Gli enzimi accelerano le reazioni anche di un milione di volte.Se non ci fossero gli enzimi la maggior parte delle reazioni dei sistemi biologici procederebbe a velocità non apprezzabili

ENZIMI

Catalizzatori prodotti da cellule viventi ma capaci di agire indipendentemente da esse

Determinano tutti i processi di degradazione, sintesi, trasformazione e conservazione dell’energia nella formazione ed evoluzione

della materia vivente. 

Sono PROTEINE spesso associate ad un metallo o molecola organica

• Gli enzimi sono altamente specifici sia nei riguardi della reazione catalizzata sia nei riguardi dei substrati

• Esiste in vasto repertorio chimico dei gruppi funzionali degli aa. Tuttavia essi spesso non riescono a soddisfare i fabbisogni chimici della catalisi.

• L’attività catalitica di molti enzimi dipende dalla presenza di piccole molecole, chiamate cofattori, il cui ruolo può essere diverso da enzima ad enzima

• La proteina enzimatica senza il suo cofattore è detto apoenzima, mentre la sua forma completa e cataliticamente attiva è detta oloenzima.

• I cofattori possono essere suddivisi in due gruppi:

• piccole molecole organiche dette coenzimi

• metalli

Il ΔG è utile per comprendere il funzionamento degli enzimi

• L’energia libera (G) è una funzione termodinamica che rappresenta una misura dell’energia utile, cioè dell’energia in grado di compiere un lavoro

• Il ΔG non fornisce informazioni sulla velocità di reazione.

• ΔG < 0 non significa che la reazione avviene ad una velocità apprezzabile

• Gli enzimi aumentano la velocità ma non influenzano la posizione dell’equilibrio

CATALISI

⇓legata ai gruppi R degli amminoacidi la cui

natura e disposizione residua individua una tasca detta SITO ATTIVO. E’ fondamentale la

conformazione nativa della proteina per la sua funzione catalitica.

 DENATURAZIONE ⇒ MODIFICA STRUTTURA NATIVA ⇒ DISATTIVAZIONE DELL’ENZIMA

 

La formazione del complesso enzima-substrato è la prima tappa nella catalisi

enzimatica

• Il potere catalitico degli enzimi deriva dalla loro capacità di avvicinare i substrati con un orientamento favorevole e promuovere la formazione di stati di transizione

• Gli enzimi formano il complesso enzima-substrato (ES) in una specifica regione detta sito attivo

Il sito attivo di un enzima è la regione a cui si lega il substratoE’ costituito da una tasca o fenditura tridimensionale formata da gruppi che derivano da parti diverse della sequenza amminoacidica della proteinaQuasi tutti gli enzimi sono costituiti da più di 100 aaIl sito attivo occupa una parte relativamente piccola del volume totale di un enzima

Il sito attivo

Un enzima complementare al suo substrato potrebbe essere un cattivo enzima.Per poter catalizzare una reazione, un enzima deve essere complementare allo stato di transizione della reazione

Meccanismo catalisi enzimatica

CATALISI OMOGENEA sub. e cat. nella stessa faseCATALISI ETEROGENEA sub. e cat. in fasi diverse Incremento di velocità 108-1020 volte con eventuale fondamentale intervento di componenti non proteiche (ioni Me o coenzimi). Struttura tridimenzionale dell’E fondamentale per la conoscenza dello stato di transizione e quindi del meccanismo di reazione. SITO ATTIVO = PARTE DELL’ENZIMA IN CONTATTO CON IL SUBSTRATO (zona piccola in confronto alle dimensioni dell’enzima).

Modificazioni sito attivo scomparsa attività enzimatica. 

Struttura primaria e strutture superiori determinate dalla sintesi proteica = predestinazione di una proteina a funzionare da enzima.

 PM enzimi = da 12000 a 106 Molecola su cui opera l’enzima = substrato

 DIMENSIONE ENZIMA » DIMENSIONE SUBSTRATO

 

 Apoenzima(denaturato con cal.) +

cofattore o gruppo prostetico (stabile al riscaldamento) ⇓

Enzima completo (oleoenzima)

Enzimi richiedono cofattori per funzionare che possono essere ioni inorganici (Fe, Mg, Mn, Zn, Mo etc.) o molecole

organiche (coenzimi) che possono essere:

  legati debolmente alla proteina   legati saldamente alla proteina (gruppo prostetico)

ATP ⇒ metabolita coezimatico + comune (cosubstrato modificato nella reazione e dissociato) NAD+ e NADP+ ⇒ coenzimi nucleotidici piridinici associati a deidrogenasi che catalizzano il trasferimento di un H- da un substrato al nucleotide portandolo nella forma ridotta con rilascio di H+

 Coenzima A ⇒ coenzima derivato dall’acido pantotenico è coinvolto nel trasferimento di gruppi acilici CH3CO-

Altri coenzimi sono: Biotina, Acido Lipoico, vitamine A, D, E e K.

