Identificazione e tipizzazione di minisatellitiIdentificazione e tipizzazione di minisatelliti

Come per gli STRs, l’identificazione dei minisatelliti avveniva in passato mediante ibridazione di sonde ripetitive su library di DNA e successivo subclonaggio e sequenziamento dei cloni positivi.

Oggi i minisatelliti vengono identificati “in silico” nei database di sequenze genomiche con il software “tandem repeats finder”, esattamente come i microsatelliti.Data la lunghezza dei minisatelliti, non sempre è possibile amplificarli mediante PCR, ed in alcuni casi si utilizza il southern blotting. In questo caso si utilizza spesso una sonda che riconosce un motivo “core” comune a più minisatelliti, e che permette di evidenziare più minisatelliti contemporaneamente (ma senza conoscere la loro identità)

Identificazione e tipizzazione di Identificazione e tipizzazione di polimorfismi Alupolimorfismi Alu

•Identificazione: ricerca in database di elementi Alu giovani (famiglia Alu Y), che hanno una più elevata probabilità di essere stati trasposti durante l’evoluzione umana e quindi di essere polimorfici.

•Tipizzazione: tramite PCR, con primers che fiancheggiano il sito di inserzione ed elettroforesi su gel d’agarosio.

•Sono i polimorfismi più facili da analizzare

Identificazione e tipizzazione di polimorfismi Identificazione e tipizzazione di polimorfismi LINE1LINE1

•Identificazione: ricerca in database di elementi LINE1 giovani (famiglia Ta), che hanno una più elevata probabilità di essere stati trasposti durante l’evoluzione umana e quindi di essere polimorfici.

•Tipizzazione: tramite PCR (vedi figura).

SNPs: single nucleotide polymorphismsSNS: single nucleotide substitutionsUEPs: unique event polymorphismsSTRs: short tandem repeats (microsatelliti)VNTRs:variable number of tandem repeatsRFLP: restrict fragment length polymorphismLINEs: long interspersed elementsSINEs: short interspersed elementsDHPLC: denaturing high performance liquid chromatographySSCP: single strand conformational polymorphismASA: allele specific amplificationASO: allele specific oligonucleotide

LA VARIABILITA’ GENETICA COME “STRUMENTO”

A. APPLICAZIONI BASATE SUL LINKAGE• MAPPATURA GENICA MEDIANTE ANALISI DEL LINKAGE NELLE

FAMIGLIE• MAPPATURA GENICA MEDIANTE ANALISI DEL LINKAGE A

LIVELLO DI POPOLAZIONI (LINKAGE DISEQUILIBRIUM MAPPING)• DIAGNOSI PRENATALE

B. GENETICA FORENSE• IDENTIFICAZIONE PERSONALE• PATERNITA’ INCERTA

C. STUDI SULL’EVOLUZIONE • INTERSPECIE• INTERPOPOLAZIONI• DNA “antico”

In qualsiasi tipo di applicazione dovrete scegliere tra diversi tipi di marcatori. Per fare questo bisogna tener conto di una serie di caratteristiche dei diversi marcatori, che possono essere più o meno importanti a seconda dei casi:

• distribuzione sul genoma• tasso di mutazione• grado di eterozigosità • tempi tecnici dell’esperimento• costi dell’attrezzatura• costi dell’esperimento• precisione del metodo

Caratteristiche biologiche

Caratteristiche tecniche

• distribuzione sul genoma• tasso di mutazione• grado di eterozigosità

• tempi tecnici dell’esperimento• costi dell’esperimento• possibilità di tipizzare con PCR• costi dell’attrezzatura• precisione del metodo

Escludiamo, per tutte le applicazioni, polimorfismi di repeats telomeriche, macrosatelliti, varianti strutturali

Escludiamo, per tutte le applicazioni, variazioni di numero e grandi variazioni di struttura dei cromosomi

Consideriamo quindi: SNPs (include SNS e insdel di una base); piccole insdel > 1bp;microsatelliti, minisatelliti, polimorfismi Alu e LINE1

