CAP. 4 

 

GESTIONE ATTREZZATURE E STRUMENTAZIONE, TARATURA 

E CALIBRAZIONE STRUMENTI 

 

 

Catello Scarica, Roberta Maggiulli, Stefania Romano, Antonio Capalbo,  

Filippo Maria Ubaldi e Laura Rienzi 

 

Centro GENERA, Clinica Valle Giulia, Roma 

   

 

Le strutture sanitarie che erogano servizi di procreazione medicalmente assistita (PMA) devono far 

fronte a numerose esigenze di diversa complessità tecnica, scientifica ed organizzativa. 

Una  moltitudine  di  attività  che  comporta  requisiti  strutturali,  tecnologici,  organizzativi  e  di 

personale, che si distinguono per la complessità crescente delle strutture che le erogano. 

La volontà di esprimere dei requisiti minimi per tali strutture è dettata dalla necessità di introdurre 

un sistema di qualità comune per tutti gli embriologi ed  il personale coinvolti nell’esercizio della 

PMA. 

 

NORMATIVE, REQUISITI E LINEE GUIDA 

La European Society of Human Reproduction (ESHRE) nell’anno 2000 ha introdotto le prime linee 

guida  che  indicano  i  requisiti  minimi  per  i  laboratori  PMA,  sottolineando  la  responsabilità 

dell’embriologo nell’applicazione corretta e giustificata delle tecniche di fecondazione assistita  in 

laboratorio (Gianaroli et al., 2000). Risulta, dunque, necessaria  l’introduzione di criteri di qualità, 

che possano assicurare la gestione del laboratorio, in modo da poter ottenere prestazioni costanti 

e di elevata qualità. 

L’obbligatorietà di un sistema integrale della gestione della qualità è stata introdotta attraverso la 

Direttiva del Parlamento Europeo del 2004/23/EC “On setting standards of quality and safety for 

donation,  procurement,  testing,  processing,  preservation,  storage,  and  distribution  of  human 

tissues and  cells”(European Union, 2004).  Il  testo di  tale Direttiva  fa  riferimento a  tutti  i  tipi di 

tessuti e cellule umani, ivi compresi i tessuti riproduttivi e i gameti. 

Uno  degli  aspetti  di  particolare  interesse  che  si  evince  dalle  linee  guida  riguarda  i  requisiti 

strumentali e la loro gestione in un laboratorio PMA. 

 

Nella fattispecie, la pubblicazione di nuove linee guida da parte dell’ESHRE nel 2008 (Magli et al., 

2008), stabilisce che:  

 

L’attrezzatura del laboratorio deve essere adeguata al tipo di lavoro eseguita in laboratorio, e deve 

essere facile da lavare e sterilizzare 

Tutti  i parametri  critici degli  strumenti devono essere monitorati  in maniera costante e devono 

essere associati ad appositi allarmi 

Tutti gli strumenti devono essere collegati ad un gruppo elettrogeno ausiliario che possa entrare in 

funzione automaticamente in caso di mancanza di alimentazione 

È raccomandato l’utilizzo di almeno due incubatori, e le bombole di gas che li alimentano devono 

essere alloggiate all’esterno del  laboratorio, e devono essere dotate di un sistema automatico di 

backup 

Gli incubatori devono essere puliti e sanitizzati con regolare frequenza 

Gli  interventi  di  manutenzione  ordinaria  e  straordinaria  su  tutti  gli  strumenti  devono  essere 

documentati, registrati e conservati in laboratorio 

Il  laboratorio dovrebbe essere attrezzato  con dispositivi per  il mantenimento della  temperatura 

ideale  dei mezzi  di  coltura,  dei  gameti,  degli  zigoti  e  degli  embrioni  durante  qualsiasi  fase  del 

trattamento all’esterno degli incubatori (i.e. piani riscaldati, termo block) 

Tutti  i dispositivi deputati al mantenimento della temperatura e della percentuale di CO2 devono 

essere sottoposti a verifiche regolari, effettuate con termometri e misuratori di CO2 e/o pH‐metri 

opportunamente  tarati.  I  risultati  di  tali  verifiche,  come  i  valori  mostrati  dal  display  di  ogni 

dispositivo in uso, devono essere registrati e conservati in laboratorio 

I manuali di istruzioni di ogni strumento devono essere disponibili in laboratorio 

Per ogni  strumento dovrebbero essere disponibili  istruzioni  scritte accessibili per  tutti  i membri 

dello staff, al fine di poter indicare le azioni da intraprendere in caso di guasto di uno strumento. 

 

Le  direttive  Europee  come  recentemente  recepite  in  Italia  (Decreto  legislativo  16/2010) 

stabiliscono che: 

1. La  progettazione  e  la manutenzione  delle  attrezzature  e  i materiali  corrispondono  alle 

destinazioni d'uso previste e sono predisposte  in modo da minimizzare ogni  rischio per  i 

riceventi e il personale.  

2. Tutte  le  attrezzature  e  i  dispositivi  tecnici  critici  sono  identificati  e  convalidati, 

periodicamente ispezionati e preventivamente sottoposti a manutenzione conformemente 

alle istruzioni del fabbricante. Le attrezzature o i materiali che incidono su parametri critici 

di  lavorazione  o  stoccaggio  (ad  esempio  temperatura,  pressione,  numero  di  particelle, 

livello  di  contaminazione  microbica)  sono  identificati  ed  eventualmente  sottoposti  a 

osservazioni,  vigilanza,  allarmi  e  interventi  correttivi  adeguati  per  individuarne  le 

disfunzioni e i difetti e per garantire che i parametri critici rimangano costantemente al di 

sotto  dei  limiti  accettabili.  Tutte  le  attrezzature  che  dispongono  di  una  funzione  di 

misurazione critica sono tarate su un parametro di riferimento reperibile, qualora esista.  

3. Le  attrezzature nuove e quelle  riparate  sono  controllate  al momento dell'installazione e 

collaudate prima dell'uso. I risultati dei controlli sono documentati.  

4. Periodicamente e' necessario procedere alla manutenzione, alla pulizia, alla disinfezione e 

all'igienizzazione  di  tutte  le  attrezzature  critiche  e  alla  registrazione  delle  operazioni 

effettuate.  

5. Per  ogni  attrezzatura  critica  e'  necessario  disporre  di  norme  di  funzionamento,  con 

indicazioni dettagliate di come intervenire in caso di disfunzioni o guasti.  

 

I requisiti minimi strumentali per un laboratorio di PMA in Italia sono stati indicati dalle Regioni in 

applicazione dell’accordo Stato Regioni del 11 Novembre 2004, attraverso il Documento “Requisiti 

strutturali, strumentali e di personale per  l’autorizzazione delle strutture che erogano prestazione 

di  procreazione  medicalmente  assistita”,  coadiuvato  dal  Documento  dell’Osservatorio  del 

Ministero della Salute “Requisiti per  la conformità al D.Lgs. 191/2007 nel prelievo,  il controllo,  la 

lavorazione,  la  conservazione,  lo  stoccaggio  e  la distribuzione di  gameti,  zigoti  ed  embrioni per 

tecniche di procreazione medicalmente assistita”. 

