Biodiversità microbica e biotecnologie...

Dipartimento di Biologia e Chimica Agro-Forestale ed Ambientale, Università di Bari Aldo Moro

Biodiversità microbica e biotecnologie alimentari

Bari 11 Marzo 2011

Marco Gobbetti


Albero della vita e biodiversità microbica

Biodiversità microbica: un mondo ancora da scoprire


Diversità fisiologica e biochimica



Sorgenti termali contengono batteri termofili

(Thermus aquaticus)

Rocce arenarie dell’Antartide contengono

funghi (verde scuro) e alghe (verdastro)

Carotaggio di ghiacciomarino dell’Antartidecontenete alghe ebatteri

Biodiversità microbica: ambienti estremi

Biodiversità microbica negli alimenti e nel tratto gastrointestinale


“Lievito naturale”

Complesso ecosistema biologico- Più di 50 specie di LAB (appartenenti al genere Lactobacillus)

- Più di 20 specie di lieviti (appartenenti ai generi Saccharomyces, Candida)


Mappa microbiologica di 25 lieviti naturali Pugliesi


La specie è l’ultimo livello tassonomico, è giusto da un punto di vista applicativo?


Quoziente di fermentazione

FQ

0

LS12

LS42

LS43LS40LS13

LS8LS24LS44

LS1

LS27LS3LS23LS33LS

35LS

45LS38 LS

7LS47LS

14LS39LS11LS25LS

41LS

36LS32LS26LS3020

4 51 LS2LS20LS18

LS6LS

28LS48LS10LS

37LS

21LS31

LS9

LS49

LS19

LS50LS16

LS5

LS4LS

17LS15

30

25

20

15

10

5

0


(M) Acido lattico(M) Acido aceticoQ.F. =

Aroma!!


Capacità proteolitica: proteinasi e peptidasi

Valore nutrizionalearoma

aminoacidi

Peptidasi

Composti volatili responsabili del sapore ed aroma

proteine

peptidi

proteinasi

Catabolismo degli aa

PepN

PepV

PepT

Valore nutrizionaleAroma, saporeConservabilità


PepQ

PepR

Valore nutrizionaleAroma, sapore


Liberazione di aminoacidi

0

LS12

LS42

LS43

LS40

LS13 LS

8LS

24LS

44 LS1

LS27 LS

3LS

23LS

33LS

35LS

45LS

38 LS7

LS47

LS14

LS39

LS11

LS25

LS41

LS36

LS32

LS26

LS30

2045

1LS

2LS

20LS

18 LS6

LS28

LS48

LS10

LS37

LS21

LS31 LS9

LS49

LS19

LS50

LS16 LS5 LS4

LS17

LS15

FA

A (

mg

kg–1

)

0

500

1000

1500

2000

2500



I biotipi di Lactobacillus sanfranciscensis possono essere selezionati per migliorare la qualità degli alimenti ma sono stabili

durante le applicazioni industriali?

Endogenuos factors effective in cereal products:Carbohydrates,N-Sources,Minerals,Lipids, free fatty acids,Enzyme activities (protease, amylase),

Field and storage germs

Process parameters:Temperature,Dough yield,Oxygen (redox potential),Fermentation time,Number of propagation steps,

Inoculum

Lactic acid bacteria

Implicit factors: bacteriocins, phages

Yeasts Contamination flora

Product quality:

