Gian Cesare Guidi Dipartimento di Scienze Morfologico ... · midollo osseo: Escluse (B cell) e (T...

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Biochimica e Fisiologia dell’Eritropoiesi

Gian Cesare GuidiDipartimento di Scienze Morfologico-

BiomedicheUniversità di Verona

GCG

Ematopoiesi primitiva e definitiva

Nature Immunology 2002;3:323

Ematopoiesi primitiva: sxproduzione di G.R. nucleati che esprimono i geni globiniciembrionari (embrione di 15-18 gg)

Ematopoiesi definitiva: dxproduzione di G.R. anucleati che esprimono il gene globinico

AGM: aorta-gonad-mesonephrosBM: bone marrowFL: fetal liver; eryp: primitive erythroid

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Cellule staminali ematopoietiche (stem cells)Caratteristiche:• Generano altre stem cells

– (auto-rinnovamento “infinito”)• Si differenziano in varie cellule progenitrici

– (linee di produzione specifiche)

EMATOPOIESI

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Stem cells nelmidollo osseo:Escluse (B cell) e (T cell), tutte le cellule al di sopra della linearossa sono stem cells.Stem cells possonorinnovarsi (in alto) o differenziarsi (in basso)

Stem cell

eritroide

proeritroblasto

eritrocita

progenitore mieloide pluripotente

mieloide

promieloblasto

granulociti

monocitamacrofago

piastrinico

megacarioblasto

piastrine

progenitore linfoide(B-cell)

(T-cell)

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Differenziazione delle stem cells(compartimenti)

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Regolazione molecolare dell’ematopoiesi

• Processo ad elevata complessità• Regolato da fattori di trascrizione

finemente accordati,– specifici per stadio di maturazione– dipendenti dal contesto

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• Un singolo fattore di trascrizione ha differenti effetti quando espresso a differenti stadi

• L’espressione di uno specifico fattore a differenti stadi può:– modulare l’ingresso nella linea cellulare

definitiva– facilitare l’interazione con differenti

proteine partner

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• Intra-cellulare (nucleare):– Fattori ubiquitari e fattori di trascrizione

ristretti a linea cellulare– regolano un programma altamente organizzato di

espressione genica

• Extra-cellulare:– Citochine, fattori di crescita, molecole di

adesione– supportano la proliferazione delle cellule progenitrici e

ne determinano la direzione di differenziazione

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Regolazione molecolare dell’emato/eritropoiesi embrionaria

Eur J Biochem 2002;269;3607

GCG

Fattori ubiquitari

• Stem cell leukemia (SCL) gene, conferisce vantaggio proliferativo alla linea eritroide sulla mieloide

• LMO2, agisce da ponte fra i fattori di trascrizione come GATA-1

• Proto-oncogene c-Myb espresso nelle linee ematopoietiche indifferenziate, diminuisce con la differenziazione; richiesto per l’espansione cellulare definitiva

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Fattori di trascrizionefamiglia dei fattori GATA

• Noti 6 componenti della famiglia, ma solo GATA-1,-2,-3 sono “ematopoietici”

• Agiscono legando un motivo di 6 nucleotidiT/AGATAG/A ad azione cis nella regolazione della trascrizione genica eritroide

• Identificato per primo il cDNA di GATA-1, poi distintamente gli altri due

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Caratteristiche dei fattori GATA

• Proteine “Zn finger”, la più usata classe di fattori di trascrizione

• Il motivo classico è Cys2His2 in cui Zn stabilizza 2 strutture molto conservate che funzionano da sequenze di riconoscimento

• Il C-finger si lega al DNA, il N-fingerinteragisce con altri fattori di trascrizione (es.: FOG)

• I siti di binding possono attivare o reprimere l’espressione genica

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Zinc finger proteinsGCG

Fattore GATA-2

• Fattore espresso nei precursori eritroidiove promuove proliferazione ma blocca differenziazione

• Precede l’espressione di GATA-1 e deve diminuire con l’aumento di GATA-1 per favorire la differenziazione

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Fattore GATA-1

• Gene locato sul cromosoma X (Xp11,23)• Fattore essenziale per tutti gli aspetti

della trascrizione genica e lo sviluppo delle linee– eritroide– megacariociticica– promieolocitica eosinofila

• Espresso anche nella– eosinofilia periferica della s. ipereosinofila

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GCG



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Finger N-terminale di GATA-1• GATA-1 interagisce con

fattori di trascrizione della famiglia FOG usando questo zinc fingerN-terminale.

