nella regolazione negativa dell’infiammazione. I risultati con-fermano una deregolazione non sesso-specifica. La terapia con natalizumab normalizza l’e-spressione di un unico trascritto, suggerendo una bassa sovrapposizione tra il meccanismo di protezione fornito dalla terapia e quello fornito dalla gravidanza. Diversamente, sia l’interferone-beta sia il glatiramer acetato hanno determinato una reversione nell’espressione di un elevato numero di trascritti, suggerendo una buona sovrapposizione dei meccanismi di protezione.Considerando poi una coorte di attività di malattia, tra i sette trascritti, due hanno evidenziato una modulazione a seguito di recidiva clinica. L’esposizione ai corticosteroidi ha determinato un ripristino dei livelli di espressione iniziale, amplificando la risposta sistemica anti-infiammatoria.In secondo luogo, il progetto ha valutato l’effetto di specifici stimoli infiammatori nonché di stimolazioni ormonali sull’espressione dei sette trascritti.I dati hanno dimostrato che tutti trascritti sono coinvolti nell’infiammazione. Tale risultato evi-denzia l’esistenza di una deregolazione genica SM-specifica, come anche il coinvolgimento di 129


processi infiammatori sia nella patogenesi della SM sia nella gravidanza. Una volta appurata la correlazione tra i trascritti e l’infiammazione, si è proceduto con l’analisi dell’effetto indotto da ormoni gravidanza-specifici sull’espressione genica. Tra i trattamenti testati, l’idrocortisone ha evidenziato una più forte capacità di modulazione genica. Tuttavia, è interessante notare come le modulazioni maggiori sono state riscontrate nella popolazione di controllo, confermando l’ipotesi dell’esistenza di meccanismi anti-infiammatori difettosi nei pazienti con SM.Come terzo punto, è stata valutata l’espressione deregolata in diverse sottopopolazioni cellu-lari, quali monociti, linfociti T e linfociti B. I risultati hanno dimostrato che ciascuna sottopopo-lazione è coinvolta nella deregolazione genica osservata.Infine, per determinare l’effettiva esistenza di uno shift Th2, lo studio ha confrontato la produ-zione di citochine pro-infiammatorie e anti-infiammatorie in pazienti con SM e controlli, prima, durante e dopo la gravidanza. L’analisi dei profili non ha evidenziato alcuna modulazione di citochine nel corso della gravidanza, in entrambi i gruppi di donne. L’unico dato interessante è l’esistenza di un sottogruppo di pazienti con SM in cui si osserva una massiccia produzione di citochine con valori di circa 100 volte superiori alla media. Tuttavia, ad oggi non è stata dimo-strata alcuna correlazione tra la maggiore espressione di citochine e gli esiti clinici nei pazienti.

CONCLUSIONI

Nel complesso, i risultati del presente studio confermano una deregolazione dei sette geni infiammazione-associati identificati nel nostro precedente del progetto finanziato da FISM. In particolare, la suddetta deregolazione genica è stata osservata in monociti, linfociti T e linfo-citi B, evidenziando che ciascuna delle tre sottopopolazioni cellulari può essere una parte del pathway associato alla malattia. Infine, tra i trattamenti di esposizione testati, l’idrocortisone, prodotto dalle donne nella fase tardiva della gravidanza, ha dimostrato un forte effetto sull’e-spressione dei geni analizzati.I risultati qui presentati portano ad una migliore comprensione dei meccanismi immunologici coinvolti nell’effetto benefico della gravidanza e al loro impatto sulla immunopatogenesi della SM. Ciò può fornire una base per lo sviluppo di nuove, più efficaci strategie terapeutiche, por-tando quindi ad una migliore gestione della malattia.

THE IMMUNE-BIOLOGICAL MECHANISMS BEHIND PREGNANCY: HOW THEY CAN INDUCE SPONTANEOUS REMISSION IN MULTIPLE SCLEROSIS


Pregnancy represents a physiological transitory state of immune tolerance to avoid the rejec-tion of the fetus, and is frequently associated with reduced activity of multiple sclerosis (MS). The immunomodulatory mechanisms contributing to the control of harmful autoimmune activity are probably directed towards the adaptive immune system; putative beneficial mechanisms in the control of MS during pregnancy include a shift from a prevailing pro-inflammatory (Th1) response to an anti-inflammatory (Th2) response. Immunoregulatory factors specific for pre-gnancy comprehend serum proteins and tolerance-promoting signaling molecules. In addition, placenta-derived hormones, prolactin, estrogens and progesterone can directly affect the fun-ction of the immune cells, which express estrogen receptors.Aiming at getting better inside into these mechanisms, we recently compared gene expression profiles in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with MS and healthy vo-lunteers before and during pregnancy. Our preliminary results clearly illustrate that the expres-sion of transcripts involved in the negative regulation of inflammation are altered nonpregnant patients compared to controls. Complementary changes occurring in the immune system du-ring pregnancy revert this imbalance, particularly for seven transcripts.Present project encompassed the investigation of the seven identified transcripts, potentially

contributing to the reduced disease activity during pregnancy. Specifically, it focused on the investigation of the seven transcripts in different cohorts of MS patients, the determination of whether pregnancy-induced changes in transcript’s expression are due to placenta-derived hormones or other immunomodulatory factors, the characterization of the blood cell subpo-pulations differently involved in gene expression and the investigation of changes in the levels of circulating cytokines with a focus on the Th1/Th2/Th17 balance during and after pregnancy.

RESULTS The first task of the project was the investigation of the seven transcripts in different cohorts of patients with MS. Analyses have confirmed the pattern of deregulated expression as observed in our previous genome-wide transcriptional analysis: a deregulated expression was observed in patients as compared with healthy controls. Notably, transcripts that were found down-regulated in patients with MS encode all for critical negative regulators in inflammatory pro-cesses. Overall, findings confirm a not gender-specific deregulation. Therapy with natalizumab leads to the reversion in expression of a single transcript, suggesting almost no overlap in the mechanism of protection between therapy and pregnancy. Differently, both interferon-beta and glatiramer acetate lead to the reversion in expression of a higher number of genes transcripts, suggesting partially overlapping mechanisms of protection.Considering a disease activity cohort, among the seven transcripts, two changed expression following clinical relapse. Notably, corticosteroids exposure resulted in a reinforcement and amplification of the systemic anti-inflammatory response.The second task aimed at evaluating the effect of inflammatory stimuli as well as of hormones stimulation on the expression of the seven transcripts. Data firstly showed that all of transcripts are inflammation-related. This result highlights the MS-specific deregulation as well as the in-volvement of inflammatory mechanisms in both pregnancy and MS outcome.Once aware that we were studying inflammation-related genes, we analyzed the effect of specific hormones stimulation on gene expression. Among the tested exposure treatments, hydrocortisone demonstrated the strongest effect on gene expression, as all genes significantly changed in expression. Notably, the most significant changes were observed in healthy con-trols rather than in patients with MS, confirming the hypothesis of a defective anti-inflammatory pathway in patients with MS. For the purpose of the third task, we ascertained gene expression deregulation in monocytes, T-lymphocytes and B-lymphocytes. Finally, findings have showed that each of the three cell subpopulation may be a part of the deregulated gene expression pathway linked to MS. To determine whether a Th2 shift occurs, the fourth task of the project aimed at comparing the production of pro-inflammatory cytokines and Th2 cytokines among the samples obtained from patients with MS and healthy controls, before, during and after pre-gnancy. Profiling analysis did not show any cytokine modulation throughout pregnancy in both groups of women. The only interesting finding in this task that warrants further investigation has been that there is a fraction of patients with MS with an about 100-fold higher expression amount of pro-inflammatory cytokines. To date we did not show any kind of correlation betwe-en higher cytokines expression and clinical outcomes in patients.

CONCLUSIONS Overall, findings confirm a deregulation of the seven inflammation-related genes identify in our previous FISM-founded project. Notably, the above-mentioned gene deregulation was obser-ved in monocytes, T-lymphocytes and B-lymphocytes, highlighting that each of the three cell subpopulation may be a part of the deregulated pathway linked to MS. Finally, among the te-sted exposure treatments, hydrocortisone, which is produced in late pregnancy, demonstrated the strongest effect on gene expression.Results of the present study lead to a better understanding of the immunological mechanisms of pregnancy-related beneficial effects and their impact on the immunopathogenesis of MS. This may provide basis for the development of novel and possibly more effective therapeutic strategies, and thus will ultimately lead to better management of the disease.

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Gilli F, Navone ND, Perga S, Marnetto F, Caldano M, Capobianco M, Pulizzi A, Malucchi S, Ber-tolotto A. Loss of braking signals during inflammation: a factor affecting the development and disease course of multiple sclerosis. Arch Neurol. 2011;68(7):879-88

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Gilli F, Navone ND, Perga S, Pulizzi A, Bertolotto A. (2010) Dysregulated expression pattern of anti-inflammatory transcripts in monocytes and T-lymphocytes from patients with Multiple Sclerosis. Atti congressuali Stresa, AINI 2010

Gilli F, Navone N, Valentino P, Perga S, Marnetto F, Sperli F, Malucchi S, Bertolotto A. (2009) Over-lapping molecular mechanisms of protection during pregnancy and interferon-beta therapy in patients with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis, 15 Suppl. 2: P795

Bertolotto A, Navone N, Malucchi S, Valentino P, Perga S, Pulizzi A, Marnetto F, Caldano M, Gilli F. Overlapping molecular mechanisms of protection during pregnancy and disease-modifying thera-pies in patients with Multiple Sclerosis. Multiple Sclerosis, 16 Suppl. 10: P438

Perga S, Navone ND, Caldano M, Gilli F, Bertolotto A. Transcriptional analysis of seven MS-asso-ciated genes after ex vivo stimulation with LPS/PMA. Multiple Sclerosis, 16 Suppl. 10: P255

BORSA DI RICERCA FINANZIATO CON IL BANDO FISM 2009per un periodo di 2 anni - 90.000 €

STUDIO NEUROFISIOLOGICO E NEURORADIOLOGICO DEI CIRCUITI TRONCOENCEFALICI IN PAZIENTI CON SCLEROSI MULTIPLA

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RESPONSABILE DEL PROGETTOFRANCA DERIUProfessore Associato di Fisiologia Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Sassari

Collaboratori:GIULIO ROSATIEUSEBIO TOLUMAURIZIO CONTIELENA GIACONIGIOVANNA PILURZI, MARIA PAOLA CABBOI IMMACOLATA MAGNANOANTONIO ACHENEANDREA SALISGIOVANNI MARIA PES


Il tronco encefalico (TE) è una piccola parte dell’encefalo dove le lesioni da sclerosi multipla (SM) sono spesso clinicamente silenti. Sebbene essenziale per formulare la diagnosi iniziale e per rilevare nuove lesioni, la risonanza magnetica convenzionale (RM) non è efficace nel moni-torare la perdita o il ripristino della funzione entro la lesione. La RM non convenzionale supera questi limiti, ma è costosa e disponibile solo in pochi centri. I pazienti con SM spesso presen-tano segni/sintomi di coinvolgimento del TE e si ritiene che anomalie dei riflessi del tronco (RT) riflettano un grave danno del TE. Per migliorare il monitoraggio dell’evoluzione, sia silente che manifesta, della malattia, è imperativo fornire al clinico un ampio spettro di mezzi non invasivi ed economici, la cui disponibilità e facilità di utilizzo possano surrogare metodi più sofisticati. Oltre a presentare questi vantaggi, la registrazione dei RT permette di testare neuroni e vie ner-vose del TE, potenzialmente in relazione con segni/sintomi o interessati da lesioni clinicamente silenti. L’attenzione è stata focalizzata su quattro riflessi: il vestibolo-collico (VC), il trigemino-cervicale (TC), il vestibolo-masseterino (VM) e l’acustico-masseterino (AM). Tra questi, solo il riflesso VC è stato studiato sistematicamente nella SM; al contrario, il TC è stato indagato solo in un ristretto numero di pazienti, e sia il VM che il AM non sono mai stati studiati nella SM. Questo progetto si proponeva l’obiettivo di effettuare una valutazione sistematica e una rivalutazione ad un anno dei RT suddetti allo scopo di: a) fare un confronto nei pazienti e in un comparabile gruppo di soggetti sani; b) correlare le anormalità dei RT con la condizione clinica dei pazienti; c) valutare il valore diagnostico dei RT rispetto ai potenziali evocati multimodali (PE) e al quadro RM; d) documentare la varietà dei possibili pattern attesi in ciascun paziente, un anno dopo la valutazione iniziale.

RISULTATI

Sessanta soggetti sani (31,9±7,8 anni) e 60 pazienti (33,3±8,3 anni, 44 femmine e 16 maschi) hanno partecipato allo studio. I pazienti avevano una diagnosi di SM recidivante-remittente, una scala di disabilità (EDSS) <5.0 (EDSS=0 nel 15,3% dei pazienti; EDSS≤2.5 nel 67,8% dei pazienti e EDSS≤5 nel 16,9%) e una durata di malattia di 10,0±14 anni. L’esame neurologico ha mostrato segni/sintomi di interessamento del TE nel 37,3% dei casi (EDSS del TE≤2,5). La frequenza dei riflessi alterati era significativamente diversa (p=0,00001) tra controlli e pazienti. Nel complesso, quando le anomalie dei quattro RT venivano cumulate, nessuno dei controlli aveva più di un RT alterato, con una Frazione di Falsi Positivi del 6,7%. Sulla base di questo dato è stato assunto che avere più di un riflesso alterato è indice di patologia. Per quanto ri-guarda i pazienti, la Frazione dei Falsi Negativi era del 15% mentre la frequenza con la quale i pazienti presentavano almeno uno, due, tre o quattro riflessi alterati era pari, rispettivamente al 85,0%, 65,0%, 21,6% e 6,6%. Considerati complessivamente, i PE multimodali erano alterati nel 80,0% dei pazienti e l’indagine RM ha rilevato lesioni mono e/o bilaterali sopratentoriali nel 98,3% dei pazienti, di cui il 72,7% aveva anche lesioni nel tronco encefalico. La RM ha

evidenziato assenza di lesioni del TE nel 28,3% dei casi. Le alterazioni dei RT correlavano significativamente con la durata di malattia e con i segni/sintomi piramidali (p=0,020). La stes-sa associazione positiva è stata trovata tra le suddette variabili cliniche e le alterazioni dei PE (rispettivamente, p=0,0001 e p=0,025) e il carico lesionale del tronco evidenziato dalla RM (rispettivamente, p=0,024 and p=0,019). Anche le alterazioni dei RT correlavano positivamente con quelle dei PE (p=0,009). Infine, la frequenza delle alterazioni dei quattro RT correlava si-gnificativamente (p=0,007) col carico lesionale del tronco, evidenziato dalla RM bilateralmente. Riguardo alle singole regioni del tronco, solo il carico lesionale del ponte e del bulbo correlava significativamente con le alterazioni dei RT (rispettivamente, p=0,001 e p=0,016).Tra i 60 pazienti che hanno partecipato allo studio, sei si sono ritirati e 17 sono stati rivalutati dopo un anno. Di questi, solo alcuni hanno mostrato un leggero peggioramento del quadro clinico, neurofisiologico e neuroradiologico, ma senza alcuna significatività statistica.Le risorse messe a disposizione dalla FISM per questo progetto sono state destinate in parte all’avvio di un laboratorio di neurofisiologia clinica per la registrazione dei riflessi del tronco encefalico, presso il Dipartimento di Scienze Biomediche dell’Università di Sassari. La parte restante è stata destinata al pagamento di una borsa di studio per i giovani ricercatori impiegati specificamente nella realizzazione del progetto.

