Immunoist

Tecniche di Immunoistochimica e Biologia Molecolare

applicate alla diagnosticaapplicate alla diagnosticaistopatologica

ImmunoistochimicaImmunoistochimica

•• Metodiche utilizzate per identificare Metodiche utilizzate per identificare costituenti cellulari e tissutali come costituenti cellulari e tissutali come costituenti cellulari e tissutali come costituenti cellulari e tissutali come antigeni in situ, utilizzando anticorpiantigeni in situ, utilizzando anticorpi

• Le tecniche di IIC possono essere applicate su cellule isolate su preparati istologici e citologici

Alcuni tumori possono essere diagnosticati con un semplice esame istologico, mentre altri per una corretta definizione richiedono l’ausilio di ulteriori indagini:


corretta definizione richiedono l’ausilio di ulteriori indagini:

• Istochimiche

• Immunoistochimiche

• Biologia molecolare

L’immunoistochimica L’immunoistochimica al microscopioal microscopio

Il principio dell’IIC prevede il riconoscimento di un


il riconoscimento di un antigene mediante l’utilizzo di un anticorpo specifico.

L’antigene è una molecola proteica, glicoproteica o lipoproteica capace di di evocare una risposta immune da parte del sistema immunitario.Ogni antigene è costituito da uno o più

AntigeneAntigene

del sistema immunitario.Ogni antigene è costituito da uno o più siti antigenici. Disponendo dell’ anticorpo specifico qualunque antigene può essere evidenziato mediante reazioni di IIC.

Ogni singolo Ag è costituito da una o più porzioni

DEFINIZIONE

DI ANTIGENEEPITOPO 1

EPITOPO 3

EPITOPO 2

Ag

costituito da una o più porzionichiamate epitopi o determinanti antigenici differenti tra loro

EPITOPO

ANTICORPO

L’antigenicità di una molecola dipende dalla sua composizione e conformazione strutturale ed

DEFINIZIONE DI ANTIGENE

e conformazione strutturale ed è modificata da tutti i trattamenti fisici e chimici attuati durante la processazione dei campioni

Gli ac sono molecole proteiche (Ig) prodotte dalle plasmacellule in grado di legarsi ad un determinante antigenico. Possono essere:

Monoclonali:costituiti da ac identici fra loro e diretti

AnticorpiAnticorpi

Monoclonali:costituiti da ac identici fra loro e diretti contro lo stesso determinante antigenico

Policlonali: costituiti da anticorpi diversi fra loro e diretti contro differenti determinanti antigenici

Ibridi: immunoglobuline modificate in modo tale che ciascun frammento abbia specificità per un differente determinante antigenico

Struttura dell’anticorpo

Frammento Fc

porzione costante specie-specifica

Frammento FabFrammento Fab

porzione dell’ Ig in grado di legare l’Ag, è costituito da domini ipervariabili che consentono grande versatilità nel riconoscimento e nel legame con l’Ag (specificità e affinità)

STRUTTURA DI UN ANTICORPO

Il complesso tra l’antigene e l’anticorpo che si forma nella reazione immune non è di per sé

REAZIONE

ANTIGENE-ANTICORPO

reazione immune non è di per sé visibile. E’ necessario quindi servirsi di marcatori che direttamente o indirettamente possano evidenziarne la formazione

Attualmente sono impiegati due

Markers della reazione immunoistochimica

Attualmente sono impiegati due differenti tipi di tracciante:

• Fluorescente

• Enzimatico

Tecniche di Immunofluorescenzautilizzano fluorocromi come marcatori della reazione antigene-

Tecniche ImmunoistochimicheTecniche Immunoistochimiche

marcatori della reazione antigene-anticorpo

Tecniche Immunoenzimatiche utilizzano enzimi per evidenziare la reazione antigene-anticorpo

• Le sostanze fluorescenti maggiormente utilizzate sono:

• Isotiocianato di fluoresceina

Tecniche di immunofluorescenzaTecniche di immunofluorescenza

• Isotiocianato di fluoresceina

• Tetrametil rodamina

• Ficoeritrina

• Cianina

• Rosso Texas

Immunofluorescenza

Carcinoma lobulare della mammella Carcinoma lobulare della mammella CK FitcCK Fitc

CK RodaminaCK Rodamina

Metodi di indagine Metodi di indagine

ImmunofluorescenzaImmunofluorescenza

Metodi diretti

Metodi indiretti


Metodo indirettoMetodo indiretto

Immunofluorescenza

Metodo direttoMetodo diretto

Immunofluorescenza

– Tessuto nervoso

Metodo direttoMetodo diretto

nervoso

Doppia colorazioneDoppia colorazione

Limiti dell’immunofluorescenza

-Scarsa possibilità di diluizione degli Ac

-Mancanza di informazioni topografiche


-Mancanza di informazioni topografiche

-Naturale estinzione della fluorescenza

-Necessità di osservazione in microscopia particolare

Non conservabilità dei preparati

Campi di applicazione dell’immunofluorescenza

• Diagnostica nefropatologica

• Diagnostica dermatologica

• Indagini citoflussimetriche

Nella diagnosi delle patologie renali l’IFdiretta permette di identificare Ag e altri fattori presenti nelle strutture glomerulari. La evidenziazione di depositi di


La evidenziazione di depositi di immunocomplessi, di frazioni del complemento, di fibrinogeno e la loro distribuzione a livello glomerulare è un fondamentale supporto nella diagnosi differenziale tra le varie glomerulonefriti.


