3 GIUGNO 2015

Dott. ssa Livia Bernardi

Biologo GenetistaLaboratorio di Genetica Formale e Molecolare

Centro Regionale di Neurogenetica, ASP CZ

IL DOMINIO N-TERMINALE DELLA

PROTEINA PRIONICA: CARATTERISTICHE

E MECCANISMI PATOGENETICI

GENE DELLA

PROTEINA PRIONICA

(PRNP)

GENOTIPI…..

MUTAZIONIDEL GENE

PRNP

Le MUTAZIONI a livello del gene PRNP possono essere di 3 tipi:

• mutazioni puntiformi → mutazione “missense” →sostituzione di un AA con un altro

• mutazioni puntiformi → mutazione “nonsenso ” → formazione di codone di stop originariamente non

esistente

• inserzioni o delezioni di octapeptidi extra (nella regione N-terminale sono normali 5 repeats di

octapeptidi fra gli aminoacidi 51 e 91: la presenza di più di 3 octapeptidi extra è correlata a malattia

da prioni ereditabile).

Mead S., Eur J Hum Genet. 2006

Mutazione: frequenza ≤ 1 su 100

Polimorfismo: frequenza > 1 su 100

…….E FENOTIPI

VARIABILITA’ FENOTIPICA ASSOCIATA A MUTAZIONI NEL

GENE PRNP

• Sono state scoperte più di 30 mutazioni diverse a carico del gene PRNP,

tutte responsabili di forme di Malattia da prioni;

• Ampio spettro di variabilità fenotipica sia per quanto riguarda la

sintomatologia clinica, (GSS, Gerstmann-Straussler-Scheinker, FFI, Familial

Fatal Insomnia e CJD, Malattia di Creutzfeldt-Jacob), sia per quanto

riguarda l’età di esordio e la durata della malattia, anche nell’ambito di una

stessa famiglia, in parte spiegabile con il polimorfismo PRNP M129V.

Jeong BH et al., JKMS 2014

218 Tyr→Asn

(Alzualde et al., 2010)

Asp

MUTAZIONI NEL GENE PRNP RIPORTATE IN ASSOCIAZIONE A

FENOTIPI ATIPICI FTD-LIKE…..

• Nitrini et al., Arq Neuropsiquiatr 2001: mutazione Thr183Ala in una grande famiglia (12 affetti) con

Malattia da prioni accertata con neuropatologia con fenotipo clinico assolutamente simile alla

Demenza frontotemporale con parkinsonismo.

• Hall et al., Neurology 2005: mutazione H187R in una famiglia con demenza frontotemporale,

trasmessa con eredità autosomico dominante, anticipata nell’adolescenza da disturbi psichiatrici. La

malattia è caratterizzata da lunga durata. La neuropatologia mostra atrofia e modesta gliosi.

• Woulfe et al., 2005: mutazione Q217R in una paziente esordita a 45 anni rivelatasi una GSS con

fenotipo clinico somigliante a demenza frontotemporale (diagnosticata inizialmente come Malattia di

Pick). Neuropatologia consistente con GSS.

• Clerici et al., J Neurol 2008: mutazione Glu196Lys in una paziente di 75 anni senza storia familiare

per demenza con originariamente diagnosi di Demenza frontotemporale.

• Giovagnoli et al., Neurol Sci 2008: mutazione Pro102Leu in una famiglia con fenotipo di demenza

frontotemporale, qui riportato come nuova espressione fenotipica della malattia di Gerstmann-

Straussler-Scheinker.

• Kumar et al., 2012: inserzione di 12 octarepeat (12 OPRI) in una famiglia con FTD atipica e

atassia. Neuropatologia consistente con malattia da prioni (placche PrP positive e diffuse tangles tau-

positive).

