UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA

Human papillomavirusHPV

Due famiglie:1) Papillomaviridae • Papillomavirus (HPV: verruche;

carcinoma cervicale)2) Polyomaviridae• BK virus (malattia renale)• JC virus (PML, leucoencefalopatia

multifocale progressiva)BK e JC causano malattia nei soggetti

immunodepressi.

HPV può causare infezioni litiche in cellule permissive, persistenti, latenti e trasformanti in cellule non permissive.

FamigliaPapillomaviridae

GenerePapillomavirus

Morfologiavirione nudosimmetria icosaedrica72 capsomeri genoma: DNA circolare bicatenariodimensioni: 55 nmcirca 100 tipi classificati in 16 gruppivirus epiteliotropo.

HPV

Caratteri generali dei virus

Il DNA (~8000 paia di basi) codifica per

6-8 geni precoci (early, E1-E8, proteine che promuovono la replicazione cellulare)

e 2 geni tardivi (late)

che codificano per 2proteine strutturali: L1 e L2.

HPV: ciclo di replicazione (la replicazione è nucleare)

a) Trascrizione dei geni virali precociI geni precoci stimolano la crescita delle cellule e facilitano la replica del genoma virale, utilizzando la DNA polimerasi della cellula ospite quando le cellule si dividono.

b) Trascrizione dei geni virali tardiviI geni tardivi codificanti proteine strutturali sono espressi solo nello strato superiore che si differenzia in ultimo, distruggendo la cheratina

Genoma di HPV-16• E1: replicazione del DNA virale• E2, E4, E5: regolano la

trascrizione e la replica (E3:??) E6 proteina oncogenica che lega la p53

• E7 proteina oncogenica che lega la p105RBE6 ed E7 immortalizzano e promuovono la crescita.

• L1: proteina maggiore del capside (è la VAP)

• L2: proteina minore del capside

Organizzazione del genoma

E6

E7

E2

E4

E5

L1

L2

E1

Long control region (LCR)

trasformazione (p53-pRb)

trasformazione

replicazioneepisomica

proteina tardiva,legame citocheratine

regolazionedella trascrizione ereplicazione DNA

proteinecapsidiche

P97

Regione codificante proteine tardive (L = Late) Regione codificante

proteine precoci (E = Early)

Proteine precoci (non strutturali)

Proteina E1 è coinvolta nella replicazione del DNA.

Proteina regolatrice E2la trascrizione di E2 permette di inibire l’E6 e l’E7. Questa proprietà viene persa quando il genoma virale si integra nel genoma dell’ospite. Questo dà via libera alla soppressione dell’inibizione di E6 e E7 che agiscono sui geni oncosoppressori bersaglio p53 e pRB

Proteina E4Non sembra avere proprietà trasformantiNei cheratinociti umani sembra intaccare l’integrità del citoscheletro cellulare (coilocitosi) favorendo la fuoriuscita delle particelle virali neoformate.

Proteina E5favorisce la replicazione cellulare Rende le cellule resistenti all’apoptosi.Favorisce la formazione dei condilomi

E6 e E7

E6 e E7 interagiscono con molte proteine, influenzando l’evoluzione di una infezione.

E6 e E7 agiscono come oncoproteine virali negli HPV ad alto rischio, non si conosce la funzione in HPV a basso rischio.

Proteina E6

L’interazione con la p53 interferisce sia con i segnali di trascrizione e traduzione della p53 che con quelli che portano all’apoptosi.

L’interazione con IRF-1 (Interferon Regulatory Factor 1) blocca la trascrizione di geni codificanti indotta da IFN e contribuisce all’evasione immunitaria del virus.