 

La  Relazione  del  Ministero  della  Salute  al  Parlamento  sullo  stato  di  attuazione  della  Legge 

contenente norme in materia di Procreazione Medicalmente Assistita del 30 giugno 2005 chiarisce 

che:  “In  data  11  Novembre  2004,  la  Conferenza  dei  Presidenti  delle  Regioni  e  delle  Province 

Autonome di Trento e Bolzano ha approvato  il Documento: Requisiti strutturali, strumentali e di 

personale  per  l’autorizzazione  delle  strutture  che  erogano  prestazione  di  procreazione 

medicalmente  assistita,  quale  indicazione  per  una  applicazione  omogenea  sul  territorio,  ferma 

restando  la  possibilità  per  le  Regioni  di  individuare  ulteriori  requisiti  anche  in  riferimento  alla 

specifica normativa regionale in materia”. 

 

I requisiti minimi tecnologici per un laboratorio PMA di I livello in Italia sono:  

Cappa a flusso laminare  

Bagnomaria termostatato 

Microscopio ottico a contrasto di fase 

Centrifuga 

Pipettatrice 

Eventuale contenitore/i criogenico/i 

 

I requisiti minimi tecnologici per un laboratorio PMA di II e III livello oltre a quelli necessari per il I 

livello sono: 

n.2 Incubatori a CO2 

Invertoscopio 

Microscopio ottico 

Micromanipolatore (applicato adinvertoscopio) 

Stereomicroscopio 

Centrifuga  

Sistema automatizzato programmabile per la crioconservazione di ovociti ed embrioni  

Adeguato numero di contenitori criogenici 

 

Tali indicazioni sono poi state fatte proprie da ogni Regione, che ha potuto integrarle con altre, e 

recentemente  sono  state  ulteriormente  implementate  dai  requisiti  previsti  nell’ASR  del 

15/3/2012. 

 

 

ATTREZZATURA E STRUMENTAZIONE 

Di seguito una descrizione dei principali strumenti specifici richiesti per la PMA: 

 

Cappa a flusso laminare verticale di grado A (classe II). 

 

Cappe a flusso laminare 

Tutti  il  laboratori  di  PMA,    autorizzati  all’esecuzione  di  tecniche  di  procreazione medicalmente 

assistita  di  qualsiasi  livello  (I,  II  o  III),  necessitano  la  presenza  e  l’utilizzo  di  una  cappa  a  flusso 

laminare, per poter assicurare la sterilità dell’ambiente di lavoro. Per le tecniche di II e III livello il 

piano  di  lavoro  della  cappa  deve  essere  riscaldato  (integrato  con  il  piano  della  cappa  oppure 

sovrastante)  e  deve  essere  prevista  la  possibilità  di  integrare  uno  stereomicroscopio  al  suo 

interno. 

Esistono diverse cappe a flusso laminare: 

 

Flusso Laminare verticale: 

classe  I:  La  cappa  di  prima  classe  è  una  cappa  la  cui  funzione  principale  è    di  proteggere 

l'operatore, ma non il campione su cui si opera. L'aria non è filtrata in entrata, ma esclusivamente 

 

in  uscita. 

dell’operat

classe  II: 

l'operatore

caratterizz

espulsa: il 

di lavoro e

classe  III: L

l'operatore

cappa  è  c

guanti fissi

uscita, tram

è  sterile  g

negativa. T

(come ebo

Si  tratta  d

tore tramite

La  cappa  d

e  che  il  c

ato da un 

flusso lamin

vitando di i

La cappa di

e dal campi

completame

i che lo isol

mite 4 filtri:

grazie  al  pa

Tali cappe s

ola e marbu

di  una  cap

e un flusso 

di  seconda 

ampione,  g

flusso d’ari

nare, prove

nvestire l’o

i classe terz

ione che ma

ente  chiusa

lano compl

: l'aria in en

assaggio  att

sono adotta

rg), non qui

pa  ventilat

d’aria entra

classe  è  u

garantendo

a  in  ingress

eniente dal 

operatore, l’

za è una ca

anipola e n

a  ed  ermet

etamente. 

ntrata è ste

traverso  2 

ate  in  labor

indi necessa

ta  aperta  f

ante che no

una  cappa 

o  condizion

so e dalla  f

sovrastante

’aria espuls

appa  la cui 

on esporlo 

tica:  l'opera

Le cappe d

rilizzata tra

filtri,  assicu

ratori  in cui

arie per la P

frontalment

on viene rim

la  cui  funz

ni  di  assol

filtrazione  s

e filtro, scen

a deve esse

funzione è 

a rischi di c

atore mani

i classe III f

mite un filt

urando  all'a

 si manipol

PMA. 

te  progetta

mandata in c

zione  è  que

uta  sterilit

sia dell’aria

nde perpen

ere filtrata d

quella di  is

contagio co

pola  gli  ag

filtrano l'ari

ro posto su

ambiente  i

ano agenti 

ata  per  la 

circolo. 

ella  di  prot

tà.  Tale  st

a aspirata s

ndicolarmen

da un secon

solare comp

on virus pat

genti  biolog

ia sia in ent

ul retro. L'ar

nterno  una

biologici d

protezione

teggere  sia

rumento  è

ia di quella

nte al piano

ndo filtro. 

pletamente

togeni. Tale

gici  tramite

trata che in

ria in uscita

a  pressione

i gruppo IV

e 

a 

è 

a 

o 

e 

e 

e 

n 

a 

e 

V 

 

Schema  di

degli Studi

Flusso Lam

 

Cappa a flu

 

 

Schema di 

 

Questo  tip

ambiente 

all'operato

contamina

per  l'opera

i  funzionam

i di Torino) 

minare orizzo

usso lamina

i funzionam

po  di  cappe

sterile  all'

ore,  in  qu

ata)  in uscit

atore e  l'am

mento  delle

ontale: 

 

are orizzona

 

mento delle 

e  servono  s

interno  de

anto  viene

a. Pertanto

mbiente. So

e  diverse  cl

ale 

                    

cappe a flu

solo  ad  evi

lla  cappa 

e  investito

o non si tra

no meno co

lassi  di  cap

               

usso lamina

tare  contam

stessa,  me

o  direttame

tta di capp

ostose risp

ppe a  fluss

are orizzonta

minazioni  d

entre  non 

ente  dal 

e di sicurez

etto alle ca

o  laminare

ale (Sarin.it

del  campion

garantiscon

flusso  di 

zza biologic

appe a fluss

e  verticale 

t)  

ne  e  a man

no  alcuna 

aria  (pote

ca,  in quant

so verticale 

(Università

ntenere  un

protezione

enzialmente

to rischiose

e vengono

à 

n 

e 

e 

e 

o 

utilizzate  in  attività di  laboratorio dove  il  rischio per  l'operatore è  limitato o nullo,  ad esempio 

nella preparazione dei mezzi di coltura (non ancora messi in contatto con i campioni biologici). 

 

Le cappe a flusso  laminare sono provviste di filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air): tali filtri 

sono realizzati in micro fibra di vetro che garantiscono un’elevata purezza dell’aria all’interno della 

cappa (per ulteriori approfondimenti consultare il capitolo 1 di questo manuale). 