CONCLUSIONI

La registrazione dei RT ha suggerito la presenza di anomalie del TE nell’85% dei pazienti. Que-sto risultato è di interesse alla luce della sua comparazione con quello dell’esame clinico (che ha evidenziato un coinvolgimento del TE nel 37,3% dei casi), con i PE (alterati nell’80,0% dei casi) e con la RM (che ha documentato lesioni del tronco nel 72,7% dei pazienti). Questi dati fanno ritenere che la valutazione complessiva dei RT dia informazioni aggiuntive su eventuali alterazioni della funzionalità dei circuiti del TE, specialmente quando queste non sono eviden-ziate da altre procedure cliniche e/o paracliniche. Il follow-up ad un anno non ha mostrato modificazioni significative rispetto alla valutazione basale, probabilmente a causa del limitato campione rivalutato. L’estensione del follow-up ad un maggior numero di pazienti, è necessaria per comprendere se i RT possano essere utili nel monitorare la funzione del tronco nel tempo.

NEUROPHYSIOLOGIC-NEUROIMAGING PAIRED STUDY OF BRAINSTEM CIRCUITS IN PATIENTS WITH MULTIPLE SCLEROSIS


The brainstem (BS) is a small part of the brain where multiple sclerosis (MS) lesions are often clinically silent. Although essential for formulating the initial diagnosis and for detecting new lesions, conventional magnetic resonance imaging (MRI) is not effective in monitoring loss or restoration of function within the lesion. Non-conventional MRI can overcome these limits but it is expensive and available only in a few centres. Patients with MS often exhibit signs/symptoms of BS involvement and BS reflex (BSR) abnormalities were proved to reflect major BS damage. To improve assessment of the silent and manifest evolution of the disease, it is imperative to provide clinicians with a wide spectrum of low-cost, painless tools whose availability and easi-ness of implementation can surrogate for more sophisticate methods. Besides offering these advantages BSR recordings allow testing BS neurons and pathways, which are potentially related to signs/symptoms often observed in MS or which are involved by clinically silent le-sions. Our attention was focused on four BSR: the vestibulo-collic (VCR), the trigemino-cervical (TCR), the vestibulo-masseteric (VMR) and the acoustic-masseteric (AMR) reflexes. Among these, only the VCR has been widely investigated in MS; by contrast the TCR has been studied in a small number of cases and both the VMR and AMR have never been investigated in MS. Objectives of this project were to carry out an initial systematic assessment and a complete reassessment 12 months later of VMR, AMR, TCR and VCR in MS in order to: a) compare

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the frequency of BSR in MS patients and healthy subjects; b) correlate BSR abnormalities to clinical conditions; c) evaluate BSR diagnostic value respect to multimodal evoked sensory potentials (EP) and MRI; d) document the variety of possible patterns expected in each patient after one year from initial evaluation.

RESULTS Sixty healthy subjects (31.9±7.8 years old) and 60 patients (33.3 ± 8.3 years old, 44 females and 16 males) participated in the study. Patients had a diagnosis of definite relapsing-remittent MS, an expanded disability scale status (EDSS) <5.0 (EDSS=0 in 15.3% of patients; EDSS≤2.5 in 67.8% of patients and EDSS≤5 in 16.9%) and an illness duration of 119.7±175.4 months. Neurological examination showed symptoms and/or signs of BS involvement in 37.3% of cases (with BS-EDSS≤2.5). The frequency of altered reflexes was significantly different (p=0.00001) between controls and patients. In the whole, when the four BSR were cumulated, none of the controls had more than one altered reflex, with a False Positive Fraction of 6.7%. Based on this finding we assumed that having more than one altered reflex is an indication of abnormality. As for patients, the False Negative Fraction was 15% and the True Positive Fraction of having at least one, two, three or four altered reflexes was 85.0%, 65.0%, 21.6% and 6.6% respectively. In the whole, multimodal EP revealed brainstem abnormalities in 80.0% of patients and MRI investigation detected monolateral and/or bilateral lesions in the supratentorial compartment of 98.3% of patients, 72.7% of whom had additional lesions in the brainstem. MRI procedure did not evidence any lesion in the brainstem in 28.3% of patients. BSR alterations consistently correlated with illness duration and pyramidal signs and/or symptoms (p=0.020). The same positive associations were found between the above mentioned clinical variables with EP alte-rations (p=0.0001 and p=0.025, respectively) and with brainstem lesion load detected by MRI (p=0.024 and p=0.019, respectively). A significant positive correlation of cumulated reflexes with EP overall score was found (p=0.009). Finally, cumulative frequency of altered brainstem reflexes significantly (p=0.007) correlated with total brainstem lesion load detected from MRI bilaterally. As for distinct brainstem regions, only pons and medulla load significantly correlated with global reflex alterations (p=0.001 and p=0.016 respectively).Among the 60 patients who participated in the initial study, six dropped out and 17 had a se-cond assessment after one year from initial evaluation. Only in some of the 17 reassessed MS the follow-up revealed a slight worsening of the outcome of all the tests performed but with no statistical significance.Part of FISM resources for this project were devoted to start the set-up of a laboratory of clinical neurophysiology specifically addressed to recording of brainstem reflexes in the Department of Biomedical Sciences of the University of Sassari. The rest was used to provide a fellowship to young researchers specifically employed in the realization of this project.

CONCLUSIONS BSR recording indicated the presence of possible BS circuit abnormalities in 85% of patients. This finding is interesting in the light of the comparison of BSR data with those obtained by cli-nical examination (proving BS involvement in 37.3% of cases), EP (altered in 80% of cases) and by MRI (showing BS lesions in 72.7% of patients). Data allow to be confident of the usefulness of BSR testing in providing additional information about abnormal function of BS circuits, espe-cially when it is not detected by clinical and/or paraclinical procedures. The follow-up carried out after one year from initial evaluation, did not show any significant modification in compari-son with basal data. The small sample may account for the lack of statistical significance. The reassessment of a larger number of patients will allow to understand whether BSR recording is of value in documenting evolution of BS function over time.


Giaconi E, Pilurzi G, Coiana J, Magnano I, Cabboi MP, Achene A, Salis A, Conti M, Pes G, Tolu E, Deriu F. Exploration of brainstem function through vestibular and trigeminal reflexes in healthy pe-ople and in patients with multiple sclerosis. 62° National Congress of Italian Physiological Society; Sorrento 25-27 th September 2011. Acta Physiologica 203 (suppl. 688): p. 103, 2011

Deriu F, Giaconi E, Rothwell JC, Tolu E. Reflex responses of masseter muscles to sound. Clin Neu-rophysiol. 2010 Oct;121(10): 1690-9

Magnano, MP Cabboi, P Cossu, M Conti, A Achene, A Salis, GF Sau, F Deriu, I Aiello. L’onda P14 nello studio del tronco dell’encefalo (TE) in pazienti affetti da Sclerosi Multipla Recidivante-Remittente (SMRR). Abstract Book Congresso Nazionale della Società Italiana di Neurofisiologia Clinica (SINC) Siena, 13-15 mag 2010 pag.294

Magnano I, Cabboi MP, Pilurzi G, Conti M, Achene A, Salis A, Giaconi E, Ortu E, Cossu P, Sau GF, Pes GM, Aiello I Tolu E, Deriu F. (2009). Alterazioni tronco-encefaliche nella Sclerosi Multipla (SM): risultati di uno studio Neurofisiologico e Neuroradiologico. Abstract Book, Congresso Nazionale SINC, Salerno 28-30 maggio 2009, pag 248

Pilurzi G, Magnano I, Giaconi E, Ortu E, Cossu P, Ruiu E, Pes GM, Tolu E, Deriu F. (2009). Vestibulo masseteric reflex and jaw acoustic reflex: a new tool to assist exploration of brainstem function in multiple sclerosis? Abstract book of International Workshop and Conference on Human Reflexes – Wiring and Firing of Motoneurones 11-15 May, Izmir (Turkey), pag 71-72

Pilurzi G, Giaconi E, Ortu E, Deriu S, Ruiu E, Magnano I, Cossu P, Achene A, Salis A, Conti M, Pes G, Tolu E, Deriu F. (2009). The acoustic masseteric reflex (AMR) and the vestibulo masseteric reflex (VMR): a new tool to explore brainstem (BS) function in man. Acta Physiologica 197(Supplement 672): 96


VALIDAZIONE DI MARKERS ELETTROFISIOLOGICI DI DANNO NERVOSO IN MODELLI ANIMALI DI SCLEROSI MULTIPLA

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RESPONSABILE DEL PROGETTOLUIS TENEUDIstituto di Neurologia SperimentaleOspedale San Raffaele, Milano

MENTORE:LETIZIA LEOCANI


I potenziali evocati (PE) sono un buon marcatore di gravità per danni del sistema nervoso nella sclerosi multipla (SM). Il loro uso nella diagnosi dell’SM è stato fortemente ridotto dopo l’av-vento della risonanza magnetica funzionale (fMRI). Tuttavia, a differenza dall’fMRI, i PE bene correlano con la disabilità clinica, generando una misura funzionale della conduzione nervosa grazie alla sua capacità di rilevare coinvolgimenti sub-clinici di una certa patologia. Inoltre, i PE sono predittivi nell’evoluzione della malattia. Infine, il rapporto costo/benefici è molto basso.Le misure di danno funzionale in modelli animali di SM sono largamente basate su valutazioni cliniche; la maggior limitazione di questo approccio sta nella sua soggettività e nel fatto che è confinata alla valutazione dell’equilibrio. D’altra parte, studi istopatologici permettono misure oggettive e specifiche del danno nervoso, ma non danno alcuna informazione sulla funzionali-tà; inoltre, richiedono il sacrificio dell’animale, e quindi di un gran numero di soggetti per studi longitudinali, con conseguenze etiche e economiche negative.Studi precedenti su PE nei modelli animali di SM hanno usato diversi roditori rispetto ai topi. Tuttavia, l’uso dei topi ha diversi vantaggi rispetto ad altri roditori, permettendo l’uso di transge-nici e un più facile approccio genetico. È essenziale avere una tecnica standard, rapida e riproducibile per registrare e analizzare i PE in maniera minimalmente invasiva, garantendo all’animale uno stress minimo ed evitando di interferire con il normale corso della malattia e con la valutazione clinica e istopatologica.Lo scopo del presente studio è di sviluppare e validare un biomarker elettrofisiologico dei danni del sistema nervoso nel modello animale di SM, per essere usato nella valutazione di terapie sperimentali.

RISULTATI

L’encefalomielite autoimmune sperimentale cronica (EAE) è stata indotta in topi femmine C57 di otto/nove settimane tramite immunizzazione sottocutanea con oligodendrocyte glycoprotein (MOG) 35-55 in complete Freund’s adjuvant (CFA). I controlli sono stati infettati con incomplete Freund’s adjuvant. La tossina Pertussis è stata somministrata ad entrambi i gruppi.Due elettrodi epidurali sono stati impiantati sotto anestesia da Sevofluorano: l’attivo sulla cor-teccia visiva V1 e il riferimento sulle aree frontali destre. Dopo adattamento al buio, i topi sono stati anestetizzati e i PE visivi (PEV) sono stati registrati 10, 20 e 40 giorni dopo immunizzazione (dpi). Un gruppo differente è stato usato come baseline. L’ampiezza rispetto alla baseline e la latenza dei PEV sono stati misurati per le tre maggiori componenti, N1, P1 e N2 ad ogni time-point. Gli animali sono stati sacrificati agli stessi tempi e un sottogruppo è stato utilizzato per analisi istologiche. Le latenze sono state analizzate statisticamente tramite analisi ANOVA.Le componenti più conservate nei PEV da flash sono l’onda negativa N1 (21.83 ±0.2), la pri-ma positiva N2 (29.08±0.51) e la seconda negativa N2 (51.44±0.97). Di queste, la più stabile e riproducibile è la P1. Le analisi neurofisiologiche nei topi EAE mostrano che le latenze delle maggiori componenti dei PEV aumentano durante il corso della malattia. Questo effetto è più marcato per le latenze di P1 (10 dpi, p =0.002; 20 dpi, p =0.001; 40 dpi, p <0.001), ma è an-che significativo per N1 (10 dpi, p =0.02; 20 dpi, p =0.001; 40 dpi, p =0.001) e N2 (10 dpi, p =0.170; 20 dpi, p =0.012; 40 dpi, p =0.02). Inoltre, l’ampiezza di P1 diminuisce nei topi EAE ma, come già riportato, la loro variabilità ne rende difficile l’interpretazione.Le analisi neuropatologiche mostrano infiltrati cellulari, demielinizzazione e degenerazione as-sonale in diverse proporzioni, maggiormente nelle aree periferiche del nervo ottico. 137


I PE somatosensoriali (PESS) sono stati registrati in topi C57 femmine wt. Sotto anestesia da Sevofluorano, tre viti epidurali sono state impiantate: due sulle cortecce parietali e una referen-za occipitale. Per il recording, sotto anestesia di Sevofluorano, le zampe posteriori degli animali sono state stimolate con impulsi quadri di corrente. I PESS sono stati registrati solo in alcuni casi. Ci sono stati problemi nel recording dei PESS; sono necessari più trials per standardizzare questa tecnica.

CONCLUSIONI

I dati mostrano un aumento nella latenza dei PEV dal momento di picco della malattia, mentre l’ampiezza comincia a diminuire a 40 dpi. Questi dati mostrano che i PEV si possono registrare sia nei topi wt che nel modello murino di EAE, costituendo un modello molto utile per il monito-raggio della funzionalità neuronale nel modello cronico di EAE. La disponibilità di recording mi-nimamente invasivi nel topo garantirebbe un biomarker eccellente per correlazioni longitudinali, funzionali e patologiche, per poter comparare l’adeguatezza di modelli animali con la patologia umana e poter valutare gli effetti delle terapie nel sistema nervoso.

VALIDATION OF NEUROPHYSIOLOGICAL MARKERS OF NERVOUS DAMAGE IN ANIMAL MODELS OF MULTIPLE SCLEROSIS


Evoked potentials (EPs) are a good marker of the severity of nervous damage in multiple sclero-sis (MS). Their use in the diagnosis of MS has been greatly reduced after the advent of the ma-gnetic resonance imaging (MRI) techniques. However, differently from MRI, EPs well correlate with clinical disability, providing a functional measurement of nervous conduction by its ability to detect subclinical involvement on a given pathway. Moreover, they may have a predictive value regarding the evolution of disability. Also, their cost/benefit ratio is to be considered quite low.Measurement of functional damage in animal models of multiple sclerosis has been based largely on clinical assessment. The main limitations of this approach rely on its subjectivity and on the fact that it is mainly confined to the assessment of gait and balance. On the other hand, histopathological studies allow objective and specific measure of nervous damage, but do not provide information on nervous function; moreover, they require to sacrifice the animal, requiring larger number of animals for longitudinal studies, with negative ethic and economical consequences.Previous studies on EPs in animal models of MS have used rodents other than mice. However, mice models have important advantages over the use of other rodents, allowing more easily the use of transgenic animals and gene targeting approaches. It becomes important the availability of standardized, fast and reproducible technique for recording and analysis of EPs minimally invasive, allowing minimal animal discomfort and avoiding to interfere with the natural clinical course of the disease and with the clinical/histopathological assessments.The aim of this project is to develop and validate an electrophysiological biomarker of nervous damage for experimental mice animal models of MS, to be used in the evaluation of the effects of experimental therapies.