Idrolizzano il legame peptitico e glicosidico

Enzimi identificati da 4 numeri: 1.   Appartenenti a una delle classi relative alla reazione catalizzata2.   Appartenenza ad una sottoclasse3.   Appartenenza ad una sottosottoclasse4. Posizione progressiva nella sottosottoclasse

EsempioATP + glucosio = ADP + glucosio-6-fosfatoCatalizzatore esochinasi (nome comune) o ATP-glucofosfotransferasi (catalizza il trasferimento del P da ATP a glucosio). Numero dell’enzima 2.7.1.1.2. classe delle transferasi7. sottoclasse fosfotransferasi1.   sottosottoclasse fosfotransferasi con OH come gruppo accettore1.glucosio come accettore del gruppo fosforico.

Enzima Chirale riesce a distinguere tra gruppi della molecola stericamente non equivalenti.  Risulta perciò altamente specifico e distingue due diversi stereoisomeri o nella reazione con un centro Pro-chirale genera uno solo dei possibili isomeri (geometrici o ottici) 

SPECIFICITA’ DEGLI EMZIMI Un enzima può avere diversi gradi di specificità:Specificità che tiene conto del legame (specificità di legame, Bassa specificità)Specificità che tiene conto di una parte della molecola (specificità di gruppo)Specificità che richiede le due parti della molecola ed il legame che le unisce (specificità assoluta).

Es.

A-B + H2O = AOH + BH•la natura di A e B non è importante•A o B devono essere determinate•A e B devono essere del tipo appropriato.Maltasi: catalizza l’idrolisi del maltosio ma essa può operare sugli -glucosidi cioè sul glucosio legato con legame -glucosidico ad un altro zucchero qualsiasi (specificità di gruppo).

Meccanismo reazione enzimatica

Catalisi per abbassamento Ea per stabilizzazione chimica del complesso attivato e/o + corretto orientamento geometrico per la formazione del complesso attivato

E con S forma ES ad energia + bassa in un equilibrio non alterato, riuscendo a discriminare tra parecchi substrati

(specificità) in competizione per il S.A. nel quale ci sono gruppi funzionali che:

•Reagiscono temporaneamente con S•Predispongono S a formare P

I gruppi catalitici di E interagendo con S lo preparano (attivano) alla reazione abbassando Ea.Tra substrato-enzima si forma il complesso ES la cui energia di legame serve per:

ridurre l’entropia (avvicinamento e orientamento substrato)desolvatare il substratoindurre binding produttivo o adattamento indotto

Dall’energia del legame E-S dipendono la catalisi e la specificità.

Desolvatazione

DIVERSI TIPI DI CATALISI Catalisi acido base specifica se dovuta a H+ o OH- o generale se dovuta a gruppi accettori o donatori di protoni (sulle catene laterali degli a.a. e più comune al pH 7 della cellula) Catalisi covalente mediante formazione di un complesso attivato stabile per la formazione di legami covalenti tra E ed S.

La velocità iniziale di una reazione aumenta quasi linearmente all'aumentare della concentrazione di substrato.

La velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e la reazione è di primo ordine V = k [S]

[S]

Vo

Cinetica Enzimatica

La proporzionalità fra V e [S] progressivamente diminuisce.

La velocità iniziale diventa indipendente dalla [substrato] e la reazione è di ordine zero rispetto al substrato.

Vmax

[S]

V

Cinetica Enzimatica

Il complesso ES è la chiave per comprendere la cinetica enzimatica

E + S ES

ES

K1

K-1

K2

K-2E +P

La seconda reazione è più lenta e quindi limita la velocità globale.In qualsiasi istante l’enzima è presente nella forma libera e in quella combinata. Quando la [S] è bassa, l’enzima sarà per lo più nella forma libera. Quindi via via che [S] tende ad aumentare viene favorita la formazione di ES.

