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I CONTROLLI DEI LABORATORI UFFICIALI: I CONTROLLI DEI LABORATORI UFFICIALI:

LL’’ESPERIENZA DELLESPERIENZA DELL’’ISTITUTO ISTITUTO

ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA

PUGLIA E DELLA BASILICATAPUGLIA E DELLA BASILICATA

dott. A. Eugenio Chiaravalle

Struttura Complessa “Chimica” IZS-PB

IV CONVEGNO DEGLI ISTITUTI IV CONVEGNO DEGLI ISTITUTI

ZOOPROFILATTICI SPERIMENTALI ZOOPROFILATTICI SPERIMENTALI

SULLSULL’’ALIMENTAZIONE UMANAALIMENTAZIONE UMANA

TUTTO SULLE MICOTOSSINE

TORINO TORINO –– 1111 Novembre Novembre 2011 2011 –– Lingotto Fiere Lingotto Fiere

Composto da:• Una Sede Centrale a Foggia • Sei strutture periferiche, denominate “Sezioni diagnostiche

provinciali”:

- Torre S. Susanna (BR)

- Campi Salentina (LE)

- Matera

- Tito Scalo (PZ)

- Taranto

- Putignano (BA)

Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata

DIREZIONEDIREZIONE

QUALITA’- SICUREZZA -FORMAZIONEQUALITA’- SICUREZZA -FORMAZIONE AMMINISTRAZIONEAMMINISTRAZIONE

OSSERVATORIO EPIDEMIOLOGICOOSSERVATORIO EPIDEMIOLOGICO CHIMICACHIMICA

MICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTIMICROBIOLOGIA DEGLI ALIMENTI BIOTECNOLOGIE E VACCINIBIOTECNOLOGIE E VACCINI

DIAGNOSTICADIAGNOSTICA SIEROLOGIASIEROLOGIA

VIROLOGIAVIROLOGIA LECCELECCE

TARANTOTARANTO BRINDISIBRINDISI

PUTIGNANOPUTIGNANO POTENZAPOTENZA

MATERAMATERA

DIREZIONE


E’ organizzata in sei strutture semplici:

• Struttura Semplice CNR Radioattività

• Struttura Semplice Anabolizzanti e Pesticidi

• Struttura Semplice Farmaci e Tossicologia

• Struttura Semplice Analisi bromatologiche, biotossine e farine animali

• Struttura Semplice Micotossine e Tecniche Immunoenzimatiche

• Struttura Semplice Metalli Pesanti e Mangimi


Struttura Complessa “Chimica”

PRINCIPALI ATTIVITA ’

• Piano Nazionale Residui - PNR

• Piano Nazionale Alimentazione Animale – PNAA

• Piano Alimenti

• Ricerca e controllo Biotossine Algali nei prodotti ittici

• Ricerca e controllo delle Micotossine

• Ricerca e controllo dei contaminanti negli alimenti di origine non animale (vegetali)

• Ricerca e controllo di additivi e conservanti negli alimenti

• Ricerca e controllo della radioattività negli alimenti


Struttura Complessa “Chimica”

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca della Radioattività nel Settore Zootecnico-Veterinario

• Istituito con Decreto del Ministero della Salute del 27 agosto 2004 (G.U. N° 43 del 22 febbraio 2005).

Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca della Radioattività nel Settore Zootecnico-Veterinario

(D.M. 27 Agosto 2004)

Settori di

attività

Controlli

Radiometrici

e ricerca

di alimenti irradiati

Progetti di ricerca

e programmi di

interconfronto

Attività di

informazione

formazione

e consulenza

Indagini

epidemiologiche

e piani di

monitoraggio

Food irradiation: metodi analitici validati

IN FASE DI ACCREDITAMENTO

I CONTROLLI UFFICIALI SULLE MICOTOSSINE

Metodi di screening:Tecniche immunoenzimatiche

Metodi di conferma: HPLC

CORRETTE MODALIT À DI CAMPIONAMENTO(Reg. CE n. 401/2006 e s.m.i.)