RESULTS Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was induced in C57BL/6 naive fe-male mice of eight-nine weeks of age by subcutaneous immunization with myelin oligoden-drocyte glycoprotein (MOG) 35-55 in complete Freund’s adjuvant (CFA). Controls were injected with incomplete Freund’s adjuvant. Pertussis toxin was administrated to both groups.Under sevoflurane anaesthesia two epidural stainless steel screw electrodes were implanted: active over the right V1 cortex and right frontal reference. Following overnight dark adapta-

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tion, mice were anesthetized with sevoflurane. Flash-VEPs were recorded at 10, 20 and 40 days post immunization (dpi). Another group was included as baseline. The amplitude with respect to baseline and latency from stimulus onset of the three main components of flash-VEPs (N1-P1-N2) were measured at each time point. Animals were sacrificed at 10, 20 and 40 dpi. A small number of mice were randomly selected at each time for neuropathological investigations. Statistical analysis was performed. VEPs latency of three groups were entered into a one way ANOVA. The most consistent components observed in flash VEPs were the first negative N1 (21.83 ±0.2), first positive P1 (29.08±0.51) and second negative N2 (51.44±0.97), as has been de-scribed previously. Of them, P1 looks like the most stable and reproducible. Concisely, neu-rophysiological determinations in EAE mice show that latencies of main components of VEPs increased through the course of the disease. This effects is especially marked for P1 latencies (10 dpi, p =0.002; 20 dpi, p =0.001; 40 dpi, p <0.001), but is also significant for N1 (10 dpi, p =0.02; 20 dpi, p =0.001; 40 dpi, p =0.001) and N2 (10 dpi, p =0.170; 20 dpi, p =0.012; 40 dpi, p =0.02). Besides, P1 amplitude decreased in EAE mice but, as have been reported previously, their relative high variance makes difficult to analyze these values. Neuropathological findings in EAE animals showed infiltrating cells, demyelinating lesions and degenerating axons in variably proportions, mainly in the peripheral areas of the optic nerves.On the other hand, somatosensory evoked potentials (SSEP) were registered in healthy C57BL/6 naive female mice. Under sevoflurane anaesthesia, three epidural stainless steel screw electrodes were implanted: two active over the parietal cortex and one reference electro-de over the prefrontal region. On registration day, animals were anesthetized. Two stimulating electrodes were placed over the calf and square wave current pulses were applied. SSEP only could be registered in a few cases. I have great problems obtaining the signals. More trials are necessary to standardize this EP technique.

CONCLUSIONS Data show increased VEPs latency as from the peak of the disease while the amplitude decre-ased at 40 days. These results display that VEPs can be recorded in healthy mice and in the chronic EAE model, constituting a useful method for monitoring peripheral nervous function in chronic-progressive EAE. The availability of minimally invasive VEPs in mice would grant a biomarker allowing longitudinal, functional and pathological correlations, to compare the ade-quateness of animal models to human diseases and to assess the effects of therapies on nervous system.


Cambiaghi M, Teneud L, Velikova S, Gonzalez-Rosa J, Cursi M, Comi G, Leocani L. Flash visual evoked potentials in mice can be modulated by tDCS. Neuroscience, 185:161-165, 2011

Teneud L, Cambiaghi M, Dina G, Quattrini A, Furlan R, Martino G, Comi G, Leocani L. Flash visual evoked potentials as neurophysiological marker of nervous damage in animal models of Multiple Sclerosis. 21st Meeting of the European Neurological Society. 28 – 31 May 2011. Lisbon, Portugal

Teneud L, Cambiaghi M, Dina G, Quattrini A, Furlan R, Martino G, Comi G, Leocani L. Flash visual evoked potentials as neurophysiological marker of nervous damage in animal models of Multiple Sclerosis. 14th European Congress on Clinical Neurophysiology. 21-25 June 2011. Rome, Italy

Cambiaghi M, Teneud L, Velikova S, Gonzalez-Rosa JJ, Cursi M, Comi G, Leocani L. Transcranial direct current stimulation (tdcs) in the mouse brain: electrophysiological effects. 1st International Workshop on Synaptic Plasticity: From Bench to Bed Side. 28th April - 1st May 2010. Giardini-Naxos, Italy

Cambiaghi M, Teneud L, Velikova S, Gonzalez-Rosa JJ, Cursi M, Comi G, Leocani L. Stimolazione transcranica con corrente diretta (tDCS) nel topo: effetto sui potenziali evocati visivi (PEV). Con-gresso Nazionale della Società Italiana di Neurofisiologia Clinica. May, 2010. Siena, Italy

Cambiaghi M, Teneud L, Velikova S, Gonzalez-Rosa JJ, Cursi M, Comi G, Leocani L. Electro-physiological effects of transcranial direct current stimulation (tDCS) in the mouse brain on visual evoked potentials (VEPs). New prospects of transcranial electrical stimulation (tES): from bench to bed side. November, 2010. Brescia, Italy

BORSA DI STUDIO FINANZIATA CON IL BANDO 2008 per un periodo di 2 anni - 41.000 €

RUOLO DI PROGRANULINA NELLA SCLEROSI MULTIPLA

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RESPONSABILE DEL PROGETTOMARCO VERCELLINODipartimento di NeuroscienzeAzienda Ospedaliero-Universitaria San Giovanni Battista di Torino

Collaboratori:PAOLA CAVALLAMARIA TERESA GIORDANADARIO GIOBBESILVIA MASERAALESSANDRA MATTIODAALBERTO ROMAGNOLOSILVIA GRIFONICLAUDIA TREBINICARLOTTA CHIAVAZZA

Collaborazioni con altri gruppi:CAPELLO E, MANCARDI GL, Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica Università di Genova FENOGLIO C, GALIMBERTI D, DE RIZ M, SCARPINI E, IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico di Milano


La progranulina (PGR), proteina con importanti ruoli nel controllo dell’infiammazione e della riparazione del danno tissutale, è un fattore neurotrofico di fondamentale importanza, in grado di promuovere la sopravvivenza neuronale e la crescita assonale. È infatti l’unico fattore neu-rotrofico la cui carenza geneticamente determinata è causa di malattia nell’uomo (demenza frontotemporale).La PGR può andare incontro a proteolisi da parte di serina proteasi, con formazione di fram-menti di minori dimensioni, chiamati granuline (GRN). Tali frammenti hanno funzioni biologiche diverse da quelle della proteina originaria. Mentre la PGR ha attività essenzialmente anti-in-fiammatoria, le GRN hanno attività pro-infiammatoria. Il grado di proteolisi di PGR può quindi risultare in una modulazione dell’infiammazione.La PGR potrebbe giocare un ruolo importante nella sclerosi multipla (SM), per le sue funzioni regolative di infiammazione e di fattore neurotrofico.Gli obiettivi dello studio sono:− valutare l’espressione di PGR nel tessuto cerebrale di casi di SM, rispetto ad aspetti fonda-mentali della malattia quali demielinizzazione e infiammazione.− determinare eventuali correlazioni tra concentrazione di PGR nel liquor e aspetti clinici della SM. Questa parte dello studio è stata effettuata su campioni di liquor provenienti dagli archivi dell’Univ. di Torino (20 pazienti con SM recidivante-remittente (SMRR) con malattia in fase di stazionarietà, 10 pazienti con SMRR in fase di recidiva clinica di malattia, 10 pazienti con SM secondariamente progressiva (SMSP)).− valutare se comuni polimorfismi genetici di PGR possono influenzare decorso o età di esordio della SM. L’analisi genetica di PGR è stata effettuata su una popolazione preliminare di 226 pazienti con SMRR, dai Centri SM dell’AOU San Giovanni Battista di Torino e dell’IRCCS Ospe-dale Maggiore Policlinico di Milano. Per descrivere il decorso clinico della SM è stato utilizzato il Multiple Sclerosis Severity Score (MSSS).

RISULTATI

A) Espressione di PGR nel tessuto cerebrale in casi di SM e in controlliNel tessuto cerebrale di casi di SM, si osserva una espressione di PGR a livello di cellule infiam-matorie come macrofagi e microglia attivata, colocalizzando con HLA-DR e CD68, mentre non è osservabile a livello dei linfociti T o B. Una debole immunoreattività citoplasmatica per PGR si osserva anche a livello dei neuroni.Nelle lesioni demielinizzanti attive, si osserva una intensa immunoreattività per PGR a livello dei

macrofagi fagocitanti detriti mielinici e a livello della microglia attivata. Nelle lesioni demieliniz-zanti croniche attive, si osserva una immunoreattività per PGR a livello della microglia attivata al bordo della lesione.Una immunoreattività per PGR si osserva a livello della microglia attivata nella NAWM e nelle lesioni croniche inattive; la quasi totalità delle cellule CD68 positive esprime anche PGR. L’e-spressione di PGR a livello microgliale è maggiore nella SM progressiva che nella SMRR.Nelle lesioni corticali e nella NAGM si osserva una immunoreattività per PGR a livello della mi-croglia e del citoplasma neuronale. Anche negli infiltrati infiammatori leptomeningei si osserva una immunoreattività per PGR a livello di monociti e macrofagi.Nei casi di controllo si osserva una immunoreattività per PGR solamente a livello del citoplasma neuronale, mentre non è presente a livello della microglia.

B) Determinazione della concentrazione di PGR nel liquor (ELISA)Non sono state osservate differenze significative nella concentrazione liquorale di PGR tra i pazienti con SM (media 21.32 ng/ml ± SEM 2.14) e i controlli (media 17.15 ng/ml ± SEM 1.60).La concentrazione liquorale media di PGR è risultata significativamente più alta nei pazienti con SMRR in fase di recidiva di malattia (media 31.26 ng/ml ± SEM 3.14) e nei pazienti con SMSP (media 24.92 ng/ml ± SEM 1.69). rispetto ai pazienti con SMRR con malattia in fase di stazionarietà (media 14.56 ng/ml ± SEM 1.54) (p < 0.01). Una correlazione modesta (r = 0.579, p<0.05) è stata riscontrata tra la concentrazione liquorale di PGR e il numero di cellule nel liquor, nei pazienti con SM.

C) Studio geneticoNei pazienti con SM con esordio di malattia <= 25 anni, è stata osservata una aumentata frequenza del genotipo rs4792938 CC (23.8% vs 7.2%, OR 3.99, p = 0.001) e del genotipo rs3785817 GG (16.3% vs 4.3%, OR 4.27, p = 0.005), rispetto ai pazienti con esordio dopo i 25 anni.Nei pazienti con decorso di malattia più aggressivo (MSSS >= 5) è stata osservata una ridotta frequenza del genotipo rs5848 CC, rispetto ai pazienti con decorso meno aggressivo (MSSS < 5) (25.9% vs 48.5%, OR 0.37, p = 0.004).Lo studio è tuttora in corso su una popolazione più ampia di pazienti.

CONCLUSIONI

Si è dimostrata la presenza di una aumentata espressione di PGR nel tessuto cerebrale nei casi di SM analizzati, dove, oltre che dai neuroni, PGR è intensamente espressa anche da macro-fagi e microglia. Quindi si è osservato un incremento liquorale di PGR, come atteso dall’intensa espressione di PGR nelle lesioni demielinizzanti attive. Tale concentrazione è risultata pure incrementata nei pazienti con SM progressiva, probabilmente dovuta all’aumentata attivazione microgliale diffusa tipica della SM progressiva. Infine si è rilevato come alcuni comuni poli-morfismi genetici di PGR possano influenzare l’età di esordio e la gravità del decorso clinico della SMRR. Tali risultati suggeriscono un ruolo importante di PGR la cui produzione potrebbe rappresentare un meccanismo protettivo nella SM, considerata la sua funzione neurotrofica. Inoltre l’equilibrio tra l’azione anti-e pro-infiammatoria di PGR potrebbe rappresentare uno dei meccanismi di regolazione dell’infiammazione nella SM.

ROLE OF PROGRANULIN IN MULTIPLE SCLEROSIS


Progranulin (PGR) is a multifunctional protein with important roles in inflammation and tissue repair, and also a neurotrophic factor that enhances neuronal survival and axonal outgrowth (Ahmed, 2007; Eriksen, 2008; Van Damme, 2008). Its importance as a trophic factor is under-scored by the fact that PGR is the only neurotrophic factor identified to cause human disease

(frontotemporal dementia) through null mutations and haploinsufficiency (Baker, 2006).Proteolytic cleavage of the PGR protein by extracellular proteases, such as elastase, produces smaller fragments termed granulins (GRN) (He, 2003). These fragments have biological fun-ctions different from the parent PGR protein. PGR may have pro- or anti-inflammatory proper-ties, depending upon the extent of regulated proteolysis of the anti-inflammatory parent PGR protein and the generation of pro-inflammatory GRN peptides. Studies have shown that PGR and GRN have different effect on epithelial cells and inflammatory cells. GRN stimulate epithelial cells to secrete interleukin-8, a major chemoattractant for neutrophils and monocytes, whereas PGR has no such effect. PGR inhibits degranulation and respiratory burst of neutrophils activa-ted by TNFα. In contrast, GRN peptides have no inhibitory effect. These observations suggest pro-inflammatory and anti-inflammatory roles for GRN and PGR, respectively (Ahmed, 2007).PGR, with its functions both as a regulator of inflammation and as a fundamental neurotrophic factor, might play a key role in multiple sclerosis (MS). Through this study, we hope to evalua-te the presence and distribution of PGR in MS brain tissue, correlating it with features such as demyelination and inflammation, to characterize the relationship between Cerebro Spinal Fluid (CSF) PRG and clinical features of the disease, and to determine if common genetic polymorphisms of PRG may influence disease course in MS.

RESULTS A) Distribution of PGR immunoreactivity in MS and control brain tissueIn MS brain tissue, PGR immunoreactivity was constantly observed on inflammatory cells (ma-crophages, activated microglia). Weak PGR immunoreactivity was also observed in neuronal cytoplasm.In active demyelinating lesions, intense PGR immunoreactivity was observed on myelin-laden macrophages and activated microglia. In chronic active demyelinating lesions, PGR immuno-reactivity was observed in activated microglia at the lesion border.PGR immunoreactivity was observed also on activated microglia in the NAWM, in progressive MS more than in relapsing-remitting MS (RRMS).In cortical GM lesions and in the NAGM, PGR immunoreactivity was observed on activated microglia and neuronal cytoplasm. PGR immunoreactivity was also observed on monocytes/macrophages in leptomeningeal inflammatory infiltrates in MS brain tissue.In controls, PGR immunoreactivity was only observed in neuronal cytoplasm; no PGR immu-noreactivity was found in the WM.B) CSF PGRN ELISAThis part of the study was performed on CSF samples from the archives of the University of Turin (20 RRMS patients during clinical remission, 10 RRMS patients during clinical relapse, 10 secondary progressive MS (SPMS) patients).No significant difference was found in mean PGR concentration in the CSF between MS (mean 21.32 ng/ml ± SEM 2.14) and control patients (mean 17.15 ng/ml ± SEM 1.60).Mean PGR concentration in the CSF was significantly higher in RRMS during clinical relapse (mean 31.26 ng/ml ± SEM 3.14), and in progressive MS (mean 24.92 ng/ml ± SEM 1.69), than in RRMS during clinical remission (mean 14.56 ng/ml ± SEM 1.54) (p < 0.01).A weak but significant correlation (r = 0.579, p<0.05) was found between PGR CSF concen-tration and CSF cell count in MS patients.C) Genetic studyPGR gene variability has been analyzed in a preliminary sample of 226 patients with RRMS, from the Azienda Ospedaliero-Universitaria San Giovanni Battista of Turin and from the IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico of Milan. MS clinical course has been estimated using the Mul-tiple Sclerosis Severity Score (MSSS).Four tagging single-nucleotide polymorphisms (SNPs) covering the entire PGR sequence were chosen. In addition, rs5848, located in the untranslated region but influencing mRNA transcrip-tion, was included as well.In MS patients with disease onset <= age 25, an increased frequency of the rs4792938 CC genotype (23.8% vs. 7.2%, OR 3.99, p = 0.001) and of the rs3785817 GG genotype (16.3%

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vs. 4.3%, OR 4.27, p = 0.005) was observed, if compared to patients with disease onset after age 25.Furthermore, in patients with more aggressive disease course (MSSS >= 5) a decreased fre-quency of the rs5848 CC genotype was observed, if compared to patients with less aggressive disease course (MSSS < 5) (25.9% vs. 48.5%, OR 0.37, p = 0.004).Further analysis of the data is still ongoing.

