Microrganismi

• I microrganismi sono organismi viventi

estremamente piccoli, microscopici,

unicellulari

• I microrganismi si trovano in quasi tutti gli

ambienti naturali

Gram-positivi

Gram-negativi

I batteri si suddividono in:

Colorazione di Gram

• La colorazione di Gram è un esame di laboratorio che

permette la classificazione dei batteri in Gram-positivi e

Gram-negativi.

• Fu messo a punto dal medico danese Hans Joachim

Christian Gram (1884), e mette in evidenza alcune proprietà

fondamentali della parete cellulare dei BATTERI.

STRUTTURA DELLA PARETE CELLULARE BATTERICA

STRUTTURA DELLA PARETE CELLULARE BATTERICA

Step 1

Versa 1-2 gocce di campione su

un vetrino. Spargilo uniformemente

sul vetrino per formare una pellicola

sottile. Lascialo asciugare all'aria.

Con il caldo puoi fissare la

pellicola, facendo passare

velocemente il vetrino due o tre

volte su una fiamma. Non

scaldarlo troppo, per evitare la

distorsione del campione

Step 2

Bagna il campione con del

cristalvioletto. Attendi 30 secondi. In

soluzioni acquose il cristalvioletto si

dissocia in CV+ e ioni di cloro (Cl-).

Questi ioni penetrano le pareti e le

membrane delle cellule Gram-positive

e Gram-negative. Lo ione CV+

interagisce con le componenti cariche

negativamente delle cellule batteriche

per tingerle di viola.

Step 3

Lava via delicatamente il

cristalvioletto con dell'acqua

del rubinetto. Non usare troppa

acqua, o rischierai di rimuovere

le macchie dei batteri gram-

positivi.

Step 4

Bagna il campione con dello

iodio. Lascialo riposare per almeno

3 secondi. Lo iodio, in forma di ioni

caricati negativamente, interagisce

con il CV+ per formare grandi

complessi di cristalvioletto e iodio

(complessi CV-I) negli strati interni

ed esterni delle cellule. Lo iodio

agisce come agente fissante per il

colore viola delle cellule.

Step 5

Lava via delicatamente lo iodio

con dell'acqua del rubinetto

Step 6

Decolora il campione aggiungendo alcol tenendo il

vetrino inclinato, in modo da far defluire subito il

liquido. Interrompi l'operazione quando il liquido

residuo è trasparente. Il passaggio di decolorazione è

fondamentale e deve essere eseguito nei tempi giusti.

Se lascerai l'agente decolorante troppo a lungo sul

campione rimuoverai le macchie viola sia dalle cellule

gram positive che da quelle gram negative. Il

decolorante, interagisce con i lipidi della membrana

cellulare batterica. Un batterio gram-negativo perderà

la sua membrana esterna, permettendo la fuoriuscita

dei complessi CV-I. Al contrario, una cellula gram-

positiva diventerà disidratata in seguito al trattamento

con etanolo, intrappolando i complessi CV-I all'interno

della parete cellulare peptidoglicolica multistrato del

batterio. Dopo la decolorazione, le cellule gram-

positive rimarranno viola e quelle gram-negative

perderanno il colore.

Step 6

Lava delicatamente via il

decolorante con dell'acqua del

rubinetto

Step 7

Bagna il campione con della

safranina di contrasto. Attendi 30

secondi. Il liquido di contrasto viene

applicato per ultimo per macchiare

con un colore rosso o rosa i batteri

gram-negativi decolorati. E'

possibile sostituire alla safranina

della fucsina basica, che macchia in

modo più intenso i batteri

anaerobici, ma si tratta di una

soluzione meno usata.

Step 8

Lava via delicatamente la

safranina in eccesso con

dell'acqua del rubinetto

Step 9

Lascia asciugare all'aria il vetrino

dopo aver scolato l'acqua . La

colorazione è terminata.

Step 10

Esamina il vetrino sotto la luce

del microscopio. I batteri gram-

positivi saranno viola, perché

macchiati dal cristalvioletto, che è

intrappolato all'interno delle loro

spesse pareti cellulari. I batteri

gram-negativi saranno rosa, perché

macchiati dalla safranina di

contrasto, dal momento che le loro

sottili pareti cellulari non sono state

in grado di trattenere i cristalvioletti

durante la decolorazione.