 

Come descritto nel Decreto  legislativo 16/2010  la  lavorazione dei campioni deve essere  sempre 

effettuata  sotto  cappa  a  flusso  laminare  che  garantisca  una  qualità  dell'aria  di  grado  A  (come 

descritto nella guida europea alle buone pratiche di fabbricazione: Good Manufacturing Practice: 

GMP – solitamente tale requisito è garantito da una cappa di classe II), con un ambiente di fondo 

adeguato  alla  lavorazione  delle  cellule, ma  almeno  equivalente  a  GMP  di  grado  D.  Condizioni 

ambientali  meno  rigorose  di  quelle  sopraindicate  possono  essere  accettabili  qualora  sia 

dimostrato che  il contatto con un ambiente di grado A ha effetti nocivi sulle cellule  (flussi d’aria 

abbondanti possono infatti influire sulla temperatura del campione) oppure non sia tecnicamente 

possibile eseguire  il procedimento richiesto  in un ambiente di grado A  (ad esempio perchè nella 

zona di lavorazione occorrono attrezzature specifiche non del tutto compatibili con il grado A, per 

esempio il micromanipolatore per la ICSI). 

 

 

Microscopi 

I centri PMA di I livello hanno l’obbligo di utilizzare un microscopio ottico a contrasto di fase, per 

la corretta visualizzazione dei gameti maschili. 

I centri di  II e  III  livello, oltre che del microscopio ottico a contrasto di  fase, necessitano di uno 

stereomicroscopio per  lo  screening degli ovociti e altre  tecniche di  fecondazione  (FIVET), di un 

invertoscopio  con  un micromanipolatore  applicato  per  effettuare  la  tecnica  di  inseminazione 

intra‐citoplasmatica (ICSI) e per la valutazione degli ovociti ed embrioni. 

 

Per  ottenere  risultati  ottimali  nell’osservazione  ed  eventualmente  nella  microfotografia,  è 

fondamentale  la  perfetta  pulizia  del  sistema  ottico  dei  microscopi  utilizzati.  È  consigliabile 

rimuovere la polvere dalle lenti degli oculari e del condensatore utilizzando un apposito soffietto. 

Tutte  le  lenti  che  compongono  il  sistema  ottico  del microscopio  devono  essere  allineate  per 

consentire una corretta visione del campione. 

 

Il microscopio  ottico  per  l’analisi  del  liquido  seminale  deve  essere  equipaggiato  con  obiettivi 

progressivi  che  raggiungano  almeno un  ingrandimento di 400X. Allo  scopo di poter  visualizzare 

correttamente le strutture cellulari in un preparato fresco e non colorato, ci si avvale della tecnica 

della microscopia a contrasto di  fase. Questo metodo usufruisce di anelli di  fase,  indicati con  la 

sigla  “Ph”,  uno  disposto  a  livello  del  condensatore,  l’altro  all’interno  dell’obiettivo.  Ad  ogni 

obiettivo  corrisponde  un  anello  diverso  all’interno  del  condensatore.  Questi  anelli  di  fase 

convogliano  i  fasci  luminosi  che  colpiscono  il  campione,  aumentando  l’ampiezza  dell’onda 

luminosa di 1/4 di  λ.  In questo modo  si aumenta  il  contrasto dell’immagine  riprodotta a  livello 

degli  oculari,  mostrando  strutture  cellulari  normalmente  visibili  solo  con  l’utilizzo  di  una 

colorazione istologica. Gli anelli di fase devono essere perfettamente centrati tra loro. 

 

L’invertoscopio  si  avvale  di  una  particolare  tecnica  di  contrasto  di  fase  che  è  detta  contrasto 

d’ampiezza o “Hoffman modulation contrast” (HMC). In pratica, il contrasto d’ampiezza si realizza 

ponendo  un  “modulatore”  opaco  sotto  al  condensatore;  tale modulatore  contiene  una  fessura 

trasparente  parzialmente  occupata  da  un  filtro  polarizzante.  Sopra  l’obbiettivo  viene  posto  un 

altro  modulatore  contenente  un  segmento  opaco  del  tutto  periferico  ed  un  altro  segmento 

contiguo semitrasparente. Il tutto su supporto trasparente. Nella pupilla d’uscita dell’obbiettivo si 

sovrappongono  così  la  porzione  trasparente  del  modulatore  inferiore  con  la  porzione 

semitrasparente del modulatore superiore,  la porzione polarizzante del modulatore  inferiore con 

la  porzione  trasparente  di  quello  superiore. Viene  aggiunto  anche  un  polarizzatore  che  occupa 

tutta la pupilla del condensatore e che può ruotare attorno all’asse. Questa rotazione rende più o 

meno  “brillante”  il  filtro.  Di  solito,  il  modulatore  inferiore  può  essere  spostato  in  direzione 

perpendicolare alla fessura e ciò permette di variare l’intensità del fascio illuminante che traversa 

l’obbiettivo.  Il contrasto d’ampiezza presenta dunque varie possibilità di regolazione. L’immagine 

dell’oggetto è formata dall’onda diffratta da un lato solo del fascio illuminante poiché quest’ultimo 

si  trova  ai  margini  della  pupilla  d’obbiettivo.  Inoltre  l’oggetto  non  si  trova  in  mezzo  ai  due 

polarizzatori e  la sua eventuale birifrangenza non disturba. Questo rende possibile  l’osservazione 

di  oggetti  contenuti  in  recipienti  in  materia  plastica  (come  le  petridish  usate  in  PMA), 

generalmente birifrangenti. 

Rispetto ad altre tecniche,  il contrasto d’ampiezza è forse meno sensibile, ma ha il vantaggio che 

gli oggetti fuori fuoco non disturbano troppo. 

 

Per assicurare una buona resa dello strumento è necessaria una adeguata pulizia, allineamento e 

centratura del microscopio.  Il microscopio viene detto centrato quando  i centri ottici di  tutte  le 

singole  lenti  o  subsistemi  giacciono  sulla  stessa  retta,  che  diventa,  a  questa  condizione,  l’asse 

ottica del sistema. Nel concetto di centratura appena esposto non rientra però  la considerazione 

dell’orientamento degli assi ottici delle singole lenti, orientamento che rientra invece nel concetto 

di  allineamento.  Un  sistema  ottico  è  allineato  quando  gli  assi  ottici  di  tutte  le  lenti  che  lo 

compongono sono paralleli ad un’unica direzione, che dovrebbe coincidere con  l’asse comune di 

tutto il sistema. 

 

Il  microscopio  invertito  usato  per  la  PMA  deve  essere  necessariamente  dotato  di  un  piano 

riscaldato  dove  viene  riposto  il  campione  durante  l’osservazione  per  garantirne  la  stabilità  di 

temperatura.  

 

Micromanipolatori 

Il micromanipolatore è un dispositivo che viene utilizzato per  le  tecniche di micromanipolazione 

dei gameti (ICSI) e degli embrioni (Biopsia). Per queste tecniche è necessario raggiungere un tale 

livello  di  precisione  dei movimenti  che  non  può  essere  realizzato  a mano  libera.  Lo  strumento 

viene  usato  per  posizionare  una  micropipetta  in  maniera  estremamente  precisa  nelle  tre 

dimensioni, spesso con una risoluzione inferiore al µm. 

