Http:// Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed...

http://www.microbiologia.unige.it/dpb/debbia.htmDinamica delle Popolazioni BattericheLaboratorio di Microbiologia Sperimentale ed

Epidemiologia

In Natura si distingue:

Vita saprofita: nell’ambiente a spese di materiale inanimato

Vita parassitaria: a carico di organismi superiori

Parassiti

Obbligati Facoltativi

(Maggioranza dei batteri)

(Minoranza)

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Epidemiologia

Parassiti

Rapporti tra batteri e ospite:Commensali (indifferenti)Simbionti (utili)Opportunisti (talvolta possono dare malattia)Patogeni (nocivi) (moltiplicazione in vivo e tossigenicità)

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Popolazione microbica normale

Esistono due gruppi di PMN: residente transito 1) Competizione con nutrienti (interferenza) 2) Competizione con i recettori sulle cellule (tropismo) 3) Produzione di batteriocine 4) Produzione di acidi grassi o altri metaboliti

(anaerobi) 5) Continua stimolazione del sistema immune

(macrofagi) 6) Stimolazione di fattori immuni protettivi (Ig)


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POPOLAZIONE MICROBICA NORMALE

Microrganismi acquisiti dalla nascita subiscono modifiche in numero e specie lungo tutto il decorso della vitaDipendono da•fattori genetici•abitudini alimentari e igieniche •situazioni di stress •fenomeni psicosomatici •età


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Residenti, o popolazione microbica normalerappresentano circa l’1% del peso corporeo.10 volte il numero totale delle cellule somatiche Intestino: più di 500 (1000) specie diverse di batteri molte delle quali non coltivabili con le metodiche tradizionali Si stima che circa il 60% del materiale fecale sia costituito da batteri.


Epidemiologia

PMN

CuteCavità orale e prime vie aereeTratto intestinaleUretraVaginaOcchio

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Epidemiologia

PMN Cute

PM transitoriaPieghe cutaneeSecrezioni sebaceeSudorazione e lavaggiDisinfezioneMedicazioni occlusive

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Epidemiologia

PMN cavità orale

Sterile alla nascita4-12 ore dopo si stabiliscono i viridanti (madre)Seguono stafilococchi, anaerobi, neisserie, moraxelle, difteroidi.Eruzione dei denti: spirochete anaerobie, prevotelle, fusobatteri, capnocytophagaActinomyces tonsille e gengive degli adultiMiceti: Candida

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Epidemiologia

PMN vie respiratorie

Faringe e trachea

simili

alla cavità oraleBronchi

pochi batteri

Bronchioli e alveoli sterili

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Epidemiologia

PMN vie respiratorie

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Epidemiologia

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La popolazione microbica dell’apparato gastro-enterico è

stata definita come "un insieme di microrganismi presenti nel lume

intestinale i quali, se convivono in un determinato equilibrio

contribuiscono allo stato di salute dell'ospite"


Epidemiologia

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Nello stomaco vi è un alto grado di acidità e il numero dei

microrganismi non supera le mille unità, mentre nell'ileo la

concentrazione aumenta arrivando nel colon a 1011-1012

batteri per g


Epidemiologia

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PMN intestinale

Duodeno: 103-106/grDigiuno-ileo: 105-108/grCieco-colon trasverso: 108-1010/grSigma-retto: 1011/gr

antibiotici

pHacido

basico


Epidemiologia

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Anche il numero e il tipo di specie di microorganismi

varia con il variare del sito anatomico


Epidemiologia

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PMN intestinale


Epidemiologia

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Portano milioni di geni (5), un numero di gran lunga superiore ai 20.000 stimati del genoma umano. Una gran varietà di composti che possono essere metabolizzati (è un organo aggiunto, bioreattore)Quando varia, si modifica anche l'assorbimento dei nutrienti Obesi e magri hanno profili batterici radicalmente diversi nei loro intestini


Epidemiologia

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La degradazione nell’intestino crasso, in particolar modo della

lignina e della cellulosa, è incompleta portando a particelle di fibre vegetali che persistono fino all’intestino distale dove

possono esercitare un ruolo che favorisce il processo di eliminazione delle feci


Epidemiologia

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E’ importante il ruolo dei batteri intestinali nella sintesi e nell'utilizzo delle vitamine.B1, B2, B6, B12, PP, H, acido pantotenico e acido folico. La vitamina K viene sintetizzata dall'Eucobacterium lentum che modifica degli steroidi a livello intestinaleI germi intestinali interagiscono con gli acidi biliari.


Epidemiologia

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Gli acidi biliari derivano dal metabolismo del colesterolo nel fegato, coniugati con glicina ed eliminati con la bile.

Il metabolismo degli ormoni steroidei (androgeni, estrogeni e corticosteroidi) avviene nel lume intestinale attraverso varie reazioni chimiche

Gli ormoni steroidei vengono modificati a livello del fegato ed escreti con la bile. Nell'intestino verranno deconiugati e sottoposti alle modificazioni enzimatiche per poi ritornare al fegato attraverso la vena porta.


Epidemiologia

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POPOLAZIONE MICROBICA INTESTINALE

A questo livello vi è una barriera protettiva costituita da uno strato di

muco denso che contiene IgA secretorie, peptidi antimicrobici e anche complessi giunzionali che tengono unite le cellule epiteliali adiacenti in modo da regolare la

permeabilità del tessuto intestinale e impedire che i microrganismi lascino

questa sede


Epidemiologia

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Gli enterociti esprimono recettori PAMP (pathogen-associated molecular pattern), comprese le proteine denominate TLR e NOD. Questi recettori captano la presenza di componenti batterici presenti e conservati in diverse specie microbiche e possono dare inizio ad una cascata pro infiammatoria per la difesa. I batteri possono presentare sulla superficie esterna delle strutture che sono individuate dalle cellule epiteliali e dalle cellule del sistema immunitario


Epidemiologia

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The commensal microbiota, intestinal epithelial cells, and intestinal immune cells engage in a complex crosstalk. Epithelial cells, M cells, and dendritic cells (DCs) can directly sense and sample the intestinal contents and communicate information about the microbiota to other subsets of immune cells. Toll-like receptors, expressed by epithelial cells, M cells and DCs, and NOD-like receptors, are classes of microbe-sensing molecules. Cytokines, chemokines, and host and microbial metabolites are key molecular mediators of intestinal homeostasis that influence responses of both host and microbe. l


Epidemiologia

PMN vagina

Alla nascita pH acido: lattobacilliDopo alcune settimane fino a pubertà pH neutro: PMN mista cocchi e bacilliPubertà pH acido: lattobacilliDopo la menopausa pH neutro: PMN mista cocchi e bacilli

IMPORTANTE IL LIVELLO DEGLI ESTROGENI

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Epidemiologia

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Epidemiologia

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Epidemiologia

Batteri a circolazione interumana: Infezioni esogene ed endogene

Portatore sano

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Possibili vie d’accesso per i microorganismi

Vie respiratorietratto gastro-entericogenito-urinario

Canali naturali

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Epidemiologia


Via Esempi

Ingestione Salmonella, Shigella, E. coli, V. cholerae, C. botulinum ecc..