Patologia renalePatologia renale

Glomerulonefrite granulareGlomerulonefrite granulare

Pattern granularePattern granulare

IgGIgG

Immunofluorescenza

Patologia cutaneaPatologia cutanea

Depositi lineari antiDepositi lineari anti--C3C3

Depositi lineari antiDepositi lineari anti--IgGIgG

Analisi Citofluorimetria


Sospensione Sospensione cellularecellulare

Campionamento

Tessuto fresco

Congelamento rapido in azoto liquido

Sezioni di 4Sezioni di 4--5 5 µµµµµµµµ al al microtomo congelatoremicrotomo congelatore

Conservazione a -80


microtomo congelatoremicrotomo congelatore -80

Asciugare le sezioni Asciugare le sezioni all’ariaall’aria

Fissare in acetone Fissare in acetone per 10’per 10’

Lavare con PBSLavare con PBS Colorazione

Sezioni non utilizzate

Congelamento

Il congelamento permette di conferire al campione di tessuto una rigidità tale da consentire l’allestimento di sezioni sottili (2-5 µ) permette inoltre di:

• Stabilizzare le strutture cellulari

• Mantenere inalterate le caratteristiche di antigenicità del tessuto

• Non interferire nella reazione Ag-Ac.

La biopsia chirurgica viene inglobata in una particolare resina chiamata OCT

che ha la proprietà:

CongelamentoCongelamento

che ha la proprietà:

- Solidificare a basse temperature

- Preservare il tessuto

- Formare un supporto rigido necessario per il taglio delle sezioni.

Il metodo maggiormente utilizzato è quello di immergere il tessuto per alcuni secondi in azoto liquido che essendo alla

CongelamentoCongelamento

secondi in azoto liquido che essendo alla temperatura di –196°C consente un rapido congelamento senza provocare danni alla struttura antigenica e all’architettura morfologica

Tecnica per If diretta

Tessuto fresco

Campionare

Congelare

Tagliare al criostato

Sezioni di 4 µµµµ su vetrini con adesivo o polarizzati

Asciugare le sezioni all’ariaAsciugare le sezioni all’aria

Fissare con acetone a 4°C

Lavare con tampone

Incubare con Ac primario fluorescinato 1 ora

Lavare con tampone

Montare con un sistema acquoso e conservare al buio

Osservare al microscopio a fluorescenza

Immunoistochimicatecniche e metodi

La tecnica Immunoenzimatica prevede l’uso di enzimi legati direttamente o

indirettamente all’Ac I° per evidenziare indirettamente all’Ac I° per evidenziare la formazione del complesso immune.

L’enzima catalizza la formazione di un precipitato colorato e insolubile visibile

al microscopio, nel sito in cui è avvenuta la reazione Ag-Ac

A seconda del tracciante enzimatico:

• IMMUNOPEROSSIDASI

EVIDENZIAZIONE DEL COMPLESSO IMMUNE

• IMMUNOPEROSSIDASI

• IMMUNOFOSFATASI

• IMMUNOGLUCOSIDASI

• IMMUNOββββ−−−−GALATTOSIDASI

Perossidasi• E’ ottenuta dal rafano ma è presente anche nei tessuti umani

• Può formare legami covalenti con le immunoglobuline le immunoglobuline

• Suo substrato è il perossido di idrogeno

2 H2O2 2H2O+O2

elemento ossidante per il cromogeno

Il cromogeno più utilizzato è la DAB che da un prodotto di ossidazione insolubile e colorato in bruno.

ImmunoperossidasiImmunoperossidasi

da un prodotto di ossidazione insolubile e colorato in bruno.

L’insolubilità e la stabilita del prodotto di ossidazione della DAB consentono il montaggio e l’archiviazione dei preparati dei preparati secondo le tecniche di routine.

Altri substrati come ad es. l’ AECfornisce un prodotto di

ImmunoperossidasiImmunoperossidasi

fornisce un prodotto di osssidazione rosso, è liposolubile e fotosensibile rendendo necessaria la conservazione al buio nonché la documentazione fotografica

I metodi immunoenzimatici possono essere:

�Diretti

Metodi immunoenzimaticiMetodi immunoenzimatici

�Diretti

�Indiretti

Il metodo diretto scarsamente sensibile non viene utilizzato nei laboratori di Anatomia Patologica

Il metodo indiretto:

•E’ estremamente sensibile e ha il vantaggio che un solo anticorpo II°

Metodi ImmunoenzimaticiMetodi Immunoenzimatici

vantaggio che un solo anticorpo II°marcato può essere utilizzato per riconoscere diversi anticorpi I°appartenenti alla stessa specie.