Flavour, texture, shelf life, nutritional value


Analisi RAPD-PCR di biotipi di Lb. sanfranciscensis

P7P7

P4P4M13M13

12,000

5,000

2,0001,650

1,000850

650

500400

300

bp

12,000

5,000

2,0001,650

1,000850

650

500400

300

bp

12,000

5,000

2,0001,650

1,000850

650

500400

300

12,000

5,000

2,0001,650

1,000850

650

500400

300

bp

100

12,0005,000

2,0001,650

1,000850650

500400300

bp

200

100

12,0005,000

2,0001,650

1,000850650

500400300

bp

200

100

200

100

12,0005,000

2,0001,650

1,000850650500400300

bp

LS12LS40 LS6 LS8 LS14LS44 LS3LS41 LS48SLS12LS40 LS6 LS8 LS14LS44 LS3LS41 LS48S

LS12 LS40LS6 LS8 LS14LS44 LS3LS41 LS48S


Profili RAPD-PCR di isolati da lieviti naturali propagati per 10 giorni

LS6 I34 I35 I36S

LS14 I50I49 I55I51 LS3 LS40 I7I5SP7P7

M13M13

200

100

12,000

5,000

2,000

1,650

1,000850

650500400

300

bp

200100

12,000

5,000

2,0001,650

1,000850650

500400300

bp

LS14 I50I49 I51 I55

I4

LS44 I25LS12 I9

I9LS12 I12

I12 I41 I42 I43

LS44 I41I25 I42 I43


3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1103

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 110

Fase di propagazione

Log u.f.c./g

Cinetica di crescita di Lactobacillus sanfranciscensis dopo propagazione del lievito naturale a 30°C per 6 h in dieci giorni consecutivi


Fase della propagazione

Log u.f.c./g

Cinetica di crescita di Lactobacillus plantarum dopo propagazione del lievito naturale a 30°C per 6 h in dieci giorni consecutivi



Biodiversità microbica: comunicazione cellulare nel lievito naturale

sfruttano come mediatori chimici una serie di composti chiamati

acil-omoserina-lattoni (AHLs)

Batteri Gram-negativi

Batteri Gram-positivi

sfruttano come mediatore chimico principale un peptide ribosomiale induttore (AIP)chiamato anche “peptide-feromone”

Mediatori chimici della comunicazione cellulare

Vibrio harveyi

Pseudomonas aeruginosa


0

0.4

0.8

1.2

1.6

2

2.4

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Time (h)

∆ l

og C

FU

/mL

Culture conditions

Viable cells

(log cell/mL)*

Dead/damaged cells(log cell/mL)*

Cultivable cells

(log CFU/mL)*

CB1 9.30a 7.93c 9.10a

CB1 - DC400 8.45c 9.32a 8.40c

CB1 - CR13 8.83b 8.94b 8.8b

CB1 - A7 9.33a 8.0c 9.04a

( ) = monocoltura

( ) = co-coltura con L. plantarum DC400

( ) = co-coltura con L. brevis CR13

( ) = co-coltura con L. rossiae A7

(A) (B)

Cinetica di crescita di Lb. sanfranciscensis CB1 in WFH (30°C, 24 h)


Cellule vitali e morte di Lb. sanfranciscensis CB1 in mono e co-coltura

CB1

CB1

CB1-A7

CB1-A7

CB1-CR13

CB1-CR13

CB1-DC400

CB1-DC400


Lb. plantarum DC400

Lb. sanfranciscensis 174

Lb. plantarum 20

Lb. paralimentarius 8D

Weissella cibaria 10XA16

Lb. pentosus 12H5

Pediococcus pentosaceus 2XA3

Lb. brevis CR13

Lb. reuteri D13

Inhibition vs. 174

Homeostasis

Homeostasis

Homeostasis

Inhibition vs. 2XA3

Homeostasis

Homeostasis

Homeostasis

Comunicazione cellulare nel lievito naturale


16

14

18

30S-S2

PGK

adhE

2926

222321

25

8

1310

9

51.0kDa

25.0

51.0kDa

25.0

pH 7.0pH 5.0 pH 7.0pH 5.0

16

18

30S-S2

PGK

adhE

26

222321

25

8

13109

14

29

51.0kDa

25.0

51.0kDa

25.0

pH 7.0pH 5.0 pH 7.0pH 5.0

1618

30S-S2

adhE

262223

21

8

13109

14

2925

PGK51.0kDa

25.0

51.0kDa

25.0

pH 7.0pH 5.0 pH 7.0pH 5.0

Porzioni di 2-DE gel di proteine estratte da Lb. sanfranciscensis DPPMA174

Mono-coltura Co-coltura con Lb. plantarum DC400

Mono-coltura + PlnA

� biosintesi delle proteine � metabolismo energetico � catabolismo di proteine e aminoacidi� risposta agli stress � omeostasi del potenziale redox cellulare


300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100R

ela

tive

Ab

und

an

ce

996.3

598.6

747.5

748.3

1493.7

600.0

499.3 1003.11494.41004.0500.1

1505.51009.1757.1 1202.1 1193.8708.3664.3 1009.9501.4 1513.61016.3788.8 792.6 1371.6 1549.51332.5995.0 1793.4427.9 1578.81386.6495.9

KSSAYSLQMGATAIKQVKKLFKKWGW

plantaricin A[Lactobacillus plantarum]

