Identificazione dei microrganismi: dalle

tecniche tradizionali alle tecnologie

molecolari più avanzate

Nicoletta Corbo

Laboratorio di Microbiologia e Virologia

Azienda Ospedaliera della Provincia di Lecco

Verona, 01/10/2015

Alexander Fleming 1929 scopre la penicillina, il capostipite dei

moderni antibiotici

Robert Koch 1881 mette a punto un sistema scientifico

per studiare i batteri, basato sui terreni di coltura batterici e sviluppa

il concetto di coltura pura

Hans Christian Gram 1884 mette a punto il metodo della

colorazione di Gram, che permette di colorare i batteri per renderli più facilmente visibili e distinguibili al

microscopio ottico

Louis Pasteur 1864 dimostra scientificamente che i microrganismi sono incapaci di generarsi spontaneamente in un

ambiente precedentemente sterilizzato e riparato da contaminazioni esterne

Verona, 01/10/2015

http://www.google.it/url?url=http://chrismielost.blogspot.com/2011_05_01_archive.html&rct=j&frm=1&q=&esrc=s&sa=U&ei=DxekU6XRHornygOavYDYBQ&ved=0CBgQ9QEwAQ&sig2=xYSBC7zZugVXr35lNo1cLA&usg=AFQjCNFd3jT3uw0Sjo2TfKBkjE-7TX2Ldwhttp://www.google.it/url?url=http://www.ulss.tv.it/Minisiti/microbiologia/Storia-della-microbiologia.html&rct=j&frm=1&q=&esrc=s&sa=U&ei=OiakU5qgIKHpywPDl4CwDw&ved=0CBYQ9QEwAA&sig2=YGfMqCBC7rJLbMPtU2pOoQ&usg=AFQjCNEtc8jO42xeH72IKuETye6AgZHZ2w

Dal Fenotipo

al Genotipo

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Fenotipo

l'insieme di tutte le caratteristiche osservabili di un organismo vivente, quindi la sua morfologia, il suo sviluppo, le sue proprietà biochimiche e fisiologiche comprensive del

comportamento

Genotipo la costituzione genetica di un

organismo vivente

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Valutazione delle caratteristiche

fenotipiche dei batteri mediante osservazione della morfologia delle

colonie

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Verona, 01/10/2015

Verona, 01/10/2015

L’utilizzo di test biochimici costituisce, insieme all’ analisi delle caratteristiche

Morfologiche: • forma • colorazione di Gram • aspetto delle colonie

Fisiologiche: • pH • temperatura di crescita • atmosfera

parametri importanti per giungere a riconoscere e distinguere una

specie microbica Verona, 01/10/2015

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Identificazione batterica

Valutazione delle caratteristiche fenotipiche dei batteri

mediante test biochimici effettuati direttamente sulle colonie

batteriche isolate

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Saggio della catalasi Pulire e sgrassare un vetrino portaoggetti.

Depositare sul vetrino una goccia di H2O2 al 3%.

Stemperare il materiale microbico nella goccia di H2O2.

Positività del saggio: formazione di effervescenza dovuta alla liberazione di

ossigeno che indica la presenza della catalasi nella coltura saggiata.

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Saggio dell’ossidasi Prelevare una colonia in esame cresciuta su substrato nutritivo agarizzato e

stemperarla su carta da filtro (Whatman n°1).

Aggiungere alcune gocce di reattivo

Positività del saggio: la coltura microbica assume, al massimo entro 10 minuti una colorazione violacea a contatto con il reattivo. La reazione è

dovuta all’enzima citocromo a3 ossidasi (componente del sistema di trasporto degli elettroni) che riduce il Tetrametil-p-fenilendiammina

idrocloride a un composto di colore viola.

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In passato veniva studiato il metabolismo batterico attraverso l’utilizzo di “macro-

metodi”

verifica dell’avvenuta reazione biochimica in provetta,

facendo crescere il microrganismo a contatto con

il substrato

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Identificazione Batterica

l’inoculo della coltura da saggiare viene inoculato in substrati che

contengono composti su cui agiscono gli enzimi implicati nello specifico

processo metabolico. In genere, il risultato dell’attività

enzimatica, è accompagnato da modificazioni cromatiche del

substrato

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Successivamente si sono sviluppati sistemi basati sul “micro-metodo” rappresentato dalle

gallerie biochimiche

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Identificazione delle specie batteriche: probabilità di una corretta identificazione

Verona, 01/10/2015

Analisi dei profili metabolici

dei ceppi batterici isolati

Trasformazione in un codice numerico

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Profilo metabolico Profilo numerico

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Le gallerie biochimiche API sono dei sistemi semiautomatici che permettono

l’identificazione dei batteri

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Il sistema si basa su gallerie costituite da differenti cupole, ognuna delle quali viene inoculata con la

sospensione batterica, permettendo di studiare più attività enzimatiche in poco spazio.