…..E ALTRI FENOTIPI ATIPICI

Codon Amino acid change cis-codon 129 Reference

145 tyrosine to stop methionine Ghetti 1996

(Kitamoto 1993b)

PrP Angiopatia Cerebrale Amiloide (CAA) (mutazione nonsenso)

Codon Amino acid change Phenotype Reference

171 Asparagine to serine(cis

valine at codon 129)

Familial neuro- psychiatric

illness (psychotic

depression, violent

behaviour, some also have

dementia; others only

psychiatric problems).

Samaia 1997

183 Threonine to alanine Familial Alzheimer’s

disease; 4 year duration

(with dementia)

Nitsch 1998

Altri fenotipi (mutazioni missense)

6 octapeptide repeat (144 bp) insert Variable including CJD, GSS, "Alzheimer’s", atypical

dementia, "Huntington’s", etc.

Collinge

1992

9 octapeptide repeat (216 bp) insert sporadic dementia; 2.5 year duration; no

spongiform change but PrP+ve plaques.

Owen 1991Altri fenotipi (OPRD, inserzioni di octapeptidi)

LA PROTEINA

PRIONICA

• Glicoproteina di circa 250 amino acidi.

• Altamente conservata nei mammiferi (regione fra i residui 23-90

(Wopfner et al., 1999; Kim et al., 2008).

• Espressa abbondantemente nei neuroni (principalmente nelle

terminazioni sinaptiche), ma anche nel sistema linforeticolare e nei

muscoli scheletrico e cardiaco (Horiuchi et al., 1995).

• Si localizza sulla superficie esterna della membrana plasmatica

attraverso un’ancora di glicosil-fosfatidil-inositolo (GPI), in siti specifici

ricchi in colesterolo e glicosfingolipidi, denominati rafts (Taylor et al.,

2006).

• Tuttavia, alcuni dati evidenziano come essa possa risiedere anche in altri

distretti della membrana ricchi di clatrina, dai quali originerebbe il

processo endocitotico della proteina (Magalhaes et al., 2002).

• E’ proteina di secrezione →viene sintetizzata nel

reticolo endoplasmico (R) per poi essere portata, dopo

essere transitata nel Golgi (G), alla membrana

plasmatica (Orsi and Sitia, 2007).

• Durante questo tragitto, va incontro a maturazione

attraverso modifiche post-traduzionali. La prima è il taglio

del peptide segnale (i primi 22 amino acidi dell’N-

terminale, dirigono la proteina al reticolo endopalsmico),

seguita dall’attacco dell’ancora GPI al C-terminale (al

residuo Ser 231 sempre nella sequenza umana) e dalla

formazione del ponte disolfuro tra i due residui di

cisteina 179-214 (nell’uomo). Altrettanto caratterizzanti

sono le aggiunte di zuccheri complessi nei residui di Asn

181 e 197, e ciò comporta che la PrPC possa esistere in

isoforme diverse aventi una, due, o nessuna, ramificazione

glucidica.

• Dopo essere stata internalizzata, la proteina prionica viene

riciclata dopo essere stata direzionata ai lisosomi (L) per

essere degradata.

CICLO DELLA PROTEINA PRIONICA

La PrPC si muove

ciclicamente dalla membrana

plasmatica al compartimento

endosomiale e viceversa.

FUNZIONI

DELLA PROTEINA

PRIONICA

• Ruolo nel metabolismo del rame (Brown et al., 1997), e, dato che lo ione è parte essenziale di enzimi

coinvolti nella rimozione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), anche nella protezione contro lo

stress ossidativo, dato che questa lega selettivamente Cu2+ per trasportarlo attraverso la

membrana plasmatica (Cu2+ stesso stimola l’endocitosi della proteina (Pauly et al., 1998); la rimozione

dalla PrPC del dominio degli octarepeats, o la mutazione delle istidine che lo legano, aboliscono

l’effetto.