CONCLUSIONS Here, we have demonstrated an increased expression of PGR in brain tissue in all MS cases in our series. While in normal brain tissue neurons are the main source of PGR, in MS activated microglia and macrophages appear to be the predominant cellular sources of PGR.Moreover we observed increased CSF PGR concentration in active MS patients. PGR CSF concentration is also increased in SPMS patients, probably due to increased widespread mi-croglial activation.Finally, we have shown that common genetic polimorphisms of PGR may influence age onset and clinical severity of RRMS.Production of PGR by microglia and macrophages might represent one of the mechanisms of neuroprotective inflammation in MS brains, influencing the survival of different neuronal cell po-pulations in response to noxious stimuli. Furthermore, production of PGR, and more specifically the balance between pro-/anti-inflammatory subforms of PGR, might be important in regulating inflammation in MS brain tissue.


Vercellino M, Grifoni S, Romagnolo A, Masera S, Mattioda A, Trebini C, Chiavazza C, Caligiana L, Capello E, Mancardi GL, Giobbe D, Mutani R, Giordana MT, Cavalla P. Progranulin expression in brain tissue and cerebrospinal fluid levels in multiple sclerosis. Mult Scler 2011 Oct;17(10): 1194-201

Vercellino M, Fenoglio C, Mattioda A, Romagnolo R, Matta M, De Riz M, De Matteis F, Giobbe D, Scarpini E, Galimberti D, Giordana MT, Cavalla P. Progranulin gene variability influences age of onset and clinical course of relapsing-remitting Multiple Sclerosis. Presentation at the ECTRIMS 2011 and SIN 2011 congresses


CORRELATI FUNZIONALI E STRUTTURALI DELL’ATTIVITÀ DEL NETWORK COGNITIVO IN PAZIENTI CON SM E DIVERSI FENOTIPI DI MALATTIA

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RESPONSABILE DEL PROGETTOMASSIMO FILIPPIProfessore Direttore Neuroimaging Research Unit, INSPE, Divisione di Neuroscienze, Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Milano

Partecipanti:MARIA ASSUNTA ROCCA, Assistente di ricerca in neurologia, Ospedale San RaffaelePAOLA VALSASINA, Bioingegnere, Ospedale San RaffaeleVITTORIO MARTINELLI, Direttore Unità Trials clinici, Ospedale San RaffaeleBRUNO COLOMBO, Neurologo ricercatore, Ospedale San RaffaeleMONICA FALAUTANO, Direttore Unità di Neuropsicologia, Ospedale San RaffaeleANDREA FALINI, Direttore Dipartimento di Neuroradiologia, Ospedale San RaffaeleGIANCARLO COMI, Direttore del Dipartimento di Neurologia, Ospedale San Raffaele


I disturbi cognitivi sono riportati in una percentuale variabile tra il 30 ed il 60% dei pazienti con sclerosi multipla (SM). Studi di risonanza magnetica (RM) convenzionale hanno dimostrato scarse correlazioni tra il livello di compromissione cognitiva e l’estensione delle alterazioni en-cefaliche in questi pazienti. Uno dei fattori che è stato considerato per spiegare la discrepanza tra misure di RM e misure cliniche nella malattia è la variazione interindividuale dei meccanismi di plasticità corticale. Molto di quello che conosciamo circa le funzioni cognitive in pazienti con SM deriva da studi dove è stato somministrato un compito attivo. Tuttavia, diversi studi hanno identificato la presenza di un’attività spontanea a riposo dei network cerebrali (incluso il “default mode network” [DMN]) anche in assenza di specifiche istruzioni cognitive (resting state [RS]). Usando tale approccio, alcuni studi hanno descritto una disorganizzazione funzionale del cer-vello con l’invecchiamento o in pazienti con patologie neurodegenerative e psichiatriche. Lo scopo principale di questo progetto è stato di approfondire la conoscenza dei meccanismi responsabili della sindrome da disconnessione cortico-sottocorticale nei pazienti con SM e lieve/moderata compromissione cognitiva. Il progetto si è principalmente focalizzato sull’inda-gine dei substrati funzionali e strutturali responsabili della disfunzione del lobo frontale in questi pazienti, allo scopo di valutare i correlati funzionali dell’esecuzione del compito di Stroop nei pazienti con SM, esplorare, utilizzando la RS RM funzionale (RMf), se la malattia altera l’attività funzionale intrinseca del cervello e infine stimare le correlazioni tra le alterazioni riscontrate con la RMf e la gravità del danno encefalico strutturale nei pazienti con SM a diversi stadi della malattia.

RISULTATI

Abbiamo acquisito un protocollo di RM (a 3.0 Tesla) strutturale (doppio eco, “double inversion recovery” (DIR), 3D T1 e diffusione) e funzionale (RS e compito Stroop) in 60 pazienti con SM (diversi fenotipi; valutazione sia clinica con “Expanded Disability Status Scale” (EDSS sia neu-ropsicologica) e 30 controlli sani.Nei pazienti con SM progressiva abbiamo trovato che un’alterazione della connettività funzio-nale delle regioni anteriori del DMN è tra i fattori responsabili della presenza di deficit cognitivi. Il danno strutturale di corpo calloso e cingolo è correlato alla severità del deficit cognitivo e delle alterazioni del DMN. In un secondo studio, abbiamo esplorato le modificazioni delle connes-sioni funzionali tra cervelletto e aree prefrontali in pazienti con diversi fenotipi di SM durante il compito Stroop, evidenziando che, nella SM, una modifica delle attivazioni e della connettività effettiva tra cervelletto destro e aree dei lobi fronto-parietali determina un’inefficace riorganizza-zione corticale con incremento del carico cognitivo. Infine, in un ampio gruppo di pazienti con SM a ricadute e remissioni (RR), abbiamo trovato alterazioni all’interno e tra i diversi network cerebrali, correlate con il carico lesionale e con il grado di disabilità clinica. Usando una sequenza volumetrica 3D T1 e un’analisi morfometrica, abbiamo valutato la distri-buzione regionale dell’atrofia della sostanza grigia (SG). Si è riscontrato che pattern distinti di 145


atrofia regionale della SG e di distribuzione delle lesioni sono associati alla presenza di deficit cognitivi. I confronti tra gruppi non hanno evidenziato differenze tra i pazienti con RR e deficit cognitivi e i pazienti con SM secondariamente progressiva (SP), mentre molte aree sono più atrofizzate nei pazienti con SMSP rispetto a quelli con decorso primariamente progressivo (PP). Nei pazienti con SMRR e SMSP, c’è una corrispondenza tra la localizzazione delle lesioni in specifiche strutture della sostanza bianca (SB) e della SG (vicine spazialmente o funzionalmen-te correlate), mentre nei pazienti con SMPP tale associazione non è stata trovata. Successiva-mente si è valutata la distribuzione regionale dell’atrofia della SG e SB in un ampio gruppo di pazienti con SMRR e la relazione tra tali alterazioni e sesso, reperti clinici e carico lesionale. Si è riscontrato che esistono diversi pattern di distribuzione regionale dell’atrofia con un rispar-mio della SG nelle regioni sottotentoriali. Sesso, durata di malattia e disabilità clinica alterano diversamente la distribuzione dell’atrofia regionale, mentre le lesioni giocano un ruolo modesto.Infine, si è applicata la sequenza DIR e quella in diffusione per quantificare il danno microstrut-turale di lesioni corticali e SG apparentemente normale in pazienti a diversi stadi di malattia. Abbiamo trovato che natura ed entità del danno a livello delle lesioni corticali contribuiscono nel differenziare i diversi fenotipi di malattia.

CONCLUSIONI

I disturbi cognitivi sono riportati in una percentuale variabile tra il 30 ed il 60% dei pazienti con SM. Nonostante l’elevata prevalenza e il drammatico effetto che questo sintomo ha nella vita quotidiana dei pazienti, i suoi substrati anatomici e funzionali non sono stati ancora chia-riti completamente. La nostra ricerca ha contribuito ad ottenere nuovi importanti dati circa i substrati anatomici e funzionali responsabili della presenza e della gravità del deficit cognitivo in pazienti con questa malattia. Abbiamo, inoltre, evidenziato nuovi meccanismi patogenetici responsabili dell’eterogeneità clinica dei fenotipi di malattia. Tutto questo potrebbe guidare in un prossimo futuro nuove strategie farmacologiche e riabilitative.

FUNCTIONAL AND STRUCTURAL CORRELATES OF COGNITIVE NETWORK FUNCTION IN MS PATIENTS WITH DIFFERENT DISEASE PHENOTYPES


Cognitive impairment affects 30-60% of MS patients. Although conventional MRI studies have shown that the degree of cognitive impairment in MS patients is correlated with the extent and severity of brain structural abnormalities, this correlation remains weak. The application of modern, MR-based techniques to the study of MS patients is increasing dramatically the understanding of MS pathophysiology and the mechanisms responsible for the accumulation of irreversible disability. In this context, one of the factors which has been advocated to ex-plain the well-known clinical/conventional MRI discrepancy in MS is the interindividual variation in brain plasticity. Much of what is currently known about cognitive function in MS derives from studies where a task or stimulus has been administered. However, several studies have identified spontaneous activity in functionally distinct networks (including the default model network [DMN]) in the absence of specific cognitive instructions (resting state [RS]). Using this “cognitively unbiased” approach, recent reports noted disruptions of intrinsic brain functional organization with normal aging and in patients suffering from neurodegenerative or psychiatric disorders. Against this background, the main aim of the project was to investigate cortico-subcortical disconnection mechanisms in MS patients with mild cognitive impairment, with a focus on the investigation of structural MRI and functional MRI (fMRI) substrates of frontal lobe dysfunction in these patients. To this aim, we investigated the functional correlates of Stroop performance in MS patients, we explored, using RS fMRI, whether MS affects the intrinsic brain functional activity and finally we assessed the magnitude of the correlation between cognitive-related cortical changes and the severity of macroscopic and microscopic brain tissue damage in MS patients at different stages of the disease.

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RESULTS We acquired structural (dual-echo, double inversion recovery, 3D T1-weighted and diffusion tensor [DT] MRI sequences) and functional MRI (resting state [RS] sequence and Stroop-word task) in 60 MS patients with different disease phenotypes and 30 healthy controls, using a 3.0 Tesla scanner.All patients underwent clinical evaluation, with rating of the Expanded Disability Status Scale (EDSS) score and neuropsychological assessment.In patients with progressive MS, we found that the disruption of the anterior components of the DMN is among the factors responsible for the presence of cognitive impairment (CI). Structural damage to the corpus callosum and cingulum was strictly related to the severity of cognitive impairment and DMN abnormalities. In a second step, we explored the modification of the connections between cerebellar and prefrontal areas in patients with different MS clinical phenotypes during Stroop performance and we found that MS patients experience different abnormalities of activations and effective connectivity between the right cerebellum and fronto-parietal areas, which contribute to inefficient cortical reorganization with increasing cognitive load. Finally, in a large group of patients with relapsing remitting (RR) MS, we found that fun-ctional abnormalities within and between large-scale neuronal networks occur and are related to the extent of T2 lesions and the severity of disability.Using 3D-T1 weighted sequence and voxel-based morphometry (VBM) analysis, we investiga-ted the regional distribution of gray matter (GM) atrophy in our patients and their relationship with CI, focal lesions and clinical disability. We found that distinct patterns of regional GM atrophy and lesions are associated with CI in MS patients. The between-group comparisons showed no difference between CI RRMS and secondary progressive (SP) MS patients, whi-le several areas were significantly more atrophied in SPMS vs. primary progressive (PP) MS patients. In RRMS and SPMS patients a correspondence was found between location of T2 lesions in specific WM structures and GM atrophy spatially closed or functionally linked to these structures; in PPMS such an association was not found.In a second step, we investigated the regional distribution of GM and WM atrophy in a large group of RRMS patients and their relationship with gender, clinical findings, and T2 lesions. We found that GM and WM atrophy have distinct patterns of regional distribution, with a sparing of GM infratentorial regions. Gender, disease duration and disability affected differently the topo-graphy of GM/WM atrophy, while T2 lesions played a modest role.Finally, we used double inversion recovery (DIR) and DT MRI to quantify tissue damage in cor-tical lesions (CLs) and the apparently normal cortex in patients with MS at different stages of the disease. We found that the nature and extent of CL damage contribute to distinguish the different MS clinical phenotypes.

CONCLUSIONS Cognitive impairment is described in 30-60% of patients with MS. Despite this high prevalence and the dramatic effect that this symptom have on patients’ daily life activity, its anatomical and functional substrates have not been fully elucidated yet. Our research has contributed to provide some important pieces of information regarding the functional and structural substra-tes responsible for the presence and severity of cognitive impairment in patients with MS. We have also obtained novel insights on the mechanisms responsible for the clinical heterogeneity of MS clinical phenotypes. All of this is likely to guide future pharmacological and rehabilitative strategies.


Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V., Radaelli M., Falini A, Comi G, Filippi M. Mapping regional gray and white matter atrophy in relapsing remitting multiple sclerosis. Multiple Sclerosis Journal, In press

Pagani E, Rocca MA, Preziosa P, Copetti M, Mesaros S, Colombo B, Horsfield MA, Falini A, Comi G, Lassmann H, Filippi M. Microstructural MR imaging of cortical lesions in multiple sclerosis phe-notypes. Platform presentation, 64th American Accademy of Neurology, 2012

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Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Radaelli M, Falini A, Comi G, Filippi M. Patterns of regional gray and white matter atrophy are associated to PASAT and SDMT performances in re-lapsing remitting multiple sclerosis patients. Poster, 64th American Accademy of Neurology, 2012

Valsasina P, Rocca MA, Martinelli V, Messina R, Misci P, Falini A, Comi G, Filippi M. Large-scale neuronal tetwork dysfunction in relapsing remitting multiple sclerosis. Poster, 64th American Ac-cademy of Neurology, 2012

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Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Radaelli M, Falini A, Comi G, Filippi M. Regional gray and white matter atrophy are largely unrelated in relapsing remitting multiple sclerosis. 63nd American Accademy of Neurology, 2011

Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Rossi P, Falini A, Comi G, Filippi M Voxel-wise asses-sment of white matter architecture integrity in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. 63nd American Accademy of Neurology, 2011

Pagani E, Rocca MA, Riccitelli G, Martinelli V, Radaelli M, Falini A, Comi G, Filippi M. Regional gray and white matter atrophy are largely unrelated in relapsing remitting multiple sclerosis. ISMRM, 2011

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Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Rossi P, Falini A, Comi G, Filippi M. Voxel-wise assessment of WM architecture integrity in MS patients with different clinical phenotypes. 21st Meeting of the European Neurological Society, 2011

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Riccitelli G, Rocca MA, Pagani E, Martinelli V, Rossi P, Falini A, Comi G, Filippi M. White matter architecture integrity studied with DT MRI in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis. 20th Meeting of the European Neurological Society, 2011

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Rocca MA, Valsasina P, Absinta M, Riccitelli G, Agosta F, Rossi P, Martinelli-Boneschi F, Falini A, Comi G, Filippi M Disruption of the default mode network in patients with primary progressive and secondary progressive multiple sclerosis. HSR Scientific Retreat, Stresa 2010

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IDENTIFICAZIONE DI FATTORI PROGNOSTICI CONDIZIONANTI L’ESITO A LUNGO TERMINE DELLA SCLEROSI MULTIPLA: ESTESA ANALISI DEL DATABASE DI LONDON ONTARIO

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RESPONSABILE DEL PROGETTOPAOLO MURAROClinical Reader in NeuroimmunolgyCentre of Neuroscience, Division of Experimental Medicine, Department of MedicineImperial College, Hammersmith Hospital, London (UK)

Collaboratori:ANTONIO SCALFARIGEORGE EBERS

Collaborazioni con altri gruppi:MARTIN DAUMER, SYLVIA LAWRY, Centre, Munich (GER)ANNEKE NEUHAUS, SYLVIA LAWRY, Centre, Munich (GER)


La sclerosi multipla è una malattia dal decorso altamente imprevedibile. Può presentarsi in maniera aggressiva, determinando grave disabilità entro un breve periodo, o mostrare un com-portamento benigno senza determinare importante disabilità anche dopo diversi anni. La va-riabilità del decorso clinico crea diverse problematiche nella gestione del paziente, per il quale, allo stato attuale, non è ancora possibile dare una valutazione prognostica sulla base delle osservazioni cliniche relative ai primi anni di malattia, al fine di selezionare interventi terapeutici commisurati al rischio di sviluppo di grave disabilità. Capire la storia naturale di questi specifici sottogruppi rappresenta un passo fondamentale per la futura programmazione di studi clinici. Lo scopo della nostra ricerca è stato di evidenziare fattori prognostici precoci che ci permetto-no di prevedere la prognosi a lungo termine, attraverso l’analisi del London Ontario database. Il London Ontario database include più di 1000 pazienti osservati per 28 anni, tra il 1972 e il 2000. Grazie allo studio della storia naturale della malattia e del valore prognostico di diversi fattori clinici e demografici, in particolare età e attacchi infiammatori, abbiamo cercato di co-struire e testare modelli predittivi del decorso a lungo termine, allo scopo di quantificare per ogni singolo paziente il rischio di raggiungimento di livelli di disabilità da moderati a severi come ad esempio l’uso di appoggio durante la deambulazione, l’essere costretti a letto o il decesso in tempi specifici. Ci siamo inoltre focalizzati sugli aspetti clinici potenzialmente associati ad un decorso particolarmente aggressivo della malattia con lo scopo di porre le basi per l’utilizzo più razionale in futuro di terapie immunosoppressive.

