Modulo 4: PRINCIPI DI TECNICHE DIAGNOSTICHE IN VIROLOGIA

C.I. MEDICINA DI LABORATORIOMICROBIOLOGIA CLINICACdS MEDICINA E CHIRURGIA AA 2018-2019

Modulo 4: PRINCIPI DI TECNICHE DIAGNOSTICHE IN VIROLOGIA

Giovanni Di Bonaventura, PhD

Università “G. d’Annunzio” di Chieti-PescaraNuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel 0871 3554812)Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel 0871 541519)E-mail: [email protected]

DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI

APPROCCIO GENERALE

▪ Presuppone un’adeguata diagnosi clinica:

▪ corretto inquadramento differenziale sul piano clinico per restringere lo spettro delleindagini da eseguire

▪ Buona conoscenza della patogenesi delle infezioni sospette

▪ corretto prelievo ed invio di un adeguato campione clinico

▪ Diagnosi di laboratorio indispensabile quando:

▪ sia prospettabile uno specifico intervento profilattico o terapeutico

▪ il quadro clinico può essere sostenuto da più virus non correlati (forme esantematiche, forme enteriche acute, infezioni respiratorie)

▪ sia necessario seguire “particolari” categorie di pazienti (ad esempio, immunodepressi)

▪ si predisponga il controllo di preparazioni commerciali di emoderivati

▪ si ricerchi l’agente eziologico di nuove o gravi patologie

▪ si eseguano indagini a carattere epidemiologico su una determinata popolazione


APPROCCIO GENERALE

La diagnosi di laboratorio di una infezione virale può essere eseguita seguendodue approcci differenti:

▪ approccio DIRETTO, a cui è riconducibile una ricerca di tipo virologico, si avvale di tecniche atte ad identificare il virus direttamente nel campione clinico. Ad eccezione dell’isolamento colturale, sono metodiche rapide, in grado di fornire una risposta al quesito diagnostico in poche ore o, al massimo, in giornata:

▪ isolamento virale (coltivazione)

▪ ricerca di particelle virali (microscopia)

▪ ricerca di antigeni virus-specifici (immunoenzimatica, IF)

▪ ricerca di acidi nucleici virali (biologia molecolare)

▪ approccio INDIRETTO, a cui è riconducibile una diagnosi di tipo sierologico, si avvale di tecniche in grado di rilevare nel siero dei pazienti la presenza di anticorpi controspecifici antigeni virali:

▪ ricerca di anticorpi vs antigeni virus-specifici

RICERCA DIRETTA DELL’AGENTE VIRALE


ISOLAMENTO (COLTIVAZIONE) VIRALE

E’ il GOLD STANDARD tra le metodiche utilizzate in diagnosi virologica.

I virus sono patogeni “intracellulari obbligati”,

quindi:

richiedono l’inoculazione in ospiti viventi adeguati (cioè: sensibili e permissivi)

OSPITI PER L’ISOLAMENTO DI:

▪ Virus batterici (fagi o batteriofagi)

▪ Batteri

▪ Virus animali

▪ Animale

▪ Uova embrionate

▪ Coltura cellulare animale

▪ Virus vegetali

▪ Pianta

▪ Coltura cellulare vegetale

ISOLAMENTO DI BATTERIOFAGI

▪ Inoculo batterico

▪ in fase esponenziale, seminato su agar od in brodo

▪ Aggiunta di batteriofagi

▪ l’infezione (litica) si manifesterà attraverso la:

▪ formazione di “placche” (zone chiare sulla piastra), in colture su agar

▪ riduzione della torbidità, in colture in brodo

▪ riduzione della frazione di cellule vitali

Placche di lisi


OSPITI PER VIRUS ANIMALI

▪ Animale

▪ Topo, coniglio, maiale

▪ Embrione di pollo (uova embrionate)

▪ Ancora usata per la produzione di vaccini (influenzali)

▪ Colture cellulari

Coltura di cellule adese a substrato (monostrato) oppure in sospensione (tessutoemopoietico: linfociti). Tre tipologie di coltura, a seconda dello spettro di infezione (n specie virali infettanti) e vita media:

▪ Colture “primarie”: cellule ottenute a seguito di separazione chimica/meccanica da campione bioptico. Ampio spettro di infezione virale ma vita a breve termine (1 generazione). Esempio: cellule di rene (canine, umane o di coniglio) per l’isolamento di Paramyxovirus, Enterovirus, Adenovirus.