Interazione della proteina E6 di HPV con p53

E6 HPV alto rischio:complessa e induce

degradazione ubiquitino-

dipendente della p53p53

bassi livelli(passaggio in

fase S e accumulo mutazioni)

p53bassi livelli

p53alti

livelliarresto del ciclo in G1

Infezione viraleDanneggiamento

DNAStress cellulare

G1

S

G2

M

porta alla degradazione e alla down regolazione delle vie implicate nell’arresto del ciclo e apoptosi

La proteina p53 sopprime la crescita cellulare attivando trascrizionalmente la proteina p21, che inibisce le chinasi del ciclo cellulare cruciali per la progressione del ciclo in G1

Proteina E7si lega alla proteina del retinoblastoma (pRB), proteina soppressoria della crescita cellulare. Interferisce con la regolazione del ciclo cellulare (induce trasformazione). Reprime la trascrizione dei geni implicati nell’apoptosi.Inoltre, l’interazione IRF-1 (Interferon Regulatory Factor 1) causa l’evasione

Interazione della proteina E7 di HPV con pRB

G2

G1

SM ppRBinattiva

ppRB

inattiva

E2F-1

E2F-1Repressione della trascrizione

E2F-1pRBE7 +

E7pRB

Complesso inattivo

Attivazione della trascrizionee passaggio in fase S

E2F è un attivatore del ciclo cellulare che è regolato dal legame con pRb, un soppressore della crescita della cellule tumorali

La proteina E7 di HPV può legare pRB. In seguito a ciò pRB non è più in grado di legare E2F e di regolarlo

Il risultato è che E2F può liberamente attivare il ciclo cellulare

Proteine strutturaliL1 e L2 sono proteine tradotte tardivamente che si

assemblano spontaneamente formando il capside icosaedrico.

L1 (proteina capsidica maggiore) rappresenta l’80% delle proteine capsidiche.

È responsabile dell’attacco del virus alle cellule suscettibili ed inoltre media la risposta umorale e cellulo-mediata all’infezione

L2 (proteina capsidica minore) rappresenta il restante 20% delle proteine capsidiche

Replicazione di HPVLa replicazione dipende dall’apparato trascrizionale della cellula e

dallo stato di differenziazione della cute / epitelio.

Il virus arriva allo strato basale tramite soluzione di continuo. I geni precoci stimolano la replicazione cellulare e il virus può replicare il genoma utilizzando la DNApol delle cellule in divisione.

L’aumento del numero delle cellule dello strato basale e spinoso causa la formazione di verruche, condilomi, papillomi.

Mano a mano che le cellule si differenziano, procede la trascrizione e traduzione dei geni virali. I geni tardivi (strutturali) sono espressi solo negli strati cheratinizzati e i nuovi virioni si assemblano nel nucleo.

• L’infezione da HPV promuove la proliferazione delle cellule spinose (acantosi) che causa un ispessimento della cute e produzione di cheratina (ipercheratosi) portando la formazione di escrescenze epidermiche.

STRATO CORNEO - +GRANULOSO +++ +++SPINOSO + / - -BASALE + / - -

SINTESI DNA SINTESI CAPSIDE

Patogenesi

• l’infezione e’ acquisita per contatto stretto

• il virus persiste nello strato basale

• I papillomavirus infettano le cellule dell’epitelio squamoso ( pluristratificato). della cute (verruche) (papillomi genitali, orali e congiuntivali) ed inducono proliferazione epiteliale.

La verruca è il risultato della stimolazione della crescita cellulare da parte del virus e dell’ispessimento degli strati basale e spinoso.

Verruche non genitali

Verruche mucosali non genitali

Papilloma congiuntivalePapilloma laringeo

Patogenesi

• Le lesioni sono caratterizzate da un ispessimento dello strato spinoso (acantosi), dello strato granuloso (paracheratosi) e dello strato corneo (ipercheratosi).

• Le cellule degli strati superficiali dell’epidermide possono presentare tipiche anomalieQueste cellule sono dette coilociti: la loro presenza è fortemente indicativa di una infezione da HPV.

Le verruche si manifestano in 3-4 mesi. L’infezione virale rimane localizzata e a

volte regredisce spontaneamente, ma può essere ricorrente.