Inalazione Mycobacterium, Mycoplasma, Legionella Chlamydia ecc…

Penetrazione diretta (aghi, ferite)

C. tetani, S. aureus ecc..

Punture d’artropodi

Rickettsia, Francisella, Y. Pestis ecc..

Sessuale N. gonorrhoeae, T. pallidum, C. trachomatis

transplacentare

T. pallidum

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Inserzioni di: cateteri (urinari, vascolari ecc.)

tubi per ventilazione sondini di drenaggioSomministrazione di farmaci che deprimono la risposta immunitaria o che alterano il microambiente di alcuni distretti dell’organismo (es. antiacidi) interruzioni dell’integrità della superficie della mucosa e della pelle

Canali occasionali

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Meccanismi di difesa naturale e barriere

L’ambiente in vivo è molto sfavorevole per i batteri: pH, T, O2, flusso dei liquidi organici, cellule ciliate, macrofagi, integrità e composizione biochimica dei tessuti, infiammazione, febbreStrato corneo della pelle

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Epidemiologia

Meccanismi di difesa naturale e barriere

Mucose: muco, lisozima, IgA, epiteli ciliati, movimento del contenuto del lume del canale mucoso (intestino, uretra)…PMN residenteCellule di sfaldamento

Colonizzazione della cute e delle mucose

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Meccanismi di difesa naturale

FagocitosiFunzioni dei fagociti: chemiotassi, ingestione e uccisione. I batteri elaborano sostanze che attraggono i fagociti, la fagocitosi è favorita dalle opsonine-anticorpi che rivestono la superficie battericaa) l’anticorpo agisce da opsoninab) l’anticorpo + antigene attiva il complementoc) opsonine possono essere prodotte da sistemi termolabili che attivano il complementoLa fagocitosi richiede consumo di energia. E’ posseduta dai granulociti e macrofagi, il meccanismo non è del tutto noto, è stato osservato un aumento della produzione di acqua ossigenata e liberazione di lisozima nei vacuoli (fagosoma, proteine antibatteriche, lisozima, pH, fosfatasi, lactoferrina, perossidasi)

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Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)

Variazione antigenica (shift)Inibizione della fusione lisosomialeElusione dei lisosomi e moltiplicazione nel citoplasmaProduzione di catalasi che scinde lo ione superossidoResistenza agli enzimi lisosomialiProduzione di IgA proteasi

Strategie batteriche

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Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig)

La resistenza ai macrofagi può aversi mediante:1. produzione di leucocidine che uccidono i macrofagi2. capsula che impedisce la fagocitosi3. produzione di superossidismutasi che sequestra l’ossigeno che serve ai macrofagi per la produzione di ATP che è necessario per la fagocitosi4. mimetismo antigenico

Strategie batteriche

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Epidemiologia

Mimetismo antigene

È la presenza di componenti strutturali che presentano notevoli analogie di composizione con materiali presenti nei tessuti dell’organismo ospite che vengono quindi difficilmente individuati come non-self

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Epidemiologia

Mimetismo antigene

S.pyogenes possiede diversi materiali antigenici (proteina M, antigeni di

membrana, carboidrati di gruppo) che presentano analogie molecolari ed

antigeniche con strutture molecolari presenti nel miocardio, cute,

nell’encefalo e nelle articolazioni e la risposta autoimmune che si mette in

opera durante l’infezione da S. pyogenes, potrebbe rappresentare un

elemento di rilievo nella patogenesi della febbre reumatica a della

cardiomiopatia reumatica. 37


Epidemiologia

Mimetismo antigene

Le Chlamydie presentano negli involucri esterni alcune proteine

ricche in cisteina che hanno analogie antigenetiche con la

catena pesante dell’alfa-miosina specifica del muscolo cardiaco ed è stata quindi ipotizzata una base

autoimmune nella patologia cardiaca correlata alla infezione di

Chlamydia (C. pneumoniae soprattutto).

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Molecular mimicry by Neisseria meningitidis.

a | Glucose catabolism in N. meningitidis proceeds by the Entner–Doudoroff pathway and lactate catabolism feeds directly into the sialic acid pathway. Note the relative number of metabolic steps from glucose to phosphoenolpyruvate compared with that from lactate to phosphoenolpyruvate. b | Sialylated lipopolysaccharide (LPS) on the N. meningitidis surface mimics the surface of eukaryotic cells, preventing deposition of the complement molecule C3. Inactivation of the lactate permease gene lctP results in C3-mediated cell lysis.


Quando un microorganismo invade l’ospite

E’ in grado di superare le difese di un individuo sano

PATOGENO

Sfrutta alcune situazioni di debolezza dell’ospiteOPPORTUNISTA

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Attributi dei microorganismi che causano malattia

Abilità di causare malattia o produrre lesioni progressive (Patogenicità) Grado di patogenicità, ovvero, malattia causata anche da batteri in numero piuttosto limitato (Virulenza).Queste proprietà possono essere suddivise in tossicità: abilità nel produrre sostanze tossiche ed invasività: abilità nel penetrare i tessuti e di diffondere.Molti di questi caratteri sono controllati da plasmidi.

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Epidemiologia

Isole di patogenicità (PAI)

I geni per i fattori di patogenicità, soprattutto se localizzati a livello cromosomico, possono essere (Gram-) riuniti in segmenti di DNA: PAII PAI probabilmente sono segmenti di DNA acquisiti orizzontalmente che differenziano i batteri che li posseggono dagli altri della stessa specie

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Infezione

L’infezione è il processo attraverso il

quale un microorganismo entra in relazione con l’ospite

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Infezioni

Monomicrobica: un singolo patogenoPolimicrobica: da più patogeni aerobi o anaerobiMista: aerobi ed anaerobi insiemeComunitaria: acquisita in ambiente non ospedalieroNosocomiale: acquisita dopo 72 ore dal ricovero

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Fasi di una proliferazione batterica

1) Adesione 2) Invasione 3) Produzione di metaboliti (crescita) 4) Produzione di tossine: enzimi degradativi tossine tipo A-B 5) Endotossine 6) Induzione di infiammazione 7) Resistenza al sistema immune (fagocitosi, Ig) 8) Resistenza agli antibiotici

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Fattori che caratterizzano un microorganismo patogeno

Adesività mediata da strutture specializzate ac. lipoteicoici nei gram-positivi proteine nei gram-negativi (fimbrie, pili ecc.)produzione di capsula (slime)capacità biochimica di metabolizzare nelle condizioni nutrizionali fornite dai tessuti dell’ospitecapacità di penetrare e moltiplicarsi in tessuti profondi (invasività)capacità di contrastare i meccanismi difensivi dell’ospiteproduzione di esotossine

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Adesione

Uno dei principali eventi che promuovono l’infezione.Il processo è mediato da strutture poste sulla superficie esterna dei batteri note come adesine, per esempio l’antigene K88 dell’Escherichia coli enteropatogeno, gli acidi lipoteicoici (streptococchi) e altre. Le cellule epiteliali hanno a loro volta, come già detto, strutture che legano le adesine ad esempio fibronectina disposta sulla superficie dell’epitelio orale.(Batteri isogenici privi di adesine non danno infezione)

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Perchè i batteri aderiscono?