 

In base al meccanismo di funzionamento esistono differenti tipi di micromanipolatori: 

1. Pneumatico 

2. Idraulico 

3. Meccanico 

4. Elettrico 

 

I micromanipolatori utilizzati in PMA sono principalmente: 

Micromanipolatore  idraulico: Con questo strumento  l'operatore è  in grado di muovere avanti e 

indietro  il pistone di un cilindro e questi movimenti vengono  trasmessi dallo spostamento di un 

liquido  (o

dell'ampie

ridotta. Pe

riempito d

essere con

Microman

movimenti

permetton

Microman

 

Incubatori

L’incubato

controllo d

piene d’ac

di CO2.  La 

lio)  tra  cil

zza degli sp

er il corretto

d’olio e  che

ntrollato. 

ipolatore  e

i di una  lev

no di contro

ipolatore. C

 

re è uno str

della tempe

qua sterile.

maggior p

indri  idrau

postamenti.

o funzionam

e non  ci  sia

elettrico:  L

va manovra

ollare degli a

Centro GEN

rumento ch

eratura è af

 Il pH, invec

arte dei me

lici  di  dive

.  I movimen

mento di qu

no bolle d’

L'operatore 

ta dall'oper

attuatori me

NERA ROMA

he simula le

ffidato ad u

ce viene co

ezzi di coltu

erso  diame

nti vengono

esto dispos

’aria. Ad og

opera  tra

ratore  in u

eccanici. 

 

A. 

e condizioni

un termosta

ntrollato in

ura di uso 

etro.  Quest

o pertanto 

sitivo è fond

gni nuova p

mite  un  ap

na serie di 

 fisiologiche

ato, quello 

n maniera in

comune  so

to  si  tradu

trasmessi m

damentale c

procedura  i

pposito  joy

segnali ele

e di temper

dell’umidit

ndiretta attr

ono  formula

uce  in  una

ma riprodot

che tutto il 

il  sistema d

ystick  che  t

ttrici o elet

ratura, umid

tà a vasche

raverso la p

ati con bica

a  riduzione

tti  in forma

sistema sia

deve quindi

trasforma  i

ttronici che

dità e pH. Il

tte o  flasks

percentuale

arbonato di

e 

a 

a 

i 

i 

e 

l 

s 

e 

i 

sodio, che 

Accrescend

idrogeno 

dissociazio

nelle coltu

Per questo

impostare 

di sodio pr

Generalme

un’atmosfe

ovociti ed 

 

Il grafico in

noti che co

stabilizza i

 

dissociando

do  la  perce

viene  ind

one del bica

re cellulari.

o motivo gl

e controlla

resente nei 

ente  i  mez

era modific

embrioni (B

ndica l’abb

on CO2 al 6

intorno ad u

osi in soluzi

entuale  di 

irettamente

arbonato d

 

i  incubator

re la perce

mezzi di co

zzi  di  coltu

cata con 5‐6

Brinster, 196

assamento

6%  il pH de

un valore d

one acquos

CO2  dell’at

e  controlla

i  sodio. Qu

i tradiziona

ntuale di CO

ltura utilizz

ra  conteng

6% di CO2, 

69; Higdon 

 del pH nel 

el mezzo ra

di 7.4 (COOK

sa, rilascia i

tmosfera  de

ata  attrave

uesto  sistem

ali sono pro

O2 desidera

ati, ed a sec

gono  25  m

si ottiene u

et al., 2008

tempo in f

aggiunge un

K Medical).

oni idrogen

ell’incubato

erso  il  bil

ma  tampon

ovvisti di ap

ta, in funzio

conda del p

mM  di  bicar

un pH di 7.

8). 

funzione di d

n equilibrio

no nel mezz

ore,  la  conc

lanciamento

e  viene  co

ppositi siste

one della qu

pH finale ric

rbonato  di 

3+0.1 cons

due diverse

di 7.3, me

zo diminuen

centrazione

o  della  re

munement

emi che con

uantità di b

hiesto. 

sodio  ed 

iderato  fisi

e percentua

entre con C

ndone il pH.

e  degli  ioni

eazione  di

e utilizzato

nsentono di

bicarbonato

utilizzando

ologico per

ali di CO2. Si

CO2 al 5% si

. 

i 

i 

o 

i 

o 

o 

r 

 

i 

i 

A titolo esemplificativo, usando  i mezzi di coltura di  fertilizzazione della COOK, come dimostrato 

dal grafico una percentuale di CO2 del 6% permette  il raggiungimento di un pH fisiologico per gli 

ovociti  (<7.4)  in un  tempo notevolmente  inferiore  (circa 80 min.) rispetto ad una percentuale di 

CO2 del 5% (circa 200 min.). Anche se il principio generale vale per tutti i mezzi di coltura, è chiaro 

che i valori di pH sono invece relativi alla composizione del mezzo stesso. 

Considerando che l’aria atmosferica è composta dal 78% N2, 21% O2, 0.94% argon, 0.035% CO2, e 

0.025%  di  altri  gas,  è  stato  messo  in  evidenza  che  in  un  incubatore  tradizionale  l’elevata 

percentuale di O2 rispetto alle condizioni  fisiologiche, potrebbe esporre gli ovociti e gli embrioni a 

condizioni di coltura sub‐ottimali, soprattutto per la presenza di specie reattive dell’ossigeno (ROS) 

(Biggers, 2001; Summers and Biggers, 2003). 

Questo  ha  portato  all’avvento  di  incubatori,  che  prevedono  il  controllo  dei  tre  gas  principali 

dell’aria atmosferica, quali N2, O2, e CO2 (o che usano miscele certificate di gas).  

 

Tipologie di incubatori. 

Gli incubatori a controllo esclusivo di CO2 consentono di regolare il pH dei mezzi di coltura, e come 

discusso precedentemente, è preferibile impostare la concentrazione di questo gas intorno al 6%. 

L’erogazione  del  gas  agli  incubatori  avviene  attraverso  una  rampa,  la  quale  termina  con  un 

rubinetto dotato di manometro che serve a regolare la pressione del gas distribuito agli incubatori. 

La pressione di erogazione, il cui valore ideale di aggira generalmente intorno alle 5 atm, è molto 

importante per il corretto funzionamento dello strumento, e per la sua messa a punto si deve far 

riferimento  alle  indicazioni  delle  aziende  che  producono  gli  incubatori.  L’umidità  elevata  è 

controllata attraverso vaschette che vengono riempite con acqua sterile. 

Un’altra  tecnologia  di  incubatori  permette  di  poter  controllare  anche  la  concentrazione  di 

ossigeno presente nell’incubatore. Come discusso precedentemente questo può essere utile per 

ridurre  la  presenza  di  specie  reattive  dell’ossigeno.  Gli  incubatori  che  si  avvalgono  di  questa 

tecnologia sono gli incubatori a controllo della CO2 e O2, e sono dotati di due vie di accesso dei gas, 

una alimentata dalla CO2, mentre  l’altra può essere alimentata dall’azoto  (N2) se si desidera una 

concentrazione di O2  inferiore  al 18%, oppure dall’O2  stesso  se  si desidera  che  sia  concentrato 

oltre il 22%. Il motivo dell’utilizzo dell’N2 per modulare la concentrazione di O2 sta nel fatto che in 

atmosfera quest’ultimo ha una densità di circa il 21%. Aumentando la concentrazione di N2 infatti 

si  diluisce  la  concentrazione  dell’O2,  in modo  da  portarlo  a  concentrazioni  più  basse  di  quella 

atmosferica. Solitamente si cerca di utilizzare una concentrazione di O2 di circa 5.5%+0.5. 