PerossidasiLa scelta del cromogeno si pone tra

DAB - Cancerogena

- Origina un precipitato marroneinsolubile nei solventi organiciinsolubile nei solventi organici

AEC - Non cancerogeno

- Origina un precipitato rossiccio solubile nei solventi organici

Fosfatasi alcalina

• Si ottiene dall’intestino di bue

• Substrati sono gli esteri fosforicialfa-naftilfosfato e naftolo AS-TR alfa-naftilfosfato e naftolo AS-TR fosfato

• Cromogeno è un sale di tetrazolio

• Conferisce una colorazione rossa

Immunoistochimica

Tecniche e metodi

Enzima + substrato

cromogeno

Prodotto colorato

Metodi Immunoenzimatici

Diretto Ac I° marcato

Semplice e rapido

Indiretto Ac I° non marcato

Ac II°

Storia dell’Storia dell’immunoistochimicaimmunoistochimica•• 1941 1941 CoonsCoons::

–– Anticorpi marcati con fluoresceina per localizzare Anticorpi marcati con fluoresceina per localizzare antigeni in sezioni di tessutoantigeni in sezioni di tessuto

•• 1966 1966 NakaneNakane::–– Anticorpi marcati con enzimiAnticorpi marcati con enzimi

•• 1970 1970 SternbergerSternberger::–– PPerossidasierossidasi--AAntinti PPerossidasierossidasi ((PAP)PAP)–– PPerossidasierossidasi--AAntinti PPerossidasierossidasi ((PAP)PAP)

•• 1981 1981 HsuHsu::–– AAvidinvidin BBiotiniotin CComplexomplex ((ABC)ABC)

•• 1984 1984 CordellCordell: : –– AAlkalinelkaline PPhosphatasehosphatase AAnti nti AAlkalinelkaline PPhosphatasehosphatase((APAAP)APAAP)

•• 1989 1989 BobrowBobrow::–– CatalysedCatalysed Reporter Reporter DepositionDeposition (CARD CSA(CARD CSA--TSA)TSA)

•• 1993 1993 BisgaardBisgaard–– Polimeri del Polimeri del destranodestrano

Perossidasi AntiPerossidasi Anti--PerossidasiPerossidasi�� AntigeneAntigene

�� Anticorpo primarioAnticorpo primario

�� Anticorpo secondarioAnticorpo secondario�� Anticorpo secondarioAnticorpo secondario

�� EnzimaEnzima

�� Complesso PAPComplesso PAP

Il sistema Avidina Biotina (ABC) si basa sulla straordinaria affinità fra l’avidina, una glicoproteina con p.m. 68.000 D presente nell’albume d’uovo e

Metodi ImmunoenzimaticiMetodi Immunoenzimatici

68.000 D presente nell’albume d’uovo e la biotina piccola molecola vitaminica. In particolare la biotina si lega ai gruppi aminici -NH2 degli Ac e della Pr di modo che più molecole di biotina corrispondono a ciascuna molecola di Ig

Metodo ABC

LSAB

Labelled Streptavidin

Biotin

(Peroxidase)

Press left mousebutton

Metodo ABCMetodo ABC

•• AntigeneAntigene

•• Anticorpo primarioAnticorpo primario

•• Anticorpo secondarioAnticorpo secondariobiotinilatobiotinilato

•• Complesso Complesso ABCABC--PrPr

Sistemi Sistemi avidinaavidina--biotinabiotina::vantaggivantaggi

•• Alta affinità dell’Alta affinità dell’avidinaavidina per la biotinaper la biotina

•• E’ possibile ottenere un elevato rapporto E’ possibile ottenere un elevato rapporto fluorocromofluorocromo/enzima/enzima--proteinaproteinafluorocromofluorocromo/enzima/enzima--proteinaproteina

•• Elevata amplificazione Elevata amplificazione

•• L’L’avidinaavidina coniugata è molto stabileconiugata è molto stabile

•• Un singolo coniugato marcato può essere Un singolo coniugato marcato può essere utilizzato in molteplici metodicheutilizzato in molteplici metodiche

•• Basso costoBasso costo

Sistemi Sistemi avidinaavidina--biotinabiotina::svantaggisvantaggi

•• Biotina endogenaBiotina endogena•• Biotina endogenaBiotina endogena

•• Reazione con multipli passaggiReazione con multipli passaggi

Polimeri del destrano

Polymer DetectionPress left mousebutton

Polymer DetectionPress left mousebuttonPress left mousebuttonPress left mousebutton


Polimeri del Polimeri del destranodestrano

�� Antigene Antigene �� Antigene Antigene

�� Anticorpo primarioAnticorpo primario

�� Anticorpo Anticorpo secondariosecondario--polimeropolimero--enzimaenzima

Polimeri del Polimeri del destranodestrano::vantaggivantaggi

•• Ottima sensibilità Ottima sensibilità

•• Nessuna interferenza legata alla biotinaNessuna interferenza legata alla biotina

•• Tempi di reazione ridottiTempi di reazione ridotti

Catalyzed Signal AmplificationCatalyzed Signal Amplification


••Tiramide biotinilataTiramide biotinilata

••acqua ossigenataacqua ossigenata

CARD: vantaggiCARD: vantaggi

•• Altissima sensibilitàAltissima sensibilità

•• Aumenta la diluizione di anticorpi primari 05Aumenta la diluizione di anticorpi primari 05