• I batteri non adesi verrebbero eliminati

• Adesione: prima tappa della colonizzazione e della formazione del biofilm

3: Fase di adesione reversibile e irreversibile

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Evidenze sperimentalidel ruolo dell’adesione nella

colonizzazione• I batteri legano recettori isolati o analoghi

dei recettori• L’adesina purificata o un suo analogo lega il

recettore • L’adesione è inibita da:

• Analoghi dei recettori e delle adesine• Enzimi che distruggono l’adesina o il recettore• Anticorpi specifici diretti contro l’adesina o il

recettore51

Cosa utilizzano i batteri per aderire? Adesine batteriche

• Proteine espresse sulla superficie• Fimbrie• Glicocalice, Lipopolisaccaride (G-), Acidi

teicoici (G+)• Enzimi

• Enzimi batterici ancorano la cellula al substrato

• Enzimi batterici possono esporre recettori criptici 52

Morfologia delle adesine

Type IV fimbriae (= bundle forming pilus)

Type I fimbriaeAfimbrial adhesin

Curli

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ADESINE BATTERICHE

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Epidemiologia

Adesività

Ogni specie batterica interagisce con recettori presenti su determinati epiteli: Esiste uno spettro

S. mitis tutta la mucosa buccale S. salivarius lingua e gengiveS. pyogenes faringe e tonsilleN. gonorrhoeae uretraV. cholerae intestino tenueE. coli ileo, colon,tratto urogenitale, ecc.

Tossine ciliostatiche

Colonizzazione delle mucose

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Fibronectina

Sulla superficie delle cellule epiteliali vi è una proteina, la fibronectina, con cui interagiscono le adesine dei batteri gram-positivi, prevenendo così l’adesione dei gram-negativi. La fibronectina è una glicoproteina prodotta dagli epatociti e distribuita in forma solubile in tutti i liquidi organici, viene escreta nelle cavità naturali dell’organismo dove si deposita sulla superficie delle mucose ed è inoltre presente nei tessuti dove forma un reticolo fibrillare. La fibronectina è coinvolta in alcuni processi biologici tra cui la fagocitosi, la rigenerazione dei tessuti e nella differenziazione cellulare.

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Acquisizione di patogeni potenziali: malattia di base

Durante il decorso di varie affezioni si determinano variazioni nelle cellule di rivestimento (cute e mucose) con colonizzazione da parte dei bacilli gram-negativi e riduzione della popolazione batterica gram-positiva

Volontari o pazienti ricoverati in clinica psichiatrica non hanno dimostrato variazioni della popolazione batterica normale dell’orofaringeVariazioni con la durata della degenza (stesso reparto)

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FIBRONECTINA: ALTRI EFFETTI SULLA POPOLAZIONE

BATTERICA RESIDENTE

La presenza di fibronectina in:ferite accidentali o causate da strumenti, sulla superficie di cateteripredispone all’invasività di cocchi gram-positivi (stafilococchi, streptococchi) che possiedono sulla loro superficie recettori per la fibronectina con la quale creano un legame molto stabile.

La colonizzazione dei cateteri avviene con batteri gram-positivi produttori di slime che li rende immuni da qualsiasi trattamento con farmaci e dall’azione dei macrofagi.

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Fibronectina: un modulatore della popolazione batterica residente

Pazienti affetti da malattie organiche o ustioni, traumi ecc. dimostrano un ridotto tasso di fibronectina nel plasma

ConseguenzeRiduzione di fibronectina dalla superficie cellulare scomparsa dei microorganismi (cocchi) gram-positivi colonizzazione da parte di bacilli gram-negativiProduzione di proteasi batterica e dell’ospite?Ulteriore riduzione del tasso di fibronectina nel sito di colonizzazione.

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Immunità attiva e Immunità umorale

Immunità attivadovuta al contatto con un antigene, produzione di anticorpi richiede tempi di sviluppo anche lungo ma può dare protezione permanente

Immunità umoraleproduzione attiva di anticorpineutralizzano tossine e prodotti cellularieffetto battericida diretto o litico con il complementobloccano l’abilità infettiva dell’agenteagglutinano i batteri facilita la fagocitosiopsonizzazione, interagiscono con le componenti di superficie che possono limitare la fagocitosi

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Epidemiologia

Sopravvivenza alla superficie delle mucose

Una volta ancorati alla superficie di un epitelio (ma questo anche nei tessuti profondi) i batteri si moltiplicano e interagiscono con le cellule superiori attraverso la produzione di sostanze variamente tossiche. Queste proteine vengono secrete da appositi sistemi secretori grazie al quale i batteri possono traslocare nel citosol della cellula eucariotica le proteine effettrici che interferiscono con il signalling eucariotico, compromettendo le funzioni cellulari e attivando il processo di apoptosi o alterano strutture particolari e causano necrosi

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Invasione Produzione di enzimi extracellulari o attivi all’esterno dei batteri: collagenasi: distrugge il collageno coagulasi: causa la coagulazione del plasma S.aureus ialuronidasi: idrolizza l’acido ialuronico (tessuto connettivo) streptochinasi: (fibrinolisina) promuove la formazione di plasmina dal plasminogeno, dissolve i coaguli emolisine: lisano i globuli rossi proteasi: idrolizzano le immunoglobuline o altre proteine dell’ospite. La tossicità gioca un ruolo importante nell’invasività ma non è un fattore diretto (capsula polisaccaridica o di acidi ialuronici, proteina M, polipeptidi di superficie, resistenza agli enzimi dei fagociti).

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Epidemiologia

Penetrazione nei tessuti profondi

Il danneggiamento dell’epitelio mucoso è per molti batteri la

strada per raggiungere la sottomucosa, altri quali

Salmonelle e Shigelle utilizzano peculiari meccanismi invasivi che

consentono di penetrare direttamente nelle cellule

dell’epitelio mucoso. 66


Epidemiologia

Sopravvivenza nella sottomucosa e nei tessuti profondi

Sfuggire alle difese immunitarie (capsula o resistenza al killing dei fagociti)

moltiplicazioneTempo di moltiplicazione in vivo (8-10h ?) (situazione simile a chemostato*, ma effetto del s.i.)Siderofori ecc.Tropismo d’organo

* sangue e linfa portano nutrimenti e allontanano scorie

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Epidemiologia

Capsula

Contrasta gli effetti potenzialmente nocivi dell’interazione adesine-recettore fagocitaMaschera le adesine, varia la carica di superficie battericaOstacola la deposizione di C3b e l’ancoraggio di AbStrategia + comune nei G+Nei G- mancata produzione di fimbrie

Colonizzazione delle mucose

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Epidemiologia

Sopravvivenza nella sottomucosa e nei tessuti profondi

Una volta all’interno di fagociti professionali, alcuni batteri patogeni sono in grado di evadere dal fagosoma (prima della fusione con i lisosomi), mentre altri sono in grado di moltiplicarsi all’interno del fagosoma alterando la membrana impedendo la fusione con il lisosoma, oppure produzione di catalasi e SOD per contrastare i meccanismi di killing ossigeno-dipendenti, eliminado i derivati dell’ossigeno molecolare provvisti di azione microbicida (perossido di idrogeno, anione superossido etc).