RISULTATI

Ci siamo focalizzati sul valore prognostico di attacchi infiammatori ed età, valutando i tempi di raggiungimento della fase progressiva e di alti livelli di disabilità (DSS 6 = uso di appoggio unilaterale, DSS 8 = essere ristretti a letto, DSS 10 = il decesso). Abbiamo identificato caratte-ristiche clinico-demografiche presenti nelle fasi iniziali della malattia che si associano ad un più alto rischio di diventare secondariamente progressivi (SP) e conseguentemente di accumulare disabilità. Tali informazioni permettono di selezionare sottogruppi di pazienti con alta probabilità di decorso aggressivo e che pertanto possono beneficiare di un approccio terapeutico più incisivo. Gruppi di pazienti con un alto (≥5), intermedio (3-4) e basso (1-2) numero di attacchi (esacerbazioni cliniche) durante la fase recidivante remittente (RR) hanno raggiunto alti livelli di disabilità in tempi simili, dimostrando che la frequenza delle ricadute non è correlata con la severità del decorso clinico. Tuttavia, il numero di riesacerbazioni durante i primi due anni di malattia ha un valore predittivo e può essere usato per selezionare pazienti a più alto rischio di disabilità. Ciò nonostante è improbabile che ci sia un rapporto causa-effetto, poiché anche tra coloro che hanno un’ intermedia/alta frequenza di attacchi (≥ 3) nei primi due anni di malattia, il 35% non sono mai successivamente entrati nella fase progressiva. La latenza dell’inizio della fase progressiva condiziona la probabilità di accumulo di disabilità dall’esordio ma non influen-za l’andamento della fase progressiva stessa, dimostrando che i meccanismi che portano alla

iniziale conversione a SM SP dettano i tempi del decorso clinico la cui evoluzione è peraltro uniforme. L’esordio della fase SP rappresenta pertanto uno spartiacque tra due fasi di malat-tia indipendenti tra loro. Infine abbiamo dimostrato che pazienti con esordio ad età avanzata sono a più alto rischio di entrare nella fase SP e pertanto hanno un maggior rischio di prognosi sfavorevole. Tuttavia il decorso clinico durante la fase progressiva non è influenzato dall’età di esordio né della fase RR né della fase SP. La fase progressiva, preceduta (SP) o no (decorso primariamente progressivo, PP) dalla fase RR, inizia alla stessa età media fra i pazienti, e con-duce al raggiungimento di alti livelli di disabilità alla stessa età media (RR/SP Vs PP: DSS 6: 49 Vs 48; DSS 8: 58 Vs 58; DSS 10: 78 Vs 78 anni).

CONCLUSIONI

I risultati non supportano una stretta correlazione tra attacchi infiammatori e meccanismi re-sponsabili dell’accumulo di disabilità permanente e suggeriscono altri fattori patogenetici. La frequenza delle ricadute cliniche precoci (2 anni dall’esordio) ha un valore predittivo riguardo l’evoluzione clinica. Il raggiungimento di elevati livelli di disabilità è verosimilmente legato ai meccanismi che conducono all’esordio della fase SP, probabilmente già attivi nelle fasi iniziali di malattia, che pertanto rappresentano una finestra di opportunità terapeutica. Quindi, una stratificazione in base all’età dovrebbe essere attentamente considerata nella pianificazione dei trial clinici. In conclusione, abbiamo identificato che un’alta frequenza di attacchi nei primi due anni ed una età più avanzata all’esordio sono due criteri base che possono essere impiegati per identificare gruppi di pazienti ad alto rischio di disabilità nei quali è indicato un approccio terapeutico più aggressivo.

IDENTIFICATION OF EARLY PROGNOSTIC FACTORS AFFECTING THE LONG-TERM OUTCOME IN MS: EXTENSIVE ANALYSIS OF THE LONDON ONTARIO DATABASE


Clinical severity of MS ranges from benign (no disability after 15 years of disease) to malignant forms, characterized by an aggressive course with accumulation of severe disability or death within a short time. It is particularly important that this variability is taken into account both in clinical practice and in randomised controlled studies design. A major challenge is to predict the long term clinical evolution of individual patients on the basis of observations taken during an early stage of the disease. Prognostic prediction would allow offering more intense disease-modifying therapies to those at higher risk of major disability and avoiding unnecessary drugs to those destined to have a benign course. The clinical effects of therapies may vary largely de-pending on different forms and stages of disease evolution. Clinical trials increasingly attempt to reduce the heterogeneity of responses to treatment by selecting specific subpopulations of patients. Therefore, it is important to understand the natural history of MS in these subgroups. Aim of this study was to investigate early prognostic factors predicting the long-term clinical outcome in MS by analysing the London Ontario (LO) database. This is one of the largest collection of MS data from more than 1000 patients longitudinally followed up for 28 years. Studying the natural history and the prognostic value of many demographic and clinical va-riables, particularly age and inflammatory attacks, we planned to construct and test models predicting disability. We aimed to construct an algorithm to quantify risk of individual subjects of developing a progressive course and of reaching a hard level of disability such as requiring use of a cane, becoming wheelchair-bound, bedridden and dying from MS at defined time points. We also aimed to identify clinical features predicting an aggressive behaviour of the disease, which will allow in future a more rationale use of experimental therapies.

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RESULTS We then extensively investigated the effects of (i) relapses and (ii) age on (a) latency to progres-sion and (b) time to hard outcomes. We identified early clinical features affecting the probability of and the latency to the secondary progressive (SP) phase and ultimately the attainment of hard disability outcomes. This information can help identify subgroups of patients more likely to experience a more aggressive behaviour and therefore to benefit from more aggressive therapies. We demonstrated that the total number of attacks before the onset of SP is not a reliable indicator of disease severity. Times to disability endpoints (disability status scale, DSS 6 = requiring walking aid; DSS 8 = being bedbound; DSS10 = dying from MS) were equal among groups with high (≥5), intermediate (3-4) and low (1-2) numbers of relapses during the relap-sing remitting (RR) phase. However, early relapses frequencies (during first two years of the disease) predict late outcomes and can be used for selecting patients more likely to have poor prognosis. Nevertheless, a causative association remains unlikely. Indeed, among those with ≥ 3 attacks during the first two years (“frequent early relapsers”) 35% did not even enter SP and the remaining 65% became SP and had a rapid disease course, indicating that mechanisms leading to SP MS are not well explained by inflammatory attacks alone. In contrast, the latency to SP is a strong predictor of long-term evolution, dictates the tempo of disability accumulation and accounts for the variability of disease course among patients. We demonstrated that lon-ger time to SP was associated with lower probability of developing severe disability and with longer times to endpoints from disease onset. However, the slope of the SP phase (time from SP to DSS levels) was not affected by duration of the RR phase, confirming that the onset of progression represents a watershed between two independent stages of the disease. Finally we showed that age, independent of the number of early relapses, strongly affects the proba-bility of experiencing a progressive course and is therefore an important determinant of long-term prognosis. Subjects who are older at RR onset have significantly higher risk of becoming progressive and shorter times to SP and to disability outcomes. However, disease evolution during the SP phase is not affected by age at RR onset. In addition ages at the onset of SP phase and of primary progressive (PP) disease do not influence times from onset of progres-sion to disability endpoints. The progressive course, preceded or not by the RR phase, starts at remarkably similar ages and its evolution, homogenous among progressive subtypes, leads to the attainment of moderate to severe disability milestones at the same median ages in RR/SP and PP patients (DSS 6: 49 Vs 48 years; DSS 8: 58 Vs 58 years; DSS 10: 78 Vs 78 years, respectively.

CONCLUSIONS Our results do not support a strong correlation between inflammatory attacks and mecha-nisms driving disability accumulation, suggesting a role of other pathogenetic mechanisms. Early relapse frequency (2 years from onset) has some predictive value towards later evolution of disability. Attainment of severe disability is induced by mechanisms tied to the onset of SP and probably already active during the early RR phase, representing the only window for thera-peutic opportunity. The onset of progression, the key determinant of prognosis, should be the target of future therapies. Given the strong effect of age on the conversion to the SP phase, attention should be paid to stratification by age in randomized clinical trials. Therefore, high early (≤ 2 years) relapse frequency and older age at RR onset can be used for selecting groups of patients at higher risk of entering the SP phase for whom a more aggressive therapeutic approach is warranted.


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Scalfari A, Neuhaus A, Daumer M, Muraro PA and Ebers G. The onset of the SP phase is the key determinant of long term disease evolution. ECTRIMS 2011, Amsterdam

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PROGETTI DI RICERCAE BORSE DI STUDIOFINANZIATI DALLA FISM 2011

BANDO RICERCA FISM2011


CRISTINA AGRESTIIstituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, RomaStudio del ruolo dei recettori del TNF durante i processi di demielinizzazione e rimielinizzazioneProgetto di ricerca E 117.600,00 | 2 anni

FRANCESCA ALOISIIstituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, RomaAnalisi dell’infezione con virus di Esptein-Barr e della risposta immunitaria nel fluido cerebrospinale e nel sangue di pazienti con sclerosi multipla mediante tecniche altamente sensibili di PCRProgetto di ricerca E 97.000,00 | 1 anno

VINCENZO BARNABASapienza Università di Roma, Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche, RomaImmuno-attivazione cronica nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 100.000,00 | 1 anno

LUCA BATTISTINIFondazione Santa Lucia, Neuroscienze Sperimentali, RomaRuolo delle cellule MAIT nella sclerosi multipla: come la flora intestinale influenza le risposte autoimmuniProgetto di ricerca E 50.000,00 | 1 anno

PAOLA CAIAFASapienza Università di Roma, Facoltà di Farmacia e Medicina, Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, RomaRiprogrammazione epigenetica nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 40.000,00 | 1 anno

PAOLO CALABRESIUniversità di Perugia, Clinica Neurologica, Laboratori di Neurologia SperimentaleDipartimento Specialità Medico-Chirurgiche e Sanità Pubblica, Ospedale S Maria della Misericordia, PerugiaUno studio elettrofisiologico dei meccanismi di alterata plasticità sinaptica in modelli sperimentali di sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 35.000,00 | 1 anno

ANNALISA CHIOCCHETTIIRCAD & Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Dipartimento Scienze Mediche, NovaraRuolo di Osteopontin a degli anticorpi anti-Osteopontina nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 70.000,00 | 3 anni

SANDRA D’ALFONSOUniversità degli Studi del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Dipartimento di Scienze Mediche, NovaraStudio delle alterazioni nelle risposte antivirali dell’immunità innata in pazienti con SMProgetto di ricerca E 100.000,00 | 1 anno

FRANCESCA GILLIIstituto di Neuroscienze della Fondazione Cavalieri Ottolenghi, Unità di Neurobiologia Clinica, Orbassano, Torino

La deregolazione di microRNAs e dei loro mRNAs bersaglio causa un difetto nel circuito di retroazione negativa che sopprime l’infiammazione in pazienti con sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 80.000,00 | 1 anno

FRANCESCA GILLIIstituto di Neuroscienze della Fondazione Cavalieri Ottolenghi, Unità di Neurobiologia Clinica, Orbassano, TorinoLa deregolazione di microRNAs e dei loro mRNAs bersaglio causa un difetto nel circuito di retroazione negativa che sopprime l’infiammazione in pazienti con sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 80.000,00 | 1 anno

BRUNO GRANUniversity of Nottingham, Division of Clinical Neurology, Nottingham (UK)Modulazione dell’ equilibrio tra cellule T regolatrici e T helper 17 da parte di recettori Toll-like: implicazioni per la sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 28.000,00 | 2 anno

ROBERTA MAGLIOZZIIstituto Superiore di Sanità, Biologia Cellulare e Neuroscienze, RomaStudio neuropatologico e molecolare mirato a comprendere la relazione tra processo infiammatorio nelle meningi e danno cerebrale corticale nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno

MARA MARONGIUCNR- Consiglio Nazionale delle Ricerche, IRGB- Istituto di Ricerca Genetica e BiomedicaCittadella Universitaria Monserrato, Monserrato, CagliariStudio del meccanismo funzionale alla base dell’associazione di CBLB con la sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno

STEFANO MORARAConsiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto di Neuroscienze, MilanoRuolo protettivo di Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) nella patogenesi dell’EAEProgetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni

FRANCESCO NOVELLIUniversità di Torino Dipartimento Medicina e Oncologia Sperimentale, Centro Ricerche Medicina Sperimentale, AOU San Giovanni Battista, TorinoRegolazione interferone-dipendente dei linfociti Th17 e Th22 nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 40.000,00 | 2 anni

STEFANO PREVITALIFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, INSPE, Divisione di Neuroscienze, MilanoRuolo di COP5/Jab1 nella mielinizzazione e nella rimielinizzazione del Sistema Nervoso Centrale (CNS)Progetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni

MARCO SALVETTISapienza Università di Roma, Neurologia e Centro Neurologico Terapie SperimentaliDipartimento di Neuroscienze, Salute Mentale e Organi di Senso, RomaCaratterizzazione dei genoptipi del virus di Epstein-Barr nella sclerosi multipla attraverso approcci di sequenziamento massivoProgetto di ricerca E 150.000,00 | 1 anno

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PROGETTI DI RICERCA E BORSE DI STUDIO FINANZIATI DALLA FISM 2011

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ANTONIO UCCELLIUniversità di Genova, Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, GenovaStudio di un modello murino transgenico per la caratterizzazione del proteoglicano NG2/CSPG4 nella patogenesi della sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni

FLAVIA VALTORTAFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Divisione di Neuroscienze, Laboratorio di Neuropsicofarmacologia Sperimentale, MilanoRuolo delle citochine pro- e anti-infiammatorie nella modulazione dell’attività e della composizione presinaptica: nuove prospettive nella ricerca sulla sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno

LAURA BERGAMASCHIDuke University - Medical Center, Center for Human Genetics, Durham, NCAnalisi molecolare dell”espressione allele specifica di IL-7Ralpha e il suo effetto sul segnale mediato da IL-7 in cellule: mDC, CD4+ e CD8+ isolate da pazienti con sclerosi multipla e controlli saniProgetto di ricerca E 37.000,00 | 1 anno