Dopo un periodo di incubazione, la cui durata varia a seconda delle diverse gallerie, è possibile procedere all’identificazione per mezzo di un lettore automatico

che misura la crescita in ogni cupola

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Tra i sistemi automatici in uso, il sistema automatico VITEK (bioMérieux), è uno

degli strumenti più comunemente usati per l’identificazione batterica

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Il sistema evidenzia la crescita batterica e le alterazioni metaboliche dei micro-pozzetti di una card di plastica

sottile, utilizzando una tecnologia basata sulla

fluorescenza

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Durante questo processo, il software compara la serie di reazioni del test alla

serie di reazioni previste per ciascun microrganismo

viene così calcolata la probabilità percentuale che si riferisce al grado di concordanza tra i due gruppi di

reazioni Verona, 01/10/2015

• Identificazione in 2-18 ore, con riduzione dei tempi di lavoro

VANTAGGI DELL’AUTOMAZIONE

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• Identificazione più accurara a livello di specie (prove

biochimiche più numerose)

VANTAGGI DELL’AUTOMAZIONE

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• Refertazione automatizzata

• Archivio dati

• Elaborazione dati: epidemiologia

VANTAGGI DELL’AUTOMAZIONE

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Spettrometro di massa, permette

l’identificazione rapida di

microrganismi, basato sulla

tecnologia MALDI-TOF

(Matrix Assisted Laser Desorption

Ionization – Time of Flight)

La spettrometria di massa MALDI-TOF MS è una tecnica analitica che consente di misurare in maniera estremamente accurata il peso molecolare di macromolecole di interesse biologico e di determinare

la loro identità in base al rapporto massa/carica (m/z)

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Si basa sull’analisi delle proteine ribosomiali contenute nel campione. Nello spettro di massa, diagramma che riporta l’abbondanza degli ioni rilevati

in funzione del rapporto massa/carica, ogni picco

corrisponde ad una proteina ribosomiale e ciascuno spettro è tipico di un microrganismo

Verona, 01/10/2015

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MALDI-TOF Il sistema è costituito da •Sorgente (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) •Analizzatore (Time Of Flight) •PC

Fornisce accurate informazioni su struttura e peso molecolare di biomolecole: • peptidi • proteine • oligonucleotidi • carboidrati • polimeri sintetici

ID microbica rapida (pochi minuti)

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MALDI-TOF MS at a glance

Desorbimento

Ionizzazione

Accelerazione

Separazione

Rilevamento

m

z =

2eU

L² t²

m: massa z: carica U: accelerazione L: durata t: tempo e: carica elementare

Rilevatore di ioni

+

+ +

+

+ +

Bersaglio

Matrice & analita

Zona di accelerazione

Campo libero

elettrodo

La pulsazione laser

colpisce la matrice e

le molecole del composto:

ionizzazione per

trasferimento di carica

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I picchi di questi spettri vengono confrontati con il profilo tipico di una specie, genere o famiglia di microrganismo, per dare una

identificazione microbica

L’identificazione microbica viene raggiunta tramite l’ottenimento di spettri,

analizzati con l’ausilio del database presente nello strumento che utilizziamo,

VITEK®MS

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IDENTIFICAZIONE RAPIDA

Trasferimento del campione in

provetta

Centrifugazione (3500 rpm per 10

min)

Semina su piastra

Incubazione (3 ore)

Identificazione VITEK MS

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Il “gold standard” per l’identificazione batterica è il sequenziamento dell’rRNA 16S

L’analisi della sequenza dell’rRNA 16S, tramite il confronto con i database di sequenze disponibili

on-line, permette di assegnare una precisa identificazione al microrganismo in esame: se

due organismi hanno 16S rRNA con più del 97% delle basi omologhe, appartengono alla stessa

specie Verona, 01/10/2015

Il sequenziamento, tuttavia, è un metodo non applicabile alla routine nei laboratori di

Microbiologia Clinica sia per la quantità di campioni da analizzare, sia per i costi di

esecuzione Verona, 01/10/2015

Verona, 01/10/2015

Verona, 01/10/2015

Verona, 01/10/2015

Verona, 01/10/2015

Verona, 01/10/2015

MRSA Surveillance

SA Nasal Complete

C. diff & C. diff/Epi

vanA for VRE

MRSA/SA SSTI

MRSA/SA Blood Culture

EV

Flu

MTB/RIF

CT/NG

GBS & GBS Lim Broth

Factor II&V

The Most Compelling Test Menu Offering….

MRSA Surveillance

SA Nasal Complete

C. diff/Epi

vanA/vanB for VRE

MRSA/SA SSTI

MRSA/SA Blood Culture

Norovirus (NEW!)

EV

Flu

MTB/RIF

CT & CT/NG

GBS

Factor II&V

BCR-ABL Monitor

HPV (Cervical CA) (NEW!)

Carba-R

Trichomonas

MRSA Gen 3

Flu/RSV

HIV Quant

HIV Qualitative

HCV Quant

BCR-ABL Ultra

Bladder CA Monitor/Symptom

Norovirus

Carba-R

MRSA Surveillance-Next Gen

Flu/RSV

CW Flu/RSV

Trichomonas

Notes: Targeted Test Menu Subject to Revision; CW = CLIA-Waived

Tests in Italics Represent Product Improvements and are Excluded from Total Test Counts

SA Nasal Complete-Next Gen

Group A/C Strep

Meningitis/Encephalitis

Pertussis

Gastro Panel

HSV 1/2 Typing

Vaginitis

GBS Ultra

HBV Quant

Breast CA Stratifier

Breast CA Signature

Pancreatic CA Monitor

EBV / NPC Screen

EBV / NPC Monitor

= US Tests

= International Tests

33 Tests

33 Tests

39 Tests

36 Tests

19 Tests

24 Tests

14 Tests

16 Tests

SA Nasal Complete-Next Gen

Pertussis

Gastro Panel

HSV 1/2 Typing

Vaginitis

CW Vaginitis

CW CT/NG

HPV (Cervical CA)

HIV Quant

HCV Quant

HBV Quant

BCR-ABL Ultra

Breast CA Stratifier

Bladder CA Monitor

Bladder CA Symptomatic

Available Now 2014-2015 2016-17 2018-19

Group A/C Strep

Meningitis/Encephalitis

GBS Ultra

CW GBS Ultra

CW Group A/C Strep

CW HPV (Cervical CA)

Breast CA Signature

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