Verruche genitali

La risposta immune all’HPVL’ immunità innata è la prima linea di difesa contro HPV.• L’interferone di tipo I esercita una effetto antivirale

diretto. • E6 e E7 dell’HPV16/18 direttamente inibiscono il

segnale dell’IFN.• L’infiammazione è importante per l’immunità innata e

adattativa.• Le proteine precoci dell’HPV alterano l’espressione dei

geni dell’ MHC di classe I. La risposta immune adattativa all’HPV:• La risposta delle cellule T di tipo Th1 è associata con la

regressione del papilloma.• La risposta immune umorale protegge contro la

reinfezione.

Il potenziale oncogeno degli HPV

• il DNA virale è stato ritrovato sia in tumori benigni che maligni.

• l’HPV 16 e 18 causano displasia e papillomi cervicali: almeno l’85% dei carcinomi cervicali contiene HPV integrato.

• l’integrazione porta all’inattivazione dei geni E1 e E2, limitando la replica virale e permettendo l’espressione dei geni E6 e E7.

• E6 e E7 agiscono come oncogeni e si legano alla p53 (E6) e alla pRb (E7).

• in assenza di queste due proteine che controllano la crescita cellulare, la cellula diventa più suscettibile a mutazioni, aberrazioni cromosomiche e subisce la trasformazione oncogena.

Clinica

• verruche cutanee• tumori benigni della testa e del collo• verruche anogenitali• neoplasie cervicali

Verruche genitali (trasmissione sessuale)

Condilomi acuminati- a cavolfio

Verruche ano-genitali -

Verruche genitali

Verruche non-genitali(non a trasmissione

sessuale)

Verruche comuni- mani, dita e ginocchi

Verruche plantari- Piedi

Verruche- mani e viso

Verruche non-genitali e Verruche genitali

Verruche non genitaliPapilloma congiuntivalePapilloma laringeo

Nongenital warts

Verruche plantari

Verruche genitali: condilomi acuminati

Infezione da HPV• in genere tra i 20 e i 30 anni di età• di solito l’infezione si risolve spontaneamente

per effetto della risposta immunitaria (nel 90% dei casi si risolve in 2 anni)

• alcune infezioni si stabiliscono e si manifestano con anormalità microscopiche.

• la persistenza virale può portare a trasformazione

Condizioni per la trasformazione

Caratteristiche delle cellule (in relazione con l’infezione virale)

Ø attiva proliferazione cellulareØ inibizione dell’apoptosi Ø evasione della risposta immune

• infezione persistente-replicazione viraleCon espressione di proteine virali• nell’infezione persistente: assenza delle

risposte cellulo-mediate dell’ospite

• Favorisce l’immortalizzazione

Ruolo di HPV

a) RESIDENZIALE•minima quantità•può persistere non rilevato per anni•può essere a basso rischio o alto rischio

b) EPISOMALE• l’HPV è attivo localizzato nel nucleo della cellula•è separato dal DNA umano -in forma plasmidica•può essere a basso rischio o ad alto rischio•può causare pap test anormali•può essere visto colposcopicamente

c) INTEGRATA•HPV-DNA circolare: è aperto e s’integra nel DNA umano •solo tipi ad alto rischio•causa Pap test anormali •visti colposcopicamente - possono essere trattati per

prevenire il tumore

HPV PUO’ ESSERE PRESENTE NELLE CELLULE IN FORMA:

a) RESIDENZIALE

poche cellule basali infettate da HPV (presente solo come DNA)

Limitata riproduzione di HPV

genomi multipli di HPV per cellula

b) EPISOMALE

c) INTEGRATO

HPV-DNA integrato nel genoma

HPV: epidemiologia

Le infezioni da HPV vengono trasmesse:a) per contatto diretto e tramite piccole lacerazioni

cutanee o delle mucose;b) durante rapporti sessualic) durante il passaggio del neonato attraverso il canale

del parto infetto.