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Epidemiologia

Le shigelle non essendo in grado di accedere all’interno degli enterociti della mucosa del colon, attraverso la membrana apicale di tali cellule, guadagnano l’accesso alla sottomucosa attraverso le cellule M per transcitosi. I pochi batteri che arrivano alla sottomucosa vengono prontamente fagocitati dai macrofagi residenti nella sottomucosa.

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Produzione di metaboliti

Sono costituiti da prodotti originati dalla crescita batterica in seguito alla demolizione di composti complessi, molti di questi, come l’acido lattico, alcoli, acetone o aldeidi o comunque composti organici possono esercitare un effetto tossico sulle cellule.

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Epidemiologia

Potere aggressivo dei batteri

Sostanze non tossiche: capsula, coagulasi, catalasi (H2O2)

SOD (O2-), collagenasi, ialuronidasi

ecc.Sostanze tossiche:Esotossine: esocitate, proteicheEndotossine: legate al batterio LPSDivisione non netta i.e. endotossine proteiche: V. cholerae 74


Differenze tra esotossine ed endotossine

ESOTOSSINE

Escrete da cellule viventi e ritrovate ad elevate concentrazioni nei terreniPolipeptidi PM 10.000-900.000Relativamente instabili: tossicità spesso rapidamente distrutta col calore>60°Altamente antigeniche, stimolano la formazione di alti titoli di antitossina che neutralizza la tossinaConvertibile in antigene (anatossina) da formalina, acidi, calore ecc.Altamente tossiche, fatali per animali da laboratorio in mg o menoNon producono febbre nell’ospite

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Differenze tra esotossine ed endotossine

ENDOTOSSINE

Parte integrante della parete dei gram-negativiComplesso lipopolisaccaridico (LPS), il lipide A è la porzione responsabile della tossicitàStabile al calore>60° per ore senza perdere tossicitàNon stimola la formazione di antitossinaLa parte polisaccaridica (molto variabile) stimola la produzione di anticorpi (Antigene somatico O)Non è convertibile in anatossinaDebolmente tossico per animali anche a dosi di mgSpesso causa febbre

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Classificazione delle esotossine

TOSSINE CITOLITICHE Attive sulla membrana delle cellule

TOSSINE NEUROTROPE Attive sulle cellule del sistema nervoso

TOSSINE ENTEROTOSSICHE Attive sulle cellule della mucosa intestinale

TOSSINE PANTROPE Attive su tutte le cellule, inibiscono la sintesi proteica

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Epidemiologia

Tossine emoliticheFormazione di pori attraverso la membrana

Attività fosfolipasica che idrolizza la fosforilcolina della membrana

Fig 7.3 LA placa

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Epidemiologia

Esotossine che agiscono a livello delle strutture della superficie

cellulare

Tossina esfoliativa sindrome cute ustionata

Tossine emolitiche (emolisine o citolisine)79


TOSSINE ENTEROTOSSICHE

Citotossiche che causano danni evidenti alle celluleCitotoniche danni non evidenti

Colerica è il prototipo (80.000 daltons)Subunità A 29.000 e 5-6 subunità B identiche 10.500Le sub. B si legano al recettore sulla membrana e facilitano l’ingresso della ALa A induce una ADP-ribosilante NAD-dipendente sul GTP che attiva in modo permanente l’adenilciclasiquesto provoca un perturbazione nel passaggio di acqua ed elettroliti(perdita di acqua attraverso il lume intestinale)

Con meccanismo simile si ritrova in E. coli, K. pneumoniae, S. typhimurium e S. enteritidis

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Epidemiologia

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Epidemiologia

Tossina pertossica

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L’esotossina dissenterica è prodotta dalla Shigella dysenteriae di tipo 1.Neurotossica ed enterotossica. L’inibizione della sintesi proteica avviene con unmeccanismo non ancora noto. Si osserva un’inibizione del trasferimento degliamminoacidi sulla catena peptidica nascente.

Tossina della pertosse. Proteina (100.000 D) composta da 5 subunità.La produzione di cAMP è regolata da due proteine situate all’interno dellamembrana cellulare: Gs che ha funzione stimolante e Gi che svolgeattività inibente. La tossina colerica ha come bersaglio finale la Gsmantenendola in uno stato attivo permanente, mentre la tossina della pertosseinteragisce con Gi impedendo qualsiasi attività inibente.

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TOSSINE PANTROPE

Tossina difterica (prototipo), catena polipeptidica di 62.000 D unita da 2 ponti S-S, la molecola è tagliata da proteasi in due frammenti A e B che restano uniti da S-S. Il frammento B riconosce il bersaglio cellulare, mediante la sua parte COOH terminale, sulla superficie della cellula. Si lega alla parte idrofoba della membrana e crea un canale attraverso il quale il frammento A penetra all’interno. Il glutatione (presente all’interno della cellula) libera il frammento A, enzimaticamente attivo (ADP-ribosilante). Agisce sul NAD staccando ADP-riboso che interagisce con il fattore EF2 bloccando la traslocazione sul ribosoma. Il complesso EF2-ADP potrebbe ancora reagire con il ribosoma e il GTP (che fornisce energia), tuttavia è bloccata l’idrolisi del GTP, non si ha quindi energia e la sintesi proteica è interrotta.

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Epidemiologia

Esotossine che inibiscono la sintesi proteica cellulare

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Epidemiologia

Esotossine citotossiche per azione sul citoscheletro

Sono tutte tossine binarie, formate cioè da due distinti componenti A e B che sono secreti separatamente e si riuniscono solo alla superficie della cellula bersaglio, possiedono tutte un attività catalitica ADP-ribosiltransferasica ed hanno come specifico bersaglio l’actina.C2 di C. botulinum, fattore citotossico necrotizzante prodotto da molti stipiti di E. coli uropatogeni nell’uomo e animali e la tossina dermonecrotica di Bordetella spp.Tossine sono denominate CDT (cytolethal distending toxins) dimostrate in in E.coli, Shigella e Salmonella. induce danni nel DNA che innescano i sistemi di riparo e il blocco del ciclo cellulare Le cellule bersaglio principali sono monociti- macrofagi. 86


TOSSINE NEUROTROPE

Tetanica e del carbonchio attive sulle cellule del SNCBotulinica attiva sulle cellule del sistema periferico

La botulinica blocca la liberazione di acetilcolina nella giunzione neuromuscolare si ha quindi paralisi flacida (meccanismo non noto)

La tetanica blocca l’inibitore del riflesso si ha quindi contrazione, diffonde attraverso il midollo spinale e giunge ai centri nervosi, blocca i mediatori (glicina, acido gamma-aminobutirrico, nucleotidi ciclici) si fissa sui recettori gangliosidici della membrana dei motoneuroni a livello presinaptico (paralisi spastica)

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Epidemiologia

GABA

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Epidemiologia

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Epidemiologia

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Epidemiologia

Tossina botulinica

Sulla base del valore di LD50 di circa 1 ng/kg [3], poche centinaia di grammi di questa tossina potrebbero teoricamente uccidere ogni essere umano presente sulla Terra (a scopo comparativo, la stricnina richiederebbe 400 tonnellate per uccidere ogni essere umano). Generalmente le dosi letali orali risultano comprese fra 0,5 e 5 mg/kg di alimento ingerito.