 

 

Incubatore  a controllo di CO2 ed O2. Centro GENERA, Roma  

 

 

 

Altri incubatori utilizzano un afflusso di gas pre‐miscelati, in modo da poter essere sicuri all’origine 

che  le  proporzioni  dei  diversi  tipi  di  gas  siano  quelle  desiderate.  Per  questa  ragione  è 

fondamentale  che  la  ditta  fornitrice  dei  gas munisca  ogni  bombola  di  gas  pre‐miscelato  di  un 

certificato che attesti che le proporzioni siano quelle desiderate e ne garantisca l’assoluta purezza. 

Questa tecnologia è utilizzata in particolare dagli incubatori da banco, che utilizzano alloggiamenti 

per  le dish di dimensioni molto  ridotte,  in modo da ottimizzare  i  tempi di  recupero delle giuste 

condizioni di coltura dopo ogni apertura degli sportelli. 

 

 

Incubatori da banco a gas pre‐ miscelati. Centro GENERA Roma 

 

Numerosi studi hanno dimostrato che la coltura di ovociti ed embrioni a basse concentrazioni di O2 

ha  degli  effetti  positivi  a  lungo  termine  rispetto  alla  coltura  con  concentrazioni  di  ossigeno 

atmosferico (Harlow and Quinn, 1979; Batt et al., 1991; Yuan et al., 2003; Karja et al., 2004; Leoni 

et al., 2007; Meintjes et al., 2008). Per questa ragione si consiglia l’utilizzo di incubatori tri‐gas, pur 

non essendo espressamente richiesto nei requisiti minimi. 

L’utilizzo  di  incubatori  è  obbligatorio  per  tecniche  di  II  e  III  livello.  Il  documento  concordato 

durante la Conferenza dei Presidenti delle Regioni e delle Province Autonome (Roma 11 Novembre 

2004) dichiara  indispensabili almeno due  incubatori per ciascun  laboratorio PMA. E’  importante 

sottolineare  che  il  numero  di  incubatori  necessari  per  garantire  buone  condizioni  di  coltura 

dipende dalle dimensioni degli stessi e dalla mole di  lavoro. Vengono richiesti un minimo di due 

incubatori standard da 140 litri ma generalmente consigliati almeno un incubatore ogni 100 cicli di 

PMA di II/III livello annui. 

 

 

 

MANUTENZIONE E TARATURA 

Per  quanto  concerne  lo  stato  e  la  manutenzione  della  strumentazione  la  DE  2006/86/CE 

nell’Allegato 1 al punto C richiede: “Tutte le attrezzature e i dispositivi tecnici critici devono essere 

identificati e convalidati, periodicamente ispezionati e preventivamente sottoposti a manutenzione 

conformemente alle istruzioni del fabbricante. […] Le attrezzature nuove e riparate devono essere 

controllate  al  momento  dell’installazione  e  convalidate  prima  dell’uso.  I  risultati  dei  controlli 

devono essere documentati” 

 

Le apparecchiature  in dotazione ad un  laboratorio di PMA devono  infatti garantire affidabilità di 

funzionamento  pertanto  dovranno  essere  sempre  tenute  in  perfetta  efficienza.  Tale  efficienza 

dovrà essere garantita con opportune procedure di manutenzione e di taratura. 

 

Possiamo distinguere diverse tipologie di manutenzione: 

Convalida: procedura atta a dimostrare e documentare che lo strumento sia in grado di fornire le 

prestazioni  conformi  alle  specifiche  ed  alle  caratteristiche  di  qualità  stabilite  dal  costruttore.  Il 

processo di convalida di uno strumento è solitamente effettuato al momento dell’istallazione e  i 

risultati devono essere registrati in un report di convalida che contenga l’analisi dei dati ottenuti, 

la  verifica  che  i  risultati  soddisfino  i  criteri di  accettabilità, ovvero  le deviazioni  riscontrate e  le 

modifiche effettuate per correggerle. 

Manutenzione ordinaria: è rappresentata dall’insieme delle azioni manutentive effettuate su uno 

strumento o attrezzatura volte a garantirne  il corretto funzionamento e a scongiurare  l’insorgere 

di  rischi per  il processo cui sono preposte, senza modificare o migliorare  le  funzioni svolte dallo 

strumento stesso (ad esempio la pulizia interna ed esterna degli strumenti). 

Manutenzione  programmata:  intervento  che  viene  effettuato  a  tempi  prefissati  per  evitare 

decadimenti nel buon  funzionamento dell’apparecchiatura. Questi  interventi  sono normalmente 

affidati  alla  ditta  fornitrice  con  la  quale  si  stipula  un  contratto  di manutenzione  annuale  e/o 

semestrale. 

Manutenzione  straordinaria:  intervento  effettuato  dopo  il  verificarsi  di  guasti  o 

malfunzionamenti. Questo  tipo di  interventi vengono effettuati  su  specifica  richiesta e vengono 

eseguiti normalmente da un  tecnico  specializzato della ditta  fornitrice dopo  che  l’operatore ha 

verificato l’anomalia di comportamento. 

Taratura: operazione atta a garantire che lo strumento in uso sia in grado di fornire misure entro i 

limiti di  tolleranza previsti.   La definizione si riferisce a quelle apparecchiature che possono  fare 

riferimento  a  strumenti  campioni  primari;  per  le  altre  può  essere  intesa  come  insieme  di 

operazioni finalizzate al controllo del buon funzionamento dell’apparecchiatura. 

Le operazioni di taratura possono essere sostanzialmente riassunte in:  

verifica che il valore misurato rientri in un “range” di limiti stabiliti 

rilevazione dell’entità dell’errore osservato per usarlo come fattore di correzione 

eventuale messa a punto dello strumento per ridurre l’errore osservato  

Per ottenere una  taratura precisa dell’attrezzatura  in uso  in un  laboratorio è necessario quindi 

monitorare  i parametri critici attraverso strumenti di riferimento, quali termometro, analizzatori 

della percentuale di CO2 e O2, e pHmetro. Tali strumenti consentono di verificare la taratura degli 

indicatori  posti  sull’attrezzatura  in  uso,  come  gli  indicatori  di  temperatura  e  CO2  e  O2,  e 

dimostrano che le apparecchiature in uso in laboratorio funzionano correttamente con i parametri 

desiderati. Gli strumenti di riferimento devono essere a loro volta tarati verso standard primari e 

certificati da un ente specifico che ne garantisca l’affidabilità (SIT ‐ Servizio di Taratura in Italia). 

Bisogna  quindi  confrontarsi  con  la  problematica  della  loro  taratura  periodica,  che  deve  essere 

effettuata dal SIT, o da laboratori da esso accreditati, indicativamente ogni 2 anni.  

 

Modulistica 

Ogni  informazione  utile  e  operazione  effettuata  su  uno  strumento,  quale  la  provenienza, 

l’acquisto,  l’installazione,  il collaudo,  le date di ricevimento e messa  in funzione,  i riferimenti alle 

procedure di taratura e manutenzione quando necessari, la loro periodicità e i dati del fornitore e 

dell’assistenza  tecnica  devono  essere  documentati  e  annotati  su  un  apposito modulo  “Scheda 

apparecchiatura”  (Allegato  1),  specifico  per  quello  strumento,  che  deve  sempre  riportare  il 

numero di inventario.  Dovrà inoltre essere predisposta inoltre una “Scheda di Manutenzione” che 

riporti tutte le operazioni effettuate relative alla verifica, alle sostituzioni, alla pulizia con la data di 

svolgimento dell’operazione e  la  firma del  tecnico che  l’ha effettuata  (Allegato 2). Dovrà essere 

prevista  inoltre  una  “Scheda  di  Taratura”  (Allegato  3)  su  cui  verrà  riportato  il  riferimento  alla 

procedura di taratura, il programma di taratura, la data di svolgimento della stessa e della futura 

taratura, la firma del tecnico e i riferimenti ai campioni primari o materiali di riferimento utilizzati 

per  il  controllo  (di  cui  si  allega  fotocopia  del  certificato  di  taratura). Qualora  la  taratura  venga 

attuata  da  un  centro  esterno  dovrà  essere  riportata  tutta  la  documentazione  inerente. 