CORRETTE MODALIT À DI CAMPIONAMENTO

(Reg. CE n. 401/2006 e s.m.i.)

Nelle pratiche routinarie, le aliquote sono solitamente inferiori ai 100 kg.

In questi casi devono essere preparati 10 campioni di cui uno destinato all’analisi.

Se il campione globale è di peso inferiore a 20 kg, si procede nel seguente modo:

• < 12 kg: nessuna suddivisione in campioni di laboratorio;

• 12 kg: suddivisione in due campioni di laboratorio.

Per rendere omogeneo tale campione si effettua una corretta macinazione.

CORRETTE MODALIT À DI MACINAZIONE

MACINAZIONE A SECCOMACINAZIONE A SECCO

MACINAZIONE A SECCO

RISULTATI FINALI

MACINAZIONE A SECCO

MACINAZIONE IN UMIDO

SGUSCIATRICE

GRATTUGGIATRICEFRUTTA SECCA

La capacità varia da 25÷80 kg/h a seconda del disco e del prodotto utilizzato

I METODI DI SCREENING ELISA

Metodi interni di prova validati ed accreditati per le determinazioni di:

� Aflatossine B e G;

� Aflatossina M1;

� Ocratossina A;

� Zearalenone;

� Deossinivalenolo;

� Fumonisine B1 e B2.

VALIDAZIONE METODI DI SCREENING ELISA

(Reg. CE n.401/2006)

Metodi quantitativi di screening:

� Precisione

� Robustezza

� Specificità

� Verifica CCβ

METODO DI SCREENING ACCREDITATO

PER LA DETERMINAZIONE DELLE AFLATOSSINE

TOTALI NEI MANGIMI E NEI PRODOTTI

PER ALIMENTAZIONE UMANA

Campo di misura (µg/kg in matrice): 0.5 – 8.0

CCβ: 0.5 µg/kg in matrice

Recupero medio: 81.0%

Precisione intermedia: CV% = 4.6%

METODO DI SCREENING ACCREDITATO

PER LA DETERMINAZIONE DELL’AFLATOSSINA M1

NEL LATTE

Campo di misura (µg/L in matrice): 0.005 – 0.08

CCβ: 0.005 µg/L in matrice



METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELL’OCRATOSSINA A NEI MANGIMI

E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA

PARAMETRO DI VALIDAZIONE

MANGIMI ALIMENTAZIONE UMANA

Campo di misura

(µg/kg in matrice)

0.012 – 0.450 1.25 – 45.00

CCβ

(µg/kg in matrice)

0.012 1.25

Recupero medio 106.0% 82.0%

Precisione intermedia:

(CV%)

5.0% 5.5%

METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DI ZEARALENONE NEI MANGIMI E

NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA



Campo di misura

(mg/kg in matrice)

0.008 – 0.700 0.0035 – 0.2800

CCβ

(µg/kg in matrice)

0.008 0.0035



(CV%)

13.0% 15.0%

METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DEL DEOSSINIVALENOLO NEI

MANGIMI E NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA



Campo di misura

(mg/kg in matrice)

0.55 – 15.00 0.09 – 2.50

CCβ

(mg/kg in matrice)

0.55 0.09



(CV%)

10.6% 7.4%

METODO DI SCREENING ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELLE FUMONISINE NEI MANGIMI E

NEI PRODOTTI PER ALIMENTAZIONE UMANA



Campo di misura

(mg/kg in matrice)

0.2 – 20.0 0.2 – 20.0

CCβ

(mg/kg in matrice)

0.2 0.2



(CV%)

4.0% 4.0%

I METODI DI CONFERMA HPLC/FLD

Metodi interni di prova validati per la determinazione di:

� Aflatossine B e G (acceditato);

� Aflatossina M1 (accreditato);

� Fumonisine B1 e B2 (in corso di accreditamento);

� Deossinivalenolo e Nivalenolo (in corso di accreditamento).