• Tale interazione è cruciale per la capacità di GATA-1 di regolare la corretta espressione genica nelle cellule ematopoietiche

ZnCisteina

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U-shaped finger 1 di FOG-1

• U-shaped è un membro della famiglia FOG (Friend Of GATA)

• Tramite il Finger 1 o 6 interagisce con GATA-1 per controllare l’espressione genica

Zn1His 3Cys-hairpin

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Complesso di trascrizione-attivazione eritroide

SCL ed E47 legano un E box (CAGGTA), circa 10 bpa monte rispetto ad un motivo GATA; LMO2 e Lbd1 fanno da ponte fra SCL1 e GATA-1. Ma di solito GATA-1 lega DNA insieme con FOG


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Interplay dei fattoriGATA-2 vs. GATA -1

• GATA-2, espresso nelle stem cells controlla le fasi precoci dell’ematopoiesi

• GATA-2 attiva la trascrizione di GATA-1, prima dell’autoregolazione di GATA-1

• l’espressione prolungata di GATA-2 nelle stem cellscompromette la differenziazione e va regolata in modo stretto

• GATA-1 regola la differenziazione terminale e la funzione delle linee eritroide e megacariocitaria

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Interplay dei fattori GATA-2 vs. GATA -1

• GATA-2 attiva l’espressione di GATA-1, mentre GATA-1 reprime l’espressione di GATA-2.

• Infine GATA-1 autoregola la propria espressione genica

Acta Hematol 2002;108:237

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Altri fattori di trascrizione• EKLF - Erythroid Kruppel-

like factor• BKLF - Basic KLF

• Neptune

• FKLF - Fetal KLF

• Fli-1 oncogene (famiglia ETS)

Essenziale per esprimere -globina

Regola espressione di proteina SHP-1, ridotta nel 60% delle policitemie vere

Essenziale per esprimere -globina

Nell’espressione di e -globina

Inibisce differenziazione eritroide - espressione repressa da EPO

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Differenziazione dei precursori eritroidi


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Eritropoietina (hEpo)• L’ormone hEpo è una

glicoproteina acida di 34 kD.

• Regolatore primario della produzione di eritrociti

• Funzioni:• promuove la

differenziazione eritroide

• avvia la sintesi di emoglobina

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Complesso EPO-recettore

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Attivazione/inattivazione di EPOr

PNAS 2001;98:4379

EPO legandosi cambia la conformazione del dimero EPOr cui segue transfosforilazione ed attivazione di JAK2: questa a sua volta fosforila residuityr su EPOr con creazione di siti d’attracco (P) per i domini SH2 di alcunitrasduttori come Stat5 e altre proteine di segnalazione che si attivano, sidissociano, poi dimerizzano e vanno al nucleo ove attivano geni fra cui quello cheesprime proteina bcl-x antiapoptotica. La trasduzione sul recettore è inattivatada una fosfatasi, attivata dalla tirosin-fosfatasi SHP1che rimuove i P.

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Attivazione/inattivazione di EPOrmeccanismo completo

GCG

Loop dell’eritropoietina

• Il sensore renale dell’ipossia avvia la produzione di EPO

• EPO segnala ai progenitori eritroidi midollaridi iniziare a produrre eritrociti

• 4 gg di proliferazione e differenziazione nelmidollo

• 3 giorni di maturazione. Perciò passa circa unasettimana fra la segnalazione dell’eventoipossico ed il rilascio di eritrociti in circolo

GCG



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Loop dell’eritropoietina

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Tipi di ipossia

• I. ipossiemica: da bassa pO2 - altitudine• I. anemica: da riduzione di Hb per

• deficit Fe, Cu• deficit B12• altro (Hbpatie, emorragie, ecc.)