•• Utilizzo di anticorpi non usualmente reattivi Utilizzo di anticorpi non usualmente reattivi •• Utilizzo di anticorpi non usualmente reattivi Utilizzo di anticorpi non usualmente reattivi

•• Possibilità di utilizzo in svariate metodiche Possibilità di utilizzo in svariate metodiche (ibridazione in situ, FISH, etc)(ibridazione in situ, FISH, etc)

•• Numerosi apteni utilizzabiliNumerosi apteni utilizzabili


Doppie colorazioni

Permettono di evidenziare contemporaneamente nella stessa Permettono di evidenziare contemporaneamente nella stessa cellula due o più antigeni diversi utilizzando differenti substrati cromogeni e differenti enzimi

Colorazioni doppie

TCRBCL: CD20/CD54R0

Doppia colorazione

Inibizione di enzimi endogeni

Applicando metodiche di immunoistochimica enzimatica è necessario ricordare che alcuni enzimi necessario ricordare che alcuni enzimi utilizzati come traccianti possono essere presenti nel tessuto da analizzare, è necessario perciò inibire l’enzima endogeno senza danneggiare le proprietà antigeniche.

Trattamento del materiale istologico e citologico da sottoporre ad indagini di IIC

Dall’effettuazione del prelievo bioptico Dall’effettuazione del prelievo bioptico o citologico al momento dell’esame o citologico al momento dell’esame

microscopico dei preparati colorati con microscopico dei preparati colorati con reazioni immunoistochimiche reazioni immunoistochimiche

microscopico dei preparati colorati con microscopico dei preparati colorati con reazioni immunoistochimiche reazioni immunoistochimiche

intervengono diversi fattori che intervengono diversi fattori che possono influenzare i risultati e possono influenzare i risultati e

portare a false interpretazioni dei portare a false interpretazioni dei quadri patologiciquadri patologici

I campioni bioptici da sottoporre ad indagini I campioni bioptici da sottoporre ad indagini di IIC vengono trattati secondo le normali di IIC vengono trattati secondo le normali procedure per l’allestimento delle sezioni procedure per l’allestimento delle sezioni per la diagnostica istomorfologica e cioèper la diagnostica istomorfologica e cioè

Trattamento del materialeTrattamento del materiale

per la diagnostica istomorfologica e cioèper la diagnostica istomorfologica e cioè

•• Fissazione Fissazione

•• Disidratazione e chiarificazioneDisidratazione e chiarificazione

•• Inclusione in paraffinaInclusione in paraffina

•• Taglio al microtomoTaglio al microtomo

FissazioneFissazione

Gli scopi principali della fissazione sono:Gli scopi principali della fissazione sono:

•• Preservare la morfologia cellulare e Preservare la morfologia cellulare e l’architettura tissutalel’architettura tissutale

•• Permettere al campione di tollerare gli Permettere al campione di tollerare gli stress della processazionestress della processazione•• Permettere al campione di tollerare gli Permettere al campione di tollerare gli stress della processazionestress della processazione

•• Mantenere un buon grado di reattività per Mantenere un buon grado di reattività per le colorazioni tradizionalile colorazioni tradizionali

•• Preservare l’integrità antigenica Preservare l’integrità antigenica

•• Mantenere le molecole antigeniche nella Mantenere le molecole antigeniche nella loro posizione originaleloro posizione originale

Tra i fissativi quello maggiormente Tra i fissativi quello maggiormente impiegato è la impiegato è la formalina neutraformalina neutratamponata (10%)tamponata (10%), che permette il , che permette il

FissazioneFissazione

tamponata (10%)tamponata (10%), che permette il , che permette il miglior compromesso tra stabilità, miglior compromesso tra stabilità,

costo, preservazione di molti antigeni, costo, preservazione di molti antigeni, buona morfologia.buona morfologia.

La fissazione con formalina determina legami crociati tra il liquido fissativo e gruppi

Azione della formalinaAzione della formalina

il liquido fissativo e gruppi attivi delle proteine, con

mascheramento di molti siti antigenici.

Trattamento del materiale istologico

Proteina naturaleProteina denaturata

•Azione della formalina sulle proteine del tessuto

Reticolazione

Trattamento del materiale istologico

Azione della formalina sulle proteine Azione della formalina sulle proteine del tessutodel tessuto

Prima della fissazionePrima della fissazione Dopo fissazioneDopo fissazione

Tempi e modalità di fissazionevariabili preanalitiche

• Primo obiettivo di standardizzazione

• Fissare immediatamente il campione

• Un ritardo determina degradazione • Un ritardo determina degradazione proteolitica con diffusione dell’antigene e ridotta o assente immunocolorazione

• Evitare una fissazione prolungata

• Tempi non superiori alle 24 ore • Condizionano l’immunoreattività tissutale

Tempi e modalità di fissazionevariabili preanalitiche

Ritardo della fissazione

Er

Procedure di ripristino dell’antigenicità

I processi a cui sono sottoposti i tessuti o le cellule dal momento del prelievo

all’effettuazione della reazione di IIC possono danneggiare l’antigenicità rendendo::

