•Geni istonici replicativi: espressi in manieracoordinata in fase S

•Varianti istoniche di sostituzione: prodotte in maniera variabile durante tutto il ciclo cellulare;hanno caratteristiche specifiche che li distinguonodagli istoni replicativi e hanno un forte impattosulle funzioni cellulari.

VARIANTI ISTONICHE

S viene fosforilata in seguito a danni al DNA

§: differenze in questo loop prevengono l’assemblaggio di un nuc.contenente H2A e H2A.Z

#: questo dominio contatta (H3-H4)2

e variazioni qui influenzano lastabilità del nucleosoma.

§ #

Le varianti istoniche sono coinvolte in vari processi, sia nella espressione genica, sia nella riparazione del DNA, sia nella costruzione di strutture eterocromatiche.

VARIANTI DI H3

Le principali varianti di H3 nei mammiferi sono:

• Varianti replicative: H3.1 e H3.2 deposti durante la fase S

• Varianti di sostituzione:

1. H3.3: ruolo positivo nella trascrizione. Blocca l’espansione dell’eterocromatina2. CENP-A: Specifico per la cromatina centromerica

Si accumulano durante tutto il ciclo cellulare nelle regioni molto trascrittecome ad esempio il cluster dei geni ribosomali

Varianti di H3 sono state trovate anche in altri organismi come Drosophila,Xenopus, Caenorabditis elegans, piante ecc.

Le varianti H3.1 e H3.3 hanno anche proprietà di assemblaggio diverseChaperone di H3.1 = CAF-1Chaperone di H3.3 = HIRA

Le due diverse chaperone supportano rispettivamente l’assemblaggioreplicativo (RC) e l’assemblaggio indipendente dalla replicazione (RI).

Sia il complesso HIRA che la subunità RbAp48 di CAF-1 hanno deidomini WD-40 ripetuti che sono noti interagire con il dimero H3-H4;

Analogamente ASF-1 mostra preferenza di legame con il dimero H3-H4;Questo suggerisce che queste caratteristiche condivise riflettano il coinvolgimento nello stesso pathway di assemblaggio.

Nonostante la stabilità del nucleosoma e dell’alto grado di compattezza nel nucleola cromatina è sorprendentemente dinamica.

Esistono vari modi di modificare la cromatina e rispondere alle necessità dellacellula di regolare i processi biologici dall’espressione genica, alla riparazionedel DNA, alla replicazione e ricombinazione.

1)1) Uso di varianti istoniche, in particolare varianti di H2A e H3.Uso di varianti istoniche, in particolare varianti di H2A e H3.

2) Modificazioni epigenetiche degli istoni: acetilazione, metilazione ed altre.

3) Uso di sistemi di rimodellamento che cambiano la stabilità e/o la posizione del nucleosoma.

Dinamicità della cromatina

H3

H2A

H4

H2B

R2 K4 K9S10 K14 R17 K18 K23 R26K27S28

MetilazioneMetilazione AcetilazioneAcetilazione FosforilazioneFosforilazione

Modificazioni covalenti delle code ammino-terminali

Poly-ADP ribosilazionePoly-ADP ribosilazione

S1 R3 K5 K8 K12 K16 K20

Ubiquitinazione

K9K5 K119

K79

S1 E3 K12 K15 K20 K24 K120

•Acetilazione: implicata nella regolazione dell’espressione genica. Interessa le LISINE (K).•Metilazione: associata a differenti funzioni cromatiniche e alla regolazione della trascrizione. Interessa le ARGININE e le LISINE (R e K). •Fosforilazione: coinvolta nella regolazione della trascrizione, nei processi di riparo del DNA e nella condensazione cromosomica durante la mitosi. Interessa le SERINE (S).•Ubiquitinazione: critica per i processi di mitosi e di meiosi. Interessa le LISINE (K).•poli(ADP)Ribosilazione:associata a varie funzioni cromatiniche(condensazione e decondensazione), principalmente al rilevamento di danni al DNA, ma anche ad altre funzioni genomiche. Interessa le GLUTAMINE (E).