L’eliminazione asintomatica del virus può promuovere la trasmissione.

HPV è resistente all’inattivazione e può essere anche trasmesso per contatto con oggetti contaminati, superfici di banconi o mobili, asciugamani.

Papillomavirus umani (HPV): classificazione

Sono stati identificati più di 150 genotipi di HPV(35 genitali) [denominazione: HPV + numero]

DIVERSI GENOTIPI SONO ASSOCIATIA DIVERSE PATOLOGIE

I papillomavirus sono classificati nei generi alpha (mucosali) e beta (cutanei).

• genere alpha:comprende HPV18 e altrigenotipi mucosali ad alto rischio di trasformazione;la specie 9 con

HPV16 ed altri genotipi ad alto rischio.• alla specie 10 (HPV6 e 11)appartengono i genotipimucosali a basso rischio ditrasformazione, responsabili di lesioni mucosali benigne, quali i condilomi acuminati.

• genere beta:genotipi di HPV associati alesioni cutanee in genere benigne

Associazione tra lesioni mucose e genotipi di HPV

6, 116, 11, 16, 18, 31

1616, 18, 31, 33, 39, 40, 59, 6816, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 67, 68, 71, 74

6, 1116, 18

6, 11

13, 3216, 18

TRATTO GENITALE:Condilomi acuminatiCondilomi pianiPapulosi bowenoideCa. vulvari, analiCa. cervice uterina

VIE RESPIRATORIE:PapillomiCa. laringo-bronchialiCONGIUNTIVA:

PapillomiCAVITA’ ORALE:Iperplasia epiteliale focaleCa. oro-faringei

HPV e neoplasia cervicale

• HPV alto rischio: HPV 16, 18, 31, 33,35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68…

• HPV basso rischio: HPV 6, 11, 26, 42, 43, 44, 53, 54, 55, 62, 66…

HPV e carcinoma della cervice

• Prevalenza del 97%-99.7% di DNA di HPV neicarcinomi della cervice (in PCR)

• I carcinomi della cervice correlati ad HPV sonoassociati:

• il 53% al 16• il 15% al 18• il 9% al 45• il 6% al 31

e• il 3% al 33

Lesioni ano-genitali da HPV

• Condilomi acuminati e piani a livello dei genitali maschili (pene, scroto) e femminili (cervice uterina, vagina, vulva) e in regione perianale [HPV 6, 11, 16, 18, ecc.]

• Carcinomi cervicali, vulvari, anali e del pene (e lesioni intraepiteliali squamose [SIL] che li precedono) [HPV 16, 18, 31, 33,39, 45, 52, 58, ecc.]

Prevalenza delle infezioni genitali da HPV

Infezione a trasmissione sessuale più frequente nell’uomo (50% della popolazione attiva sessualmente è stata infettata da HPV)•Correlata al numero e alla frequenza dei partner•Correlata all’età (massima tra i 15 e i 25 anni)•Correlata allo stato immunitario

(maggiore in pazienti HIV positivi, in donne in gravidanza)

•Correlata alle abitudini di vita (fumo, alimentazione, contraccettivi orali)

Cofattori della progressione tumorale

• Fattori genetici (anormalità di struttura o numeriche dei cromosomi, riarrangiamenti o sovraespressione di oncogeni cellulari)

• Antigeni HLA (associazione HLA-cl.IID con carcinoma della cervice)

• Immunodepressione (infezione da HIV)• Coinfezioni con altri virus o microrganismi (HSV-2,

Clamidia)• Numero dei parti • Fumo • Contraccettivi orali • Fattori ormonali• Dieta (assenza di carotenoidi, vitamina C)

Neoplasia cervicale: progressione della malattia

SIL = Lesione Intraepiteliale Squamosa )

3-6 mesi 4-5 anni Dopo 20-30 anni

Epitelio Normale Infezione HPV

CoilocitosiCIN1 CIN2 CIN3 Carcinoma

ASCUS / LSIL HSILScreening

Trattamento

ASCUS: cellule squamose atipiche di significato non determinato

CIN: Cervical Intraepithelial Neoplasia coilociti cellule arrotondate vacuolizzate

L’infezione persistente ha un ruolo importante per lo sviluppo della neoplasia cervicale.