• Inaccessibile l’Ag all’Ac

• Modificando parzialmente l’antigenicità

• Modificandola in modo irreversibile

La reattività immunologica può essere ripristinata rompendo questi legami crociati o con un

Ripristino dell’antigenicitàRipristino dell’antigenicità

questi legami crociati o con un trattamento

Enzimatico

Alte temperature

Gli enzimi proteolitici rompono i legami aldeidici rendendo i siti antigenici disponibili per il relativo Ac. Quelli maggiormente utilizzati sono:

Trattamento enzimaticoTrattamento enzimatico

• Pepsina

• Proteasi XXIV

• Tripsina

• Proteinasi K

L’incubazione con uno di questi enzimi può avvenire a temperatura ambiente o a 37°C per un periodo di tempo variabile (5-30’) e

dipende:

Trattamento enzimaticoTrattamento enzimatico

dipende:

• concentrazione

• durata della fissazione

• spessore della sezione

• tipo di enzima

A partire dagli anni 90 l’uso delcalore ha largamente sostituito i

metodi enzimatici. Le alte

Ripristino dell’antigenicitàRipristino dell’antigenicità

metodi enzimatici. Le alte temperature sono in grado di ristabilire l’originale struttura

proteica dopo che questa è stata modificata dalla fissazione in

formalina

Metodi di recupero dell’antigenicità

• Come effettuare lo smascheramento

Recupero a caldo

• Forno a microonde

• Pentola a pressione

• Bagno termostatato

• Autoclave

Efficienza dei metodi di recupero dell’ antigenicità

Fattori che condizionano lo smascheramento antigenico in mezzo liquido

� Tempo di riscaldamento

T (°C) x t (min.) � pH

-Ag indifferenti al pH della soluzione

-Ag buoni risultati a pH acido

-Ag buoni risultati a pH basico

Smascheramento

� Intensità di colorazione aumenta aumentando i tempi

Recettore per estrogeni

10’

Smascheramento

Recettore estrogeni

’20’

Smascheramento

Recettore per estrogeni

30’

Efficienza dei metodi di recupero dell’antigenicità

• Tempo/Temperatura

• A parità di trattamento il tempo e la temperatura alla quale le sezioni vengono sottoposte giocano un alla quale le sezioni vengono sottoposte giocano un ruolo fondamentale per il raggiungimento di un risultato ottimale

• Casi con reattività debole o incerta possono diventare chiaramente positivi se esposti al calore per un periodo più lungo

• Viceversa casi sicuramente negativi restano tali anche dopo esposizione prolungata al calore

Metodi di recupero dell’antigenicità

• Soluzioni utilizzate

• Tampone citrato 0.01 M pH6

• Tampone EDTA pH 8-9• Tampone EDTA pH 8-9

• Tampone glicina

• Acqua distillata

REIDRATARE

SPARAFFINARE

FASI DELLA COLORAZIONE IIC

Ac I°

Ac II°

CROMOGENO

CONTRASTO

PRETRATTAMENTO

INIBIZIONE

ABC-ENZIMAMONTAGGIO

OSSERVAZIONE

Una delle maggiori difficoltà Una delle maggiori difficoltà dell’immunoistochimica sta nell’interpretazione dell’immunoistochimica sta nell’interpretazione dei risultati. La presenza di deposizione di dei risultati. La presenza di deposizione di substrato cromogeno in corrispondenza di una substrato cromogeno in corrispondenza di una

Interpretazione dei Interpretazione dei risultatirisultati

substrato cromogeno in corrispondenza di una substrato cromogeno in corrispondenza di una cellula o di un tessuto, spesso, dovrebbe cellula o di un tessuto, spesso, dovrebbe significare che in quella sede è avvenuta una significare che in quella sede è avvenuta una reazione tra l’anticorpo e l’antigene tissutale.reazione tra l’anticorpo e l’antigene tissutale.Questo è vero nella maggior parte dei casi, Questo è vero nella maggior parte dei casi, tuttavia altri eventi definiti artefatti, possono tuttavia altri eventi definiti artefatti, possono essere responsabili della colorazioneessere responsabili della colorazione

Le cause più comuni di colorazioni dovute Le cause più comuni di colorazioni dovute ad artefatti sono:ad artefatti sono:

••Presenza di perossidasi o fosfatasi (già presenti nel Presenza di perossidasi o fosfatasi (già presenti nel tessuto ) non adeguatamente inibite.tessuto ) non adeguatamente inibite.

Interpretazione dei Interpretazione dei risultatirisultati

tessuto ) non adeguatamente inibite.tessuto ) non adeguatamente inibite.

••CrossCross--reattività dell’anticorpo Ireattività dell’anticorpo I°° con un antigene con un antigene diverso da quello in studio.diverso da quello in studio.