Step 11

RISPOSTA DELLA PARETE BATTERICA ALLA

COLORAZIONE DI GRAM

Gram-positivi

Gram-negativi

I batteri si suddividono in:

• I batteri possono essere ulteriormente classificati sulla base della loro forma al

microscopio, più comunemente come cocchi (sferici) o bastoncelli (cilindrici).

• Le specie di batteri più comuni in ognuno dei quattro gruppi individuati da questa analisi

sono le seguenti:

• I cocchi gram-positivi sono generalmente Stafilococchi (che significa cocchi in gruppi)

o Streptococchi (che significa cocchi in catene).

• I bastoncelli gram-positivi includono Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, e Listeria.

• I cocchi gram-negativi sono più comunemente Neisseria.

• I bastoncelli gram-negativi sono suddivisi ulteriormente come segue:

– Bastoncelli gram-negativi coccoidi (o coccobacilli) che includono

Bordetella, Brucella, Haemophilus, Pasteurella.

– Gli altri bastoncelli gram-negativi includono E. coli, Enterobacter,

Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, e molti

altri

Cinetica della divisione cellulare

La curva di crescita

• Osservata quando i microrganismi vengono coltivati in terreno liquido (brodo)

• Misura la variazione della “quantità” (massa totale o concentrazione) di batteri

nel tempo:

• rappresentazione grafica di tipo “semilogaritmica”

• Log (concentrazione cellulare espressa come Log10 CFU/ml, dove CFU=

unità formanti colonie) vs tempo

• Generalmente, si articola in 4 fasi (periodi) distinte e sequenziali

Fase di latenza (lag phase)

• Fase di adattamento metabolico: • Sintesi di nuovi enzimi per il metabolismo cellulare

• Sintesi di nuovi componenti strutturali cellulari

• Numero cellulare costante; lieve aumento volumetrico

• Durata variabile (specie-specifica): • in alcuni casi può essere di breve durata od assente

Fase esponenziale (log phase)

• Tutti i microrganismi sono in fase di riproduzione attiva • Gli eventi riproduttivi (di ciascuna cellula della popolazione) non avvengono nello

stesso tempo (coltura non sincronizzata)

• Velocità di crescita costante nel tempo: • Aumento del numero cellulare

• Aumento della massa cellulare totale

• Popolazione uniforme per proprietà chimico-fisiche

• Chiamata anche fase logaritmica

Fase stazionaria

• Numero totale di cellulare vitali rimane costante: • Arresto della riproduzione

• Tasso riproduttivo controbilanciato dal tasso di mortalità

• Possibili cause: • Raggiungimento di una densità critica di popolazione

• Accumulo dei cataboliti (azione tossica)

• Limitazione dei nutrienti

• Limitata disponibilità di O2

Fase di morte (declino)

• Morte cellulare a velocità esponenziale

• Morte: perdita irreversibile della capacità di riprodursi

• In alcuni casi, il tasso di mortalità rallenta e causa un

accumulo di cellule resistenti

PREPARAZIONE DEI TERRENI PER LA

COLTIVAZIONE DEI BATTERI

I terreni sono dei particolari substrati

utilizzati per l'allestimento delle

colture batteriche.

I batteri sono dei microorganismi

presenti ovunque suolo, aria, cibi e

su tutte le superfici.

TERRENI DI COLTURA

I terreni di coltura si dividono in due grandi categorie:

• Liquidi in presenza di germi possono dar luogo a intorbidimento,

sedimentazione, pellicola superficiale o sviluppo di gas.

• Solidi si ottengono per opportuna aggiunta di agar in terreni liquidi.