▪ Colture semicontinue (diploidi): derivano dall’embrione umano. Spettro di infezionesimile alle primarie, possono però essere mantenute per più generazioni (fino a 100).Esempio: fibroblasti fetali umani per isolamento di HSV, VZV, CMV, Adenovirus.

▪ Colture continue o “trasformate”: cellule trasformate (immortalizzate) ed aneuploidi, sireplicano indefinitamente, sebbene presentino uno spettro di infezione più ridotto. Esempio: cellule HeLa, Caco-2, Hep-2.


TECNICA DI ISOLAMENTO

Procedura:

1.Trattamento del campione per limitare la inattivazione virale (es. neutralizzazione pH

urine; decontaminazione batterica in campioni altamente contaminati)

2.Semina del campione in coltura cellulare

3.Mantenimento ed ispezione delle colture (33-37°C; 1-2 volte al giorno)

4.Rilevazione di avvenuta replicazione virale.

▪ formazione di placche (aree localizzate di lisi/distruzione cellulare)

▪ comparsa di “effetti citopatici caratteristici” (CPE)

5.Tipizzazione del virus

Esposizione del monostrato

cellulare al campione

Effetto citopatico

(CPE o placca)

Rilevazione di antigeni virali

(virus a crescita lenta o CPE-)


TECNICA DI ISOLAMENTO


MATERIALI BIOLOGICI

Virus del morbillo. Cellule A549

(carcinoma gastrico umano).

Virus del morbillo. Sezione istologica di

biopsia polmonare in paziente

immunocompromesso con polmonite.

▪ Sincizio: cellule giganti multinucleate formate dalla fusione, virus-indotta, di cellule infette.▪ Paramyxovirus, Herpesvirus, HIV, RSV.


CYTOPATHIC EFFECT (CPE)

RSV in coltura cellulare.

Corpi di inclusione: cambiamenti istopatologici cellulari causati, direttamente od

indirettamente, dal virus:

▪ corpi del Negri (Rhabdovirus)

▪ inclusioni di Cowdry (Herpesvirus, varicella-zoster)

▪ inclusioni ad “occhio di civetta/gufo” (CMV)

CMV: inclusioni ad

“occhio di gufo”


CPE

Rhabdovirus: corpo di Negri


PLACCA LITICA

Vaiolo su cellule di rene di

scimmia (BSC40). Placca

singola, 48 h. MOI: 1

Vaiolo su cellule di rene di

scimmia (BSC40). Numerose

placche, 48 h. MOI: 100

Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-4

Formazione di placche litiche,

evidenziate a seguito di

colorazione con cristalvioletto

Molteplicità di infezione (Molteplicity Of Infection, MOI): rapporto tra numero di agenti

infettanti (batteri, virus) e numero di cellule infettate, presenti in un sistema sperimentale.

▪ Consente di isolare, tipizzare e conservare il virus.▪ Possibilità di isolare virus non sospettabili o non conosciuti al momento

dell’isolamento.▪ Importante per diagnosi precoce (HIV: in bambini nati da madri sieropositive; CMV: in

bambini da madri con infezione in atto od immunodeficienti)▪ Altamente sensibile e specifica, se associata ad ID sierologica

TUTTAVIA:▪ Richiede lunghi tempi di esecuzione, strumentazione dedicata, elevato “expertise”.▪ E’ necessario un sospetto eziologico, in quanto i virus presentano un tropismo

cellulare.▪ Dipendente dalla presenza di virus vitali nel campione (la refrigerazione inattiva i

virus «enveloped»).▪ Impossibilità di coltivare alcuni virus (HPV, EBV, HBV, HCV, rotavirus).▪ Poco sensibile (in caso di infezioni paucivirali) e specifico, se non associata ad altri

tests (sierologici).


PRO & CON

Le ridotte dimensioni virali (20-300 nm) richiedono l’utilizzo della microscopia elettronica.

Il campione viene attraversato da un fascio di elettroni in un sistema sotto vuoto; in tal modo, viene

proiettata una immagine, ingrandita centinaia di migliaia di volte, su uno schermo a

fluorescenza.

L’osservazione microscopica fornisce informazioni sulla forma, dimensioni, struttura ed

organizzazione virale. Pertanto, essa ha valore identificativo soltanto per i virus in cui tali tratti

sono peculiari.

Causa scarsa sensibilità della tecnica, il campione viene generalmente concentrato

(ultracentrifugazione) prima dell’osservazione, tranne che per campioni fecali o lesioni da HSV

(1011 virioni/ml). E’ possibile aumentare la sensibilità mediante utilizzo di anticorpi specifici

(immunomicroscopia elettronica).