• La velocità iniziale massima della reazione (Vmax) si osserva quando tutto l’enzima è presente sotto forma di complesso ES.

• Questa condizione, però, esiste solo quando [S] è elevata. L’effetto saturante del substrato è una proprietà caratteristica degli enzimi responsabile dell’appiattimento della curva.

• E +S ES E +P

• La velocità di catalisi Vo, definita come moli di prodotto formate al secondo, viene determinata dalla demolizione di ES per dare origine a P, quindi

• Vo = K2[ES]

K1

K-1

K2

Equazione di Michaelis-Mentendove:

costante di Michaelis-MentenQuando Vo= 1/2Vmax

=

Alla fine

Vo =

Vmax [S]

Km + S

Vmax [S]

Km + S

Vmax

2

Dividendo per Vmax si ha:

1

2=

[S]

Km +[S]

Risolvendo per Km abbiamo Km+[S] = 2S

Oppure Km=[S] quando Vo=1/2 Vmax

Quindi Km è equivalente alla concentrazione del substrato a cui Vo è metà della Vmax

Vmax e Km possono variare considerevolmente passando da un enzima all’altro. Sono parametri calcolabili sperimentalmente

Grafico di Michaelis-Menten

Significato delle costanti cinetiche

• Lo studio della cinetica enzimatica è importante per vari motivi:

1) Aiutano a comprendere come lavorano gli enzimi2) Aiutano a comprendere come lavorano in vivo: le

costanti cinetiche Km e Vmax, sono di estrema importanza per capire come gli enzimi si coordinano tra loro a livello metabolico

3) Permettono confronti tra organi e tra specie4) Possono essere usate a scopo clinico-diagnostico

Andamento cinetico

Vmax

[S]

V

Cinetica Enzimatica

½ Vmax

Km

Vo=Vmax

La costante di Michaelis (KM)

kM kM kM kM kM kM kM

affinità

KM = K2 +K-1 /K1

K2 è la costante che limita la velocità (stadio lento) per cui è >> di K-1 che è la costante di dissociazione del complesso ES

Quindi la KM è la concentrazione del substrato alla quale la metà dei siti per il substrato sono saturati. Quindi KM fornisce una misura della conc di substrato richiesta affinchè la catalisi abbia luogo

KM e Vmax sono importanti caratteristiche degli enzimi

• Per la maggior parte degli enzimi KM varia da 10-1 a 10-7

Effetti della concentrazione dell’enzima

Vmax è direttamente proporzionale alla [E]

Km è indipendente dalla [E] e dalla [S]

• La Vmax esprime il numero di turnover degli enzimi, cioè il numero di molecole di substrato convertite in prodotto da una molecola enzimatica nell’unità di tempo quando l’enzima è totalmente saturato dal substrato

la quantità di enzima che catalizza la formazione di una micromole di prodotto in un minuto

Unità Internazionale

il numero di molecole di substrato convertite in prodotto nell'unità di tempo da una molecola di enzima quando è saturata con il substrato.

kcat o numero di turnover

• Il numero di turnover dipende da k2 che è detta anche kcat. Se è nota la conc totale di siti attivi [E]T, allora

• Vmax = k2 [E]T quindi

• K2 = Vmax/ [E]T

Vmax = kcat [ET] kcat = k2

kcat kcat kcat kcat kcat kcat

efficienza catalitica

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

Enzima kcatcatalasi 40 000 000

anidrasi carbonica 1 000 000

acetilcolinesterasi 14 000

lattato deidrogenasi 1 000

chimotripsina 100

DNA polimerasi 15

lisozima 0,5

Il rapporto Kcat/KM è una misura dell’efficienza catalitica

• Quando la conc del substrato è molto più elevata di KM la velocità della reazione catalizzata è uguale a Vmax

• Però dentro la cellula la maggior parte degli enzimi non sono saturati dal substrato

• Riportando l'equazione di Michaelis-Menten nella forma

è possibile ottenere il grafico dei doppi reciproci (o di Lineweaver-Burk), rappresentando graficamente l'andamento di 1/V in funzione di 1/[S]. In tal modo si ottiene una retta con intercetta sull'asse delle ascisse nel punto - 1/KM, sull'asse delle ordinate nel punto 1/Vmax e con coefficiente angolare pari al rapporto KM/Vmax.

[S]

1

V

K

V

1

V

1

max

M

max

Che cosa influenza la velocità della reazione?