GIUSEPPE CHIAPPETTAIstituto Superiore di Sanità Reparto di Malattie infiammatorie e demielinizzanti del sistema nervoso, Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, RomaRicerca di interazioni patogeneticamente rilevanti tra EBV e il retrovirus endogeno della famiglia W MSRV nel cervello con sclerosi multiplaBorsa di addestramento E 22.000,00 | 1 anno

DILETTA DI MITRIIRCCS Fondazione Santa Lucia Unità di Neuroimmunologia, RomaRuolo svolto dall’immunosenescenza nell’insorgenza e nella progressione della sclerosi multiplaBorsa di Ricerca Senior E 64.000,00 | 1 anno

ANNA FALCOFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Istituto Scientifico Divisione di Neuroscienze, MilanoRegolazione degli interneuroni cerebrali e spinali da parte delle GTPasi RacBorsa di addestramento E 37.000,00 | 2 anni

SILVIA MUSIOIRCCS Istituto Neurologico C.Besta, Immunologia e Patologia Muscolare, MilanoIl ruolo dei basofili nella encefalite autoimmune sperimentale, un modello animale di sclerosi multiplaBorsa di Ricerca E 52.000,00 | 1 anno

JONATHAN VINETDepartment of Neuroscience, section Medical Physiology University Medical Center Groningen, Groningen, The NetherlandsCaratterizzazione di un fenotipo microgliale favorevole alla rimielinizzazioneBorsa di ricerca E 55.000,00 | 1 anno


MARTA BASSIUniversità degli Studi di Milano, Dipartimento di Scienze Cliniche, MilanoIl sistema della cura: promozione del benessere tra persone con sclerosi multipla, caregiver ed operatori sanitariProgetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno

MARCO BOVEUniversità degli Studi di Genova, Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Fisiologia Umana, GenovaL’impatto della riabilitazione motoria e cognitiva sulle proprietà dinamiche della struttura cerebrale: verso la personalizzazione di interventi terapeutici in pazienti affetti da sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 146.000,00 | 1 anno

FLAVIA MATTIOLISpedali Civili di Brescia, UO Riabilitazione Specialistica, BresciaL’efficacia della stimolazione tramite tDCS (transcranial Direct Current Stimulation) nella riabilitazione cognitiva della sclerosi multipla: studio clinico controllatoProgetto di ricerca E 50.000,00 | 1 anno

FRANCA TECCHIOConsiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), ISTC, LET’S, Dip. di Neuroscienze Ospedale Fatebenefratelli, RomaAlleviare la Fatica nella sclerosi multipla mediante stimolazione transcranica in corrente continua (tDCS): è possibile differenziare target di stimolazione entro le cortecce primarie sensorimotorie?Progetto di ricerca E 24.000,00 | 2 anni

VALENTINA TOMASSINIUniversity of Oxford Nuffield Department of Clinical Neurosciences (FMRIB Centre and Clinical Neurology), FMRIB Centre, John Radcliffe Hospital, Headington, Oxford Cardiff (UK)Valutazione delle capacità di immaginazione motoria e degli effetti della pratica mentale di un compito motorio in pazienti affetti da sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni

CARLO TROMPETTOIstituto di Neurologia, Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, Università di Genova, GenovaEffetto delle onde d’urto sulla rigidità della caviglia in pazienti con sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 41.300,00 | 1 anno

VALIDAZIONE DI NUOVI TARGET/PATHWAYS

LORETTA TUOSTOSapienza Università di Roma Dipartimento di Biologia e Biotecnologie Charles Darwin, RomaCaratterizzazione delle vie di segnalazione del CD28 come bersagli terapeutici nella regolazione della tolleranza immunologica nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 100.000,00 | 1 anno

PASQUALE ANNUNZIATAUniversità degli Studi di Siena, Dipartimento di Scienze Neurologiche, Neurochirurgiche e del Comportameno, Siena

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Studio degli effetti immunomodulatori di un nuovo cannabinoide agonista selettivo per il recettore CB2 su cellule immunocompetenti nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 40.000,00 | 2 anni

FRANCESCO CUCCAIstituto di Ricerca Genetica e Biomedica (IRGB) of CNR, Dipartimento diBiomedicina del CNRIRGB, Cittadella Universitaria di Monserrato, Monserrato, CagliariApproccio razionale per la ricerca di composti per la cura della sclerosi multipla basato sull’analisi dei target biologici individuati dagli studi di associazione sull’intero genoma in SardegnaProgetto di ricerca E 100.000,00 | 1 anno

ROBERTA DE SIMONEDipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, Istituto Superiore di Sanità, RomaI mitocondri come bersagli e mediatori degli effetti benefici degli agonisti PPARg nella sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 61.000,00 | 2 anni

MASSIMO DEGANOFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor Divisione di Immunologia, Trapianti e Malattie Infettive, MilanoComprendere il meccanismo ed aumentare l’efficacia del composto FTY720 (Fingolimod) nella terapia della sclerosi multipla tramite un approccio di biologia strutturaleProgetto di ricerca E 70.000,00 | 1 anno

LETIZIA LEOCANIIRCCS university Hospital San Raffaele, Neurological Dep.t; INSPE-Experimental Neurophysiology, MilanoStimolazione cerebrale transcranica a corrente diretta come terapia immunomodulante nella SM: studio pilota in modelli muriniProgetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni

ROSETTA PEDOTTINeurological Institute Foundation IRCCS Carlo Besta, Neuroimmunology and Muscolar Pathology Unit, MilanoIl sistema delle prokineticine nelle malattie demielinizzanti autoimmuni del sistema nervoso centrale: meccanismi patogenetici e possibili nuovi bersagli di terapia per la sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni

PAOLA TIRASSAConsiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto Biologia Cellulare & Neurobiologia, RomaIl nerve growth Factor dato in forma di collirio in un modello animale di sclerosi multipla: uno studio prospettico sul trattamento durante le fasi precoci della malattiaProgetto di ricerca E 30.000,00 | 2 anni


LAURA BONZANOUniversità degli Studi di Genova, DINOG - Dipartimento di Neuroscienze, Oftalmologia e Genetica, GenovaPerformance motoria della mano come nuovo endpoint clinico quantitativo nella SM: valutazione longitudinale su pazienti CIS e correlazione con accumulo di disabilità e integrità tissutale alla RMProgetto di ricerca E 50.400,00 | 1 anno

ANDREA COSSARIZZAUniversità di Modena e Reggio Emilia, Dipartimento di Scienze Biomediche Sezione di Patologia Generale, ModenaPolifunzionalità delle cellule iNKT periferiche come marcatore immunologico delle differenti forme di sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno

MASSIMO FILIPPIFondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Neuroimaging Research Unit, INSPEDivisione di Neuroscienze, MilanoDefinizione della rete di connettività strutturale e funzionale nella sclerosi multipla tramite l’applicazione dell’approccio “graph theory”Progetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno

PASQUINA MARZOLAUniversità di Verona, Dipartimento di Informatica, VeronaImaging funzionale nello studio della plasticità neuronale in un modello sperimentale di sclerosi multipla su rattoProgetto di ricerca E 50.000,00 | 1 anno

FRANCA DERIUUniversità di Sassari, Dipartimento di Scienze Biomediche, Lab di Fisiologia e Bioingegneria dell’Uomo, SassariStudio neurofisiologico, neuroradiologico e clinico del tronco encefalico in pazienti con sclerosi multiplaProgetto di ricerca E 30.000,00 | 1 anno

MORENA MARTUCCICharitè Medical University, Institute of Biochemistry, Berlin (Germany)Identificazione di marcatori infiammatori e dei relativi meccanismi specific per la sclerosi multiplaBorsa di addestramento E 58.000,00 | 2 anni

PROGETTI SPECIALI 2011

MIELINIZZAZIONE

CARLA TAVEGGIAIstituto di Neurologia Sperimentale, Ospedale San Raffaele - MilanoLaboratorio Interazioni Axo-Gliali Progetto Speciale E 240.000,00 | 3 anni

NUOVI TRATTAMENTI SINTOMATICI

DIEGO CENTONZEFondazione Santa Lucia IRCCS e Università di Tor Vergata, Clinica Neurologica, Dipartimento di Neuroscienze, RomaSymptomatic treatment through central and peripheral neurostimulation procedures for people with Multiple SclerosisProgetto Speciale E 382.000,00 | 3 anni



GIANLUCA MENICHETTIFondazione Cavalieri Ottolenghi Istituto di Neuroscienze Dipartimento di Neuroscienze, Sezione di Fisiologia, Università di Torino, TorinoEffetto dell’interazione oligodendrocita-assone sulla regolazione delle propietà intrinsiche di crescita assonale e maturazione oligodendrocitariaBorsa di ricerca E 36.000,00 | 2 anni

PAOLO GIANNETTI Imperial College London Multiple Sclerosis Trial Collaboration, London UKIl ruolo della microglia attivata nella sclerosi multipla e nelle sindromi clinicamente isolate: studio di imaging immunologicoBorsa di addestramento E 50.000,00 | 2 anni

PAOLO CALABRESI Università degli Studi di Perugia, Clinica Neurologica, Dipartimento Specialità Medico-Chirurgiche, PerugiaUno studio elettrofisiologico sulla plasticità sinaptica in modelli sperimentali di sclerosi multiplaE 30.000,00 | 1 anno

ANGELA BONONI Università di Ferrara Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Sezione di Patologia Generale, FerraraRuolo di proteine mitocondriali nella patogenesi della sclerosi multiplaBorsa di ricerca E 50.000,00 | 2 anni

SIMONE PATERGNANI Università di Ferrara, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Sezione di Patologia Generale, FerraraAnalisi di parametri mitocondriali in oligodendrociti durante condizioni pro-infiammatorieBorsa di addestramento E 37.000,00 | 2 anni

MARZIA PERLUIGI Sapienza Università di Roma, Facoltà di Medicina, dipartimento di Scienze Biochimiche, RomaRuolo dello stress ossidativo nella sclerosi multipla. Un’analisi proteomica e red-ox proteomicaE 25.000,00 | 1 anno

FRANCESCO RIA Università Cattolica, Istituto di Patologia Generale, RomaMeccanismi molecolari del trasferimento delle informazioni ambientali alle cellule T nella patogenesi della EAE: ruolo del TLR2E 120.000,00 | 2 anni

GIULIO DISANTO University of Oxford, Department of Neurology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Prof. Ebers group, Oxford UKCaratterizzazione funzionale delle varianti dei geni KIF coinvolti nella patogenesi della sclerosi multiplaBorsa di ricerca E 20.700,00 | 3 anni

SIMONA PERGA AOU S. Luigi Gonzaga, Centro di Riferimento Regionale Sclerosi Multipla, Orbassano, TorinoAnalisi delle variazioni di singoli nucleotidi polimorfi in TNFAIP3 associati alla sclerosi multiplaE 40.000,00 | 2 anni

PAOLA COSSU Università degli Studi di Sassari Dipartimento di Neuroscienze e Scienze Materno-Infantili, Sezione Clinica Neurologica, SassariStudio della via metabolica della vitamina D e suo possibile ruolo nella suscettibilità della popolazione Sarda alla sclerosi multiplaBorsa di ricerca E 49.000,00 | 2 anni

CHIARA FRESIA Università degli Studi di Genova, Dipartimento di Medicina Sperimentale (DIMES), Sezione Biochimica, GenovaRuolo dell’acido abscissico nella sclerosi multipla: studio dei livelli in vivo nei pazienti e degli effetti in vitro su oligodendrociti e neuroniBorsa di ricerca E 50.000,00 | 2 anni

MATTEO COEN University of Geneva, Faculty of Medicine Department of Pathology and Immunology, Geneva (Switzerland)Caratterizzazione della parete venosa nella sclerosi multiplaBorsa di addestramento E 50.000,00 | 2 anni

COSIMA BALDARI Università di Siena, Dipartimento di Biologia Evolutiva, SienaLa proteina adattatrice Rai in differenziamento, attività e chemiotassi dei linfociti Th17 e nella patogenesi della sclerosi multiplaE 100.000,00 | 2 anni

ANTONIO BERTOLOTTO Azienda Ospedaliero Universitaria (AOU) S. Luigi Gonzaga SCDO Neurologia 2 - Centro di riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM),Orbassano, TorinoCorrelazione tra neurodegenerazione e infiammazione nella sclerosi multipla: NR4A2 come modulatore di infiammazioneE 30.000,00 | 1 anno

GABRIELA CONSTANTIN Università degli Studi di Verona, Dipartimento di Patologia, VeronaRuolo della mucina e immunoglobulina TIM-1 nella migrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale infiammatoE 50.000,00 | 1 anno

ELISABETTA VOLPE Fondazione Santa Lucia, Unità di Neuroimmunologia, RomaMeccanismi molecolari coinvolti nella regolazione dell’apoptosi di cellule Th17 nella sclerosi multiplaE 30.000,00 | 1 anno

ANTONINA DOLEI Universita di Sassari, Centro di Eccellenza per lo sviluppo della ricerca biotecnologica e per lo studio della biodiversità della Sardegna e dell’area mediterranea, Sassari

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Studio del retrovirus associato alla sclerosi multipla (MSRV)/HERV-W come marcatore prognostico di progressione e del suo contributo alla patogenesiE 110.000,00 | 2 anni


DOMENICO RESTIVO Unità Operativa di Neurologia, Ospedale Nuovo Garibaldi, CataniaValutazione del trattamento della disfagia associata a sclerosi multipla, con stimolazione elettrica periferica del faringe. Studio pilotaE 20.000,00 | 1 anno

NINO BASAGLIA Azienda Ospedaliero-Universitaria di Ferrara UO Medicina Riabilitativa, Dipartimento di Neuroscienze/Riabilitazione, FerraraGli effetti della terapia robotica del cammino sulla capacità deambulatoria e sull’attivazione delle unità motorie in soggetti con sclerosi multipla. Uno studio randomizzato controllatoE 20.000,00 | 1 anno

ANTONIO CERASA Istituto di Scienze Neurologiche-CNR, Unità di Ricerca Neuroimmagini, Germaneto, CatanzaroI correlati di neuroimmagine della riabilitazione cognitiva nei pazienti con sclerosi multipla con sintomi cerebellariE 20.000,00 | 1 anno

FRANCA TECCHIO Consiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto di Scienze e Tecnologie della Cognizione, RomaAlleviare la Fatica nella sclerosi multipla: un intervento con stimolazione transcranica in corrente continua (tDCS)E 30.000,00 | 1 anno

GRAZIELLA FILIPPINI Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta, Unità Neuroepidemiologia, MilanoIntegrare le esperienze e le preferenze dei pazienti con sclerosi multipla con i risultati della ricerca scientifica per sviluppare informazioni sulla salute utili per decisioni informate e condiviseE 110.680,00 | 1 anno

ALESSANDRA SOLARI Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Unità di Neuroepidemiologia, MilanoPreferenze di ruolo, conoscenza del rischio e decision-making nelle persone con sclerosi multipla (AutoMS)E 130.680,00 | 2 anni

NICOLA DE STEFANO Università degli Studi di Siena, Dipartimento di Scienze Neurologiche, Neurochirurgiche e del Comportamento, SienaModifiche nell’arco di 10 anni della sostanza bianca e grigia cerebrale in pazienti con sclerosi multipla in rapporto a disabilità fisica e disfunzione cognitivaE 100.000,00 | 2 anni

PAOLO RICCIO Università della Basilicata, Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, PotenzaLe basi molecolari per un intervento nutrizionale nella sclerosi multiplaE 60.000,00 | 2 anni

PATRIZIA PANTANO Sapienza Università di Roma, Dipartimento di Scienze Neurologiche, RomaPlasticità strutturale in pazienti con SM e atassia: variazioni longitudinali della microarchitettura della sostanza bianca associate con il training propriocettivoE 30.000,00 | 1 anno