VALIDAZIONE METODI DI CONFERMA HPLC/FLD

(Dec. 657/2002/CE)

Parametri di validazione:

� Linearità strumentale;

� Specificità;

� LOD e LOQ;

� Precisione (CV%);

� Recupero %;

� Robustezza;

� Incertezza di misura.

METODO INTERNO ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELLE AFLATOSSINE TOTALI (B1, B2, G1, G2) NEI CEREALI E

NELLA FRUTTA A GUSCIO MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA POST-COLONNA

Validato secondo la Decisione 657/2002/CEValidato secondo la Decisione 657/2002/CEValidato secondo la Decisione 657/2002/CEValidato secondo la Decisione 657/2002/CE

Campo dCampo dCampo dCampo d applicazione: Grano, Mandorle, Pistacchi.applicazione: Grano, Mandorle, Pistacchi.applicazione: Grano, Mandorle, Pistacchi.applicazione: Grano, Mandorle, Pistacchi.

Incertezza di misura: 13.1%

AFLATOSSINAAFLATOSSINAAFLATOSSINAAFLATOSSINA CAMPO DI CAMPO DI CAMPO DI CAMPO DI MISURAMISURAMISURAMISURA((((µg/kg in g/kg in g/kg in g/kg in matrice)matrice)matrice)matrice)

LOQLOQLOQLOQ((((µg/kg in g/kg in g/kg in g/kg in matrice)matrice)matrice)matrice)

RECUPERO RECUPERO RECUPERO RECUPERO MEDIOMEDIOMEDIOMEDIO

PRECISIONE PRECISIONE PRECISIONE PRECISIONE INTERMEDIAINTERMEDIAINTERMEDIAINTERMEDIA

(CV%)(CV%)(CV%)(CV%)

B1 0.22 – 4.00 0.22 84% 4.9%

B2 0.08 – 1.00 0.08 86% 9.1%

G1 0.48 – 4.00 0.48 88% 7.7%

G2 0.10 – 1.00 0.10 86% 8.8%

METODO INTERNO ACCREDITATO PER LA DETERMINAZIONE DELL ’AFLATOSSINA B1

NELLE MATERIE PRIME PER MANGIMI MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE

FOTOCHIMICA POST -COLONNAValidato secondo la Decisione 657/2002/CE

Campo d’applicazione: Grano, Avena, Mais.

Incertezza di misura: 8.8%

AFLATOSSINAAFLATOSSINAAFLATOSSINAAFLATOSSINA CAMPO DI CAMPO DI CAMPO DI CAMPO DI MISURAMISURAMISURAMISURA

((((µg/kg in matrice)g/kg in matrice)g/kg in matrice)g/kg in matrice)





B1 5.8 – 40.0 5.8 74% 7.0%

LA DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA

Le procedure di conferma sfruttano la rivelazione fluorimetrica accoppiata ad opportune reazioni di

derivatizzazione post-colonna.

Nel caso delle Aflatossine viene impiegata la derivatizzazione fotochimica.

Le Aflatossine B1 e G1 non sono naturalmente fluorescenti, grazie a questa reazione possono emettere in

fluorescenza.


G1

G2

B1

B2

G1

G2

B1

B2

Senza

derivatizzazione

Con

derivatizzazione

ANALISI DELLE AFLATOSSINE CON DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA POST-COLONNA

I VANTAGGI DELLA DERIVATIZZAZIONE FOTOCHIMICA ON -LINE POST-COLONNA

� La possibilità di lavorare in modo automatizzato, grazie al derivatizzatore fotochimico on-line, permette di aumentare notevolmente la riproducibilità dell’analisi, semplificando inoltre la fase di pre-trattamento del campione;

� La derivatizzazione effettuata post-colonna rende notevolmente più ripetibili i t.r. degli analiti ris petto a quando viene effettuata pre-colonna.

