Università degli Studi di Torino Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie Molecolari

Corso di Immunologia Molecolare

Alessia Bachmann

I recettori per IL-10 e IL-9

A.A. 2006/2007

Recettoreper l’ Interleuchina 10

Espressione di IL-10R• Tessuti non ematopoietici

• Milza, timo e PBMC alti livelli

poco

Cellule dendritiche

• Altre cellule: oligodendrociti epidermiche

Thomson AW and Lotzze MT, The Cytokine Handbook, 1:603 Fourth Edition (2003)

macrofagi

linfociti T e B

neutrofilimonociti

cellule NK

Caratterizzazione di IL10-R• cDNA di IL-10R1 murino isolato da linee di macrofagi e mast cell mIL-10R1 mRNA codifica per un polipeptide di ~110 KDa

• cDNA di IL-10R1 umano isolato da library di cellule di linfoma hIL-10R1 mRNA codifica per una proteina di 90-110 KDa

• le sequenze aminoacidiche murine e umane sono identiche per il 60% e simili per il 73%

• IL-10R umano è specie-specifico; IL-10R murino lega sia IL-10 di topo sia di uomo

• IL-10R2 inizialmente clonato come recettore orfano; nel 1997 si scoprì che era la seconda catena essenziale nel complesso IL-10R

Donnelly RP et al, The expanded family of class II cytokines that share the IL-10 receptor-2 (IL-10R2) chain, J Leukoc Biol, 76: 314, 2004

Thomson AW and Lotzze MT, The Cytokine Handbook, 1:603, Fourth Edition (2003)

Struttura di IL-10R• Appartiene alla classe II della famiglia dei recettori per le citochine

• E’ un eterodimero composto da due catene molto simili tra loro: IL-10R1 e IL-10R2, quest’ultima è condivisa con recettori per altre citochine

Pletnev S et al, BMC Struct Biol, A model of the ternary complex of interleukin-10 with its soluble receptors, 28: 10, 2005

Donnelly RP et al, The expanded family of class II cytokines that share the IL-10 receptor-2 (IL-10R2) chain, J Leukoc Biol, 76: 314, 2004

•Entrambe hanno un dominio extracellulare di 200aa, un’elica transmembrana di 20aa e un dominio intracellulare che contiene 322aa (IL-10R1) o 62aa (IL-10R2)

IL-10R1 ha costanti di legame nanomolari per IL-10

IL-10R2 ha poca affinità per l’IL-10; stabilisce invece un legame migliore con il complesso binario IL-10/IL-10R1

..Premesse..

..Conseguenze..

Yoon SI et al, Conformational changes mediate IL-10R2 binding to IL-10 and assembly of the signaling complex, J Biol Chem, 2006 Sep 18; [Epub ahead of print]

Zdanov A, Structural features of the interleukin-10 family of cytokines, Curr Pharm Des,10: 3873, 2004

E’ stato dimostrato:

Si è potuto invece studiare e cristallizzare il complesso IL-10/sIL-10R1

E’ difficile, se non impossibile, ottenere un complesso ternario IL-10/IL-10R1/IL-10R2 stabile capace di cristallizzare

Zdanov A, Structural features of the interleukin-10 family of cytokines, Curr Pharm Des,10: 3873, 2004

Pletnev S et al, BMC Struct Biol, A model of the ternary complex of interleukin-10 with its soluble receptors, 28: 10, 2005

Studio dei recettori solubili

Pletnev S et al, BMC Struct Biol, A model of the ternary complex of interleukin-10 with its soluble receptors, 28: 10, 2005

Struttura del complesso IL-10/sIL-10R1/sIL-10R2

Molecola caratterizzata da una duplice simmetria nella quale ogni dominio di IL-10 è legato a 2 catene di recettore

In soluzione la stechiometria del complesso è 2IL-10:2sIL-10R1:2sIL-10R2

E’ stato dimostrato con la tecnica FRET (fluorescence resonance energy transfer), potente strumento per determinare se due molecole interagiscono nelle cellule vive, che:

• le catene IL-10R2, costitutivamente espresse, sono associate in membrana nel complesso recettoriale dell’ IL-10

• IL-10R1 e IL-10R2 sono pre-assemblate nella membrana cellulare anche in assenza del ligando IL-10

Krause CD et al, Interactions among the components of the interleukin-10 receptor complex, Biochem Biophys Res Commun, 340:377, 2006