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Epidemiologia

Endotossina

Glucosamina fosforilata ed esterificata con acidi grassi saturi

Ripetizione di unità diverse nelle diverse specie

Contribuisce alla tossicità del Lipide A influenzandone l’idrosolubilità e la struttura

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Epidemiologia

Endotossina

In passato si riteneva che LPS agisse direttamente sulle membrane biologicheOggi si sa che: stimola i macrofagi al rilascio di sostanze che sono le reali effettrici dell’attività tossicaAttiva la cascata del complementoAttiva la cascata della coagulazione

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Epidemiologia

Effetti dell'endotossina

- febbre (attivazione di IL-l)- neutropenia: adesivita' delle cellule ai vasi, granulocitosi

- ipoglicemia: intensa attività metabolica cellulare glicolisi

- ipotensione: vasodilatazione, permeabilità, stagnazione di liquidi

- anormale perfusione di organi essenziali- attivazione del complemento-disseminata coagulazione intravascolare

- reazioni di Schwartzman (locale e generalizzata)

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Superantigene

Alcune tossine particolari liberate da alcuni patogeni attivano le cellule T senza richiesta di antigene, si legano al recettore di queste cellule sia a quello del complesso maggiore di istocompatibilità che può scatenare una risposta immune nei confronti delle stesse cellule, quindi molto rischioso. Esempi di queste tossine sono quelle dello shock tossico di S.aureus e quelle eritrogeniche di S.pyogenes.

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Epidemiologia

superantigeni

Enterotossine stafilococcicheTSST (Tossina dello Shock Tossico)T. pirogeniche streptococcicheDevono parte della loro tossicità a:Specifica attività enzimatica (es. attivazione interleuchinaSono fortemente pirogene

Interagiscono con i LT, attivazione e moltiplicazione in % amplificata (2-20% vs 0.0001-0.01% normale Ag)

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Epidemiologia

A. L’antigene convenzionale, internalizzato ed elaborato dalla cellula viene esposto nel contesto del MHC II al riconoscimento del TCR con specifica capacità combinatoria

A. Il superantigene lega direttamente, senza precedente internaliz. ed elaboraz., le proteine del MHC II e il TCR

100


Infiammazione

Si ha in risposta di infezione batterica, ma in particolare per i virus, si ha un eccesso di risposta immune in proporzione al processo infettivo. Chlamydia, Borrelia e sifilide, ma anche streptococchi (febbre reumatica)

101


102


Epidemiologia

103


IgALe IgA o immunoglobuline secretorie si trovano in tutti gli epiteli in contatto con l’esterno. Si formano, attraverso la cattura, da parte delle cellule M (microfold) che sono localizzate nei pressi delle placche del Peyer, di corpi estranei, virus, batteri, tossine, ecc. Queste cellule non hanno attività fagocitaria, presentano quindi l’antigene ai macrofagi sottostanti che lo digeriscono e lo presentano alle cellule T che elaborano le IgA specifiche, in questo modo l’organismo ha immunoglobuline per contrastare l’invasione dei microorganismi più frequentemente presenti.

104


105


106

IgA

La mucosa intestinale secerne Ig, in particolare IgA. Si calcola che ne siano prodotte dai 40 ai 60 mg al giorno per ogni kg di peso corporeo. Nelle placche del Peyer vengono prodotte anche IgM. Le IgA sono considerate l’elemento primario per la risposta immunitaria verso gli antigeni microbici. Le IgG fanno parte della risposta immunitaria innata della mucosa.


INTERAZIONI TRA BATTERI Infezioni polimicrobiche

Possono essere più gravi di quellecausate da un singolo patogeno

quando le interazioni tra le singolespecie

trasformano un’infezione mista inuna

INFEZIONE SINERGICA

107


INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico

E’ un fenomeno comune eimportante nella produzione di

infezioni miste diaerobi ed anaerobi

specie in tessuti a lento ricambio odrenaggio o dove l’eliminazione

dei patogeni è rallentato

108



E’ un fenomeno ben documentatonelle infezioni sperimentali

intraddominalitessuti mollisetticemiedentaliginecologiche

109



E’ un fenomeno ben documentatonelle infezioni sperimentali

Da peritoniti sono stati isolati i varimicroorganismi in coltura pura:

Rinoculati in animaliSingola specie: innocua

Coltura mista: palese infezione

110


INTERAZIONI TRA BATTERI Sinergismo batterico (ipotesi)

Favorevoli modifiche dell’ambienteProvvedere a nutrienti essenzialiProvvedere a fattori di virulenzaModulare la risposta immunitariaProtezione reciproca nei confronti degli agenti antibatterici

111


INTERAZIONI TRA BATTERISinergismo batterico

Favorevoli modifiche all’ambiente

Il consumo di O2 da parte dei batteri aerobi nella popolazione mista produce condizioni favorevoli alla proliferazione degli anaerobi, i quali a loro volta proteggono i batteri aerobi dalla fagocitosiIl basso pH dovuto al metabolismo di molti aerobi e acidogeni crea situazioni favorevoli per lo sviluppo di anaerobi e acidofili

112




Molte specie aerobie che producono capsula

(E.coli, K.pneumoniae, S.pneumoniae)raramente producono ascessi seagiscono come unico patogenomentre il Bacteroides fragilis

(anaerobio)produce una capsula che è in grado dipromuovere la formazione di ascessi113




ASCESSO: UN AMBIENTE PROTETTOLa formazione sinergistica di un ascesso provvede:una barriera alla diffusione degli agenti antibattericiuna barriera ai fattori dell’immunità dell’ospiteallo sviluppo di più specie batteriche che:>elaborano enzimi inattivanti gli antibiotici (β-lattamasi, cinasi anti aminoglicosidi ecc.)>causano strette condizioni di anaerobiosi che compromettono l’attività di di aminoglicosidi e chinoloni così come la fagocitosi 114



Provvedere a nutrienti essenziali(commensalismo)

Veillonelle e difteroidi sintetizzano vit. K (naftaquinone) che è richiesto da B.melaninogenicus per crescere e per esprimere la virulenzaS.mutans produce PAB utilizzato da S.sanguisI treponemi fanno uso di acidi grassi (butirrico e succinico) liberato da anaerobi (fusobatteri, batteroidi)Le Veillonelle metabolizzano ac. lattico liberato dalla popolazione microbica normale (PMN)Molti batteri della cavità orale usano ac. lattico liberato dagli altri commensali

115



Provvedere a fattori di virulenza

Fusobacterium necrophorum elabora una leucocidina che protegge Corynebacterium pyogenes dall’attività battericida dei leucociti. (C.pyogenes produce un fattore di crescita per F.necrophorum)