Muscarella, M; Iammarino, M; Nardiello, D; Lo Magro , S; Palermo, C; Centonze, D; Palermo, D. (2009).Validation of a confirmatory analytical method for the determination of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in foods and feed materials by HPLC with on-line photochemical derivatization and fluorescence detection. Food Addit. Contam. 26:1402-10.

METODO INTERNO PER LA DETERMINAZIONE DELL ’AFLATOSSINA M1 NEL LATTE MEDIANTE

HPLCValidato secondo la Decisione 657/2002/CE

Campo d’applicazione: Latte

Campo di misura: 0.015 – 10.0 µg/kgin matrice

Limite di rivelabilità: 0.015 µg/kgin matrice



Incertezza di misura: 7%Muscarella, M; Lo Magro S.; Palermo, C.; Centonze, D. (2007). Validation according to European Commission Decision 2002/657/EC of a confirmatory method for aflatoxin M1 in milk based on immunoaffinity columns and high performance liquid chromatography with fluorescence detection. Anal. Chim. Acta 594:257-64.

ANALISI DI CONFERMA PER AFLATOSSINA M1

CAMPIONE DI LATTE CONTAMINATO (AFLATOSSINA M1 =0.15 8 µg/L)

METODO INTERNO PER LA DETERMINAZIONE DELLE FUMONISINE B1 E B2 NEI PRODOTTI

ALIMENTARI MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST -COLONNA

Validato secondo la Decisione 657/2002/CE

Campo d’applicazione: Grano, Avena, Mais.

FUMONISINAFUMONISINAFUMONISINAFUMONISINA CAMPO DI CAMPO DI CAMPO DI CAMPO DI MISURAMISURAMISURAMISURA((((µg/kg in g/kg in g/kg in g/kg in matrice)matrice)matrice)matrice)





B1 16 – 384 16 85% 4.1%

B2 20 – 384 20 71% 4.7%

LA DERIVATIZZAZIONE CHIMICA

POST-COLONNA

Per le fumonisine è stata sfruttata la possibilità di derivatizzare chimicamente la funzione amminica primaria presente in questi composti mediante reazione con una miscela di agenti derivatizzanti composta da o-ftalaldeiede (OPA) e N,N-dimetil-2-mercaptoetilammina (Thiofuor™).

FB

O

O R

OH OH

NH2

COOH

O

O

HOOC

COOH

HOOC

CHO

CHO

NSH

OPA

Thiofluor TM

N

S

N

OH

FB

ANALISI DELLE FUMONISINE CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA

ANALISI DI CONFERMA PER FUMONISINE

Campione di farina di mais contaminato (FB1+FB2 = 169 µg/kg)

METODO INTERNO PER LA DETERMINAZIONE DI DEOSSINIVALENOLO E NIVALENOLO NEL GRANO E NEL

MAIS MEDIANTE HPLC/FLD CON DERIVATIZZAZIONE CHIMICA POST-COLONNA

Validato secondo la Decisione 657/2002/CE

Campo d’applicazione: Grano, Mais.

MICOTOSSINA CAMPO DI MISURA

(µg/kg in matrice)

LOQ(µg/kg in matrice)

RECUPERO MEDIO

PRECISIONE INTERMEDIA

(CV%)

DON 47 – 384.0 47 99% 6.9%

NIV 37 – 384.0 37 92% 7.9%

Muscarella, M.; Lo Magro, S.; Nardiello, D.; Palermo, C.; Centonze. D. (2008) Development of a new analytical method for the determination of fumonisins B1 and B2 in food products based on high performance liquid chromatography and fluorimetric detection with post-column derivatization. J. Chromatogr. A 1203:88-93.


POST-COLONNA

Per deossinivalenolo e Nivalenolo è stata impiegata una derivatizzazione chimica post-colonna a 2 step.