• Adesione, migrazione e differenziamento cellulare, mediante l’interazione con diversi putativi

partner funzionali (ligandi, altre proteine ma anche lipidi, acidi nucleici e metalli) che includono

molecole di adesione cellulare, proteine di membrana e della matrice extracellulare (Sorgato and

Bertoli, 2009). Tali interazioni medierebbero eventi di trasduzione del segnale, che, in linea con la

generale proprietà di cito-protezione della proteina, contrasterebbero specialmente la morte

apoptotica della cellula (rispetto ai WT, i neuroni di topi PrP-KO si sono maggiormente suscettibili

all’apoptosi indotta da deprivazione di siero (Kuwahara et al., 1999).

LIGANDI DELLA PROTEINA PRIONICA

Linden et al., 2007

STRUTTURA DELLA PROTEINA PRIONICA

• La proteina matura è divisa in due domini: dominio N-terminale (residui 23-120) e dominio C-terminale (residui 121-

231), strutturalmente indipendenti (Riek et al., 1996).

• Tutte le mutazioni patogene finora identificate nel gene PRNP si trovano nel dominio C-terminale o nel dominio N-

terminale a partire dal codone 102, con ECCEZIONE delle OPRD e OPRI (residui 51-91, che formano un segmento di

cinque copie in tandem di una sequenza di otto aminoacidi (octarepeat), e della mutazione Pro39Leu (Bernardi, Cupidi,

Frangipane et al., Neurobiol aging 2014), che invece sono localizzate nel dominio N-terminale.

• Questo ha portato a spostare tutta l’attenzione dei ricercatori sulla regione C-terminale (regione amiloidogenica, molto

conservata nei mammiferi) che è ritenuta associata alla malattia, per cui è stata più studiata della regione N-terminale

(Nunziante et al., 2003).

• La regione N-terminale è ampiamente non strutturata e flessibile , e ciò le dà il vantaggio della possibilità di

interagire con diversi ligandi, micro-(ioni rame) e macro-molecole (lipidi, proteine), a differenza delle strutture

stericamente rigide; comprende un segmento di cinque copie in tandem di una sequenza di otto aminoacidi

(octarepeat), implicato nel legame col rame, in assenza del quale non assume struttura secondaria (Brown et al., 1997).

Ha un alto grado di conservazione nelle specie (Wopfner et al., 1999), in particolare i residui 23-90, il che suggerisce

un loro importante significato funzionale (Wopfner et al., 1997; Kim et al., 2008).

• La regione C-terminale forma invece un rigido dominio globulare, contenente 3 regioni ad alfa-elica e due a

foglietto beta antiparalleli. Termina con un’»ancora» di GPI (glicosil-fosfatidilinositolo) che lega la proteina alla

superficie esterna della membrana cellulare. Questo dominio è stabilizzato da un ponte disolfuro che collega l’elica α2

con l’elica α3 e comprende due siti di glicosilazione (Donne et al., 1997).

Gill AC et al., EMBO J 2000

PROTEINE NON STRUTTURATE FLESSIBILI (DOMINIO N-TERMINALE)

• Proteine la cui funzione è direttamente correlata al disordine strutturale

• Hanno una conformazione estesa (quindi riconoscono molti ligandi) che dipende dalla

• Composizione AA caratteristica con abbondanza di prolina, non casuale.

Trasduzione del segnale

Regolazione del ciclo cellulare

Espressione genica

TRANSIZIONE DISORDINE-ORDINE: può consistere sia nell’assunzione di uno statosemplicemente più ordinato, sia di una struttura secondaria o terziaria.

BINDING PROMISCUITY: capacità di legare più target differenti. Ovviamente ciòpresuppone l’adozione di diverse conformazioni.

MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI: (fosforilazioni, acetilazioni, metilazioni,…).Proprietà molto importante per tutte le proteine la cui funzione è soggetta a modulazione.