S.aureus produce ialuronidasi che esalta l’attività necrotica degli streptococchi anaerobi e conduce alla distruzione dei tessuti

116



Modulazione della risposta immunitariaNelle infezioni miste gli anaerobi inibiscono la fagocitosi degli aerobi mediante disturbi o indebolimenti delle attività di:opsonizzazionechemiotassi dei neutrofiliproduzione di ossigenobatteriocidiaAttraverso il meccanismo di:diminuzione delle opsonine del sieroproduzione di acidi grassi volatili (butirrico e succinico) tossici per la fagocitosiproduzione di leucocidine

117



Protezione reciproca nei confronti degli agenti antimicrobici

B.fragilis e altre specie anaerobie producono β-lattamasiNelle infezioni miste questi enzimi proteggono le specie sensibili ai β-lattamici inattivando questi antibiotici (patogenicità indiretta)B.fragilis e vari Clostridi possono aminofenilare il cloramfenicolo rendendolo inefficace sulla restante popolazione batterica mista

118



Strategie terapeutiche

L’eliminazione selettiva di un componente della popolazione mista fa fallire il sinergismo battericoFarmaci a spettro ristretto

Eliminazione di tutti i patogeni in causaAntibiotici ad ampio spettrousualmente β-lattamiciin caso di allergie: macrolidi o altri agenti

119


Altre strategie batteriche per sfuggire alle difese dell’ospite

Capsula: per mascherare le cellule opsonizzate ostacola la fagocitosi (S.pneumoniae, K.pneumoniae, H.influenzae)Coagulasi: il germe si annida nel coagulo per proteggersi dalle difese in generale S.aureusFibrinasi, jaluronidasi, collagenasi: distruggere l’integrità dei tessuti con penetrazione all’interno (molti opportunisti)Compromettere la funzionalità dei fagociti e delle cellule ciliate: BordetelleProduzione di enzimi citotossici: S.aureus, S.pyogenes, Pseudomonas spp.A livello di fagocitosi: blocco dei processi ossidativi (Salmonella, Legionella) impedire la fusione tra fagosoma e lisozima (Gonococchi, Micobatteri)

120



Cattura del ferro (siderofori) in competizione con lattoferrinaSfuggire alla risposta immunitaria: liberare la capsula (pneumococchi)Variazioni di antigenicità (Borrelia e gonococchi) E.coli KI nella meningite infantileCattura di materiale dell’ospite e distribuirlo sulla superficie esterna per confondere la risposta immunitaria (Treponema pallidum)Liberare la proteina A che si lega alla porzione Fc delle Ig che provoca l’inversione dell’anticorpo (S.aureus)

121



Fase aerobia (aerobi, >>>ATP)

Fase anaerobia (aerobi, <<<ATP) Fase planctonica Fase sessile Ridotta tossicità di LPS P.aeruginosa, Aggregatibacter actinomycetemcomitansMorte cellulare programmata (PCD) 123



Biofilm: Ig, macrofagi, antibiotici, replicazione lentaFase intracellulare, per sfuggire ai macrofagi, Ig e a molti antibiotici, tasso di crescitaInduzione di forme filamentoseQuorum sensing, attivazione di alcune funzioni cellulari mediate da ferormoni (in funzione del numero)Attivazione di uno stato vitale ma non coltivabile

124


125

S. pneumoniae

S. pneumoniae is known for its ability to enter into a state of genetic competence under conditions of high cell density in response to a secreted signaling peptide (QS). Only a fraction of the S. pneumoniae cells become competent in response to the peptide autoinducer and elaborate a bacteriocin that causes the lysis of noncompetent cells.

The lysed cells release not only transforming DNA and nutrients but also pneumolysin and other factors important for virulence.

S. pneumoniae sacrifices some its relatives for this purpose which facilitates invasion of its host.


Altre strategie battericheIl biofilm come fattore di patogenicità e virulenza

La vita dei microorganismi è prevalentemente sessile e solo una frazione minima (<0,1 %) mantiene uno stato planctonico

126



La semplice adesione ad una superficie, attiva nel microorganismo l’espressione di molti geni che codificano sia per tutti i prodotti deputati alla vita sessile sia quelli che sono coinvolti nei meccanismi di patogenicità e virulenza 127



Una volta che i batteri sono adesi, essi si organizzano in microcolonie. Questo fenomeno implica la presenza di un biofilm, ove i microorganismi sono immersi, costituito da polisaccaridi e prodotti metabolici che, come già detto, mediano adesività tra i microorganismi e gli epiteli e tra i batteri stessi.

128

Biofilm : una resistenza fenotipica

Dunne WM Jr . Clin Microbiol Rev 2002;15:155-166 129



Il biofilm rappresenta un nido di microorganismi anche quando tutte le forme planctoniche sono state uccise. Questo spiega perché i cateteri colonizzati sono sorgenti di gravi infezioni con scarse possibilità di successo terapeutico.

132

Biofilm batterici e Infezioni recidivanti

• Endocarditi: valvole naturali o artificiali • Quadri legati a inserzione di cateteri, protesi, lenti,tubi endotracheali • Otiti,sinusiti • Prostatiti, uretriti ,cistiti • infezioni vie biliari•Fibrosi cistica

Riacutizzazioni di BPCOCosterton JW e al :science 1999;284 :1318-22134

Sethi et al. N Engl J Med 2002; 347: 465-471

• Prevenire la formazione di biofilm

• Disgregare biofilm, già esistenti

• Eradicare i microrganismi negli strati più profondi del biofilm

Attacco al Biofilm

137

Creson M. Focus: Bacterial Cities TimesDispatch.com 13 Gennaio 2003

La strategia terapeutica deve tener conto che gli antibiotici

attualmente in uso sono stati sviluppati e studiati

per agire contro batteri planctonici e non organizzati

in biofilm

Attacco al Biofilm

138



Nel loro insieme queste osservazioni indicano che la fase planctonica è quella che favorisce la disseminazione della vita microbica, mentre la fase sessile all’interno del biofilm è favorevole alla sopravvivenza.

140



Lo sviluppo del biofilm è condizionato dalla presenza nell’ambiente di un fattore prodotto dagli stessi microorganismi autoinducente che a sua volta dipende dal numero dei batteri, il fenomeno è noto come quorum sensing

141


Epidemiologia

Quorum Sensing

142


Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri

Quorum sensing

E’ stato identificato nel 1970 su un batterio luminescente il Vibrio fischeri che colonizza un cefalopodo. Il microorganismo è presente in mare ad una concentrazione di circa 100 cell/ml. Mentre sull’organo luminoso del pesce raggiunge 1010 cell/ml e diviene luminescente.

143


Espressione di un gene in funzione della densità dei batteri

Quorum sensing

I batteri elaborano un prodotto specie specifico (omoserinalattone) diffusibile nell’ambiente ove permane e si accumula.Quando la concentrazione raggiunge un limite condizionato dal numero dei batteri presenti si ha induzione del gene bersaglio.

144


Quorum sensing

Il sistema detto luxI~luxR è stato identificato in molte specie ed è tutto da valorizzare.E’ un sistema molto economico per rivelare la propria presenza solo quando il numero è sufficientemente alto per avere tutti i vantaggi (nutrimenti, trasferimento di geni, fattori di patogenicità e virulenza, ecc.)