••Legame aspecifico dell’anticorpo alla cellula o tessuto Legame aspecifico dell’anticorpo alla cellula o tessuto (attraverso il frammento Fc o per carica elettrica)(attraverso il frammento Fc o per carica elettrica)

••Inadeguata fissazione del tessuto. Inadeguata fissazione del tessuto. Scarsa fissazione Scarsa fissazione provoca un eccesso di “fondo “; eccesso di fissazione provoca un eccesso di “fondo “; eccesso di fissazione provoca una ridotta sensibilitàprovoca una ridotta sensibilità

Esistono alcune strategie che possono aiutare a Esistono alcune strategie che possono aiutare a distinguere una colorazione immunoistochimica distinguere una colorazione immunoistochimica specifica da una non specicifica o legata ad specifica da una non specicifica o legata ad artefatti L’interpretazione dei risultati in IIC deve artefatti L’interpretazione dei risultati in IIC deve tenere conto del tipo di positività attesa per un tenere conto del tipo di positività attesa per un determinato Ab che può essere di quattro tipi:determinato Ab che può essere di quattro tipi:

Pattern di colorazionePattern di colorazione

determinato Ab che può essere di quattro tipi:determinato Ab che può essere di quattro tipi:

•• NucleareNucleare

•• Citoplasmatica Citoplasmatica

•• Di membranaDi membrana

•• ExtracellulareExtracellulare

Pattern di colorazione

• NUCLEARE

• CITOPLASMATICO

• DI MEMBRANA

L’approccio diagnostico immunoistochimico deve essere

Campi di applicazioneCampi di applicazione

immunoistochimico deve essere condotto con razionalitàscegliendo, sia il tipo di materiale più idoneo, sia gli anticorpi da utilizzare, secondo un algoritmo appropriato

Si definisce Si definisce algoritmo algoritmo immunoistochimicoimmunoistochimico la successione la successione logica nella selezione degli anticorpi da logica nella selezione degli anticorpi da utilizzare al fine di giungere alla utilizzare al fine di giungere alla


utilizzare al fine di giungere alla utilizzare al fine di giungere alla diagnosi.diagnosi.

Esiste un Esiste un algoritmo primarioalgoritmo primario che che consiste nell’utilizzo di un pannello di consiste nell’utilizzo di un pannello di anticorpi che consente di identificare anticorpi che consente di identificare la neoplasia la neoplasia

Le positività riscontrate con Le positività riscontrate con l’algoritmo primariol’algoritmo primario consentono consentono di applicare un di applicare un algoritmo algoritmo secondariosecondario al fine di classificare al fine di classificare


secondariosecondario al fine di classificare al fine di classificare adeguatamente la neoplasia. adeguatamente la neoplasia. Raramente si rende necessario Raramente si rende necessario l’utilizzo di un ulteriore l’utilizzo di un ulteriore algoritmoalgoritmo

Campi di Campi di applicazioneapplicazione “IHC”“IHC”

••Marcatori di differenziazioneMarcatori di differenziazione

•• “Colorazione speciale”“Colorazione speciale”

••Marcatori di differenziazioneMarcatori di differenziazione

•• “Colorazione speciale”“Colorazione speciale”•• “Colorazione speciale”“Colorazione speciale”

••Marcatori di neoplasia Marcatori di neoplasia

••Marcatori di agenti infettiviMarcatori di agenti infettivi

•• Fattori prognosticiFattori prognostici

•• “Colorazione speciale”“Colorazione speciale”

••Marcatori di neoplasia Marcatori di neoplasia

••Marcatori di agenti infettiviMarcatori di agenti infettivi

•• Fattori prognosticiFattori prognostici

Marcatori di Marcatori di differenziazionedifferenziazione

•• Natura della popolazione cellulareNatura della popolazione cellulare•• Linfomi B/TLinfomi B/T•• Linfomi B/TLinfomi B/T

•• Epiteliale vs. mesenchimaleEpiteliale vs. mesenchimale

•• DD melanoma amelanoticoDD melanoma amelanotico

•• Mesotelioma vs adenocarcinomaMesotelioma vs adenocarcinoma

Marcatori di Marcatori di differenziazionedifferenziazione

•• Sottoclassificazione linfomiSottoclassificazione linfomi

•• Sottoclassificazione neoplasie Sottoclassificazione neoplasie •• Sottoclassificazione neoplasie Sottoclassificazione neoplasie mesenchimalimesenchimali

•• Differenziazione endocrinaDifferenziazione endocrina

Colorazione specialeColorazione speciale

•• Individuazione tipi cellulari Individuazione tipi cellulari •• Individuazione tipi cellulari Individuazione tipi cellulari specifici: cellule specifici: cellule sustentacolari, cellule sustentacolari, cellule follicolari dendritiche eccfollicolari dendritiche ecc..

