SOCIETÀ ORTICOLA ITALIANA

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PERUGIA

DIPARTIMENTO DI ARBORICOLTURA E PROTEZIONE DELLE PIANTE

CONVEGNO NAZIONALE

GERMOPLASMA OLIVICOLO E TIPICITÀ

DELL’OLIO

5 DICEMBRE 2003

Facoltà di Agraria – Borgo XX Giugno, 74

Complesso Monumentale di S. Pietro - Perugia

Con il contributo finanziario di:

REGIONE DELL’UMBRIA

FONDAZIONE CASSA DI RISPARMIO DI PERUGIA

PARCO TECNOLOGICO AGROALIMENTARE DELL’UMBRIA

CAMERA DI COMMERCIO, INDUSTRIA, ARTIGIANATO E AGRICOLTURA DI PERUGIA

ASSOCIAZIONE PRODUTTORI OLIVICOLI DI PERUGIA

In copertina:

Particolare dell’affresco di Giotto “Ingresso di Gesù a Gerusalemme” Padova – Cappella degli Scrovegni (1302 – 1305)

2

Comitato Scientifico

Antognozzi Evasio, Famiani Franco, Montedoro Gianfrancesco, Proietti Primo, Romano Bruno, Servili Maurizio, Standardi Alvaro, Tombesi Agostino.

Comitato Organizzatore

Proietti Primo (Presidente), Antognozzi Evasio, Boco Mirco, Casulli Valeria, Famiani Franco, Farinelli Daniela, Nasini Luigi, Pilli Massimo,

Degli Esposti Fragola Tiziana, Troni Marisa.

Dipartimento di Arboricoltura e Protezione delle Piante

Via Borgo XX Giugno, 74 - 06121 Perugia

Tel. 075/5856259 - Fax 075/5856255 - E-mail arboree@unipg.it

Coordinamento

Primo Proietti – Massimo Pilli

Dipartimento di Arboricoltura e Protezione delle Piante Facoltà di Agraria – Università degli Studi di Perugia

Stampato in Italia – Printed in Italy

3

CARATTERIZZAZIONE DI OLI D'OLIVA MEDIANTE METODI MOLECOLARI BASATI SULL'ANALISI DEL DNA Marmiroli N.(1), Palmieri L.(1), Donini P.(2), Fogher C.(3) Martin A.(4), da Câmara Machado A. (5), Lopes P. (6), Breton C. (7) (1) Dipartimento di Scienze Ambientali, Università di Parma, Parma (2) National Institute of Agricultural Botany, Cambridge, Regno Unito (3) Plantechno S.r.l., Vicomoscano (CR) (4) Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas, Institute for Sustainable Agriculture, Cordoba, Spagna (5) Department of Agricultural Sciences, University of Azores, Angra do Heroismo, Portogallo (6) G

vano a sistemi com erciali o a metodiche descritte in letteratura. L'efficacia dei metodi è stata valutata misurando la resa quantitativa, determinata mediante analisi spettrofotometrica, e le

nuc crosatellitari. Una valutazione comparativa dei metodi ha

l'es

Int

divnelori getale, animale o microbica di composizione complessa, e spesso assoggettati

mo estratti contenenti DNA di

il m ere a diverso grado di raffinazione, filtrato o meno, di

trat ossono portare alla degradazione del DNA

svianc tecniche di purificazione brevettate da

son ni et al. 2003).

par na, Portogallo, Francia, Belgio e

enetic and Biotechnology Department, Universidade de Tras-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portogallo (7) Phylogene S.A, Nimes, Francia Riassunto

Nell'ambito del progetto OLIV-TRACK finanziato dalla Commissione Europea sono stati saggiati oltre venti metodi per l'estrazione di DNA da olio d'oliva, con lo scopo di applicare tecniche di tracciabilità per definire l'autenticità e l'origine dell'olio in base all'uso di marcatori molecolari. I protocolli analizzati corrisponde

m

proprietà qualitative del DNA estratto: amplificabilità di sequenze cloroplastiche e leari e di sequenze mi

portato alla definizione dei migliori protocolli applicabili con affidabilità per trazione di DNA da olio e per le successive analisi molecolari. roduzione La tracciabilità molecolare degli alimenti è un argomento di grande attualità, e erse tecnologie vengono sviluppate per consentire il riconoscimento degli ingredienti le complesse matrici alimentari. I campioni alimentari derivano infatti da materiali di gine ve

a trattamenti meccanici, chimici o termici. L’identificazione con metodologie lecolari presuppone la preparazione da queste matrici di

buona qualità e in quantità sufficienti per le analisi richieste. Nel caso dell’olio d’oliva, ateriale di partenza può ess

origine monovarietale o costituito da una miscela di olive di cultivar diverse. I tamenti a cui vengono sottoposti gli oli p

presente nel materiale vegetale di origine. Negli ultimi anni, diversi protocolli sono stati luppati o modificati per estrarre DNA dalle matrici alimentari, e sono ora disponibili he protocolli commerciali basati su

compagnie del settore. Protocolli destinati specificamente all’estrazione di DNA da olio o ancora scarsi (Muzzalupo e Perri 2002; BuscoNell’ambito del progetto OLIV-TRACK (contratto QLK1-CT-2002-02386), i tner appartenenti a sei paesi europei, Italia, Spag