AUMENTO DELLA VELOCITA’ DI INTERAZIONE

CARATTERISTICHE

DEL DOMINIO N-TERMINALE

• Il dominio N-terminale è fondamentale per la internalizzazione della proteina (Nunziante, Gilch&

Schatzl, 2003), e quindi nel processo di endocitosi, nella regione polibasica formata dai residui aa23–

aa28NH2-KKRPKP (Sunyachetal.,2003).

• I residui aa23–aa90 sono segnale di bersaglio per i raft ai quali si ancora la proteina tramite l’ancora

GPI (Walmsley, Zeng & Hooper, 2003).

• La regione polibasica aa23–aa30 sembra cruciale per il corretto ripiegamento della PrPC e potrebbe

regolare l’acquisizione della conformazione specifica della proteina patogena (Ostapchenko et al.,

2008).

• Media un effetto neuroprotettivo (residui aa23-aa50) sia in in vitro che in vivo (Didonna et al.,2012;

Flechsig et al.,2003).

• LEGA LO IONE RAME nella sequenza degli octarepeat ripetuti (residui aa59–aa90), evento

essenziale nel processo di endocitosi (Brown etal.,1997). Delezioni e inserzioni in questa regione

hanno effetto negativo sulla risposta della cellula allo stress ossidativo (Yin et al., 2006; Zeng et

al., 2003) e fanno aumentare la percentuale di resistenza alla digestione da proteasi della proteina

patogena.

• LEGA GLI OLIGOMERI AΒ con alta affinità mediandone l’effetto neurotossico (Parkin, 2007; Chen,

Yadav & Surewicz, 2010; Lauren et al.,2009).

• LEGA LA TUBULINA dei microtubuli del citoscheletro attraverso le regioni nei residui 23-50 e 51-

91 (regione degli octarepeat) e il legame diventa più forte quando il numero di octarepeat aumenta,

dimostrando un ruolo attivo della proteina prionica nella dinamica dei microtubuli all’interno dei

neuroni (Dong, 2008) e provocando un ostacolo al trasporto assonale nel neurone.

• LEGA L’ACETILCOLINESTERASI (AChE), proteina chiave del sistema colinergico nel tessuto nervoso,

è localizzata nei raft lipidici di membrana e nelle terminazioni sinaptiche, come la PrP. L’AChE si lega ai

monomeri PrP (a livello del dominio N-terminale, residui 23-99 e 100-120) e ne induce

l’aggregazione, modificando le proprietà strutturali delle fibrille Prp. Dopo il reclutamento nelle

fibrille PrP, l’AChE perde la sua attività enzimatica e aumenta la citotossicità mediata da PrP. L’AChE

quindi agisce come molecola ausiliaria nel ripiegamento della proteina prionica (Torrent, 2015).

IL DOMINIO N-TERMINALE LEGA:

IPOTESI SUL MECCANISMO DI CAMBIAMENTO CONFORMAZIONALE DELLA

PROTEINA PRIONICA NEI MAMMIFERI (DOMINIO C-TERMINALE)

• La conservazione attraverso l’evoluzione degli AA nel dominio C-terminale ha fatto pensare che alcuni tratti della

proteina possano essere importanti ai fini della conversione della proteina normale in quella patogena.

• Nel cavallo e nel coniglio (specie resistenti alla infezione da prioni), la strutture della proteina mostra un rigido β2-α2

loop (che per composizione in AA può fornire la possibilità di fornire legami a idrogeno nei foglietti beta) e un

contatto più vicino fra questo loop e la elica α3 (Perez 2010; Wen 2010); quindi la resistenza all’infezione da prioni

sembrerebbe dipendere dalla composizione in AA del loop β2-α2 e dalla sua interazione con l’elica α3 (Legname 2012).