µg/ml

0 2 4 6 8 10 12A

rea

(mA

U*m

l)0

20

40

60

80

100

120

Lb. plantarum DC400*

Lb. sanfranciscensis 174

Lb. plantarum 20

Lb. pentosus 12H5

P. pentosaceus 2XA3

(r2= 0,99)

2,58 ppm

1,4 ppm

0,6 ppm

*(Monocolture of DC400: 0,067 ppm)

0,04 ppm



0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8O

D 5

40

nm

* **

*

*

*

DMEM

DC400

DC400

– DPPMA17

4

PlnA

DPPM

A174

24 h

48 h

72 h

0.8

0.7

0.8

0.7

0.8

0.7

0.8

0.7

0

0.8

0.7

0.8

0.7

0.8

0.7

0.8

0.7

0

Vitalità delle cellule Caco-2/TC7 dopo 24, 48 e 72 h di incubazione con laplantaricina A purificata (PlnA) da monocoltura di Lb. plantarum DC400 o da co-coltura con Lb. sanfranciscensis DPPMA174 (DC400-DPPMA174).


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

ctr 1

DC 400

EDC400/

174

E

pin A

INFg

INF g

+ D

C400/

174 E

INF g

+pin

A

T24

T48* *

*

*

*

*** ****

DMEM

DC400

DC400 –

DPPMA174

P lnA

INF-

γ

INF-

γ + DC40

0 –

DPPMA17

4

INF-

γ + PlnA0

DMEM

DC400

DC400 –

DPPMA174

P lnA

INF-

γ

INF-

γ + DC40

0 –

DPPMA17

4

INF-

γ + PlnA00

Ohm

sx

cm2

Ohm

sx

cm2

* **

* *

*

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

ctr 1

DC 400

EDC400/

174

E

pin A

INFg

INF g

+ D

C400/

174 E

INF g

+pin

A

T24

T48* *

*

*

*

*** ****

DMEM

DC400

DC400 –

DPPMA174

P lnA

INF-

γ

INF-

γ + DC40

0 –

DPPMA17

4

INF-

γ + PlnA0

DMEM

DC400

DC400 –

DPPMA174

P lnA

INF-

γ

INF-

γ + DC40

0 –

DPPMA17

4

INF-

γ + PlnA00

Ohm

sx

cm2

Ohm

sx

cm2

* **

* *

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

ctr 1

DC 400

EDC400/

174

E

pin A

INFg

INF g

+ D

C400/

174 E

INF g

+pin

A

T24

T48* *

*

*

*

*** ****

DMEM

DC400

DC400 –

DPPMA174

P lnA

INF-

γ

INF-

γ + DC40

0 –

DPPMA17

4

INF-

γ + PlnA0

DMEM

DC400

DC400 –

DPPMA174

P lnA

INF-

γ

INF-

γ + DC40

0 –

DPPMA17

4

INF-

γ + PlnA00

Ohm

sx

cm2

Ohm

sx

cm2

* **

* *

*

Resistenza transepiteliale (TEER) delle cellule intestinali Caco-2/TC7

Isolamento di batteri lattici da lievito naturale

Utilizzo del pool di lattobacilli e di enzimi microbici

Selezione per l’attività proteinasica e peptidasica specifica

Lb. brevis 14GLb. alimentarius 15M Lb. hilgardii 51BLb. sanfranciscensis 7A

Lb. sanfranciscensis E14Lb. sanfranciscensis E21 Lb. sanfranciscensis 174 Lb. sanfranciscensis 13Lb. sanfranciscensis A1 Lb. sanfranciscensis 274


St 1 2

ω-gliadins

α, β, γ-gliadins

Hydrolysed gliadins

St 1 2

ω-gliadins

α, β, γ-gliadins

Hydrolysed gliadins

ω-gliadins

α, β, γ-gliadins

Hydrolysed gliadins

regione dei frammenti di idrolisi

((11)) standardstandard gliadinicogliadinico europeoeuropeo;; ((22))impastoimpasto acidificatoacidificato chimicamentechimicamente ee ((33))impastoimpasto alal 2020%% didi farinafarina fermentatofermentatoconcon batteribatteri latticilattici selezionatiselezionati ee proteasiproteasiperper 4848 hh aa 3737°°CC..

campione glutine (ppm)

Controllo ac. chim. 18.700

Fermentato 12

R5-ELISA Sandwich e Competitiva



CAD

B. long

um

Lb. delbru

eckii s

ubsp

. bulga

ricu

s

Lb. ca

sei

Lb. plan

taru

m

B. infa

ntis

B. bre

ve

Lb. ac

idop

hilu

s

St.

ther

mop

hilu

s

Prep

arat

o VSL#

3

St.