• distribuzione nel genoma: fondamentale, omogeneamente distribuiti e comuni nel genoma: OK STRs e SNPs• tasso di mutazione: poco rilevante• grado di eterozigosità: fondamentale, il numero di meiosi informative è correlato al grado di eterozigosità del marcatore:

OK STRs e parte degli SNPs (quelli con H elevata) • tempi tecnici dell’esperimento• costi dell’attrezzatura• costi dell’esperimento• precisione del metodo• possibilità di automazione su larga scala: OK SNPs

• distribuzione nel genoma: fondamentale, omogeneamente distribuiti e comuni nel genoma: OK STRs e SNPs• tasso di mutazione: molto importante, OK SNPs• grado di eterozigosità: importante

OK STRs e parte degli SNPs (quelli con H elevata) • tempi tecnici dell’esperimento• costi dell’attrezzatura• costi dell’esperimento• precisione del metodo• possibilità di automazione su larga scala: OK SNPs

• distribuzione nel genoma: sufficiente che i geni non siano in LD per una più facile trattazione statistica: OK tutti i marcatori• tasso di mutazione: non rilevante

OK tutti i marcatori• grado di eterozigosità: fondamentale, maggiore l’eterozigosità, maggiore l’informazione. OK minisatelliti, STRs• ereditarietà mendeliana: importante per una più facile trattazione statistica • tempi tecnici dell’esperimento• costi dell’attrezzatura• costi dell’esperimento• precisione del metodo• tipizzazione mediante PCR: fondamentale: spesso quantità di DNA minime• possibilità di automazione su larga scala: non rilevante

• distribuzione nel genoma: sufficiente che i geni non siano in LD per una più facile trattazione statistica: OK tutti i marcatori• tasso di mutazione: non fondamentale ma da tenere in considerazione

OK tutti i marcatori• grado di eterozigosità: fondamentale, maggiore l’eterozigosità, maggiore l’informazione: OK minisatelliti, STR• ereditarietà mendeliana: importante per una più facile trattazione statistica

OK STR, SNPs • tempi tecnici dell’esperimento• costi dell’attrezzatura• costi dell’esperimento• precisione del metodo• tipizzazione mediante PCR: non rilevante se non in relazione ai costi• possibilità di automazione su larga scala: non rilevante

• distribuzione nel genoma: non rilevante• tasso di mutazione: fondamentale, deve essere contenuto

OK SNPs, NO STRs• grado di eterozigosità: non rilevante

• tempi tecnici dell’esperimento• costi dell’attrezzatura• costi dell’esperimento• precisione del metodo• tipizzazione mediante PCR: non rilevante se non in relazione ai costi

• distribuzione nel genoma: non rilevante• tasso di mutazione: dipende dal contesto, possono essere usati SNPs, Alu, STRs, ma in modo diverso• grado di eterozigosità: +/- importante a seconda dei casi

• tempi tecnici dell’esperimento• costi dell’attrezzatura• costi dell’esperimento• precisione del metodo: fondamentale

Un allele è una variazione ad un locus

La frequenza allelica è la frequenza di un certo allele in una popolazione.Es. Popolazione composta da

20 omozigoti CC45 eterozigoti CT35 omozigoti TT

Frequenza allele C = (20 x 2 + 45)/ 2x100 = 0.425Frequenza allele T = (35 x 2 + 45)/ 2x100 = 0.575

ad esempio

Allele 1: CCGCTACGTACGGCGATCGATGGCGGCCACGCTCGCGATCGCTACGCTAAllele 2: CCGCTACGTACGGCGATCGATGGCGGCTACGCTCGCGATCGCTACGCTA

Eterozigosità della popolazione per il locus in esame = 1-0.4252-0.5752 = 0.489

Equilibrio di Hardy-Weinberg

Assunzioni:• accoppiamento casuale • no mutazione • no migrazione• no selezione• popolazione infinita

(no deriva genetica)

= p2

= q2

= 2pq

AA

Aa

aa

sia p la frequenza di A ,

e q la frequenza di a .