MARIA PIA ABBRACCHIO Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Scienze Farmacologiche, Laboratorio di Famacologia Cellulare e Molecolare della Trasmissione Purinergica, MilanoStrategie rimielinizzanti innovative per la sclerosi multipla: focus su GPR17, nuovo recettore coinvolto nel differenziamento oligodendrocitarioProgetto di ricerca E 100.000,00 | 2 anni

OVIDIO BUSSOLATI Università degli Studi di Parma Dipartimento di Medicina Sperimentale, ParmaL’induzione dei trasportatori per il glutamato EAAT da parte dei retinoidi: un approccio per la prevenzione del danno eccitotossico degli oligodendrociti e dei loro precursoriE 30.000,00 | 1 anno

MARILENA PALMISANO Fondazione San Raffaele del Monte Tabor Dipartimento di Genetica e Biologia CellulareLaboratorio di Neuro Glia, MilanoRuolo delle MAP chinasi p38 nella mielinizzazioneBorsa di addestramento E 50.000,00 | 2 anni

ALESSANDRA BOLINO Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, INSPE-Division of Neuroscience, MilanoUn possibile ruolo per la chinesina kif13B nella mielinizzazione e rimielinizzazione del sistema nervoso centraleE 30.000,00 | 1 anno

MAURO MACCARRONE Università degli Studi di Teramo, Dipartimento di Scienze Biomediche Comparate, TeramoRuolo del sistema endocannabinoide nel processo neurodegenerativo della sclerosi multipla sperimentaleE 130.000,00 | 2 anni

IVAN DE CURTIS Università Vita-Salute San Raffaele, Divisione di Neuroscienze, Laboratorio di Adesione cellulare, MilanoRegolazione degli interneuroni GABAergici da parte delle GTPasi Rac: implicazioni per la sclerosi multiplaE 30.000,00 | 1 anno

CARLO AVOLIO Università degli Studi di Foggia, Sezione di Clinica delle Malattie del Sistema NervosoDipartimento di Scienze Mediche e del Lavoro, Foggia

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Recettore purinergico P2X7 su monociti di pazienti con sclerosi multipla ed effetti degli attuali trattamenti immunomodulanti per la malattiaE 30.000,00 | 1 anno

FRANCESCA FALLARINO Università degli Studi di Perugia, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche - Sezione di Farmacologia, PerugiaInduzione di immunità protettiva in un modello murino sperimentale di sclerosi multipla mediante agonisti dei recettori TLR7 e TLR9E 30.000,00 | 1 anno

ROBERTO FURLAN Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Divisione di Neuroscienze, Istituto di Neurologia Sperimentale, Unità di Neuroimmunologia Clinica, MilanoIL-27 e IL 35 nella encefalomielite autoimmune sperimentale: un affare di famigliaE 120.000,00 | 2 anni

GIAN CARLO AVANZI Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale Laboratorio di Medicina Interna e Immunologia Clinica, NovaraIl ruolo di Gas6 e dei suoi recettori nella sclerosi multipla: studio clinico e biologicoE 30.000,00 | 1 anno

SIMONA CASAZZA Università degli Studi di Genova Dipartimento di Neurologia, Oftalmologia e Genetica, GenovaLe cellule mesenchimali staminali influenzano l’ambiente microgliale? Implicazioni per il trattamento della sclerosi multiplaBorsa di ricerca senior E 64.000,00 | 2 anni

LAURA LOVATO Università degli Studi di Genova Dipartimento di Neuroscienze Oftalmologia e Genetica, GenovaIdentificazione mediante marcatura isotopica di proteine coivolte nell’azione immunomodulante e neuroprotettiva della cellule staminali mesenchimaliBorsa di addestramento E 64.000,00 | 2 anni

MIRIAM MATTOSCIO Imperial College London Centre for Neuroscience, Division of Experimental Medicine, London UKMobilizzazione di cellule staminali ematopoietiche in pazienti affetti da sclerosi multipla in terapia con anticorpo monoclonale anti alfa-4 integrina: rilevanza funzionale e possibili applicazioniBorsa di addestramento E 50.000,00 | 2 anni

PAOLO MURARO Imperial College London Division of Experimental Medicine, Centre for Neuroscience, London UKRilevanza funzionale della mobilizzazione di cellule staminali ematopoietiche a seguito di trattamento con anticorpo contro integrina alpha4 in pazienti con sclerosi multiplaE 67.000,00 | 2 anni

STEFANO PLUCHINO Cambridge Centre for Brain Repair, Department of Clinical Neurosciences, Cambridge UK

RNA non codificanti e plasticità terapeutica delle cellule staminali neuraliE 105.000,00 | 3 anni

RICCARDO SACCARDI Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi, Firenze, SODc Ematologia, Dipartimento di Area Critica Medico Chirurgica, Università di Firenze, FirenzeValutazione immunologica del midollo osseo in pazienti affetti da sclerosi multipla severa sottoposti ad autotrapianto di cellule staminali ematopoieticheE 184.000,00 | 2 anni

ALESSIO NENCIONI Università degli Studi di Genova Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche, GenovaFK866 e fluridone: nuovi farmaci NAD-correlati contro la sclerosi multipla?E 30.000,00 | 1 anno

ANNALISA CHIOCCHETTI Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Dipartimento di Scienze Mediche, NovaraMappatura funzionale dell’attività di Osteopontina nell’encefalomielite autoimmune sperimentale e nella sclerosi multiplaE 30.000,00 | 1 anno

KATIA MANGANO Università degli Studi di Catania, Dipartimento di Scienze Biomediche, CataniaTrattamento epigenetico con il composto ipometilante 5-aza-2-deossicitidina in modelli animali di sclerosi multiplaBorsa di ricerca E 48.000,00 | 2 anni

ROBERTO COSIMO MELCANGI Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Endocrinologia, Fisiopatologia e Biologia Applicata (DEFIB), MilanoValutazione degli effetti protettivi degli steroidi neuroattivi nel modello della encefalomielite autoimmune sperimentaleBorsa di ricerca E 30.000,00 | 1 anno

MARIA BEATRICE PASSANI Università di Firenze, Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica, FirenzePotenziali terapeutici di antagonisti del recettore istaminergico H4 nel trattamento di neuropatologie autoimmuniE 20.000,00 | 1 anno


MASSIMO FILIPPI Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, Unità di Neuroimaging Quantitativo, Istituto di Neurologia Sperimentale, Divisione di Neuroscienze, MilanoDefinizione delle misure RM predittive dell’accumulo di disabilità e compromissione cognitiva a lungo termine in pazienti con SM e un esordio a ricadute della malattia: studio longitudinale a 13 anniProgetto di ricerca E 60.000,00 | 1 anno

VITTORIO MARTINELLI Instituto Scientifico San Raffaele, Dipartimento di Neurologia, Milano

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Caratterizzazione di profili di espressione di geni e di microRNA, da cellule di sangue perifierico di pazienti affetti da sclerosi multiplaE 60.000,00 | 2 anni

DAMIANA PIERAGOSTINO Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara, Dipartimento di Scienze Biomediche, labo-ratori del Ce.S.I. Centro Studi sull’Invecchiamento, Fondazione universitaria, ChietiStrategie di Proteomica nella sclerosi multipla: studi strutturali e funzionali delle isoforme ossidate della transtiretina, un possibile biomarcatore di malattiaBorsa di ricerca E 48.000,00 | 2 anni

CLAUDIA VERDERIO Istituto CNR di Neuroscienze - Milano, Dipartimento di Farmacologia Medica, MilanoMicrovescicole microgliali nel liquido cerebrospinale: un potenziale marcatore nella sclerosi multiplaBorsa di ricerca E 30.000,00 | 1 anno


CCSVI

GIOVANNI MALFERRARI Dipartimento Neuromotorio; S.C. Neurologia; S.S. Patologia Cerebrovascolare Arcispedale Santa Maria Nuova, Reggio EmiliaConfronto fra studio neurosonologico con valutazione in real time (Virtual Navigator) e RMN nell’analisi dell’emodinamica venosa cerebrale in pazienti con SM e controlliProgetto Speciale E 99.850,00 | 1 anno

SALUTE E QUALITÀ DELLA VITA

ALESSANDRA SOLARI Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Unità di Neuroepidemiologia, MilanoLa versione italiana del “Motherhood Choice”: un ausilio decisionale sulla maternità per le donne con SMProgetto Speciale E 48.000,00 | 1 anno

SALUTE E QUALITÀ DELLA VITA

ANDREA GIORDANO Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Unità di Neuroepidemiologia, MilanoImpiego del supplemento informativo “Sapere Migliora” per i pazienti con SM di nuova diagnosi nella pratica clinica corrente (SIMS-Practice)Progetto Speciale E 43.500,00 | 1 anno



LUCIANA GIARDINODiaprtimento Morfofisiologia Veterinaria e Produzioni Animali (DIMORFIPA) Università di Bologna, Ozzano Emilia, BolognaInsuccesso della rimielinizzazione in sclerosi multipla: un caso di ipotiroidismo tissutale indotto dall’infiammazione?E 70.000,00 | 2 anni

LUISA BERNARDINELLI Dipartimento di Scienze Sanitarie Applicate e Psicocomportamentali Università degli Studi di PaviaRicerca di variazioni di sequenza nella regione HLA di classe I associate alla SM attraverso un approccio basato sul risequenziamento di pool di DNAE 140.000,00 | 2 anni

LUCIA CORRADO Dipartimento di Scienze Mediche, Laboratorio di Genetica Umana Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, NovaraRicerca di variazioni di sequenza nella regione HLA di classe I associate alla SM attraverso un approccio basato sul risequenziamento di pool di DNABorsa di ricerca E 44.000,00 | 2 anni

ROBERTA RIGOLIO Dipartimento di Neuroscienze e Tecnologie Biomediche Università di Milano-Bicocca, MonzaStudio pilota per determinare il contributo dei neutrofili nello sviluppo di malattia in due modelli animali per la sclerosi multipla che mimano la forma acuta e recidivante-remittente di malattiaE 25.000,00 | 1 anno

LEONARDO ANTONIO SECHI Dipartimento di Scienze Biomediche Università di Sassari Associazione fra geni e ambiente nella sclerosi multipla E 25.000,00 | 1 anno

GIULIETTA VENTURI Dipartimento del Farmaco Reparto Farmaci Antitumorali Istituto Superiore di Sanità, RomaExosomi, virus di Epstein-Barr e sclerosi multipla: ruolo potenziale nella Epidemiologia e Ezioatogenesi e come biomarcatori per il monitoraggio clinico della malattia E 25.000,00 | 1 anno

LUCIA MORI Department of Biomedicine, University Hospital Basel, Basel, SwitzerlandTopi CD1-transgenici come nuovo modello sperimentale per lo studio della SME 30.000,00 | 1 anno

ANNA PAOLA BATOCCHI Dipartimento di Neuroscienze Istituto di Neurologia Università Cattolica del Sacro Cuore, RomaSottopopolazioni di linfociti T CD8 effettrici e della memoria e decorso clinico nella sclerosi multipla NeuroimmunologiaE 70.000,00 | 2 anni

FRANCESCO CECCONI Dipartimento di Neuroscienze Sperimentali IRCCS Fondazione Santa Lucia, RomaRuolo dell’autofagia nella regolazione delle cellule T associata alla sclerosi multiplaE 70.000,00 | 2 anni

ELIANA MARINA COCCIA Dipartimento di Malattie infettive, parassitarie ed immuno-mediate Istituto Superiore di Sanità, RomaCellule dendritiche plasmacitoidi: ruolo nel controllo della risposta immunitaria in pazienti trattati con IFN-ßBorsa di ricerca E 44.000,00 | 2 anni

CHIARA FRESIA Università degli Studi di Genova, Dipartimento di Medicina Sperimentale (DIMES), Sezione Biochimica, GenovaRuolo dell’acido abscissico nella sclerosi multipla: studio dei livelli in vivo nei pazienti e degli effetti in vitro su oligodendrociti e neuroniBorsa di ricerca E 50.000,00 | 2 anni

ALICE LARONI Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA USARuolo della popolazione cellulare natural killer CD56bright nella Epidemiologia e Ezioatogenesi della sclerosi multiplaBorsa di ricerca E 44.000,00 | 2 anni

GRAZIA MARIA LIUZZI Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare e Biologia Molecolare Università degli Studi di Bari “Ernesto Quagliariello”Analisi del network proteolitico nella sclerosi multipla: una breccia significativa verso la comprensione dei meccanismi patogenetici e la valutazione laboratoristica dell’efficacia della terapiaE 50.000,00 | 2 anni

LUCA MUZIO Dipartimento Neuroscienze, INSpe HSR Fondazione San Raffaele del Monte Tabor, MilanoStudio dei meccanismi molecolari del danno neuronale nelle malattie neuro-infiammatorie E 100.000,00 | 2 anni

FRANCESCO NOVELLI Dipartimento di Medicina e Oncologia Sperimentale Università di Torino, Centro Ricerche Medicina Sperimentale (CERMS) Ospedale San Giovanni Battista, TorinoCaratterizzazione funzionale dei linfociti T helper (Th)17 nella sclerosi multipla ed analisi dei meccanismi della loro inattivazione E 80.000,00 | 2 anni

SIMONA ROLLA Dipartimento di Oncologia e Medicina Sperimentale Università degli Studi di TorinoCaratterizzazione del repertorio TCR dei linfociti Th17 autoreattivi nella sclerosi multipla Borsa di ricerca E 40.000,00 | 2 anni

ADA MARIA TATA Università di Roma La Sapienza Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo, RomaAcetilcolina di derivazione non neuronale nella sclerosi multipla: possibile duplice ruolo

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Studio longitudinale sul funzionamento neuropsicologico in pazienti con sclerosi multipla in confronto con la popolazione generale E 100.000,00 | 3 anni


MARIA CRISTINA GAUZZI Biologia Cellulare e Neuroscienze Istituto Superiore di Sanità, Roma1,25(OH)2D3 come modulatore della SM: metabolismo, attività immunoregolatoria e relazione con l’IFN di tipo I in cellule dendritiche. NeuroimmunologiaE 55.000,00 | 2 anni

LAURA PICCIO Washington University in St Louis School of Medicine, Neurology, St Louis, Missouri, USARuolo di TREM-2 nella sclerosi multipla e nel suo modello animale E 120.000,00 | 2 anni

CECILIA LATERZA Divisione di Neuroscienze Istituto Scientifico San Raffaele, MilanoGenerazione di cellule staminali riprogrammate da Pazienti con sclerosi multipla e differenziamento in precursori neuronali ed oligogliali Borsa di addestramento E 38.000,00 | 2 anni

CLAUDIO SETTE Fondazione Santa Lucia Laboratorio di Neuroembriologia, RomaMyD88: un nuovo bersaglio molecolare per la terapia della sclerosi multipla E 70.000,00 | 2 anni

ROSETTA PEDOTTI Unità di Patologia Muscolare e Immunologia Istituto Nazionale Neurologico Carlo Besta, MilanoDemielinizzazione anticorpale nella sclerosi multipla: uno studio translazionale dall’uomo al topo con anticorpi purificati da pazienti con SM in relapse clinica E 50.000,00 | 2 anni

ELISABETTA ORILIERI Dipartimento di Scienze Mediche, laboratorio di Immunologia Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, NovaraRuolo di anticorpi anti-Osteopontina nella sclerosi multipla Borsa di ricerca E 40.000,00 | 2 anni

MAURIZIO BIFULCO Scienze Farmaceutiche Università degli Studi di Salerno, FiscianoProgettazione, sintesi e studio dell’efficacia terapeutica di nuovi modulatori del sistema endocannabinoide nella sclerosi multipla E 140.000,00 | 2 anni

ALBERTO CHIARUGI Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica, Università di Firenze, FirenzeInibizione del fenomeno dell’epitope spreading con farmaci inibitori della PARP-1 e relative implicazioni teraputiche in modelli di R-EAE E 70.000,00 | 2 anni