SDS-PAGE di polipeptidi gliadinici estratti da impasti di farina di grano incubati per 24 h con i ceppi presenti nel preparato commerciale VSL#3.

J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2010 Dec;51(6):777-83.Gluten-free sourdough wheat baked goods appear safe for young celiac patients: a pilot study.Di Cagno R, Barbato M, Di Camillo C, Rizzello CG, De Angelis M, Giuliani G, De Vincenzi M, Gobbetti M, Cucchiara S.Department of Plant Protection and Applied Microbiology, University of Bari, Bari, Italy.


Lattobacilli del lievito naturale e celiachia: trial in vivo

Department of Pediatrics and European Institute for the Study of Food Induced Diseases, University of Naples, Federico II,

BY

S1

S2

- 13 celiac patients (in remission)

was enrolled

-6 patients consumed BY equivalent

to 10 g of gluten

-2 patiets consumed S1

-5 patiens consumed S2

- 60 days of administration

- Sixteen celiac patients (in remission)- 60 days of soministration of bread S2 containing 10 g of prefermented gluten

Steps:1. time 0: serologic tests (AGA;EMA, TTG), intestinal biopsy and steatocrit2. 30° day: clinical and serologic tests, steatocrit.3. 60° day: clinical and serological tests, steatocrit, intestinal biopsy4. wash-out period

Department of Pediatric Gastroenterology and Liver Unit, Sapienza University of Rome, Italy


Serology, morphometric and immunohistochemistry analyses of celiac disease

patients during challenge with fermented baked good

Celiac patient

Time EMA tTG Marsh Grade CD3 γδ CD25

S1 bread

S.A. T0 Negative 0.5 T0 42 4.8 2

T60 Negative 0.5 T3a 59.6 29.6 22

P.M. T0 Negative 1.7 T0 30 6.6 1

T60 Light positivity 9.2 T2 78.4 29.6 30

S2 bread

F.I. T0 Negative 1.6 T0 39 5.6 6

T60 Negative 1.0 T0 38 8.6 5

I.C. T0 Negative 1.9 T0 3.7 0.9 11

T60 Negative 1.1 T0 11 3.8 9

R.R. T0 Negative 0.3 T0 53 11.5 3

T60 Negative 0.3 T0 56 17.8 4

I.I. T0 Negative 0.5 T0 31 8.4 21

T60 Negative 0.3 T0 36 12.8 21

C.C. T0 Negative 0.4 T0 32 21 3

T60 Negative 0.7 T0 47 18 7


Biopsy (t0) Biopsy (t60)

CD3 (t0) CD3 (t60)


1

2

3

1

2

3

T-CD

U-CD

HC

-3 -2 -1 0 1 2 3

Fatt. 1: 63.81%

-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Fatt.

2: 3

6.19

%

Hydrocarbons

Aldehydes

Ketones

Alcohols Esters

Short chain fatty acids

Sulfur compounds

T-CD

U-CD

HC

-3 -2 -1 0 1 2 3

Fatt. 1: 63.81%

-3,0

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Fatt.

2: 3

6.19

%

Hydrocarbons

Aldehydes

Ketones

Alcohols Esters

Short chain fatty acids

Sulfur compounds

Dieta gluten-free e microbiota intestinale nei soggetti celiaci



(BMC Microbiology, submitted)

Duodenal and Faecal Microbiota of Celiac Children: Molecular, Phenotype and

Metabolome Characterization

Raffaella Di Cagno1, Ilaria De Pasquale1, Maurice Ndagijimana2, Pamela Vernocchi3, Patrizia

Ricciuti1, Francesca Gagliardi4, Luca Laghi3, Ruggiero Francavilla4, Carmine Crecchio1, M.

Elisabetta Guerzoni3, Marco Gobbetti1and Maria De Angelis1*

Dieta gluten-free e microbiota intestinale nei soggetti celiaci


Biodiversità microbica e biotecnologie alimentari

……………………

“Il ruolo dell’infinitamente piccolo, in natura, è infinitamente grande” (Louis Pasteur, 1822 - 1895)

Biodiversità microbica e biotecnologie...

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