CD21 CD21 -- cellule FDcellule FD

Marcatori prognosticiMarcatori prognostici

•• Ag regolatori del ciclo Ag regolatori del ciclo cellulare cellulare (Mib(Mib--1, cicline)1, cicline)

•• Recettori ormonali Recettori ormonali (Er, Pr)(Er, Pr)•• Recettori ormonali Recettori ormonali (Er, Pr)(Er, Pr)

•• Prodotti di oncogeni e geni Prodotti di oncogeni e geni oncosoppressori oncosoppressori (Erb(Erb--B2, Myc)B2, Myc)

•• Ag legati all’invasività Ag legati all’invasività (E(E--caderina)caderina)

Marcatori immunoistochimici Marcatori immunoistochimici di riconosciuta validità clinicadi riconosciuta validità clinica

•• ER, PRER, PR•• Proliferazione Proliferazione –– Ki67Ki67•• Proliferazione Proliferazione –– Ki67Ki67•• HERHER--22•• KITKIT•• EGFREGFR

Il carcinoma della mammella, viene caratterizzato con lo studio di:

� Parametri morfologiciGrandezza del tumore,istotipo,infiltrazione, grado di differenziazione, presenza o meno

CARCINOMA DELLA MAMMELLA

Fattori prognostici/predittivi

Grandezza del tumore,istotipo,infiltrazione, grado di differenziazione, presenza o meno di linfonodi metastaticiParametri biologici (non puramente morfologici)• Attività proliferativa (MIB1)• Assetto ormonale (ER,PR)• Prodotti di oncogeni (HER2)

Per caratterizzare i parametri biologici si impiegano metodiche:

� Immunoistochimica che permettono di evidenziare sostanze di natura

Carcinoma della mammella

Fattori pronostici

di evidenziare sostanze di natura proteica presenti nei tessuti

� Ibridazione in situ (FISH e CISH) identificazione di una sequenza di acido nucleico in tessuti o cellule

• Validità clinica�Estrogeni-Progesterone�Mib1

Marcatori prognostici/predittivi

�Mib1�Cerb-2

Queste indagini sono svolte su tutte le neoplasie perché complementari non solo all’interpretazione istopatologica ma anche per le relative implicazioni terapeutiche

Scelta degli anticorpi

Estrogeni


Progesterone


� KI67 (Mib1)

Valutazione dell’attività proliferativa delle cellule neoplastiche e normali.delle cellule neoplastiche e normali.

Si utilizza un Ac monoclonale ki67 (clone MIB1) che riconosce un antigene nucleare presente in tutte le fasi attive del ciclo cellulare

Scelta degli anticorpiMib1


� C-erb-B2

�L’anticorpo reagisce con l’oncoproteina

C-erb-B2 su tessuti fissati in formalina C-erb-B2 su tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina.

�La colorazione è localizzata nelle membrane cellulari delle cellule neoplastiche

Her-2

� Kit standardizzati

� Devono essere eseguiti accuratamente

Valutazione dello stato di HER2/neu

� Attualmente sono disponibili numerosi sistemi per

valutare lo stato di HER2/neu (Southern Blot, Dot

Blot, PCR quantitativa).

� I più frequentemente utilizzati sono la � I più frequentemente utilizzati sono la

dimostrazione dell’iperespressione di HER2

mediante indagine immunoistochimica (IHC) e

dell’amplificazione mediante ibridazione in situ

fluorescente (FISH).

Carcinoma della mammella:valutazione dello stato di HER-2/Neu

� Her 2/neu/c-erbB-2 appartiene alla famiglia

dei recettori per i fattori di crescita.dei recettori per i fattori di crescita.

� E’ un componente della via di trasduzione del

segnale coinvolto nella crescita cellulare.

� La sua localizzazione extra-cellulare lo rende

un possibile bersaglio farmacologico.

� I campioni con intensa positività per Her-2 (IHC 3+) sono elegibili per la terapia con Herceptin.

Valutazione dello stato di HER2/neu

� I campioni IHC 2+ devono essere ritestati con altro metodo, preferibilmente con indagine FISH.

� I campioni sono inizialmente testati mediante IHC.

HER2/NEU EXPRESSIONHER2/NEU EXPRESSIONIHC IHC -- HercepTest HercepTest

2+ 3+

Vysis (PathVysion) - Dakocytomation HER-2/DNA probes

� Permettono di valutare l’ amplificazione del gene HER-2 mediante FISH.

� Entrambe le metodiche prevedono l’utilizzo di due sonde a DNA marcate con sostanze fluorescenti:

HER-2 che identifica l’ intero gene HER-2 marcato con Spectrum Orange®CEP 17 è marcato con Spectrum Green® e si ibridizza con il DNA alfa-satellite localizzato in corrispondenza del centromero del cromosoma 17 (17p11.1-q11.1)

HER-2/NEU - FISH

HER2/NEU AMPLIFICATION

Low Level High Level

Problemi metodologiciProblemi metodologici

•• Tecniche di smascheramentoTecniche di smascheramentoantigenicoantigenico

•• Cloni utilizzatiCloni utilizzati•• Cloni utilizzatiCloni utilizzati•• Sensibilità dei sistemi di Sensibilità dei sistemi di rivelazionerivelazione

•• Scoring methodsScoring methods•• Controlli di qualitàControlli di qualità

Marcatori di neoplasiaMarcatori di neoplasia

•• bclbcl--2 2 -- linfomi follicolari vs linfomi follicolari vs iperplasia follicolareiperplasia follicolareiperplasia follicolareiperplasia follicolare

•• Ciclina D1 Ciclina D1 -- linfoma mantellarelinfoma mantellare

•• p53 p53

•• p80 p80 -- ALCLALCL

Marcatori di neoplasiaMarcatori di neoplasia

Bcl2Bcl2

•• Determinazione della sede primitiva Determinazione della sede primitiva di una neoplasia metastaticadi una neoplasia metastatica–– Profilo cheratineProfilo cheratine

Marcatori di differenziazioneMarcatori di differenziazione

–– Profilo cheratineProfilo cheratine

–– Marcatori melanocitariMarcatori melanocitari

–– TTF1 ecc...TTF1 ecc...