L’interazione tra IL-10R1 e IL-10R2 è comunque relativamente debole: la cellula è così sensibile simultaneamente a molti ligandi i cui recettori utilizzano la catena IL-10R2

Interazioni tra le catene recettoriali

Attraverso studi di mutagenesi, di legame e di cristallografia è stato dimostrato che:

Poiché IL-10R1 e IL-10R2 sono associati in membrana, IL-10R2 regolerebbe la rapida attivazione o inattivazione del segnale indotto dall’ IL-10

Nel complesso IL-10/IL-10R1 il recettore media un cambiamento conformazionale su IL-10 che permette il legame produttivo di IL-10R2

Yoon SI et al, Conformational changes mediate IL-10R2 binding to IL-10 and assembly of the signaling complex, J Biol Chem, 2006 Sep 18; [Epub ahead of print]

Assemblaggio del complesso ternario

E’ confermato il meccanismo sequenziale di assemblaggio del complesso recettoriale

Trasduzione del segnale

Kotenko SV and Langer JA, Full house: 12 receptors for 27 cytokines, Int Immunopharmacol, 4: 593, 2004

JAK1 e Tyk2 sono costitutivamente legati rispettivamente a IL-10R1 e IL-10R2

Attivazione di JAK1 e Tyk2 che fosforilano le Tyr 427 e 477 di IL-10R1

Queste stesse tirosine fosforilate di IL-10R1 reclutano STAT 3

Dimeri di STAT3-P traslocano nel nucleo dove si legano alla Gamma-activated sequence (GAS)

Murray PJ, Understanding and exploiting the endogenous interleukin-10/STAT3-mediated anti-inflammatory response, Curr Opin Pharmacol, 6: 379, 2006

L’ IL-10 può:

• ridurre selettivamente l’espressione di set di geni

• bloccare l’espressione di geni attraverso un meccanismo generale (blocco FT o induzione RNasi)

Azione anti-infiammatoria

~15-20% dei geni indotti dal LPS

Murray PJ, Understanding and exploiting the endogenous interleukin-10/STAT3-mediated anti-inflammatory response, Curr Opin Pharmacol, 6: 379, 2006

…Come i patogeni sfruttano il pathway di IL-10…

… ci sono ancora tante domande …

Quali sono precisamente i geni regolati dall’ IL-10 che mediano l’AIR?

Come fanno i prodotti dei geni attivati da IL-10 a regolare così tanti target infiammatori?

Molte citochine attivano STAT3, ma solo IL-10 sembra attivare il pathway dell’AIR. Qual è la differenza tra IL-10 e le altre citochine che attivano anch’esse STAT3?

La regolazione della risposta anti-infiammatoria da parte di IL-10 avviene solo nei macrofagi e nelle cellule dendritiche o è più diffusa?

Come si può sfruttare il pathway endogeno anti-infiammatorio per curare l’infiammazione cronica e acuta in diverse malattie?

Murray PJ, Understanding and exploiting the endogenous interleukin-10/STAT3-mediated anti-inflammatory response, Curr Opin Pharmacol, 6: 379, 2006

Recettoreper l’ Interleuchina 9

Caratterizzazione di IL9-R• IL-9R murino, scoperto nel 1990, è un polipeptide di 468 aa

• IL-9R umano è una proteina di 522 aa con il 53% d’identità con la molecola presente nel topo

Thomson AW and Lotzze MT, The Cytokine Handbook, 1:347, Fourth Edition (2003)

• Nell’uomo, invece, ci sono almeno 4 pseudogeni con ~90% di omologia con il gene di IL-9R, il quale è localizzato nella regione subtelomerica dei cromosomi X e Y

• Nel topo, il gene per IL9-R è presente in singola copia ed è composto da 9 esoni e 8 introni

• Sono stati identificati mRNAs di IL9-R che non hanno la sequenza codificante per i domini transmembrana e citoplasmatici, risultato di uno splicing alternativo; è un evento raro

Li X, The common gammac-cytokines and transplantation tolerance, Cell Mol Immunol, 1:167, 2004

• E’ un recettore eterodimerico composto da una catena specifica α e dalla catena γ, che è condivisa con recettori per altre interleuchine (IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, IL-21)