• I. stagnante: da ridotto flusso ematico tessutale

• I. citotossica: impedimento all’uso di O2da parte delle cellule - avvelenamenti

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Effetti dell’ipossia

J Appl Phys 2004;96:1187

GCG

HIF-1 Hypoxia inducible factor 1

• Proteina eterodimerica specificamente coinvolta nel mantenere l’omeostasi di O2

• Regola l’attivazione di geni inducibilidall’ipossia fra i quali il gene per EPO

• Nell’ipossia il dimero si lega alla sequenza (A)CGTG presente nell’elemento responsivoall’ipossia di geni target controllati da pO2 come ad esempio l’angiogenetico VEGF (vascularendothelial growth factor), EPO, ed alcuni della via glicolitica (MPGM, DPGM)

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HIF-1 Hypoxia inducible factor 1• 2 subunità, sempre presente e

(labile, 14q21-24) presente nell’ipossia

• nell’ipossia coopera con per attivare la trascrizione di geni target fra cui EPO

• sub viene sempre prodotta ma in condizioni di normale pO2subisce rapida proteolisi e non interagisce con

• nella figura si osserva l’interazione di HIF-1 con il DNA su specifiche sequenze dette HRE(Hypoxia Response Elements) locate sui promotori di geni sensibili all’ipossia

GCG

Regolazione genica da pO2

• HIF-1 è strettamente regolata da pO2 e si accumula rapidamente nelle cellule in ipossia (alto)

• In condizioni non ipossiche HIF-1 è prodotta ma subito degradata da proteasi (ubiquitina e legame con VHL – basso)

J Appl Phys 2004;96:1195

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Eritropoiesi e bilancio del Ferro

• Regolazione basata sul controllo meticoloso dell’assorbimento intestinale

• Non esiste regolazione escretoria– Perdite:

• sangue mestruale• desquamazione epiteliale di cute e mucose

– tratto G.I.– tratto biliare– vie urinarie

GCG


• Deficit di Fe tessutale ed accelerata eritropoiesi aumentano di alcune volte l’assorbimento

• Lo stimolo eritropoietico ha più potenza nell’aumentare l’assorbimento di Fe rispetto al deficit tessutale

GCG



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• In gravidanza una parte del Fe totale è destinata al feto in sviluppo

• Nel deficit di Fe i precursori eritroidi hanno priorità a spese degli altri tessuti

• Nel sovraccarico l’eritropoiesi procede normalmente, ma il Fe in eccesso si deposita nei tessuti (fegato, cuore, pancreas, ecc.) in quanto la capacità di aumentare l’eliminazione di Fe è molto limitata

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Distribuzione corporea del Ferro• Fe totale 3-5 g• 65-75% in Hb• 0,5-2,0 mg assorbiti/gg• perdite/gg analoghe• eritropoiesi rifornita da

SRE per riciclo• 0,1% in transito• riserve epatocitarie1 g• distribuzione alterata in

gravidanza, deficit e sovraccarico

Nature Rew Genetics 2000;1:208

GCG



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Assorbimento di Fe - Molecole

• DMT1• Dcytb• Ferroportina (IREG1)• Efestina• HFE+2-microglobulina

• TfR1• TfR2

Trasportatore di mucosa Fe-reduttasi (Fe3+Fe2+) Trasportatore basolaterale Fe-ossidasi (Fe2+Fe3+)modula uptake/rilascio di

Fe plasmatico nelle cripte duodenali

Recettore 1 per Tf Recettore 2 per Tf (+)

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Assorbimento del Fe-Epcidina• Piccolo peptide circolante di

sintesi epatica recentemente scoperto che regola l’assorbimento intestinale di Fe (store regulator)

• Quando sideremia aumenta troppo (1), epcidina è rilasciata (2) e riduce assorbimento tramite ritenzione di Fe nei macrofagi e differenziazione di enterociti a ridotta espressione di proteine di trasporto (3)

• Quando sideremia diminuisce troppo l’espressione di epcidina è ridotta per favorire l’assorbimento di Fe

GCG



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Epcidina, EPO ed omeostasi del Fe

JCI 2002;110:1037

GCG

Trasporto del Fe-Transferrina

• TF lega Fe+++, lo rende solubile, ne attenua la reattività, lo rilascia alle cellule

• TF rilascia Fe alle cellule dopo legame con TFR• In circolo vi sono 4 forme di TF:

– ApoTF– Tf monoferrica (unico Fe+++ legato a C-t) – Tf monoferrica (unico Fe+++ legato a N-t)– OloTf (2 Fe+++)