Applicazioni microbiologicheApplicazioni microbiologiche

• Identificazione di virus• Identificazione di batteri• Identificazione di virus• Identificazione di batteri

Helicobacter PyloriHPV

� Tra gli agenti virali un posto di rilievo è assegnato allo Human Papilloma Virus (HPV)

HPV e carcinoma della cervice

.

� Numerosi studi epidemiologici hanno dimostrato un innegabile legame tra infezione da HPV e sviluppo del carcinoma della cervice uterina

HPV e oncogenesi cervicale

•Sono stati identificati 100 genotipi di cui 40 presentano tropismo per il tratto ano-genitale•Vengono suddivisi in tre categorie che ne identificano il diverso potenziale oncogeno•Vengono suddivisi in tre categorie che ne identificano il diverso potenziale oncogeno

�Alto rischio (16, 18 )�Rischio intermedio (31,33,35,51,58)�Basso rischio (6, 11, 34,42,61,68)

Colorazione IIC per HPV

Ibridazione in situ

• Ibridazione in situ

ISH

HPV 16-18

1) Estrazione del DNA• Le sezioni raccolte in un tubo sterile sono state sparaffinate, reidratate e incubate per tutta la notte con proteinasi K a 37°C

PCR

notte con proteinasi K a 37°C• Inattivazione della proteinasi K a 95°C per 30’

2) Reazione di PCRPreparare una miscela di amplificazione contenente: H2O, dNTP, MgCl2, Taq-polimerase templato

La PCR avviene attraverso una serie di cicli composti da tre fasi:

�Denaturazione�Annealing

PCR

�Denaturazione�Annealing�Allungamento

Termociclatore computerizzato opportunamente programmato

PCR

P.M. Contr- Contr+ - + + +

Elettroforesi su gel di agarosio

Ibridazione inversa

Tipizzazione genotipica di HPV

Campi di applicazione

�Possibilità di individuare i ceppi coinvolti

�Possibilità di individuare lesioni latenti o preneoplastiche

�Utilità nello screening preventivo

Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie neoplastiche

CITOCHERATINE

• Famiglia di proteine che costituiscono la maggior parte dei filamenti intermedi del citoscheletro delle cellule epiteliali.la maggior parte dei filamenti intermedi del citoscheletro delle cellule epiteliali.

• In base al peso molecolare che varia da 40 a 67 kD sono numerate da 1 a 20

• La loro evidenziazione in una cellula normale o neoplastica depone quindi per una origine epiteliale


CITOCHERATINE

• Sono espresse in modo caratteristico nei diversi tipi di epiteli normali e/o neoplastici

Es: CK7 + ADK polmone CK20 - ADK polmone

-ADK colon + ADK colon

• In IIC vengono utilizzati Ac diretti contro le singole CK o cocktail di Ac variamente allestiti per identificare CK a basso/medio/alto peso molecolare


CITOCHERATINE

Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie

S-100

• L’anticorpo reagisce con una proteina presente in numerose linee proteina presente in numerose linee cellulari (cellule muscolari striate e cardiache, melanociti, elementi gliali)

• E’ positiva nei mioepiteli ma non è un marcatore specifico


S-100

Principali Ac utilizzati nella diagnostica delle patologie mammarie

Actina del muscolo liscio

• E’ un componente del sistema contrattile cellulare; è espressa dalle cellule mioepiteliali cellulare; è espressa dalle cellule mioepiteliali ma anche dai miofibroblasti stromali

• L’Ac diretto contro l’actina identifica quindi tutti gli elementi normali o neoplastici che presentano una struttura contrattile di tipo muscolare


•Actina del muscolo liscio

Sono stati identificati sei tipi di actina a seconda del tessuto muscolare di origine riconosciuti da Ac differentiriconosciuti da Ac differenti

-alfa actina muscolo liscio

-alfa actina muscolo scheletrico e cardiaco

-alfa actina muscolo liscio, mioepiteli, miofibroblasti


•Actina del muscolo liscio


Calponina

• E’ una proteina che regola la contrazione • E’ una proteina che regola la contrazione delle cellule muscolari lisce

• E’ un marcatore molto sensibile delle cellule mioepiteliali. Mostra moderata cross-reattività con i miofibroblasti

• Positività citoplasmatica


Calponina


• E-Caderina

• Le caderine sono una famiglia di proteine di adesione cellulare. Formano complessi con le adesione cellulare. Formano complessi con le proteine citoplasmatiche chiamate catenine.Questi complessi insieme con altri componenti del citoscheletro,tra cui l’actina, sono parte essenziale del sistema di adesione intercellulare e quindi coinvolti nella invasività delle cellule tumorali


• E-Caderina

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