Nella prima fase, il DON e NIV, a caldo ed in soluzione alcalina, si frammentano formando vari sottoprodotti, con

rilascio di formaldeide.

OH3C

O

OHCH2OH

CH3

O

R

OH115°C

OH-

OH3C

HO

OHCH2OH

CH3

O

R

OH

115°C

OH-O + P.D.

DON (R = H) NIV (R = OH)


POST-COLONNA

Nella seconda camera di reazione, la formaldeide generata reagisce con metilacetoacetato ed ammonioacetato, producendo un derivato diipropiridinico fluorescente, secondo la reazione di Hantzsch.

NH3

OO

O O

NH2

O O

O O

O

O O

O O

N

ANALISI DI DEOSSINIVALENOLO E NIVALENOLO NEL GRANO E NEL MAIS CON DERIVATIZZAZIONE

CHIMICA POST-COLONNA

ANALISI DI CONFERMA PER DEOSSISINIVALENOLO E NIVALENOLO

T em po / m in

0 5 10 15 20

Seg

nale

/ L.

U.

0

2

4N IV

D O N

(a)

(b)

Campione di grano fortificato con 1.75 mg/kgdi DON e NIV

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

I metodi di conferma HPLC per la determinazione di micotossine nei prodotti per alimentazione umana ed animale sono stati inseriti nel volume:

MICROBIAL TOXINS

A cura di: Otto Holst

Editore: Humana Press Inc.

Collana: Methods in Molecular Biology

Inoltre sono disponibili, in lingua italiana, sul numero di Febbraio 2011

della rivista “Laboratorio2000”.

ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA PUGLIA E DELLA BASILICATA

STRUTTURA COMPLESSA “CHIMICA”

TOTALE CAMPIONI ANALIZZATI PER LA RICERCA DI MICOTO SSINE

ANNO 2009 (n. 1004)177

66

1

82

4

163

23

147

255 7

55

28

148

73

0

50

100

150

200

Aflato

ssina

B1

Aflato

ssine

total

i

Deossi

nivale

nolo

Ocrato

ssina A

Fumon

isine

T2

Vomito

ssina

Aflato

ssina

M1

AssentePresente ma conforme

243

86

186172

12

83

221

ATTIVIT À ANNO 2009MANGIMI (n.938)

171

65

81

4146

25

160

21

5755

28161

9

0

50

100

150

200

N. Campioni

Aflatos

sina B

1

Deossi

nivalen

olo

Fumonisi

ne

Ocrato

ssina A T2

Vomito

ssina

Zeara

lenon

e

Presente maconformeAssente

236

85

171181

9

83

170

ATTIVIT Á ANNO 2009

21 1 1 1

4

1

12

2

0

2

4

6

Aflatos

sina B

1

Deossi

nivalen

olo

Fumonisi

ne

Ocrato

ssina A

Zeara

lenon

e - - -

Aflatos

sina B

1

Aflatos

sine t

otal i

Ocrato

ssina A

Presente maconforme

Assente

CEREALI AD USO UMANO

(n.6)

ALTRO

(n.10)

148

73

0

50

100

150

200

250

LATTE E DERIVATI

(n.221)

Aflatos

sina M

1

5

4

ATTIVIT À ANNO 2009

CAMPIONI DI PROVENIENZA ESTERA

3

2

1

3

1 1 1

3

1

2

0

2

4

6

N. Campioni

Aflato

ssina

B1

Fumon

isine

Ocratos

sina A

Vomito

ssina

Zeara

lenon

e - -

Aflato

ssina

B1 - -

Aflato

ssina

M1 - -

Ocratos

sina A



(n.1)

ALTRO

(n.2)

MANGIMI

(n.11)

LATTE E DERIVATI

(n.4)5




ANNO 2010 (n. 1172)