Neoplasia cervicale: progressione della malattia

Persistenza dell’infezione HPV• In circa dell’1% dei casi il virus tende a

persistere.• L’infezione attiva riemerge dalla latenza durante

una immunodeficenza associata a:• gravidanza• radiazioni solari• stress emozionale• stress fisico• HIV• chemioterapia antitumorale

Diagnosi• Sierologica: poco affidabile poiché solo una bassa

percentuale di pazienti sviluppa anticorpi durante l’infezione (non viene effettuata!)

• Verruca: al microscopio si osserva il caratteristico aspetto istologico che consiste in una iperplasia delle cellule spinose e in un eccesso di produzione di cheratina.

• Pap test: presenza di cellule epiteliali squamose coilocitiche (citoplasma vacuolizzato) che sono arrotondate e a gruppi.

• Colposcopia (esame che permette la visione della cervice uterina) acido acetico al 4% (la papula diventa bianca)

• Sequenza diagnostica: Pap test colposcopia PCR

Diagnosi: Pap Smears• i cambiamenti citologici associati con infezione HPV

rappresentano le basi dello screening con gli strisci del Papanicolau.

• il prelievo delle cellule dalla cervice e l’esame morfologico di esse per identificare segni di malignità.

• la diagnosi con il Pap-test permette di osservare ASCUS(cellule squamose atipiche di significato non determinato) durante lo screening cervicale.

• questa diagnosi è un indicatore dell’anormalità cellulare ma non è sufficiente per una diagnosi definitiva di una lesione intraepitelaile squamosa.

• a donne che hanno queste anormalità si consiglia una biopsia colposcopica.

Diagnosi microbiologica di infezione: tests molecolari

esistono diversi sistemi basati sulla PCR per evidenziare genoma di HPV in campioni biologici

(in tamponi cervicali e campioni istologici)

Trattamenti per HPV ad alto rischio

Dopo colposcopia

• LEEP (loop electrosurgical excision procedure: procedura

di escissione con elettrocauterizzazione)

• In alternativa metodi chimici (podofillina , podofillotossina, acido tricloroacetico, 5-fluorouracile).

• Chirurgia con il Laser

• Crioterapia chirurgica

• Chirurgia generale (conizzazione).

• Stimolatori della risposta innata o infiammatoria quali: IFN o l’imiquimod (Aldara), Cidofovir

• Profilassi: vaccini (Gardasil, Cervarix).

Vaccini

AS04 of aluminium phospate and monophosphoryl lipid A (MPL)

Proprietà delle proteine del capside del virus HPV L1

La proteina L1 può autoassemblarsi in particelle virus-simili (VLPs) che sono antigenicamente identiche ai virioni.

Capside naturale: L1+L2+DNA

Capside costituito

solo da L1

Proteina ricombinante L1

• non-infettante

• altamente immunogeno

GSK: il vaccino anti-HPV contiene HPV L1 virus-like particles (VLPs)

HPV L1 Virus-Like-Particle (VLP) Sintesi del vaccino

Cellula eucariotica

L1 gene dell’HPV

DNA

L1 gene inseritonel plasmide mRNA

Trascrizione

Traduzione

Proteine del capside

Capside virale vuoto

(VLP)Induce una

risposta immune

dell’ospite

HPVInsideHPV

Il vaccino HPV

• Approvato per le femmine di età dai 9- 26 anni

• 3 dosi a 0, 2, e 6 mesi per via im

• Minimi intervalli:– 4 settimane tra la prima e la

seconda dose – 12 settimane tra la seconda

e la terza dose.