Temperatura, °C

Velo

cit

à d

i re

azi

on

eTEMPERATURA

pH

Velo

cit

à d

i re

azi

on

e

pH

Pepsina ChimotripsinaTripsina

La velocità aumenta all’aumentare di T, ma nella catalisi enzimatica un aumento di T può portare ad una variazione di conformazione con perdita conseguente dell’attività catalitica. Di solito si ha un max di attività tra 40°C e 60°C e la denaturazione completa a 90-95 °C.

Andamento variabile con uno o più massimi di attività a diversi pH. A pH estremi:•si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima•si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame ES•si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone l’affinità per S•si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del complesso ESGli effetti 2 e 3 influenzano la KM il 4 la Vmax.

Influenza della temperatura  Lo studio attività/temperatura permette di calcolare dall’equazione di Arrhenius K=A e-Ea/RT

dalla cui linearizzazione si possono calcolare:Ea (molto + basso nelle reazioni enzimaticamente catalizzate)Q10= coefficiente termico ovvero fattore di cui aumenta la velocità quando T aumenta di 10°C. Reazioni non catalizzate Q10= 2Reazioni catalizzate 1<Q10< 2

Influenza del pHAndamento variabile con uno o più massimi di attività a diversi pH. A pH estremi:•si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima•si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame ES•si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone l’affinità per S•si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del complesso ESGli effetti 2 e 3 influenzano la KM il 4 la Vmax. 

Fattori che influenzano la velocità di reazione

• Temperatura

• pH

• Concentrazione dell’enzima

• Concentrazione del substrato

• Nel caso di enzimi allosterici anche la presenza di modulatori positivi e negativi

Temperatura

pH

[E]

[S]

Se mettiamo in grafico V in funzione di [S], troviamo che: •A bassi valori di [S], la velocità V, aumenta quasi linearmente con l’aumentare di [S]. •Ma come [S] aumenta, gli aumenti di V diventano via via più piccoli (iperbole rettangolare). •L’asintoto rappresenta la velocità massima della reazione,Vmax •La concentrazione di substrato che produce una V che è la metà di Vmax è detta costante di Michaelis-Menten, Km.

La maggior parte delle reazioni chimiche ha più substrati

Reazioni sequenziali = reazioni con + substrati tutti presenti affinchè si abbia la liberazione di prodotti

REAZIONI CON PIU’ SUBSTRATI

Reazioni a ping-pong = prodotto liberato prima che tutti i substrati siano stati legati.

S1 per primo si lega ad E che subisce una modificazione per sostituzione liberando il primo prodotto: poi l’enzima modificato si lega al secondo substrato S2 formando il secondo prodotto e liberando l’E nella forma originaria.

SISTEMI MULTIENZIMATICIReagiscono in una serie consecutiva di reazioni in cui P diventa S della reazione successiva (azione concertata da 2 a 20 E di reazioni in sequenza).

INIBIZIONE ENZIMATICA

Inibitori (I) =diminuiscono le velocità di reazioneL’inibitore può legarsi all’enzima mediante legami:

Fisici (inibizione reversibile) con l’allontanamento di I si ripristina l’attività di E

Chimici (inibizione irreversibile) la formazione di legami covalenti impedisce il semplice allontanamento dell’I.

Inibitori enzimatici (piccole molecole o ioni)

ReversibiliIrreversibili

INIBIZIONE REVERSIBILE

Inibizione competitiva = I compete con S per il sito attivo di E Si può ridurre aumentando la [S]. Cambia KM non cambia Vmax

Inibizione non competitiva = I si lega ad E in un sito diverso dal sito attivo. Si abbassa la Vmax ma non si modifica la KM

Inibizione incompetitiva = I si lega solo al complesso ES. E + S ES E+P; ES+I ESISi modificano entrambe le costanti cinetiche.

Inibizione Competitiva

Inibizione competitiva per formazione di legami col sito attivo.I è spesso simile al substrato e si lega al sito attivo dell’enzima

impedendo al substrato di legarsi

                                                                                                 

                                                                                    

 Un inibitore competitivo diminuisce la velocità della reazione perché riduce la frazione di molecole enzimatiche legate al substrato

Un inibitore competitivo ridurrà l'affinità enzima substrato, cioè aumenterà il valore di KM.

Si può rimuovere aumentando [S]. Ad alte concentrazioni di substrato la reazione non viene rallentata e Vmax è sempre la stessa.