GCG



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Trasporto del Fe-Transferrina

•HOLO-Tf si lega a TFR•Endocitosi del complesso•Azione di pompa a protoni su endosoma e rilascio di Fe

•DMT1 cattura e trasporta Fe++

fuori dall’endosoma•Fe viene utilizzato o depositato (cellule non eritropoietiche)

•APO-TF e TFR vanno sulla membrana e si dissociano a pH neutro - il ciclo riprende


GCG

Destino del Fe in differenti cellule


GCG



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Geni del metabolismo del Feesiti di possibili mutazioni

• Ceruloplasmina

• DMT1

• Epcidina• Ferroportina• Frataxina (triplicazione genica)• HFE• Efestina• Transferrina

• sTFR2

Fe in SNC, fegato; diabete; anemia

grave anemia, ridotto assorbimento

emocromatosi grave anemia, sovraccarico di Fe atassia, mocardiopatia emocromatosi ridotto assorbimento grave anemia; sovraccarico di Fe

in parenchimi aumento assorbimento;

sovraccarico di Fe

GCG

Regolazione del Ferro

Le cellule regolano il loro contenuto in Fe controllando l’espressionedei sistemi di captazione e delle proteine di deposito di FeLIP = Labile Iron Pool

Tf

FER

DCT1(NRAMP2)

L’espressione dei sistemi di captazione è sovraregolata nel deficit e sottoregolatanel carico di Fe

L’espressione delle molecole di ferritina è sovraregolata nel carico e sottoregolatanel deficit di Fe

LIP TfRIRP

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Regolazione del FerroLe proteine che consentono l'auto-regolazione del Fe intracellularesono le IRP-1 e IRP-2 (Iron Regulatory Proteins). Sono proteinecitoplasmatiche che si legano a RNA e funzionano in modo trans sulmRNA che contiene gli IRE (Elementi Responsivi al Fe) strutture ad azione cis. Gli IRE, siti di legame per IRP sono strutture a forma diforcina a 28 nucleotidi. Sono presenti nelle regioni non traslate checodificano per TfR, Ferritina, ALA sintasi ed altre stutture correlate.

coding5’ An

IRP IRP

3’An

IRPX

codingUTRUTR

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IRP-1• Variazioni nel Fe intracellulare alterano la

conformazione di IRP1 da forma enzimatica attiva (aconitasi) a bassa affinità per RNA, a forma senza attività aconitasi ma ad alta affinità per RNA. Tali conversioni consentono a IRP1 di monitorare le variazioni nella disponibilità di Fe intracellulare.

• Se aumenta Fe, aumenta la forma IRP1 a bassa affinità per RNA e diminuisce il legame di IRP1 a IRE.

• Se Fe diminuisce, IRP1 aumenta la sua affinità per RNA e si lega maggiormente a IRE.

GCG



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Differenze fra IRP-1 & IRP-2•IRP-2 non ha attività aconitasi•IRP-2 si lega a IRE come IRP-1 e funziona come repressoretraslazionale

•Una diminuzione di Fe intracellulare aumenta il legame a mRNA dientrambi gli IRP (1 & 2) ma in modi differenti:

– Il controllo di IRP1 è soprattutto post-traslazionale con switch da forma non legante (aconitasi) a forma legante (no-aconitasi) che avviene con piccole variazioni della quantità di proteina IRP-1

– Invece l'aumento di legame di IRP-2 è il risultato di sintesi de-novo

•Le conseguenze delle differenti distribuzioni tessutali di IRP (1 & 2) non sono ancora note, ma le due proteine sembrano avere identicocomportamento quali sensori di Fe intracellulare

GCG

Regolazione del Ferro

Le IRP (1 e 2) sentono i livelli di Fe(II) nel LIP e controllano per traslazione l’espressione dei geni che trasportano gli IRE, cioè: TfR, DCT1, Ferritina (FT), FER (Fe Reduttasi) e ALA sintasi

Tf

FER

DCT1(NRAMP2)

L’espressione dei sistemi di captazione è sovraregolata nel deficit e sottoregolatanel carico di Fe

L’espressione delle molecole di ferritina è sovraregolata nel carico e sottoregolatanel deficit di Fe

LIP TfRIRP

FT

GCG



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Controllo traslazionale coordinato dicaptazione di Fe e sintesi di Ferritina