• Infatti, una interruzione del contatto fra il loop β2-α2 e l’ elica α3 nelle proteine mutate (es. Q212P-GSS,V210I-

CJD, E200K-CJD, D178N-CJD-FFI, DOMINIO C-TERMINALE) le rende più flessibili, esponendo maggiormente il

residuo idrofobico e influenzando le proprietà di interazione della proteina con i suoi ligandi; queste modifiche

strutturali della proteina a livello di loop β2-α2 e elica α3 sembrano dimostrare l’esistenza di epitopi critici nella

conversione della proteina da normale a patogena (Meli 2011; Legname 2012).

LA MAGGIOR PARTE DELLE MUTAZIONI NEL GENE PRNP (DOMINIO C-TERMINALE) AUMENTA LA FLESSIBILITA’ DELLA PROTEINA RISULTANTE (MELI 2011)

• Le mutazioni D178N e E208H mostrano un leggero aumento di

flessibilità a livello dei residui 134-156.

• Le mutazioni E196K, ecc. mostrano un aumento di flessibilità fra i

residui 165-175.

• Le mutazioni V180I ecc. mostrano un deciso aumento di

flessibilità in entrambe le regioni comprese fra i residui 165-175

e 185-200.

QUINDI la variazione in flessibilità coinvolge principalmente due

regioni comprese fra i residui 165-175 e 185-200 (dominio C-

terminale) comprendenti il loop β2-α2 e la regione strutturale α2-α3.

L’aumento di flessibilità facilita l’accesso a stati conformazionali

alternativi (Meli et al., 2011), rimodellando i siti della proteina

coinvolti nel riconoscimento dei ligandi e quindi nel riconoscimento fra

molecole.

Mutazione (sostituzione di un nucleotide con diverso nucleotide)

Sostituzione di un AA con diverso AA

Aumento della flessibilità della proteina

Aumento distanza fra loop β2-α2 e elica α3, per cui ridotta

comunicazione fra questi componenti

La proteina è costretta a riorganizzare i siti reattivi

coinvolti nel riconoscimento proteina/proteina e

proteina/ligando (es. inattivazione di inibitori o attivazione di

effettori di segnali)

Gli effetti sulla flessibilità della proteina possono essere

trasmessi a tutta la catena proteica, anche a siti distanti

dalla posizione dell’AA mutato

IPOTESI MODELLO DINAMICO (MELI 2011)

Risultato finale: maggior propensione della proteina alla conversione nella proteina patogena!!!!

MUTAZIONE P39L: CARATTERISTICHE

DELL’AA PROLINA

• La prolina è un amminoacido non polare, il cui gruppo laterale ècostituito da un anello che non si adatta in una strutturasecondaria ordinata, tendendo ad interromperne la linearità.

• Più proline in sequenza si conformano a loro volta in una tipicastruttura ad elica (POLIPROLINA II (PP II), molto frequentenelle proteine ad alta flessibilità conformazionale.

• Esistono proteine che incorporano nella loro sequenza moltiresidui di prolina. Una di queste è il collagene, proteinastrutturale ubiquitaria nei tessuti animali ed umani. Graziealla sua conformazione ad elica, il collagene acquisisceproprietà fisiche e meccaniche particolari(elasticità/resistenza alla trazione).

• I domini ricchi di prolina vanno a formare delle "tasche"molecolari che interagiscono con i ligandi e sono fondamentaliquindi per la trasduzione del segnale intracellulare: infatti latrasduzione del segnale intracellulare avviene tramiteproteine che possiedono concentrazioni di prolina piùabbondanti rispetto alla sequenza proteica integrale.

MUTAZIONE P39L E IPOTESI

SUL RUOLO DEL RESIDUO PROLINA

(DOMINIO N-TERMINALE) (1)

• La regione N-terminale compresa fra i residui 37-53 (poliprolina, PPII) può cambiare nella struttura tramite

idrossilazione in un sito specifico, il residuo 44, in cervello di topi con malattia da prioni (Gill et al., 2000). Ciò

avviene durante o dopo il transito della proteina nel lume del reticolo endoplasmico, grazie al’enzima prolil-4-idrossilasi

(collagene).