Alcuni inibitori competitivi sono farmaci molto utili.

La sulfanilammide è un antibiotico contenente S strutturalmente identico all’acido p-amminobenzoico

(PABA) un metabolita richiesto dai batteri per la sintesi dell’acido folico. La sulfanilammide si lega all’enzima che

sintetizza la PABA e lo inibisce in modo competitivo inibendo la sintesi di acido folico.

Altri inibitori competitivi sono le statine che inibiscono la sintesi del colesterolo

Inibizione non competitiva: inibitore e substrato si legano

simultaneamente in siti diversi dell’enzimaInibizione competitiva per cambiamento di conformazione

Gli inibitori non competitivi agiscono diminuendo il numero di turnover ma non agiscono sulla proporzione di molecoleche legano il substrato

I

                                                                                                                 

                              

La KM rimane invariata

La Vmax diminuisce

L’inibitore abbassasemplicemente la conc dell’enzima funzionale

Il substrato può ancora legarsi al complesso EI oltre che all’enzima da solo. In ogni caso il complesso ESI non procede verso la formazione dei prodotti

Inibizione incompetitiva: l’inibitore si legasolo al complesso ES

Il complesso ESI non procede verso la formazione di alcun prodotto.

Il substrato non viene più convertito in prodotto.

L’inibizione incompetitiva non può essere rimossa da un eccesso di substrato

Inibizione non competitiva

Inibitori irreversibili

• Alcuni inibitori irreversibili sono farmaci importanti. La penicillina agisce modificando covalentemente l’enzima transpeptidasi e in questo modo la sintesi della parete batterica viene bloccata e i batteri tendono a morire.

• L’aspirina agisce modificando covalentemente l’enzima cicloossigenasi riducendo la sintesi dei segnali infiammatori

Gli inibitori irreversibili si combinano o distruggono un gruppo funzionale dell’enzima essenziale per l’attività catalitica.

Es. Inibitori suicidi o inattivatori basati sul meccanismo che portano avanti le prime tappe della reazione enzimatica normalmente, poi invece di essere convertiti nel prodotto di reazione diventando composti molto reattivi che si legano irreversibilmente all’enzima.

specificità

reazioni

substrati

complementarietà strutturale

mutuo riconoscimento

regolazione

modulazione dell’attività

quantità di proteina enzimatica

GLI ENZIMI REGOLATORI

ENZIMI REGOLATORI

• Gli enzimi regolatori sono capaci di modulare la attività catalitica in risposta di certi segnali. Nei metabolismi possono lavorare insieme in modo sequenziale, ma almeno uno determina la velocità complessiva catalizzando la reazione più lenta (enzima regolatore).

• In molti sistemi multienzimatici il I enzima di ogni sequenza è un enzima regolatore.

Vi sono due classi di enzimi regolatori:

Enzimi allosterici che agiscono mediante il legame reversibile di un metabolita chiamato modulatore

• Enzimi regolati mediante modificazioni covalenti reversibili

• Queste due classi di enzimi sono proteine a struttura quaternaria che spesso non hanno sulla stessa subunità sito attivo e sito regolatore.

• Quando il substrato si comporta da modulatore l’enzima è detto omotropico

• se si tratta di molecola diversa eterotropico

Gli E regolatori non seguono il modello di Michaelis e Menten con andamento a sigmoide invece che iperbolico della curva Vo –[S] dovuto a interazioni cooperative tra le subunità dell’E.

ENZIMI NEL TERRENO Sono prevalentemente liberi ed extracellulari e possono

rimanere stabili ed attivi per migliaia di anni.Nel suolo esiste attività catalitica inorganica ed

enzimatica, ma quest’ultima è molto più efficiente e eliminabile con trattamenti termici energici (110-150 °C per 15-30 h per una distruzione totale)

Nel suolo 4 classi di E:•Ossidoreduttasi•Idrolasi•Liasi•Transferasi

La prime due sono predominantiPolisaccaridasi e proteinasi (idrolasi) demoliscono macromolecole come carboidrati e proteine e sono essenziali per i cicli biologici di C e N.Fosfatasi e solfatasi (idrolasi extracellulari) producono P e S nutrienti per le piante. Altre idrolasi demoliscono fitofarmaci e xenobiotici.Deidrogenasi (ossidoreduttasi intracellulari) danno informazioni sull’attività biologica delle popolazioni microbiche.