OSSERVAZIONE MICROSCOPICA

La tecnica della colorazione negativa è quella più frequentemente utilizzata:

▪ adsorbimento virale su retino, quindi colorazione con un sale

metallico pesante elettron-denso (acetato di uranile, acido

fosfotungstico).

▪ colorazione del fondo ma non delle particelle virali (contrasto

negativo); in realtà, anche i virus assorbono una piccola quantità di

colorante che ne mette in evidenza alcuni dettagli strutturali.

SARS

HIV Ebola virus

HBV


OSSERVAZIONE MICROSCOPICA

▪ Consente di identificare nuovi virus (es. coronavirus della SARS)▪ Rapida (15-30 min)▪ Specifica

TUTTAVIA:▪ Scarsa sensibilità: 106-107 virioni/ml▪ Elevati costi di gestione▪ Richiesta di elevato expertise

MICROSCOPIA ELETTRONICA

PRO & CON

▪ E’ necessario disporre di sieri immuni (anticorpi anti-antigene) specifici.▪ Tecnica impiegata nella diagnosi di numerose infezioni:

▪ A seconda del virus e, quindi, della tipologia del materiale da esaminare (cellule, feci, sangue-siero) possono essere applicate differenti tecniche:

▪ Immunofluorescenza (IF)▪ Immunoperossidasi▪ Immunoenzimatica

▪ In genere, la sensibilità di queste tecniche è maggiore di quella associata all’isolamento virale.


RICERCA DI ANTIGENI VIRALI

▪ Immunofluorescenza (IF): rivelazione “fluorescente” del complesso Ag-Ab mediante tecnica «diretta» od «indiretta»

▪ IF impiegata per la ricerca di:▪ antigeni virali presenti nelle cellule epiteliali di sfaldamento delle vie respiratorie (BAL,

aspirato naso-faringeo) (adenovirus, coronavirus, VRS, virus influenzali e para) o di occhio e cute (HSV, VZV);

▪ antigene precoce pp65 di CMV nei leucociti infetti.



CMV all’interno di leucocitiCoronavirus in cellule epiteliali di sfaldamento

▪ Immunoperossidasi (IP): rivelazione “colorimetrica” del complesso Ag-Ab▪ simile alla IF, sebbene l’anticorpo sia marcato con perossidasi di rafano che, in

presenza di idoneo substrato, sviluppa una reazione colorimetrica▪ molto utile se applicata a tessuti integri, colorati per l’istochimica (definizione

delle relazioni spaziali tra antigene virale e strutture cellulari)



Ricerca di antigeni specifici mediante ELISA Ricerca immunoistochimica antigenica del West Nile virus nel cervello di hamsters infetti

▪ Immunoenzimatica (ELISA, EIA): rivelazione “colorimetrica” complex Ag-Ab.▪ “sandwich test”: anticorpo (specifico per un antigene) di cattura adsorbito ad una superficie

plastica (pozzetto o biglia); legame con anticorpo di rilevazione direttamente marcato con un enzima o viene riconosciuto da un terzo anticorpo marcato in grado di legare Fc delle Ig

▪ utilizzabile anche per antigeni “solubili”▪ non è influenzata dalla qualità (prelievo, trasporto) del campione

▪ E’ la metodica più frequentemente impiegata nei laboratori di virologia, in quanto adatta per la ricerca di antigeni virali cellulo-associati, antigeni in fase fluida (sangue, liquor, siero) od antigeni rilasciati nel surnatante delle co-colture infette.

▪ Utilizzata nella diagnosi rapida di virus respiratori (influenza, RSV), enterici (rotavirus), epatici (HBV) e HIV.



▪ Permettono la rilevazione di quantità infinitesimali di acidi nucleici virali

▪ Tecnica rapida ed altamente sensibile (sensibilità teorica: 1 virione)

▪ Trovano particolare applicazione nella ricerca di virus:

▪ difficili o impossibili da coltivare (HPV, HIV, poliomavirus)

▪ a lenta crescita (CMV, VZV)

▪ ad elevata (enterovirus) o scarsa variabilità antigenica

▪ Non influenzata dalla qualità del campione e dalla sua vitalità

▪ Differenti tipologie di saggi molecolari:

▪ Tecniche che amplificano la sequenza bersaglio (PCR, TMA)

▪ Polymerase Chain Reaction (PCR): amplificazione di DNA target e rivelazione

elettroforetica

▪ Transcription Mediated Amplification (TMA): amplificazione isotermica che impiega

una transcrittasi inversa e T7 RNA polimerasi (maggiore efficienza di amplificazione

vs PCR)