Un’apparecchiatura che, a seguito di taratura, abbia rilevato una non idoneità al suo utilizzo, dovrà 

essere  messa  fuori  servizio.  L’evento  dovrà  essere  segnalato  apponendo  un’etichetta  visibile 

sull’apparecchiatura e la data in cui l’evento è stato rilevato. L’apparecchiatura non potrà essere in 

nessun  modo  utilizzata  fino  a  quando  la  riparazione  e  la  taratura  di  nuovo  effettuata  non 

dimostrino che è di nuovo funzionante. L’evento dovrà essere riportato sulla scheda di taratura. 

 Vediamo nei particolari come è opportuno programmare  la manutenzione dei diversi  strumenti 

specifici: 

 

Per le cappe a flusso laminare le normali operazioni di manutenzione programmata (con cadenza 

almeno  annuale)  consistono  nella  sostituzione  dei  prefiltri  secondo  le  indicazioni  della  ditta 

costruttrice,  nella  pulizia/disinfezione  delle  superfici  interne  con  opportuni  disinfettanti  e  nel 

controllo dell’efficienza dei filtri.  

La manutenzione ordinaria (con cadenza quotidiana) prevede la pulizia con appositi detergenti dei 

piani e delle pareti interne della cappa, e la rimozione della polvere dal sistema di ventilazione. 

Deve essere effettuata una verifica della presenza di microrganismi nell’aria filtrata (vedi capitolo 

1). Se  le cappe sono dotate di piani  riscaldati, questi devono essere  tarati mensilmente all’inizio 

dell’attività, per poi passare, qualora  i risultati siano all’interno dei range di accettabilità ad una 

verifica di taratura quadrimestrale con adeguato strumento di riferimento certificato SIT.  

L’esito  della manutenzione  programmata  e  della  eventuale  taratura  dei  piani  riscaldati  devono 

essere opportunamente registrati nel logbook dedicato ad ogni apparecchiatura. 

 

 

Per quanto riguarda gli incubatori le normali indicazioni d’uso prevedono la protezione delle pareti 

dell’incubatore dalla  luce  solare diretta. È da evitare  inoltre  l’introduzione di grandi quantità di 

materiale  lasciando  spazi  per  permettere  la  circolazione  dell’aria.  La  manutenzione  ordinaria 

prevede  pulizia,  decontaminazione  e  rimozione  della  polvere  dal  sistema  di  ventilazione, 

sostituzione e sterilizzazione delle vaschette d’acqua (da effettuare mensilmente). Occorre inoltre 

controllare quotidianamente i valori di temperatura e di percentuale di CO2 e di O2, controllando i 

valori  indicati  dal  termometro/sonde  permanenti  installati  sull’apparecchiatura  e  visibili  sul 

display. Annotare i risultati su apposita scheda (Allegato 4). 

I valori si esercizio sono generalmente i seguenti: 

- Temperatura: 37° C (tolleranza +0.2°C) 

- CO2: 6% (tolleranza +0.2%) 

- O2: 5% (tolleranza +0.5%) 

 

La  tolleranza  per  questi  parametri  è  un  valore  critico  da  stabilire  in  funzione  delle  condizioni 

fisiologiche  cui  si  tende.  Per  quanto  riguarda  la  temperatura  la  tolleranza  non  può  che  essere 

minima, dal momento che anche piccole variazioni di temperatura sono riconosciute come cause 

di effetti dannosi per i gameti e gli embrioni. 

La  percentuale  di  CO2  deve  essere  funzionale  al  raggiungimento  del  pH  desiderato,  cui 

contribuiscono diversi parametri quali il tipo di terreno di coltura utilizzato e la temperatura, ed è 

per  questo  che  la  tolleranza  della  percentuale  di  questo  gas  deve  essere  stabilita  in  base  alle 

caratteristiche  generali  di  ciascun  sistema  di  coltura.  Per  quanto  riguarda  la  tolleranza  della 

percentuale di O2 è importante ricordare che nonostante sia riconosciuto il vantaggio di effettuare 

la coltura con basse concentrazioni di questo gas, non è ancora del  tutto chiaro  il valore  ideale 

oltre  il  quale  non  bisogna  spingersi. Questo  comporta  che  la  tolleranza  può  avere  un margine 

molto più ampio (5‐7%). 

Per  la  taratura  (da  programmare,  come  già  detto,  mensilmente  all’inizio  dell’attività,  per  poi 

passare con risultati stabili all’interno dei range di tollerabilità, ad una verifica quadrimestrale), e 

quindi per il controllo del termometro, sonde CO2 e O2 permanenti, bisogna utilizzare strumenti di 

riferimento certificati SIT inseriti sui diversi ripiani o nelle singole celle, e registrare i valori per un 

intervallo  di  tempo  di  almeno  60 min  con  frequenze  di  6 min,  avendo  cura  di  non  aprire  lo 

sportello dell’incubatore durante l’esecuzione del controllo. 

Come già descritto precedentemente è bene annotare gli esiti del controllo di taratura su apposita 

scheda, riportando per ogni rilevamento: 

•il valore medio e la deviazione standard delle misure rilevate con il campione di riferimento; 

•il valore letto sullo strumento permanente installato sull’apparecchiatura; 

•la deviazione evidenziata; 

•la deviazione massima ammissibile; 

•la  data  di  effettuazione,  la  data  del  successivo  controllo  di  taratura  e  la  firma  di  chi  l’ha 

effettuata. 

Sebbene  la misurazione della percentuale di CO2 sia un metodo  indiretto per attestare  il pH del 

mezzo di coltura in uso, si raccomanda di valutare il pH anche con metodo diretto. È stato, infatti, 

dimostrato che talvolta variazioni della percentuale di CO2 non si ripercuotono  immediatamente 

sul valore reale del pH del mezzo di coltura (Pool, 2004). 

Controlli microbiologici  

È necessario effettuare almeno con cadenza annuale  il controllo microbiologico dei  ripiani degli 

incubatori e delle cappe attraverso dei tamponi che dovranno essere esaminati tramite coltura da 

laboratori autorizzati (per ulteriori approfondimenti consultare il capitolo 1 di questo manuale). 

 

I frigoriferi devono essere caricati in modo che l’aria circoli liberamente, e in modo da mantenere 

all’interno una  temperatura bassa. Devono essere effettuate con cadenza annuale  le operazioni 

che prevedano: 

• rimozione della polvere dalle piastre esterne di aerazione 

• sbrinamento 

• pulizia e decontaminazione dell’interno dei frigoriferi e dei congelatori. 

 

Controllare  inoltre  i  termometri  permanenti  installati  su  frigoriferi  e  congelatori  confrontandoli 

con  un  termometro  campione  di  riferimento  certificato  SIT  verificando  la  taratura  della 

temperatura eseguendo  il controllo sui diversi ripiani del frigorifero o del congelatore. Effettuare 

la registrazione dei dati sull’apposito logbook. 