221

Regno Unito, si sono prefissi di individuare i metodi migliori e più affidabili per l’estrazione di DNA da olio d’oliva di diversi tipi. In totale sono stati analizzati oltre 30 protocolli derivati dalla letteratura, modificati o adattati da protocolli sviluppati per

monio bromuro): metodo

di

ati su matrici leganti il DNA: Kit Macherey-Nagel NucleoSpin Food, Tissue, Kit Qiagen Dneasy Plant mini, kit Qiagen stool

ini, kit Promega Wizard Magnetic Food, kit Biogene Geneclean, kit Sigma GenElute ic DNA, metodo con idrossiapatite e modificazioni di Breton (com. pers.).

osina, rDNA); . amplificazione con primer disegnati sul loci microsatellitari (Sefc et al. 2000).

zione con primer disegnati su sequenze enzimatiche note per la messa in

iori quantità di DNA risp

applicazione ad altre matrici alimentari, protocolli commerciali, protocolli proprietari.

MMetodi basati su estrazione con CTAB (esadeciltrimetilam

ateriali e metodi

di Busconi et al. 2003; metodo di Martin (com. pers.); metodo di Lopes con modificazioni (com. pers.); metodo di Muzzalupo e Perri (2002); metodo di Fabbri et al. (1995); metodo di Kobayashi et al. (1998); metodo di Doyle e Doyle (1990); metodoBreton (com. pers.).

Metodi basNucleoSpin Plant, NucleoSpin mPlant Genom

Altri metodi: metodo con esano di Palmieri e Donini (com. pers.), metodo con eptano di Breton (com. pers.), metodo di Mathias (com. pers.), metodo di Van Bragt (1996), metodo con TE di Martin (com. pers.).

Il DNA estratto con i diversi metodi è stato amplificato utilizzando come controllo DNA estratto da foglie di olivo provenienti dalla medesima cultivar. Cinque tipi di amplificazione mediante PCR sono stati eseguiti:

1. amplificazione con primer disegnati su sequenze conservate di DNA plastidico; 2. amplificazione con decameri a sequenza arbitraria secondo il protocollo RAPD

(Welsh e McClelland 1990); 3. amplificazione con primer disegnati su geni nucleari noti (ole45. amplificaevidenza di SNP (polimorfismi di singola base).

Risultati e discussione I protocolli utilizzati sono stati classificati in tre categorie: (i) metodi basati su

estrazione con CTAB, che si basano sulla presenza del detergente CTAB come agente per purificare il DNA da polisaccaridi e composti fenolici; (ii) metodi basate su resine, filtri a matrice di silicio o sferette paramagnetiche alla base di kit commerciali con soluzioni brevettate contenenti agenti caotropici e composti a specifico legame per le molecole di DNA, seguiti da eluizione e purificazione; (iii) metodi che non ricadono nelle categorie precedenti, facenti uso a volte di solventi organici per trattare gli oli prima dell’estrazione. Le differenze nei metodi portano a differenze nelle rese e nella qualità del DNA estratto. In una prima fase, tutti i metodi sono stati provati su oli vergini e non, filtrati e non, monovarietali o misti. Le quantità di DNA estraibili per millilitro di olio sono riportate in Figura 1, con un range indicativo dei risultati ottenuti in diversi esperimenti. I kit commerciali sembrano estrarre le magg

etto agli altri metodi. La qualità del DNA estratto è stata valutata sottoponendo il DNA ad amplificazione con diversi tipi di primer.

222

I metodi basati sul CTAB sono stati modificati o adattati da protocolli descritti in letteratura: la quantità di olio necessaria varia da 6 a 400 ml secondo i metodi. Nella maggior parte dei casi, il DNA risulta amplificabile con primer cloroplastici e RAPD, mentre solo in pochi casi il DNA risulta amplificabile con loci nucleari specifici: i me di Busconi et al., Muzzalupo e Perri, Fabbri, Kobayashi, Martin.

azione di DNA ottenuti da 8 oli monovarietali con primer RAPD (ma

ogn arie ripetute estrazioni per ottenere sufficienti quantità di DNA: le rese possono tuttavia essere piuttosto alte. Nella maggior

ottenuto è amplificabile con primer universali e anche sito-specifici. In particolare, il kit Promega Wizard®Magnetic DNA Purification System for Food è stato efficace nelle mani di diversi partner del progetto.

Tra gli altri metodi, quello di Palmieri-Donini con esano è risultato il più efficace, portando all’ottenimento di DNA amplificabile con primer disegnati su loci microsatellitari e sequenze geniche codificanti per enzimi coinvolti in vie biosintetiche di interesse primario in olivo.

Le diverse prove di amplificazione mostrano che è possibile ottenere amplificati lunghi fino a 2000 bp, dimostrando che le dimensioni del DNA estratto sono sufficienti per consentire l’amplificazione di molti marcatori molecolari utili ai fini della tracciabilità.