▪ Tecniche che amplificano il segnale di rilevazione (bDNA, HC):

▪ bDNA: rilevazione in chemioluminescenza (sonde marcate con fosfatasi alcalina

complementari alla molecola di bDNA)

▪ Hybrid capture (HC): ibridazione in fase liquida del DNA target denaturato con sonda

a RNA specifica per la sequenza in esame


RICERCA DI ACIDI NUCLEICI


RICERCA DI ACIDI NUCLEICI


RICERCA DI ACIDI NUCLEICI: PCR

HC assay: utilizzato per la ricerca e la genotipizzazione di HPV


RICERCA DI ACIDI NUCLEICI: HYBRID CAPTURE (HC)

DIAGNOSI SIEROLOGICA DELLE INFEZIONI VIRALI


RISPOSTA UMORALE (PRODUZIONE ANTICORPALE)

▪ La prevalente componente proteica della struttura virale rende il virione altamente immunogeno. Nel corso dell’infezione virale vengono prodotte tutte le tipologie anticorpali:

▪ IgM, si manifestano precocemente (indice di infezione in atto/recente) e solo nella “prima infezione” di soggetto non immune. Scompaiono dopo alcune settimane.

▪ IgG, si presentano più tardivamente ma persistono per anni. Sono prontamente mobilizzate a seguito dei possibili successivi contatti con l’antigene. “Controllo” virale a livello sierico. Più efficaci delle IgM.

▪ IgA secretorie mucosali, che svolgono un importante ruolo di “barriera” alla penetrazione virale delle mucose.

▪ La diagnosi sierologica si basa essenzialmente sulla ricerca di IgM o alternativamente:

▪ sieroconversione (comparsa di Ab specifici): indice di infezione (primaria) in atto

▪ aumento (≥ 4-fold) del titolo anticorpale (2 campioni: fase acuta vs convalescenza): indice di infezione (riattivazione o reinfezione) in atto.

▪ Generalmente preferita all’isolamento, la diagnosi sierologica risente della reattività crociata tra virus appartenenti alla stessa famiglia (sierotipi)

▪ Le tecniche immunologiche per la ricerca di anticorpi virali comprendono:

▪ saggi FUNZIONALI

▪ saggi su MEMBRANA

▪ saggi di LEGAME


RISPOSTA UMORALE (PRODUZIONE ANTICORPALE)

SAGGI FUNZIONALI: evidenziazione di specifiche attività derivanti dalla formazione dell’immunocomplex:

▪ Saggio di neutralizzazione: Abs specifici neutralizzano un caratteristico effetto citopatico (CPE). Rappresenta il “gold standard”, sebbene costoso e time-consuming.

▪ Reazione di inibizione dell’emoagglutinazione: Abs specifici in grado di inibire l’attività emoagglutinante di alcuni virus (influenza, parainfluenza, morbillo).

▪ Reazione di fissazione del Complemento: in presenza di Abs specifici si forma un immunocomplesso che lega il Complemento. In queste condizioni, il Complemento non può lisare gli eritrociti (sistema di rilevazione della formazione dell’immunocomplesso: Ag + eritrociti).


RISPOSTA ANTICORPALE

Titolo anticorpale. Il titolo è il reciproco della più alta diluizione del siero del paziente che mantiene attività rilevabile nei confronti di un antigene noto:

▪ neutralizzare un CPE

▪ inibire la reazione di emoagglutinazione



Nella diagnosi sierologica, il titolo anticorpale ci da informazioni sulla:

▪ sieroconversione (comparsa di Ab specifici): indice di infezione (primaria) in atto

▪ aumento (≥ 4-fold) del titolo anticorpale misurato in 2 campioni (fase acuta vs convalescenza): indice di infezione (riattivazione o reinfezione) in atto.


SAGGIO DI NEUTRALIZZAZIONE CPE


SAGGI DI INIBIZIONE EMOAGGLUTINAZIONE

SAGGIO SU MEMBRANA (Western blot): identificazione di Abs diretti verso singole e specifiche proteine virali.