Tipi di modificazione istonicheTipi di modificazione istoniche

Conseguenze funzionali delle modificazioni Conseguenze funzionali delle modificazioni istonicheistoniche

•Le modificazioni non influenzano la stabilità del core nucleosomale, ma alterano solamente la carica elettrostatica delle code N-terminali. Ciò modifica le proprietà strutturali dell’istone o il suo legame al DNA.

•Si crea un meccanismo che altera la struttura della cromatina, la cui conseguenza è una modificazione dello stato trascrizionale (“on-off”) oppure la definizione di strutture cromosomali di ordine superiore.

•Modificazioni transitorie e quindi reversibili.

B)Le modificazioni covalenti creano siti di legame per particolari domini proteici reclutando così specifici complessi di “proteine associate alla cromatina”.

A)

Tutte le modificazioni vengono effettuate da COMPLESSI ENZIMATICI ad esse dedicati.La delezione dei geni codificanti tali enzimi è di solito letale.

Sia i complessi enzimatici che modificano gli istoni sia i fattori che interagisconocon le modificazioni sono stati identificati come MODIFICATORI di PEV

Gruppo Su(var), soppressoriDeacetilasi istoniche (HDACs)Fosfatasi proteiche (PPTs)S-adenosilmetionina sintetasi (SAM)HP1 [Su(var)2-5]

Gruppo E(var), intensificatoriPresenti in vari complessi dirimodellamento della cromatinaATP-dipendenti:Swi/Snfbrahmaquesti aumentano la mobilitànucleosomale

Su(var) ed E(var) CONTENGONO PARTICOLARI DOMINI PROTEICI

Bromodominio:SNF2TAFII250HRX/M11 (gruppo TRX nel mammifero; interagisce con complessi di rimodellamento)

Dominio SET:Su(var)3-9E(z) (gruppo Pc; ha anche attività di Acetilasi istonica)Tritorax

Cromodominio:PolycombHP1

Residui acetilatiinteragiscono conil Bromodominio

Residui metilatiinteragiscono conil Cromodominio

L’ACETILAZIONEL’ACETILAZIONE

Nel 1964 Allfrey scoprì l’esistenza di istoni acetilati o deacetilati e ipotizzò un loro ruolo nella regolazione genica.

Nel 1996 venne identificata e purificata la prima acetiltrasferasi istonica (HAT: Histone Acetyl-Transferase).

Oggi il numero di acetilasi e deacetilasi istoniche si è ampliato notevolmente

H3

H2A

H4

H2B

K9 K14 K18 K23 K27

K12 K15 K20 K24

K9K5

K5 K8 K12 K16

RUOLO DELL’ACETILAZIONE RUOLO DELL’ACETILAZIONE ISTONICAISTONICA

•Decondensa la fibra da 30nm

•Favorisce l’accesso dei fattori di trascrizione sulla cromatina

•Agisce come segnale per il legame di proteine non istoniche

HDAC

HAT

METILAZIONE

Sono state identificate metilasi specifiche per alcuni residui di lisina:Drosophila: Su(var)3-9S.pombe: Clr4Human: SUV39H1L’attività metilasica è espletata dal dominio SET di questi enzimi ed è specifica per H3K9.Anche altri residui possono essere metilati (a carico di altre metilasi).

H3metK9 viene riconosciuta dalla proteina HP1 attraverso il suo cromodominio.

Non è stata identificata, invece, alcuna attività metilasica per i domini SET contenuti in PcG e Trx

H3

H4

R2 K4 K9S10 K14 R17 K18 K23 R26K27S28

S1 R3 K5 K8 K12 K16 K20

Esiste un legame tra funzione Su(var), silenziamento genico e assemblaggiodell’eterocromatina

E(var) e Trxinserisconosegnali eucromaticie destabilizzanoo degradanol’imprinteterocromatico

Su(var) e PcGfavoriscono l’aggiunta di segnalieterocromatici e rimuovonosegnali eucromatici

RUOLO DELLA METILAZIONERUOLO DELLA METILAZIONE

IL CODICE ISTONICOIL CODICE ISTONICO

Quasi sempre le modificazioni istoniche sono evidenziabili in combinazione.

La natura combinatoriale delle modificazioni istoniche rivela l’esistenza di una

sorta di CODICE ISTONICO (“histone code”) che impone le caratteristiche

regolative di un gene, estendendo l’informazione potenziale del codice genetico.