145


Quorum sensingApplicazioni

E’ stato dimostrato che se in P.aeruginosa si inattiva il gene las il microorganismo perde i suoi caratteri di patogenicità.

Si possono rendere innocui i patogeni eliminando il loro sistema quorum sensing?

146


Quorum sensingApplicazioni

Trovare composti che funzionano come gli autoinduttori ma bloccano il gene

Furanone è stato trovato in un’algaha dimostrato di interferire con il quorum sensing di Serratia liquefaciens.

147


148I Gram-positivi causano effetti simili ma usano mediatori diversi


La scoperta dei sistemi quorum sensing nei batteri gram-negativi ha non solo approfondito le nostre conoscenze sulla patogenesi delle infezioni causate da questi organismi ma potrebbe anche provvedere ai mezzi per il trattamento di queste comuni ed importanti infezioni

Hartman and Wise 2001 149

E’ noto che in natura i batteri si presentano con caratteristiche molto diverse da quelle che mostrano in coltura in laboratorio

L’ambiente naturale può essere sfavorevole alla crescita e alla sopravvivenza di molti batteri, specialmente di quelli adattati a moltiplicarsi nell’uomo o negli animali

Questi microorganismi hanno sviluppato risposte sofisticate alle variazioni ambientali

150

Quando le condizioni ambientali non sono idonee alla crescita, i batteri entrano in una fase programmata di

sviluppo che risulta in uno stato metabolico meno attivo e rende il batterio più resistente.

•Aumento della resistenza agli agenti antimicrobici

•Cambiamenti nell’idrofobicità di superficie e nelle capacità adesive

•Cambiamenti a carico degli acidi grassi di membrana, degli aa della parete

•Cambiamento di forma

•Topologia del cromosoma

151

I BATTERI SI ADATTANO ALLE VARIAZIONI AMBIENTALI MEDIANTE

•Induzione della sintesi di sistemi di cattura dei nutrienti presenti in concentrazioni ridotte

•Modificazione della sintesi di alcuni enzimi allo scopo di utilizzare efficientemente i nutrienti presenti in

concentrazioni ridotte

•Modulazione del tasso di incorporazione dei nutrienti presenti in eccesso

•Riorganizzazione di alcune vie metaboliche allo scopo di evitare possibili blocchi

Coordinamento dei tassi di sintesi per mantenere la crescita bilanciata

153

VBNCviable but non culturable

(Xu et al. 1982)

I batteri in stato VBNC sono metabolicamente attivi ma non sono in

grado di attuare i processi divisionali che portano alla formazione di colonia sui

terreni di coltura normalmente utilizzati per il loro rilevamento

154

FATTORI CHE INFLUENZANO L’ATTIVAZIONE DELLO STATO

VBNC

Scarsità di nutrienti

Temperatura

Luce

Salinità

Pressione idrostatica

Ossigeno

155

ELENCO DI ALCUNI BATTERI CHE POSSONO ATTIVARE LO STATO

VBNC

Aeromonas

Agrobacterium

Alcaligenes

Campylobacter

Enterobacter

Pseudomonas

Rhizobium

Salmonella

Shigella

Vibrio

Yersinia

Enterococcus

Escherichia

Helicobacter

Klebsiella

Legionella

Micrococcus

156

SAGGI UTILIZZATI PER LA DIMOSTRAZIONE DELLA VITALITA’ BATTERICA

•Conta Vitale Diretta (DVC)

•Immunofluorescenza - Conta Vitale Diretta (DFA-DVC)

•Colorazione con cloruro di tetrazolio (CTC)

•Colorazione con “Live/Dead bacLight Viability kit”

•Ricerca di RNA messaggero (RT-PCR)

•Ricerca di antigeni specifici dello stato VBNC

157

Le cellule non coltivabili (VBNC, stressate) possono rappresentare un problema

per la salute pubblica se non rilevate con saggi

adeguati

158

a | Innate immune cues. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) reside intracellularly within bladder epithelial cells. A small number of intracellular bacteria respond to the activation of host immune effectors by filamentation. Epithelial-cell death accompanies bacterial growth, thereby resulting in the exposure of filamentous and bacillary organisms on the surface. The filamentous form is resistant to neutrophil phagocytosis. The recovery from filamentation results in the invasion of naive epithelial cells to begin the process again.

Filamentation of bacteria in response to environmental cues.

164


b | Predator sensing cues. Marine bacterial populations are made up of multiple species, including the prototypical Flectobacillus spp. Protist grazing on all species stimulates filamentation in Flectobacillus spp. Filamentous forms cannot be grazed by marine protists. Recovery from filamentation results in an alteration in the diversity of bacteria in the environment and the depletion of non-Flectobacillus species 165


c | Quorum sensing cues. Proteus mirabilis grows as a bacillary form that can count the number of similar species in the vicinity by quorum sensing. If a quorum of organisms is verified, the bacteria respond by initiating the differential gene expression that leads to filamentation. Although a mechanistic reason for filamentation in Proteus spp. Is under debate, the evidence suggests that this morphology leads to enhanced invasion of the urothelium, thereby providing protection from the host immune response. Dissemination into the tissue disperses the swarming filaments. Cell division is restored owing to low levels of quorumsensing molecules in the tissue.

166


d | Antimicrobial cues. Filamentation occurs if bacteria are exposed to certain β‑lactam antibiotics in vitro and in vivo. Filamentation allows for survival until the antibiotic is diluted or becomes inactive. The restoration of cell division occurs once the antibiotic activity is lost. In some cases, for example, Burkholderia pseudomallei, cell-division capacity is maintained even in the presence of antibiotics of similar and dissimilar classes, which indicates that protection has been conferred to daughter cells. The

mechanisms and consequences of this response have not yet been explored.167

INVASIONE CELLULARE da parte di batteri enteropatogeni

169

Cos‘è un batterio enteropatogeno invasivo?

• I batteri invasivi sono capaci di promuovere il loro ingresso in

cellule che non sono fagociti professionisti.

• I batteri enteroinvasivi raggiungono il lume intestinale,

aderiscono alle cellule dell’ospite e superano la barriera naturale,

estremamente impermeabile, rappresentata dalle cellule epiteliali

Esempi:

Yersinia enterocolitica e Yersinia pseudotuberculosis

Shigella spp.

Salmonella spp.

Listeria monocytogenes 170

Barriere all‘infezione batterica nel tratto gastro-intestinale

171

La barriera dell‘epitelio intestinale

172

Cellule M: il punto debole, il tallone d‘Achille

Le placche del Peyer (formate da un centro germinativo di linfociti B circondato da linfociti T) si trovano nella sottomucosa dell’intestino tenue. L’epitelio sovrastante le placche presenta cellule M, cellule epiteliali specializzate nel consentire il passaggio di particelle nel tessuto linfoide sottostante.La superficie basolaterale invaginata forma una superficie dove migrano linfociti e macrofagi. Molecole e particelle vangono trasportate nella tasca.