▪ Procedura

1. separazione degli Ags virali (da cellule infette) mediante elettroforesi

2. trasferimento Ags su membrana

3. esposizione al siero in esame

4. sistema di rilevazione colorimetricadell’immunocomplex: Abs anti-Ig umanemarcati con enzima

5. aggiunta del substrato per l’enzima

6. rilevazione segnale (colorimetrico, chemiluminescenza)




WESTERN BLOT

SAGGI DI LEGAME (immunoenzimatico e radiometrico):

1. adsorbimento Ags su supporto solido (pozzetto o microsferule di polistirene)

2. aggiunta del siero in esame

3. rilevazione immunocomplex mediante aggiunta Ab 2ario anti-IgG umanemarcato con:

• EIA (saggio immunoenzimatico): enzima in grado di reagire con idonei substrati; reazione colorimetrica, misurata allospettrotometro.

• RIA (saggio immunoradiometrico): isotopo radioattivo (125I); segnalemisurato con un contatore di raggi .

Sensibilità RIA > EIA. Tuttavia, il saggio EIA viene comunemente preferito perchè automatizzabile, versatile, standardizzabile e non richiede radioattivo.




EIA RIA

DETERMINAZIONE DEL TITOLO VIRALE


In laboratorio può essere necessario – non soltanto a scopo diagnostico ma anche per ricerca e per la preparazione di vaccini - TITOLARE l’attività infettante dei virus, cioè determinare quante particelle virali infettanti sono presenti per unità di volume del campione biologico.

Si possono usare vari metodi, a seconda del virus.

N.B. Il numero di particelle infettanti è sempre inferiore al numero totale di virioni, in quanto durante la replicazione virale la maggior parte delle particelle che si formano è defettiva.

Il rapporto particelle infettanti/totali può, pertanto, essere anche 1:200


MICROSCOPIA ELETTRONICA

La microscopia elettronica può essere utilizzata anche per valutare il titolo viralepresente in un campione.

1. La sospensione virale viene posta su un retino per ME e colorato.

2. Alla sospensione viene aggiunta una quantità nota di sferedi latex.

3. Il rapporto relativo sfere-virus fornisce una stima della

carica virale.

▪ Non è una tecnica standardizzata e di uso frequente

▪ Poiché richiede un sufficiente numero di particelle virali (scarsa sensibilità), tale tecnica è adatta per la diagnosi di infezioni con massiva eliminazione virale (Rotavirus)

▪ Aggiunta di anticorpi specifici per aumentare la sensibilità (immunoelettromicroscopia)

▪ Generalmente si tende a sovrastimare il titolo Microfotografia di una goccia contenentemicrosfere in lattice (sferiche) ed unità di virus vaccinico (Poxvirus) (più piccole, forma a “mattone”).(Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, 2001)


SAGGIO DI PLACCA

Titolo virale (ufp/ml) = concentrazione di unità infettanti in grado di indurre

la formazione di placche (ufp) in cellule animali in coltura od in uova

embrionate

Titolo virale = 100 ufp (unità formanti placca) x 105 (fattore diluizione) = 1 x 107 ufp/ml


SAGGIO DI PLACCA (PLAQUE ASSAY)


Formazione di “pocks” emorragici indotte da cowpox virus sulla membrana corion-allantoidea (CAM) di embrioni di pollo, a seguito di incubazione per 3 gg a 37.5°C.


INOCULAZIONE DI UOVA EMBRIONATE


Davis, Duylbecco, Eisen, Ginsberg “Microbiology” 4th ed, J.B. Lippincott 1990, Fig. 48-1

Titolo virale = reciproco della max diluizione virale che causa emoagglutinazione = 32 unità HA/ml

1. Allestire diluizioni seriali “2-fold” del campione (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, …)2. Aggiungere 1% RBC animali (maiale, pollo)3. Incubare a +4°C per 1-2 h4. Lettura risultati


SAGGIO DI EMOAGGLUTINAZIONE

Saggio di emoagglutinazione. Sette differenti campioni, numerati da 1 a 7, sono stati diluiti serialmente come indicato nella prima riga, esposti ad eritrociti di pollo, ed incubati in ghiaccio per 1-2 h. I pozzetti dell’ultima riga non contengono virus (ctrl negativo). Il titolo anticorpale è indicato a destra dell’ultima colonna.(Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-8)


SAGGIO DI EMOAGGLUTINAZIONE

Tecnica Quantità (per ml)

Microscopia elettronica 1010 particelle EM

Saggio in uova embrionate 109 egg ID50

Saggio di formazione di placca 108 ufp

Saggio di emoagglutinazione 103 unità HA

Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Table 2-4

sen

sib

ilità


SENSIBILITA’ TECNICA

Modulo 4: PRINCIPI DI TECNICHE DIAGNOSTICHE IN VIROLOGIA

Documents

Transcript of Modulo 4: PRINCIPI DI TECNICHE DIAGNOSTICHE IN VIROLOGIA