Le frequenze genotipiche raggiungono l’equilibrio in una generazione;Le frequenze alleliche rimangono costanti nel tempo

All’equilibrio:

La variabilità interpopolazioni

Le frecce indicano il tipo di variabilità più frequentemente osservata nelle popolazioni umane

Esiste variabilità tra popolazioni, relativamente ad un locus, quando le frequenze degli alleli sono diverse tra le popolazioni

La variabilità interpopolazioni si misura mediante distanze genetiche, La misura di distanza genetica più utilizzata è l’indice di fissazione FST

Note per gli studenti: per la variabilità intrapopolazioni fai riferimento alle diapositive 24-25

L’indice di fissazione FST

Date 2 popolazioni pop1 e pop2Date 2 popolazioni pop1 e pop2

con frequenze alleliche ad un sito polimorfico pari a con frequenze alleliche ad un sito polimorfico pari a

pp11 e q e q11 (pop1) (pop1)

pp22 e q e q22 (pop2) (pop2)

con pcon p11+ q+ q11=1 e p=1 e p22+ q+ q22 = 1 (ovvero un sito biallelico) = 1 (ovvero un sito biallelico)

Definiamo “metapopolazione” una popolazione con frequenze Definiamo “metapopolazione” una popolazione con frequenze alleliche pm e qm che sono la media delle frequenze delle due alleliche pm e qm che sono la media delle frequenze delle due

popolazioni:popolazioni:

PPm m = (p= (p11 + p + p22)/2)/2

qqmm = (q = (q11 + q + q22)/2)/2

FFST ST = (H= (HTT – H – HSS)/H)/HTTDove HT è pari a alla eterozigosità attesa della metapopolazione e HS è la media delle eterozigosità attese delle due popolazioni po1 e pop2

HT = Eterozigosità attesa della metapopolazione secondo HW = 2pmqm

HS = media delle eteroz. attese nelle due popolazioni secondo HW = (2p1q1+2p2q2)/2

Date 2 popolazioni pop1 e pop2Date 2 popolazioni pop1 e pop2Con frequenze alleliche ad un sito polimorfico pari a Con frequenze alleliche ad un sito polimorfico pari a

p1 e q1 (pop1) p1 e q1 (pop1) p2 e q2 (pop2) p2 e q2 (pop2)

con p1+ q1=1 e p2+ q2 = 1 (ovvero un sito biallelico)con p1+ q1=1 e p2+ q2 = 1 (ovvero un sito biallelico)

FFSTST = (varianza di p) / p q = (varianza di p) / p q

varianza di p = [(pvarianza di p = [(p11-p)-p)2 2 + (p+ (p22-p)-p)22] / 2] / 2

p = p medio = (pp = p medio = (p11 + p + p22) / 2) / 2

L’indice di fissazione FST(DEFINIZIONE ALTERNATIVA MA EQUIVALENTE)

pop1 p1 = 0.6; q1 = 0.4

pop2 p2 = 0.3; q2 = 0.7

pop1 p1 = 0.9; q1 = 0.1pop2 p2 = 0.1; q2 = 0.9

pop1 p1 = 1.0; q1 = 0.0pop2 p2 = 0.0; q2 = 1.0

FFSTST = = (varianza di p)(varianza di p) // ( p q ) ( p q )

FST = [(0.6-0.45)2 + (0.3-0.45)2] / 2 / (0.45 x 0.55) = 0.091

FST = [(0.9-0.5)2 + (0.1-0.5)2] / 2 / (0.5 x 0.5) = 0.640

FST = [(1.0-0.5)2 + (1.0-0.5)2] / 2 / (0.5 x 0.5) = 1.000

pop1 p1 = 0.3; q1 = 0.7

pop2 p2 = 0.3; q2 = 0.7

FST = [(0.3-0.3)2 + (0.3-0.3)2] / 2 / (0.3 x 0.7) = 0.000

Alcuni esempi per il calcolo di FST