•A basso Fe intracellulare la traslazione di mRNA per Ferritina è bloccata da IRP su IRE, quella per TFr, DCT1, FEP è favorita dal binding di IRP ad alta affinità. Ciò rende stabile mRNA traslato•A Fe alto la traslazione di mRNA per Ferritina è possibile, quella per TFr, DCT1, FEP è rallentata dal mancato binding di IRP a bassa affinità con IRE. Ciò rende instabile mRNA traslato (RNAasi)

coding5’ An

IRP IRPTf R, DCT1, FePortina

5’ An

Ferritina

IRP

5’RNAasi

5’ An

Alto Fe

IRP

Basso Fe

IRP

s60s40s43

IRP

IRPIRP

coding coding

coding

FT

TfR, DCT1FeP FRasi

X

X

LIP

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Binding di IRP-1 e -2 proteine regolatrici di Fe

GCG



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Recettore per la transferrina - TFr

• TFr è la sola via fisiologica di ingresso cellulare di Fe

• TFr sono presenti su tutte le cellule nucleatein funzione delle esigenze

• La scorta di Fe cellulare è determinata dal numero dei TFr; più alto in midollo, fegato, placenta

TFr è un omodimero transmembranaconnesso da legami S-S.

Un gruppo acile attaccato al terminecitoplasmatico della molecola ancora iltutto alla membrana plasmatica

YTRF

Segnale di internalizzazione

Recettore di TransferrinaTFr

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Recettore solubile per la transferrina - sTFr

• Monomero troncato del recettore cellulare• Circola complessato con TF • Il maggior rilascio di sTFr plasmatico avviene

ad opera degli eritroblasti, in secondo luogo dai reticolociti

• I livelli di sTFr sono determinati dall'attività eritropoietica midollare che può causare variazioni da meno otto volte a più venti volte i valori normali

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Deposito di Ferro - Ferritina

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HRI - Heme Regulated Inhibitor

• Inibisce, tramite fosforilazione di eIF2(fattore di iniziazione), la sintesi di Hb nei reticolociti

• L’inibizione feed-back si osserva quando la concentrazione intracellulare di emedeclina

• NO influenza l’azione di HRI

• Il meccanismo previene la sintesi di catene globiniche in eccesso rispetto all’eme (meglio anemia microcitica che emolitica)

• Controlla la traslazione di Hb dopo la perdita del nucleo (25% del totale)

• Agisce come sensore ed effettore a protezione degli stress

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HRI - Heme Regulated Inhibitor

• A. Regolazione della sintesi di e globine ad opera di HRI ed eme

• B. Risposta alterata dell’eritropoiesi nel deficit di Fe in HRI-/-

Stress

EMBO J 2001;20:6909

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Gene della -globina -attivazione della trascrizione

• Cluster di alcuni geni -like su cromosoma 11• Livello di espressione dipendente da regione di

controllo del locus (LCR)• LCR consiste di 5 siti ipersensibili alla DNAasi (HSs)

estesi su 20-30 kb e 10-60 kb a monte dei geni • HSs appaiono dapprima nelle CFU-E in conseguenza

del binding di fattori specifici ed ubiquitari di trascrizione (motivi CACC, E box, GATA-1, MARE)

GCG



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Gene della -globina -attivazione della trascrizione

Nature Genetics 2003;35:190

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Clusters dei geni per le globine

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Metabolismo dell’eme• -aminolevulinato sintetasi 2

(ALAS2) è rate limiting sulla via metabolica.

• ALAS2 è l’isoenzima eritroide

• La mutazione del gene per ALAS2 (Xp11.21) causa anemia sideroblastica X-linked

• La mutazione è spesso associata ad allele mutante per il gene HFE

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Catabolismo dell’eme

GCG



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Conclusioni• La tradizionale visione morfologica è stata

integrata/sostituita dai risultati delle indagini genetiche e di biologia molecolare

• I vari meccanismi molecolari, attivi a partire da BFU-E, operano secondo un programma finemente sintonizzato cui contribuiscono espressione di geni ed azione di regolatori

• L’intervento coordinato di geni e regolatori è sensibile a sottili variazioni che avvengono nell’ambiente esterno e si adegua ad esse tramite meccanismi epigenetici

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