Questi terreni non consentono movimento al microorganismo che di

conseguenza è costretto a crescere nel punto ove è stato seminato. Le

singole colonie possono essere catalogate in base alla loro forma, colore,

superficie, margine, aspetto e grandezza

A sua volta i terreni si possono dividere in:

• Generici che vengono utilizzati per la crescita di una vasta gamma di

mocroorganismi

• Specifici che vengono utilizzati per il riconoscimento e l'isolamento di

determinati batteri

Semina su piastre di agar

CHEMIOTERAPIA (definizione)

Paul Ehrlich, 1910

Disciplina farmacologica volta alla ricerca

di sostanze chimiche artificiali e naturali dotate di

tossicità selettiva nei confronti degli agenti

responsabili di infezioni, infestioni, neoplasie o

disordini immunologici

SI DISTINGUONO, IN FUNZIONE DEI DIVERSI BERSAGLI, TRE

SETTORI DELLA CHEMIOTERAPIA:

1) ANTIMICROBICA

2) ANTIBLASTICA

3) IMMUNOMODULANTE

La scoperta della penicillina

La storia degli antibiotici ha inizio nel 1928,

quando Fleming, studiando varianti dello

stafilococco, osservò che una muffa che

contaminava una delle sue culture aveva

inibito intorno a sé la crescita dello

stafilococco.

Inoltre, Fleming potè osservare che il

brodo di coltura in cui erano cresciuti

i funghi possedeva un potente effetto

inibitorio nei confronti di molti

microrganismi.

Poiché la muffa apparteneva al genere

Penicillum, Fleming chiamò questa

sostanza antibatterica PENICILLINA

Alexander Fleming

6 August 1881 – 11 March 1955

Penicillium notatum

Cos’è un farmaco antibatterico

ANTIBIOTICO Molecola naturale a basso P.M., prodotta dal

metabolismo di un microrganismo:

Actinomiceti (Streptomyces), Miceti

(Penicillium, Cephalosporium), in grado di

inibire la crescita di altri microrganismi e/o

causarne la distruzione

CHEMIOTERAPICO Farmaco ad attività antibatterica prodotto per

sintesi chimica (analogo strutturale di un

antibiotico)

AGENTE ANTIBATTERICO

Composto in grado di interferire con la crescita e la

moltiplicazione batterica; contrariamente al

disinfettante, è attivo solo verso batteri

metabolicamente attivi

Caratteristiche ideali di un agente antimicrobico

• Adeguata attività antimicrobica

• Scarsa o nulla attività sulla flora commensale e sui

meccanismi di difesa dell’ospite

• Tossicità selettiva

• Attivo a basse concentrazioni

• Stabile, economico, facilmente somministrabile

• Raggiunge adeguate concentrazioni tissutali

• Assenza di effetti collaterali e/o sistemici

• Assenza di resistenze nella popolazione microbica

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1983-1987 1988-1992 1993-1997 1998-2002 2003-2007

Anni

Spellberg B et al., Clin Infect Dis, 2004; Fox JL, Nature Biotechnology, 2006

Numero di nuovi farmaci antibatterici approvati dalla

“Food and Drug Administration” dal 1983 ad oggi N

um

ero

di n

uo

vi

farm

aci

an

tib

att

eri

ci

Meccanismo di azione degli antibiotici

DNA RNA

DHFA THFA Ribosomi

30S —

50S —

Inibitori della DNA Topoisomerasi

Chinoloni

2-Piridoni

Inibitori della sintesi dell’RNA

Rifamicine

Sintesi proteica

inibitori della subunità 30S

Tetracicline

Glicilcicline

Aminoglucosidi

inibitori della subunità 50S

Macrolidi

Cloramfenicolo

Lincosamidi

Streptogramina B

Altri inibitori

Oxazolidinoni

GE-2270A (EF-Tu)

Everninomicina

Inibitori della sintesi della

parete batterica

Penicilline

Cefalosporine

Monobattami

Carbapenemi

Ramoplanina

Bacitracina

Vancomicina

Teicoplanina

Cicloserina

Fosfomicina

Parete

cellulare

Inibitori del metabolismo

folico dipendente

Sulfonilamide

Trimetoprim

Membrana cellulare

Antibiotici attivi a

livello della membrana

cellulare

Polimixine

Defensine

Magainine

Chu DTW e coll., 1996

Antibiotico-resistenza

Uno stipite batterico è resistente ad un farmaco quando:

• è in grado di moltiplicarsi in presenza di concentrazioni di farmaco che

risultano inibitorie per la massima parte degli stipiti della stessa specie

• è in grado di moltiplicarsi in presenza di concentrazioni del farmaco pari

a quelle massime raggiungibili nel corso dell’impiego terapeutico

• L’antibiotico resistenza è una proprietà geneticamente trasmissibile del

microrganismo.