In una seconda fase, un ristretto pannello di metodi selezionati nella prima fase è stato cimentato su 10 oli distribuiti in modo anonimo ai diversi partner: 5 oli vergini commerciali di composizione mista e 5 oli vergini monovarietali di origine spagnola e francese. Al termine delle prove, 4 metodi si sono rivelati in grado di fornire con consistenza e affidabilità buoni risultati a partire da oli di tipo diverso: Il metodo di

to

Busconi et al.

Lopes

Mazzalupo-Perri

Fabbri et al.

Kobayashi et al.

A B

Dneasy

DNA Stool

NSFood

NSPlant

NSTissue

zard magnetic

Geneclean

Genelute

Breton idross.

0 1000 2000 3000 4000

lmieri-Donini

Mathias

DNA yield (ng/ml oil)

Fig

5000

Wi

Pa

ura 1. A. Confronto tra le quantità di DNA estraibili da olio d'oliva con i diversi metodi utilizzati. B. Esempio di amplific

rcatori di peso molecolare nella prima corsia da sinistra). Per i metodi basati su filtri a silicio o sferette paramagnetiche, il volume di olio per i estrazione è solitamente piccolo, e sono necess

parte dei casi, il DNA

223

Bu

perimentati sono stati classificati in una graduatoria in base alla resa, alla qualità del DNA estratto e alla sua amplificabilità con primer sito-specifici. Tabella 1. Valutazione comparativa dei metodi di estrazione di DNA da olio d'oliva Metodo Valutazione (da 0,

peggiore, a 5 migliore)

Metodo Valutazione (da 0, peggiore, a 5

migliore)

sconi et al. (2003), il metodo di Kobayashi, il metodo con esano di Palmieri e Donini e il kit Promega. L’amplificazione con primer disegnati su loci microsatellitari ha consentito in alcuni casi il riconoscimento della cultivar di origine di uno degli oli monovarietali (Arbequina).

Il risultato finale del test è mostrato in Tabella 1, dove i metodi s

Busconi et al. 5 Fabbri et al. 3 Kobayashi et al. 5 NucleoSpin Food

MN 3

Promega wizard magnetic food

5 Qiagen DNA stool mini kit

3

Palmieri e Donini 5 TE Martin 3 CTAB Martin 4 CTAB Lopes

II III Isopropanol Isopropanol/Proteina

2 3 2 3 3

se K NucleoSpin Plant MN

4 Qiagen Dneasy plant mini kit

2

Breton idrossiapatite 4 Biogene Geneclean 2 kit

NucleoSpin Tissue MN

4 Sigma GenElute plant genomic

2

Mathias 4 Van Bragt 2 Muzzalupo e Perri 3 Doyle e Doyle 1

Il DNA ottenuto con i metodi giudicati essere i migliori è stato amplificato con primer per marcatori microsatelliti e con primer disegnati su sequenze enzimatiche utili alla messa in evidenza della presenza di SNP (polimorfismi per singolo nucleotide). Conclusioni

Da una serie di protocolli analizzati per l'estrazione di DNA dall'olio di oliva, diversi si sono dimostrati adattabili a oli disponibili in commercio. Fra tutti quelli saggiati, quattro risultaind

no di maggiore efficacia e suscettibili di applicazione anche in un contesto ustriale: Busconi et al., Palmieri e Donini, Kobayashi, e il kit Promega. Le quantità

di olio richieste, fino a un massimo di 160 millilitri, le difficoltà tecniche dei procedimenti, le attrezzature richieste, il costo e la manodopera sono compatibili con un loro adattamento a livello industriale. Il DNA estratto risulta sufficientemente puro, di dimensioni tali da consentire il fingerprinting con descrittori molecolari specifici per

224

analisi di identità, discriminazione e uniformità. L’analisi svolta con marcatori SSR permette di giungere a una prima identificazione di differenti cultivar che costituiscono oli monovarietali, essendo stato evidenziato il medesimo profilo in DNA estratto direttamente da pianta e quello estratto da olio della stessa cultivar. L’amplificazione ott

cente parte di una miscela di olio.

oro è stato sv l di ricerca "Tr n and authenticity of olive oil d genomic and metabolomic OLIV-TRACK." QLK1-CT-2002-02386, finanziato dalla Commissione , Quinto

uadro.

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elsh J., McClelland M., 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary ucleic Acids Res. 18: 7213–7218.

enuta con primer specifici per la messa in evidenza di SNP permette di considerare tali marcatori utili per una futura applicazione degli stessi in PCR quantitativa, onde determinare la percentuale per ogni cultivar fa

Ringraziamenti Il lav olto nell'ambito de

by combine progetto aceability of origi

approaches. Europea

Programma Q

Bibliografia Busconi M., F

extraction from nd n the identiFood Chem

lan

and efficient DNA ext tion m d for plants, especi y Tissue Culture a

Muzzalupo I., Perri6-80. nd characterisation Re om

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Macholive (Olea eu d t acterization in

Bragt, P.H., 1996. Molecular Biological Techniques, in vitro DNA manipulation including PCR and in situ hybridization. International Post Graduate Course. 5-12 July Porto.

Wprimers. N

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