 

Per una buona manutenzione dei bagni  termostatici è consigliabile effettuare periodicamente  il 

controllo del livello del liquido, monitorare la temperatura del bagno, sostituire l’acqua contenuta 

nella  vasca  e  sanificare  la  vasca.  Controllare  annualmente  i  termometri  permanenti  installati 

confrontandoli  con  un  termometro  campione  di  riferimento  certificato  SIT.  Tenere  anche  per 

questi apposita registrazione. 

 

La manutenzione  dei microscopi  consiste  nella  rimozione  sia  della  polvere  dagli  oculari  e  dagli 

obiettivi usando cartine ottiche sia di tracce di olio dagli obiettivi usati per immersione. Controllare 

saltuariamente la lubrificazione delle parti mobili e sostituire la lampada di illuminazione, quando 

necessario,  seguendo  le  istruzioni  della  ditta  costruttrice.  E’  necessario  inoltre  programmare 

periodicamente (almeno annualmente) centratura ed allineamento delle ottiche. 

Quando non  in uso,  il microscopio va tenuto coperto e al riparo dalla  luce, per evitare danni alle 

lenti. 

 

Le pipettatrici possono essere manuali, elettroniche, monocanale o multicanale. Quelle manuali 

sono  le  più  utilizzate  all’interno  dei  laboratori.  Si  consiglia  l’utilizzo  unicamente  di  puntali 

monouso;  inoltre  è  opportuno mantenere  le  pipettatrici  a  temperatura  ambiente,  evitare  che 

subiscano urti, tenerle in posizione verticale e procedere ad una regolare pulizia, manutenzione e 

taratura. 

 

Per dispensatore si intendono quelle apparecchiature utilizzate per distribuire terreni di coltura e 

reagenti in provette, bottiglie o capsule di Petri. È opportuno controllare l’accuratezza dei volumi 

dispensati e, nel caso si debbano distribuire reagenti o terreni sterili, è opportuno controllare che 

le  parti  dell’apparecchio  in  contatto  con  essi  siano  in  condizioni  asettiche.  Mantenere  le 

apparecchiature  in  perfette  condizioni mediante  accurata  pulizia  dopo  ogni  ciclo  lavorativo,  in 

accordo con le indicazioni della ditta costruttrice. 

 

Come già detto  i termometri/misuratori CO2 e O2  in utilizzo presso  il  laboratorio devono essere 

tarati  periodicamente  mediante  confronto  con  strumenti  certificati  da  appositi  enti.  A  titolo 

esemplificativo ci si può dotare di un termometro campione primario fatto tarare ogni due anni da 

un ente accreditato con cui effettuare  tutte  le verifiche su  incubatori, piani riscaldati,  frigoriferi, 

congelatori. 

 

Il pHmetro è  lo strumento che serve per  la valutazione diretta del pH del mezzo di coltura.   Gli 

elettrodi  del  pHmetro  devono  essere  condizionati  e  conservati  secondo  le  istruzioni  del 

costruttore. Dopo  ogni  uso  devono  essere  puliti  con  acqua  distillata.  La  taratura  va  effettuata 

periodicamente  utilizzando  soluzioni  tampone  di  riferimento  (ad  es.,  pH  4  epH  7  a  37°).  Le 

soluzioni vanno conservate nelle migliori condizioni e non oltre  la data di  scadenza. Le aliquote 

giornaliere  utilizzate  devono  poi  essere  scartate  dopo  la  taratura.  Va  inoltre  controllato 

periodicamente  lo  stato di efficienza degli elettrodi  registrando  i valori  in mV  in corrispondenza 

delle tarature a pH 4 e pH 7. La differenza tra due misurazioni in rapporto al valore teorico indicato 

dal costruttore rappresenta un indice di invecchiamento dell’elettrodo. 

 

 

 

pH‐metro da incubatore: è fornito di una sonda con un supporto nel quale può essere introdotto 

il mezzo  di  coltura  e  inserito  in  incubatore  per  valutarne  il  pH  nella  camera  stessa.  Centro 

GENERA, Roma. 

 

Pianificazione 

Visto  l’enorme  lavoro che richiede  la gestione delle apparecchiature  in un  laboratorio di PMA,  la 

corretta  pianificazione  delle manutenzioni,  delle  tarature  e  della  sorveglianza  degli  strumenti 

costituisce un requisito  fondamentale.  In allegato  (Allegato 5) un esempio di pianificazione della 

gestione delle attrezzature. 

 

Dispositivi in rete per la misurazione dei parametri critici e allarmi 

E’  oggi  possibile  effettuare  la  rilevazione  in  continuum  dei  parametri  critici  degli  strumenti 

mediante  l’utilizzo di datalogger (posizionati all’interno degli  incubatori, frigoriferi, contenitori di 

azoto liquido) costituiti da una o più sonde elettroniche collegate ad una centralina che memorizza 

le misure di uno o più parametri, effettuate ad intervalli di tempo opportunamente stabiliti. Questi 

sistemi permettono  la misurazione,  l’elaborazione,  la comunicazione e  la  registrazione dei valori 

dei sensori. Nel caso  in cui  i valori  letti non corrispondano ai range di tollerabilità scattano degli 

allarmi  in modo  da  permettere  un  immediata  azione  correttiva  da  parte  del  responsabile  del 

sistema. 

I sensori possono essere: 

‐ Sensore di livello per l’azoto liquido  

‐ Pressione del liquido nel tank  

‐ Sensori di temperatura nei tank 

‐ Sensori di temperatura per incubatori e frigoriferi 

‐ Sensori di livello per la CO2 

‐ Sensori di livello per O2 

‐ Sensori di temperature degli ambienti  

‐ Umidità dell’ambiente  

‐ Pressione dell’ambiente  

‐ Sensori di movimento e presenza  

 

Le reti presenti in commercio possono essere reti cablate o reti wireless. Quest’ultime permettono 

vantaggi  dal  punto  di  vista  del  cablaggio  (non  necessario);  sono  quindi  più  facilmente 

implementabili. Non vi sono, però, dati in letteratura che garantiscano che il sistema wireless non 

sia nocivo per  le  cellule.  I  sistemi di allarme  sono diversi e possono essere acustici e/o visivi, e 

possono  essere  collegati  con  la  rete  telefonica  in  modo  da  poter  inviare  avvisi  al  personale 

responsabile. Tali sistemi possono essere già presenti all’interno degli strumenti, come ad esempio 

gli allarmi acustici che avvisano in caso di apertura prolungata degli incubatori, oppure visivi come 

gli  allarmi  luminosi  in dotazione di  alcuni  incubatori  che  avvisano quando  il  livello dell’acqua è 

troppo basso. 

Altri  tipi  di  sistemi  di  monitoraggio  e  allarme  possono  essere  istallati  successivamente  agli 

strumenti, come nel caso delle sonde che misurano il livello d’azoto nelle banche. 

 

Conclusioni 

Il laboratorio di PMA si occupa della inseminazione di gameti e della coltura di embrioni umani, ne 

consegue  una  grande  responsabilità  da  parte  degli  operatori.  Si  tratta  infatti  (a  differenza  dei 

laboratori diagnostici) di effettuare colture dette ex vivo, ovvero di coltivare cellule in vitro che poi 

vengono  reintrodotte nel corpo materno  (in vivo). Non si può escludere che alcuni parametri di 

laboratorio possano influire non solo sulla vitalità delle cellule durante la coltura ma anche avere 

effetti a  lungo  termine sul  feto. E’ ben nota  l’estrema sensibilità degli ovociti ad esempio a  lievi 

variazioni  di  temperatura  che  portano  alla  depolimerizzazione  del  fuso  meiotico  con  rischi 

potenziali sulla successiva segregazione cromosomica. 