Significato “clinico” della resistenza

I ceppi resistenti sopravvivono in presenza di concentrazioni raggiunte in

vivo a livello sierico dall’antibiotico in seguito a somministrazione di

normali dosi terapeutiche.

La resistenza predice il possibile fallimento della terapia antibiotica

Misura della sensibilità batterica ad un antibiotico:

MIC e MBC

Il metodo più corretto per determinare l’efficacia di un

antibiotico nei confronti di un microrganismo consiste nello

stabilire, per ogni farmaco antibatterico:

• la concentrazione minima inibente (MIC)

• la concentrazione minima battericida (MBC).

Questo metodo permette di stabilire una scala di attività

dell’antibiotico per diverse specie batteriche.

Test di antibiotico-sensibilità

Definizioni

MIC Minimal Inhibitory Concentration: è una misura quantitativa

dell’attività di un antibiotico verso un determinato batterio.

Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in

grado di inibire la crescita batterica visibile.

MBC Minimal Bactericidal Concentration: è definita come la più

bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la

crescita batterica di almeno il 99,9% (1 germe su 1.000 elude

l’azione antibiotica) della popolazione iniziale.

CLSI Clinical and Laboratory Standard Institut: pubblica i criteri per

l’interpretazione dei risultati dei tests di sensibilità (categorie

interpretative).

Preparazione della MIC

Preparare una serie di provette contenenti terreno con diverse

concentrazioni di antibiotico, ed inocularle con quantità convenzionali

(5 x 105 cfu/ml) dell’organismo da testare.

Incubare le provette (37°C, 18-24h).

La MIC è data dalla concentrazione più bassa di antibiotico che porta

ad assenza di crescita dopo 18-24 ore di incubazione

Preparazione della MBC

E’ invece possibile calcolare la MBC se le provette che non presentano

crescita sono sottoposte a subcultura in terreno fresco privo di antibiotico:

la concentrazione più bassa di antibiotico alla quale il microrganismo non

è in grado di crescere quando viene trasferito in terreno fresco equivale

alla MBC

• Le categorie interpretative

– Sensibilità,

– Sensibilità Intermedia

– Resistenza

sono individuate da valori di MIC detti BREAKPOINTS (soglia,

limite)

• I valori standard di sensibilità variano per ciascun

microrganismo e sono basati sulla concentrazione plasmatica

di farmaco che può essere raggiunta senza la comparsa di

effetti tossici.

Test di antibiotico-sensibilità

Categorie interpretative

Breakpoint

• I breakpoints per la categorizzazione (S, I, R)

vengono individuati dalla CLSI e determinati sulla

base della:

– FARMACOCINETICA e FARMACODINAMICA degli

ANTIBIOTICI (livelli raggiunti in vivo nel sangue e tessuti

dall’antibiotico)

– ATTIVITA’ CLINICA mediante correlazione tra risultati in

vitro (MIC) e risultati in vivo (risoluzione del caso clinico).

Vanno allestite piastre con idoneo terreno solido sulle

quali viene successivamente inoculata una quantità di

batteri sufficiente a dare uno sviluppo confluente

generando una patina uniforme sul terreno

Diffusione in agar

Antibiogramma

Deporre sulla superficie della piastra, con l’aiuto di una pinzetta

sterile, una serie di dischetti di carta assorbente imbevuti con

adatte concentrazioni degli antibiotici che si desidera testare.

Incubare le piastre a 37°C per 18-24 ore.

Diffusione in agar

Antibiogramma

Misurare il diametro degli aloni di inibizione

formatisi per ogni antibiotico

Diffusione in agar

Antibiogramma

Interpretazione dei risultati

MICRORGANISMO SENSIBILE

MICRORGANISMO con RESISTENZA