Struttura di IL-9R

• IL-9Rα appartiene alla superfamiglia dei recettori per l’ematopoietina di tipo I caratterizzati dalla mancanza di attività tirosin-chinasica

• IL-9Rα lega IL-9 con alta affinità ma non è capace di mediare da sola il segnale

Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004

Trasduzione del segnale

Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004

• In seguito al legame dell’ IL-9, si attivano le JAK che fosforilano IL-9Rα attivando così i pathway di segnalazione

• JAK1 e JAK3 sono costitutivamente legate rispettivamente a IL-9Rα e γc

• le JAK si legano a una regione ricca in prolina chiamata BOX1

1) STAT

Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004

Per l’attivazione di STAT sono necessarie due regioni nel dominio citoplasmatico di IL-9Rα:

- Il BOX1(ricco in prolina) al quale si associa JAK1

- La tyr 407 che, una volta fosforilata, recluta i fattori STAT-1, -3 e -5

Le molecole di STAT-P dimerizzano e migrano nel nucleo, dove regolano l’espressione di geni target

2) IRS e PI3 Kinase

Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004

Le proteine IRS-1 e IRS-2 (insulin receptor substrate) contengono i domini:

- PTB (protein tyrosine binding)

- PH (pleckstrin homology)

- e siti per la fosforilazione di tyr e ser/thr

In seguito alla fosforilazione delle tirosine, le IRS reclutano proteine segnale contenenti il dominio SH2, come p85 (subunità regolatoria della PI3K), Grb-2 e PLCγ

3) MAP kinases

Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004

In realtà non si conosce ancora la proteina scaffold che unisce IL-9R alla cascata delle MAPK

Il legame di IL-9 induce il reclutamento e la fosforilazione della proteina adattatrice SHC, la quale lega cosi Grb2

Grb2 porta poi in membrana lo scambiatore SOS, che attiva RAS, quindi RAF, MEK…..

Down-regolazione del segnale

Degradazione di IL-9R attraverso il pathway ubiquitina-proteosoma

Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004

Attivazione di fosfatasi

L’IL-9 stessa induce l’espressione di 3 membri della famiglia dei soppressori SOCS: cytokine-inducible SH2-containing

protein (CIS), SOCS2 e SOCS3

Dalla crescita dipendente da IL-9 alla proliferazione tumorale autonoma: 2 modelli sperimentali

Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004

A: Dopo settimane di coltura, da cellule responsive all’IL-9 si possono ottenere cellule-T indipendenti dalle citochine altamente tumorigeniche in vivo

B: Cellule dipendenti da IL-9 trasfettate con IL-9R mutato (senza la tyr 407), possono, anche se con minor frequenza, dare origine a cellule tumorali indipendenti dalle citochine

• Thomson AW and Lotzze MT, The Cytokine Handbook, Fourth Edition (2003)

• Pletnev S et al, A model of the ternary complex of interleukin-10 with its soluble receptors, BMC Struct Biol, 28:10, 2005

• Donnelly RP et al, The expanded family of class II cytokines that share the IL-10 receptor-2 (IL-10R2) chain, J Leukoc Biol, 76:314, 2004

• Yoon SI et al, Conformational changes mediate IL-10R2 binding to IL-10 and assembly of the signaling complex, J Biol Chem, 2006 Sep 18; [Epub ahead of print]

• Zdanov A, Structural features of the interleukin-10 family of cytokines, Curr Pharm Des,10:3873, 2004

• Krause CD et al, Interactions among the components of the interleukin-10 receptor complex, Biochem Biophys Res Commun, 340:377, 2006

• Renauld JC, Class II cytokine receptors and their ligands: key antiviral and inflammatory modulators, Nat Rev Immunol, 3:667, 2003

• Williams LM et al, Interleukin-10 suppression of myeloid cell activation--a continuing puzzle, Immunology, 113:281, 2004

• Kotenko SV and Langer JA, Full house: 12 receptors for 27 cytokines, Int Immunopharmacol, 4:593, 2004

• Murray PJ, Understanding and exploiting the endogenous interleukin-10/STAT3-mediated anti-inflammatory response, Curr Opin Pharmacol, 6:379, 2006

• Li X, The common gammac-cytokines and transplantation tolerance, Cell Mol Immunol, 1:167, 2004

• Knoops L and Renauld JC, IL-9 and its receptor: from signal transduction to tumorigenesis, Growth Factors, 22:207, 2004

Bibliografia