Questi stati epigenetici devono essere stabiliti, mantenuti ed ereditati

attraverso mitosi e meiosi (MEMORIA CELLULARE).

Il fenotipo è però sempre VARIEGATO, poiché possono avvenire repentini

cambiamenti di stato.

•Modificazioni sullo stesso e/o su differenti istoni possono essere interdipendenti e generare varie combinazioni su qualunque nucleosoma

•Distinte modificazioni delle code istoniche inducono interazioni con diverse proteine associate alla cromatina:

Le regole del codice istonico

•Diversi tipi di struttura di ordine superiore dipendono dalla concentrazione locale e dalla combinazione di nucleosomi modificati differenzialmente

In pratica le modificazioni istoniche servono a definire particolari stati della cromatina.

•Le modificazioni istoniche alterano la struttura della cromatina, determinando uno stato “on-off” della trascrizione.

Condensazione mitotica

Eterocromatina

Diverse combinazioni riscontratesu geni attivati

•La modificazione di un residuo influenza quella di un altro residuo sullo stesso istone o su un altro dello stesso nucleosoma.

L’interazione può essere SINERGICA:pH3S10 favorisce AcH3K9 e/o K14 durantela stimolazione ormonale in cellule di mammifero;oppure ANTAGONISTICA:pH3S10 inibisce metH3K9

Su H4 si hanno situazioni analoghe.

MODIFICAZIONI DELLE VARIANTI ISTONICHE NUCLEOSOMALI DI H3

•Nella pianta alfalfa si è visto che H3.3 è circa due volte più acetilato chel’istone H3 (variante replicativa)

•Dato confermato anche in Drosophila e mammifero

•H3.3 è arricchito in regioni altamente trascritte e contiene modificazioni associate alla trascrizione: metH3K4; metH3K36; AcH3K9,14,18,23

La situazione può essere ancora più complessa

combinazione di varianti istoniche e PTM puòdefinire il destino di regioni cromatiniche einfluenzare anche il fato cellulare.

Modello per l’instaurazione e il mantenimento del pattern di modificazioni posttrascrizionali delle varianti di H3

PTMs sugli istoni varianti non-nucleosomali:

H3.3: K9- meK9, me2K9, acK9,14 Questo profilo non è suscettibile di ulteriore modificazione da parte di Suv39.H3.1: K9- meK9 inserito nel nucleosoma può essere ulteriormente metilatoda Suv39

?

Our hypothesis rests on the central concept that mammalian histone H3 variants (H3.1, H3.2, and H3.3), although remarkably similar in amino acid sequence, exhibit distinct posttranslational ‘‘signatures’’ that create different chromosomal domains or territories, which, in turn, influence epigenetic states during cellular differentiation and development.

L’IPOTESI BARCODE PER L’ISTONE H3

Hake S.B. and Allis C.D. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103; 6428-6435

L’idea è che varianti di H3, differentemente modificate possano contribuirea stabilire DOMINI CROMOSOMALI

Questo risulterebbe da una scelta combinata di percorsi di assemblaggio(varianti ed enzimi che le modificano prima della deposizione) e ambienti circostanti specifici (azione locale di enzimi modificanti sulla cromatina).

Studi recenti hanno evidenziato un ruolo per le varianti di H3 nelladeterminazione del destino cellulare durante l’embriogenesi.

•In Drosophila e topo quando il DNA paterno si decondensa incorporaH3.3 di origine materna.

•Durante la meiosi avviene un rimodellamento massivo della cromatinanei cromosomi sessuali maschili, che incorporano specificamente H3.3

•In Drosophila HIRA di origine materna è stato implicato nella deposizionedi H3.3 sulla cromatina materna. Mutazioni in questo gene causano difettinello stadio di decondensazione.

•In topo mutanti di HIRA non vanno oltre lo stato di gastrula. Quindi neltopo HIRA è essenziale a stadi successivi alla decondensazione.

•Domini cromosomali paterni e materni hanno diverse caratteristiche:Cromatina pericentrica materna: 3meH3K9 + 3meH4K20 + HP1βCromatina pericentrica paterna: meH3K9 + HP1β