102

191

127

9

179

44

203

32

114

83

6 4

110

76

10

50

100

150

200

250

Aflato

ssina

B1

Aflato

ssine

total

i

Deossi

nivalen

olo

Ocrato

ssina

A

Fumonisi

ne T2

Aflatos

sina M

1

AssentePresente ma conformeNon conforme

194

36

223235

197

10

187

ANNO 2010MANGIMI (n.945)

62

172

1

148

24

96

76

165

17

64

143

30

0

50

100

150

200

250

300

N. Campioni

Aflato

ssina

B1

Deossi

nivalen

olo

Fumon

isine

Ocrato

ssina A T2

Zeara

lenon

e

Non conforme (1)


235

172 172 182

10

173

ATTIVIT Á ANNO 2010

37

18

25

9

31

20

18

7 38

15

38

15

31

2 10

10

20

30

40

50

60

70

N. Campioni

Aflato

ssina

B1

Aflato

ssine

total

i

Deossi

nivale

nolo

Fumon

isine

Ocrato

ssina

A

Zeara

lenon

e - -

Aflato

ssina

B1

Aflato

ssine

total

i

Ocrato

ssina A

Non conformePresente ma conformeAssente


(n.271)

ALTRO

(n.7)110

76

1

0

50

100

150

200

250

LATTE E DERIVATI

(n.187)

Aflatos

sina M

1

55

34

51

25

53 53

ATTIVIT À ANNO 2010


41

1 15

1

36

16

25

9

28

20

15

7 36

14

35

15

31

20

10

20

30

40

50

N. Campioni

Aflato

ssina

B1

Deossi

niva

lenolo

Fumon

isine

Ocratos

sina A

Zeara

lenon

e - -

Aflato

ssina

B1

Aflato

ssine

totali

Deossi

niva

lenolo

Fumon

isine

Ocratos

sina A

Zeara

lenon

e -

Aflato

ssina

M1 - -

Ocratos

sina A


CEREALI AD USO UMANO (n.256)

ALTRO

(n.2)

MANGIMI

(n.13)LATTE E DERIVATI

(n.4)

52

34

48

22

50 50




ANNO 2011 (n. 978)

94

146

118 12

10098

132

63

2

8073

8 3

93

55

0

50

100

150

200

Aflato

ssina

B1

Aflato

ssine

total

i

Deossi

nivale

nolo

Ocrato

ssina

A

Fumon

isine

T2

Aflato

ssina

M1

AssentePresente ma conformeNon conforme

241

30

198

197

153

11

148

ANNO 2011MANGIMI (n.809)

70

125

2

74

76

75

67

118

46

83

70

74

0

50

100

150

200

250

300

N. Campioni

Aflatos

sina B

1

Deossi

nivalen

olo

Fumonisi

ne

Ocrato

ssina A T2

Zeara

lenon

e

Non conforme (2)


197

140 142

164

11

144

ANNO 2011

24

21

1

18

12

26

20

5

624

17

2

30

11

0

10

20

30

40

50

60

70

N. Campioni

Aflato

ssina

B1

Aflato

ssine

total

i

Deossi

nivale

nolo

Fumonisi

ne

Ocrato

ssina A

Zeara

lenon

e

Non conforme (3)Presente ma conformeAssente


93

55

1

0

50

100

150

200

250

LATTE E DERIVATI

Aflatos

sina M

1

50

RISULTATI 2011


6

2

2

6 8

20

16

1

17

12

23

16

2

9

19

20

27

7

14

3

15

0

10

20

30

40

50

N. Campioni

Aflato

ssina B

1

Deossi

nivalen

olo

Ocrato

ssina

A - -

Aflato

ssina B

1

Aflato

ssine

tota

li

Deossi

nivalen

olo

Fumon

isine

Ocrato

ssina

A

Zeara

lenon

e -

Aflato

ssina M

1 - -

Non conforme (1)



MANGIMI LATTE E DERIVATI

24

189

37

29

3939

34

11 3

Grazie per l’attenzione

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