• La regione PPII in altre proteine svolge un ruolo regolatorio, permettendo loro di interagire con diversi ligandi a

seconda della conformazione assunta (Siligardi e Drake, 1995; Smith et al., 1997).

• Affinchè avvenga questa idrossilazione (e quindi il cambiamento strutturale) è necessaria una sequenza di consenso

fra i residui 27-29 (Lys-Pro-Gly) e 38-40 (Tyr-Pro-Gly) (Gill et al., 2000).

MUTAZIONE P39L

E IPOTESI SUL

RUOLO DEL RESIDUO PROLINA (2)

• E’ possibile che anche per la proteina prionica, come avviene per le altre proteine con

la regione PPII, i cambiamenti della struttura PPII, permettano alla proteina di

variare il riconoscimento di diversi recettori, generando diversi segnali anche con

attività opposte (Tompa et al., 2005, Beland and Roucou, 2012).

• Si è ipotizzato che la mutazione di una prolina in questa regione polibasica (residui

23-50, aumento di flessibilità), critica per la attività neuroprotettiva della PrP (in

risposta allo stress ossidativo), possa permettere una interazione fra proteina e

ligandi più rapida, abolendone le proprietà neuroprotettive e causando effetti

deleteri (Haigh et al., 2009; Turnbaugh et al., 2011).

INOLTRE: Gli effetti sulla flessibilità della proteina possono essere trasmessi a

tutta la catena proteica, anche a siti distanti dalla posizione dell’AA mutato,

causando sia l’assunzione di uno stato semplicemente più ordinato/disordinato, sia

cambiamenti di struttura secondaria o terziaria.

QUINDI ESISTE UNA

CORRELAZIONE FRA

MUTAZIONE DELLA

PROTEINA PRIONICA E

FENOTIPO SPECIFICO?

218 Tyr→Asn

(Alzualde et al., 2010)

Asp

Jeong BH et al., JKMS 2014

MUTAZIONI

Thr183Ala , H187R, Q217R,

Glu196Lys, Pro102Leu, 12 OPRI in

fenotipo FTD-like;

MUTAZIONI

Tyr145X→CAA

Asn171Ser→disordini psichiatrici

Thr183Ala→FAD

OPRI/OPRD→CJD, GSS, AD, HD

NON ESISTE UNA PRECISA

CORRELAZIONE FRA MUTAZIONE DELLA

PROTEINA PRIONICA E FENOTIPO

CLINICO SPECIFICO

Possiamo ipotizzare che il fenotipo FTD-like

clinico e radiologico dipenda dal coinvolgimento

topografico della patologia nelle regioni

frontali prima che in altre regioni.

Questo conferma che la ricerca di mutazioni

nel gene PRNP vada considerata in tali

manifestazioni fenotipiche, in particolare dopo

esclusione delle mutazioni nei geni causativi

FTD.

IN LINEA DI MASSIMA ESISTE UNA

PRECISA CORRELAZIONE FRA MUTAZIONE

DELLA PROTEINA PRIONICA E FENOTIPO

NEUROPATOLOGICO SPECIFICO

Infatti, in fenotipi atipici con

mutazioni del gene PRNP per i quali

erano disponibili dati

neuropatologici, questi

dimostravano la presenza di

malattia da prioni (es/ Kumar

2012; Nitrini 2001, Woulfe

2005).

MUTAZIONE P39L?

• Il fenotipo clinico FTD-like associato potrebbe dipendere dalla localizzazione della

mutazione in una zona particolare del dominio N-terminale.

• Potrebbe dipendere dalla topografia delle lesioni nelle regioni frontali.

• Non si può comunque escludere che la mutazione P39L sia invece un raro polimorfismo

che predisponga il soggetto a neurodegenerazione.

• Sicuramente sarebbero di grande aiuto la neuropatologia o uno studio su topi

transgenici.

GRAZIE PER L’ATTENZIONE!