Nonostante  l’introduzione di nuove  tecnologie,  le operazioni necessarie a mantenere  la stabilità 

dei parametri critici degli strumenti in uso nei laboratori richiedono tempo e particolari attenzioni. 

E’  da  considerare  anche  l’estrema  sensibilità  dei  termometri  e  delle  sonde  utilizzate  per  la 

valutazione  delle  percentuali  dei  gas  anche  a  parametri  fisici  quali  temperatura  e  umidità 

dell’ambiente.  Manutenzione,  taratura  e  calibrazione  rappresentano  quindi  indispensabili 

strumenti per garantire adeguate  condizioni di  coltura, ottimizzando  i  risultati e minimizzando  i 

rischi per gli embrioni. 

L’intera  gestione  dei  parametri  critici  della  strumentazione  può  essere,  già  oggi,  effettuata 

automaticamente con sonde  indipendenti, collegate  in rete, con  le rilevazioni accessibili anche  in 

back‐office.  Questo  porta  evidentemente  ad  una  notevole  riduzione  dei  rischi  di  alterazioni 

inconsapevoli  delle  condizioni  di  coltura. Crediamo  che  un moderno  laboratorio  di  PMA  debba 

dotarsi necessariamente di sofisticati strumenti di rilevazione, allarmi e registrazione dei parametri 

critici ed in particolare delle temperature, livelli di CO2, O2 e azoto. 

 

 

                     

REFERENZE 

 1. Biggers JD. Thoughts on embryo culture conditions. ReprodBioMed Online 2001;4:30–8. 

 

2. Brinster RL. In vitro cultivation of mammalian ova. Adv Biosci 1969;4:199–233. 

 

3. Brinster RL. Studies on the development of mouse embryos. The effect of osmolarity and 

hydrogen ion concentration. J Exp Zool 1965;158:49–58 

 

4. Decreto  Legislativo  25  gennaio  2010,  n.  16  così  come modificato  dal  D.  Lgs.  85/2012 

"Attuazione delle direttive 2006/17/CE e 2006/86/CE, che attuano la direttiva 2004/23/CE 

per quanto  riguarda  le prescrizioni  tecniche per  la donazione,  l'approvvigionamento  e  il 

controllo di tessuti e cellule umani, nonche' per quanto riguarda  le prescrizioni in tema di 

rintracciabilita',  la  notifica  di  reazioni  ed  eventi  avversi  gravi  e  determinate  prescrizioni 

tecniche per la codifica, la lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di 

tessuti e cellule umani"pubblicato nella Gazzetta Ufficiale del 18 febbraio 2010, n. 40 

 

5. Decreto Legislativo 6 novembre 2007 “Attuazione della Direttiva 2004/23/EC per quanto 

riguarda  le prescrizioni  tecniche per  la donazione,  l'approvvigionamento e  il  controllo di 

tessuti  e  cellule  umani,  nonche'  per  quanto  riguarda  le  prescrizioni  in  tema  di 

rintracciabilita',  la  notifica  di  reazioni  ed  eventi  avversi  gravi  e  determinate  prescrizioni 

tecniche per la codifica, la lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di 

tessuti e cellule umani" 

 

6. European  Union.  Commission  Directive  2006/17/EC  of  8  February  2006  implementing 

Directive  2004/23/EC  of  the  European  Parliament  and  of  the  Council  as  regards  certain 

technical  requirements  for  the donation, procurement and  testing of human  tissues and 

cells. Official Journal of the European Union 2006:L38/40. 

 

7. European  Union.  Commission  Directive  2006/86/EC  of  24  October  2006  implementing 

Directive 2004/23/EC of the European Parliament and of the Council as regards traceability 

requirements, notification of  serious  adverse  reactions  and events  and  certain  technical 

requirements for the coding, processing, preservation, storage and distribution of human 

tissues and cells. Official Journal of the European Union 2006:L294/32 

 

8. European Union. Directive 2004/23/EC of the European Parliament and of the Council of 31 

March  2004  ‘On  setting  standards  of  quality  and  safety  for  the  donation,  procurement, 

testing, processing, preservation, storage, and distribution of human  tissue cells’. Official 

Journal of the European Union 2004:L102/48. 

 

9. Gianaroli  L,  Plachot  M,  van  Kooij  R,  Al‐Hasani  S,  Dawson  K,  De  Vos  A,  Magli  MC, 

Mandelbaum J, Selva J, van Inzen W. Guidelines for good practice in IVF laboratories. Hum 

Reprod 2000; 15:2241‐2246 

 

10. Harlow GM, Quinn  P.  Foetal  and  placental  growth  in  the mouse  after  pre‐implantation 

development  in  vitro  under  oxygen  concentrations  of  5%  and  20%.  Austr  J  BiolSci 

1979;32:363–369 

 

11. Karja NW, Wongsrikeao P, Murakami M, Agung B, Fahrudin M, Nagai T, Otoi T. Effects of 

oxygen  tension  on  the  development  and  quality  of  porcine  in  vitro  fertilized  embryos. 

Theriogenology 2004;62:1585–1595 

 

12. Legge  n.  40/2004  “Norme  in materia  di  procreazione medicalmente  assistita”. Gazzette 

Ufficiale n.45 del 24 febbraio 2004 

 

13. Leoni GG, Rosati I, Succo S, Bogliolo L, Bebbere D, Berlinguer F, Ledda S, Naitana S. A  low 

oxygen  atmosphere during  IVF  accelerates  the  kinetic of  formation of  in  vitro produced 

ovine blastocysts. Reprod Domestic Anim 2007;42:299–304.  

 

14. Magli MC, Van den Abbeel E, Lundin K, Royere D, Van der Elst J, Gianaroli L for Committee 

of  the Special  Interest Group on Embryology. Revised guidelines  for good practice  in  IVF 

laboratories. Hum Reprod2008; 23:1253‐1262 

 

 

15. Meintjes M, Chantilis SJ, Douglas JD, Rodriguez  AJ, Guerami AR, Bookout DM, Barnett BD, 

Madde JD. A controlled randomized trial evaluating the effect of lowered incubator oxygen 

tension  on  live  birth  in  a  predominantly  blastocyst  transfer  program;  Hum  Repr 

2009;24:300–307 

 

16. Pool TB. Obtimizing pH in clinical embryology. Clin. Embryol. 2004;7:1–17 

 

17. Summers  MC,  Biggers  JD.  Chemically  defined  media  and  the  culture  of  mammalian 

preimplantation embryos: historical perspective and  current  issues. Hum Reprod Update 

2003;9:557–82 

 

18. WHO. Manuale di sicurezza nei laboratori. AIRESPSA 2005. 

 

19. Yuan YQ, Van Soom A, Coopman FOJ, Mintiens K, Boerjan ML, Van Zeveren A, de Kruif A, 

Peelman  LJ.  Influence  of  oxygen  tension  on  apoptosis  and  hatching  in  bovine  embryos 

cultured in vitro. Theriogenology 2003;59:1585–1596.