ANNA MARIA MALFITANO Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Biomediche Università degli Studi di SalernoStudio dell’’efficacia terapeutica di nuovi modulatori del sistema endocannabinoide

come modulatore della risposta immunitaria e nel reclutamento di progenitori oligodendrocitari E 52.000,00 | 3 anni


PIER MARIA FURLAN Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche S.C.D.U. Psichiatria Università degli Studi di Torino, Orbassano, TorinoL’efficacia dell’Eye Movement Desensitization and Reprocessing (EMDR) in pazienti con Disturbo Post Traumatico da Stress con diagnosi di sclerosi multipla. Uno studio randomizzato controllatoE 52.000,00 | 3 anni

MARIA GRAZIA GRASSO IRCCS Fondazione Santa Lucia, RomaLa disfagia nella sclerosi multipla: correlazioni cliniche di risonanza e di fibroscopia seguita da riabilitazioneE 80.000,00 | 2 anni

ALBERTO PRIORI Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico, Mangiagalli e Regina Elena, Milano La stimolazione transcranica con correnti dirette (tDCS) delle aree corticali motorie per il trattamento della fatica nella sclerosi multiplaE 40.000,00 | 1 anno

NICOLA SMANIA Dipartimento di Scienze Neurologiche e della Visione Università degli Studi di Verona Effetti di un training dell’abilità di integrazione sensori-motoria sui disturbi dell’equilibrio in pazienti affetti da sclerosi multipla E 70.000,00 | 2 anni

CLAUDIA BORREANI Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori Unità di Psicologia, Milano Valutazione qualitativa di un ausilio informativo (CD e booklet “Sapere Migliora”) per le persone con sclerosi multipla (SIMS-Qual) E 40.000,00 | 1 anno

ALESSANDRA SOLARI Unità di Neuroepidemiologia e Eziopatogenesi, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano Indagine postale di auto-valutazione del benessere fisico e psicologico negli adulti con SM e nelle persone a loro vicine: follow-up a lungo termine (Studio POSMOS) E 40.000,00 | 1 anno

ANDREA GIORDANO Unità di Neuroepidemiologia e Eziopatogenesi, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano Preferenze individuali e partecipazione alle decisioni mediche nella SMBorsa di ricerca E 42.000,00 | 2 anni

SIMONA MALUCCHI Centro di Riferimento Regionale Sclerosi Multipla & Neurobiologia Clinica Azienda Ospedaliera Universitaria San Luigi Gonzaga, Orbassano, Torino

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nella sclerosi multipla Borsa di ricerca E 40.000,00 | 2 anni

FRANCESCA GILLI AOU S. Luigi Gonzaga Centro di Riferimento Regionale Sclerosi Multipla Orbassano, TorinoI meccanismi immuno-biologici della gravidanza: come possono indurre una spontanea remissione nella sclerosi multipla Borsa di ricerca E 90.000,00 | 2 anni


PAOLO MARIA ROSSINI Università Campus Bio-Medico Ospedale S. Giovanni Dipartimento di Neuroscienze Cliniche RomaFatica nella sclerosi multipla: Identificazione di un profilo neuroanatomico e funzionale [FaMuS] E 60.000,00 | 1 anno

MARCO ROVARIS Fondazione Don Carlo Gnocchi, IRCCS Santa Maria Nascente Unità Operativa Sclerosi Multipla, MilanoFisiopatologia del danno tissutale nella sclerosi multipla progressiva: studio comparativo immunologico e di RM rispetto a pazienti con malattia del motoneurone E 55.000,00 | 2 anni

MARCO VERCELLINO Dipartimento di Neuroscienze Università di Torino Ruolo delle progranulina nella sclerosi multipla E 25.000,00 | 1 anno

MARCO COSENTINO Dipartimento di Clinica Medica Sezione di Farmacologia Sperimentale e Clinica Università dell’Insubria, Varese Vie adrenergiche/dopaminergiche nei linfociti circolanti come marcatori precoci nelle sindromi clinicamente isolate che progrediscono in sclerosi multipla E 50.000,00 | 1 anno

MARCO DI DARIO Istituto di Neurologia Sperimentale IRCCS San Raffaele, Milano Profilo di espressione genica delle cellule mononucleari del sangue periferico: identificazione di potenziali marcatori molecolari per la sclerosi multipla Borsa di addestramento E 36.000,00 | 2 anni

PAOLO EDOMI Dipartimento di Scienze della Vita Università di Trieste, Trieste Validazione di nuovi marcatori biologici della sclerosi multipla e loro utilizzo per la produzione di un chip proteico diagnosti E 45.000,00 | 1 anno

MARIA FOTI Biotecnologie e Bioscienze Laboratorio di medicina molecolare e immunologia Università degli Studi di Milano-Bicocca, Milano Identificazione di biomarcatori e nuovi bersagli terapeutici nella sclerosi multipla mediante l’utilizzo di approcci di biologia dei sistemi complessi E 50.000,00 | 1 anno


GENETICA

SANDRA D’ALFONSODipartimento di Scienze Mediche, Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, NovaraFILIPPO MARTINELLI BONESCHIIstituto di Neurologia Sperimentale, Divisione di Neurologia, Istituto Scientifico San Raffaele, MilanoAnalisi genetica della SM: progetto ImmunochipProgetto Speciale E 200.000,00 | 2 anni

PROGETTI FINANZIATI PRIMA DEL 2009 PRESENTATI AL CONGRESSO NAZIONALE 2012


PAOLO PINTONDipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica Università degli Studi di FerraraOmeostasi intracellulare del Ca2+ e mitocondri in oligodendrociti durante stress ossidativo e loro ruolo nella morte per apoptosiE 60.000,00 | 2 anni | 2008

ANGELA BONONI Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica; Sezione di Patologia Generale Università di FerraraOmeostasi intracellulare del Ca2+ e mitocondri in oligodendrociti durante stress ossidativo e loro ruolo nella morte per apoptosiBorsa di addestramento E 32.000,00 | 2 anni | 2008

UMBERTO DIANZANI Dipartimento di Scienze Mediche Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, NovaraRicerca di marcatori coinvolti nello sviluppo della sclerosi multipla: correlazione di alterazioni genetiche e funzionali dell’immunità cellulo-mediata con marcatori dell’infezione da EBVE 120.000,00 | 2 anni | 2008

MAURA PUGLIATTI Clinica Neurologica Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di SassariFattori di rischio nella sclerosi multipla: uno studio internazionale caso-controlloE 129.500,00 | 2 anno | 2008


CLAUDIO SOLARO Dipartimento di Neurologia ASL 3 GenoveseValutazione e terapia mediante robot nel trattamento del deficit dell’arto superiore nella sclerosi multipla: uno studio multi-centro, randomizzato e controllatoE 60.000,00 | 2 anni | 2008

VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS/PATHWAYS

ERNESTO FEDELE (subentra a MAURIZIO RAITERI) Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Farmacologia e Tossicologia, Centro di Eccellenza per la Ricerca Biomedicale, Università di GenovaStudio sul ruolo funzionale di RANTES sulla trasmissione glutamatergica nel cervello umano ed in topi EAEE 100.000,00 | 2 anni | 2008

GIUSEPPE BATTAGLIA Neuroscienze, Neurofarmacologia, Istituto Neurologico Mediterraneo - Neuromed, Pozzilli, IserniaRuolo dei recettori metabotropici del glutammato in modelli sperimentali di sclerosi multiplaE 130.000,00 | 2 anni | 2008


MASSIMO FILIPPI Divisione di Neurologia Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor, MilanoCorrelati funzionali e strutturali dell’attività del network cognitivo in pazienti con SM e diversi fenotipi di malattiaE 130.000,00 | 2 anni | 2008

FRANCA DERIU Dipartimento di Neuroscienze, Scienze Psichiatriche ed Anestesiologiche Università degli Studi di SassariStudio neurofisiologico e neuroradiologico dei circuiti del tronco dell’encefalo in pazienti con sclerosi multiplaE 60.000,00 | 2 anni | 2008

LUIS TENEUD Servizio di Neurofisiologia Clinica, Lab. di Psicofisiologia e Neurofisiologia Sperimentale IRCCS Ospedale San RaffaeleValidazione di markers elettrofisiologici di danno nervoso in modelli animali di sclerosi multiplaBorsa di ricerca E 41.000,00 | 2 anni | 2008

PAOLO MURARO Department of Cellular and Molecular Neuroscience, Division of Neuroscience and Mental Health Imperial College, LondonIdentificazione di fattori prognostici condizionanti l’esito a lungo termine della sclerosi multipla: estesa analisi del database di London OntarioE 60.000,00 | 2 anni | 2008

BRUNO BONETTI Dipartimento di Scienze Neurologiche e della Visione, Sezione di Neurologia, Ospedale Policlinico Università di VeronaApproccio Proteomico per la Identificazione di Autoantigeni riconosciuti da IgG del Liquor Cerebro-Spinale nella sclerosi multiplaE 70.000,00 | 2 anni | 2008

VALIDAZIONE DI NUOVI TARGETS/PATHWAYS

CINTHIA FARINA Dipartimento di Neuroscienze, Istituto di Neurologia Sperimentale, Fondazione Centro S. Raffaele del Monte Tabor, MilanoFunzione di TrkB sugli astrociti reattivi nelle placche di sclerosi multiplaE 80.000,00 | 2 anni | 2007

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PROGETTI FINANZIATI PRIMA DEL 2009 PRESENTATI AL CONGRESSO NAZIONALE 2012

COMITATO SCIENTIFICO FISM

201120102009

COMITATO SCIENTIFICO FISM2011

FRANCESCA BAGNATODepartment of Radiology and Radiological Sciences, Institute of Imaging Science; Vanderbilt University, Nashville USA

LUCA BATTISTINI IRCCS S. Lucia Neuroimmunology Unit European Centre for Brain Research, Roma

ANTONIO BERTOLOTTO ASO S. Luigi Gonzaga, Centro di riferimento Regionale Sclerosi Multipla (CReSM), Orbassano (TO)

DIEGO CENTONZE Fondazione Santa Lucia IRCCS e Università di Tor Vergata, Clinica Neurologica, Dipartimento di Neuroscienze, Roma

GABRIELA CONSTANTIN Dipartimento di Patologia e Diagnostica, Università degli Studi di Verona, Verona

FRANCESCO CUCCA Dipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi di Sassari, Sassari

UMBERTO DIANZANI Dipartimento di Scienze Mediche, I.R.C.A.D., Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Novara

ROBERTO FURLANUnità di Neuroimmunologia Clinica, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT, Milano

MARIA GRAZIA GRASSOIRCCS Fondazione Santa Lucia, Roma

MATILDE INGLESEMount Sinai School of Medicine, New York, USA

GIANVITO MARTINOUnità di Neuroimmunologia, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT, Milano

PAOLO MURARODivision of Experimental Medicine, Centre for Neuroscience, Imperial College London, London, UK

VITO PISTOIALaboratorio di Oncologia, I.R.C.C.S. G. Gaslini, Genova

188 189

COMITATO SCIENTIFICO FISM 2011

PAOLO RICCIODipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, Università della Basilicata, Potenza

MARCO SALVETTIUniversità “La Sapienza” - Neurologia e Centro Neurologico Terapie Sperimentali (CENTERS), Roma

ALESSANDRA SOLARIUnità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano

JEAN-LOUIS THONNARDUniversité catholique de Louvain, Institute of NeuroScience (IoNS), Bruxelles, Belgique

BERNARD ZALCBâtiment de la Pharmacie, Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, Hôpital de la Salpêtrière, Paris, France

CHAIRMAN COMITATO SCIENTIFICO FISM

GIULIO LEVI Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio Fisiopatologia di Organo e Sistema, Roma


FRANCESCA BAGNATODepartment of Radiology and Radiological Sciences, Institute of Imaging Science; Vanderbilt University, Nashville USA

LUCA BATTISTINI IRCCS S. Lucia Neuroimmunology Unit European Centre for Brain Research, Roma

ANTONIO BERTOLOTTO ASO S. Luigi Gonzaga, Centro di riferimento regionale Sclerosi Multipla (CReSM), Orbassano, Torino

DIEGO CENTONZE Fondazione Santa Lucia IRCCS e Università di Tor Vergata, Clinica Neurologica, Dipartimento di Neuroscienze, Roma

FRANCESCO CUCCA Dipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi di Sassari, Sassari

UMBERTO DIANZANI Dipartimento di Scienze Mediche, I.R.C.A.D., Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro, Novara

ROBERTO FURLANUnità di Neuroimmunologia Clinica, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT, Milano

ENRICO GRANIERIIstituto di Clinica Neurologica, Università di Ferrara, Arcispedale Sant’Anna, Ferrara

MARIA GRAZIA GRASSOIRCCS Fondazione Santa Lucia, Roma

MATILDE INGLESEMount Sinai School of Medicine, New York USA


PAOLO MURARODivision of Experimental Medicine, Centre for Neuroscience, Imperial College London, London UK

VITO PISTOIALaboratorio di Oncologia, IRCCS G. Gaslini, Genova

190 191


MARCO SALVETTIUniversità La Sapienza, Neurologia e Centro Neurologico Terapie Sperimentali (CENTERS), Roma

ALESSANDRA SOLARIUnità di Neuroepidemiologia, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C. Besta, Milano

JEAN-LOUIS THONNARDUniversité catholique de Louvain, Institute of NeuroScience (IoNS), Bruxelles Belgique

LAWRENCE WRABETZLaboratorio di Biologia della Mielina, IRCCS Ospedale San Raffaele, DIBIT, Milano

BERNARD ZALCBâtiment de la Pharmacie, Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, Hôpital de la Salpêtrière, Paris France

COORDINATORE DELLA RICERCA FISM

GIULIO LEVI Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio Fisiopatologia di Organo e Sistema, Roma


FRANCESCA BAGNATONeuroimmunology Branch, NINDS, Waaren G. Magnuson Clinical Center, NIH, Bethesda, USA

UMBERTO DIANZANI Università del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro Dipartimento di Scienze Mediche, IRCAD, Novara

ROBERTO FURLAN IRCCS Ospedale San Raffaele, Unità di Neuroimmunologia DIBIT, Milano

PAOLO GIRLANDA A.O.U. Policlinico G. Martino, Dipartimento di Neuroscienze Psichiatria e Anestesiologia, Servizio di Neurofisiopatologia, Messina

ENRICO GRANIERI Università di Ferrara, Istituto di Clinica Neurologica, Arcispedale Sant’Anna, Ferrara

MARIA GRAZIA GRASSO IRCCS Fondazione Santa Lucia, Unità Operativa “E” Sezione Sclerosi Multipla, Roma

JURG KESSELRING Rehabilitationszentrum Chefarzt Neurologie Valens, Suisse


XAVIER MONTALBANHospital General, Clinical Neuroimmunology Unit, Barcelona, Spain

PAOLO MURAROFaculty of Medicine, Imperial College, Charing Cross Campus, Department of Cellular and Molecular Neuroscience, Division of Neuroscience and Mental Health, London UK

VITO PISTOIALaboratorio di Oncologia, IRCCS G. Gaslini, Genova

MARCO SALVETTIUniversità La Sapienza, Dipartimento di Scienze Neurologiche, Roma

ALESSANDRA SOLARIIstituto Nazionale Neurologico Carlo Besta, Laboratorio di Epidemiologia, Milano

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GIOACCHINO TEDESCHISeconda Università di Napoli, Istituto di Scienze Neurologiche, II Clinica di Neurologia, Napoli

LAWRENCE WRABETZIRCCS Ospedale San Raffaele, Dipartimento di Biotecnologie Avanzate (DIBIT), Laboratorio di Biologia della Mielina, Milano

BERNARD ZALCBiologie des Interactions Neurones/Glie, Unite Mixte de Recherche Inserum U-711, UPMC, Hôpital de la Salpêtrière, Paris France

COORDINATORE DELLA RICERCA FISM

GIULIO LEVI Istituto Superiore di Sanità, Laboratorio Fisiopatologia di Organo e Sistema, Roma e Sistema, Roma

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