173

Fattori che determinano se il batterio sarà internalizzato o no:

• Natura del recettore sulla cellula ospite

• Forza dell’interazione

• Capacità del batterio di inviare segnali che stimolano o antagonizzano l’internalizzazione

174

STUDI IN VITRO E IN VIVO

Colture cellulari

Diverse linee cellulari sono state usate per studiare l’invasione batterica: sistema eccellente, riproducibile e non complicato, ma con diverse limitazioni

Modelli animali

Dopo che i dettagli molecolari sono stati determinati in vitro, possono essere poi verificati in modelli animali

175

Meccanismi di invasione cellulare

TriggerZipper

Yersinia, Listeria Salmonella, Shigella

176

Ingresso di Listeria monocytogenes in fagociti non professionisti in vitro

Sono coinvolte almeno due proteine di superficie: • Internalina (InlA): proteina di superficie che è ancorata covalentemente alla parete

• InlB: proteina di superficie legata debolmente alla parete

177

in vivo

• I topi non sviluppano una malattia letale dopo infezione per os con Listeria: scarsa traslocazione dei batteri attraverso l’intestino•Risultati simili con Listeria wt o mutanti inlA

Listeria wt causa una malattia sistemica in topi transgenici che esprimono caderina E umana negli enterociti, mentre mutanti InlA sono incapaci di attraversare la barriera intestinale efficientemente

• Cellule che esprimono E-cadherin di topo, al contrario di cellule che esprimono E-cadherina umana, non permettono ingresso di Listeria via inlA

•la specie specificità è dovuta a differenze in un singolo aa

178

Model of invasion of the intestinal epithelium by Listeria

179

Motilità dipendente dalla polimerizzazione

di actina• Polimerizzazione dell’actina con

formazione di code• Si muove nel citoplasma• Invade le cellule adiacenti• ActA: proteina di 90 kDa,

determina il reclutamento e l’assemblaggio dei filamenti Localizzata ad una estremità del batterio

Velocità: 1um/sec

181

• I batteri a contatto con la membrana plasmatica continuano a muoversi

• Producono protusioni che si estendono nella cellula adiacente: listeriopodi

• Si forma una vescicola con due membrane e la cellula si libera nel citoplasma

• Listeriolisina• PC- PLC: proteina extracellulare 28 kDa fosfolipasi

a largo spettro, idrolizza la fosfatidil colina (PC)• Metallo proteasi: trasforma il precursore di PC-

PLC (33 kDa) in forma attiva (28 kDa)• Le due fosfolipasi determinano la lisi di entrambe le

membrane cellulari. Non è noto se svolgano ruoli diversi nei due compartimenti che formano il vacuolo Pseudopodi: 40 um

Ingresso nella cellula adiacente e fuoriuscita dal vacuolo secondario

Per la fuoriuscita dai vacuoli:

182

plcBhlyA

actA

hlyA plcA

inlA/B

inlA: internalina; hly: listeriolisina; plcA: PI- PLC (una fosfolipasi);

actA: polimerizzazione actina; plcB: PC- PLC (una fosfolipasi) 183

The invasive phenotype of Shigella is dependent on a type III secretion system encoded by a 30 kb region of a 200 kb virulence plasmid

VIRF: quando il batterio cresce a 37°C, la proteina plasmidica virF si lega al promotore di virB inducendo l’espressione della proteina virB, anch’essa plasmidicaVirB: attiva i promotori ipa, mxi, e spa.

Ipa B e C, si integrano nella membrana dell’ospite e promuovono la formazione degli pseudopodi

IpaA iniettata nel citoplasma dell’ospite favorisce la depolimerizzazione dell’actina accumulata intorno al sito d’ingresso del batterio. Le proteine IpaA servono anche per la lisi del vacuolo

mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genes spa surface presentation of invasion plasmid antigensspa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del complesso di traslocazione inattivo Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il contatto con la cellula

IcsA (VirG): una ATPasi localizzata sulla membrana esterna della cellula batterica, in posizione polare IcsA richiama sulla superficie della cellula batterica diverse proteine actino-associate, provocando la polimerizzazione dell’actina dell’ospite e lo spostamento della cellula batterica.

IcsB lisa le membrane dei vacuoli; esposta sulla superficie o secreta

185

IPa (Invasion-Plasmid-Antigens)-ABCD

Ipa B e C, si integrano nella membrana

dell’ospite e promuovono la formazione degli

pseudopodi

FATTORI DI VIRULENZA plasmidici

IpaA iniettata nel citoplasma dell’ospite

favorisce la depolimerizzazione

dell’actina accumulata intorno al sito d’ingresso del

batterio. Le proteine IpaA

servono anche per la lisi del vacuolo

IpaA (30 kDa) IpaB (62 kDa), IpaC (42 kDa), e

IpaD (35 kDa) in condizioni non secretorie sono accumulate nel

citoplasma legate ad una proteina di 18 kDa

(IpgC) che ne impedisce

l’aggregazione e la digestione

VIRF: quando il batterio cresce a 37°C, la proteina plasmidica virF si lega al promotore di virB inducendo l’espressione della proteina virB, anch’essa plasmidicaVirB: attiva i promotori ipa, mxi, e spa.

186

IcsA (VirG): una ATPasi localizzata sulla membrana esterna della cellula batterica, in posizione polare IcsA richiama sulla superficie della cellula

batterica diverse proteine actino-associate, provocando la polimerizzazione dell’actina dell’ospite e lo spostamento della cellula batterica.

IcsB lisa le membrane dei vacuoli; esposta sulla superficie o secreta

FATTORI DI VIRULENZA

spa surface presentation of invasion plasmid antigens

mxi membrane excretion of Ipa, and virulence vir genes.

spa e mxi operon: la loro espressione porta all’assemblaggio del complesso di traslocazione inattiva Mxi-Spa; l’attivazione avviene dopo il contatto con la cellula

187

Preinvasion step in the pathogenesis of Shigella spp. Ipa: invasion plasmid antigens; Mxi-Spa: membrane expression of Ipa proteins and surface presentation of antigens

A 37°C, VIRF e VIRB attivano operon spa, mxi e ipa

invasion plasmid antigens ipa, surface presentation of invasion plasmid antigens spa, membrane excretion of Ipa mxi, virulence vir genes.

188

Early steps in the invasion of Shigella spp into M cells. Ipa: invasion plasmid antigen; Spa: surface presentation of antigens

189

Cytoskeletal rearrangements induced during Shigella invasion of epithelial cells. Shigella secretes the effector proteins, such as IpaB, IpaC, IpaA and VirA, into host cells. IpaB and IpaC are integrated into the host membrane, and IpaC modulates Cdc42-dependent filopodial formation which, in turn, may cause activation of Rac1 and lamellipodial formation. IpaA binds vinculin, and the resulting IpaA−vinculin complex promotes depolymerization of actin filaments, which is thought to be required for modulation of lamellipodial formation. VirA binds / -tubulin heterodimers and induces MT destabilization. VirA-induced MT destabilization would in turn lead to MT growth and stimulation of the Rac1 activity, and thus evoke the local membrane ruffling.

192

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