Estrazione del DNA dal lievito di birra - Edizioni scolastiche · distruggendola e permettendo al...
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1 Estrazione del DNA dal lievito di birra MATERIALE OCCORRENTE: • cucchiaio da laboratorio; • beuta da 100 ml; • spatola; • spruzzetta. REATTIVI: • lievito di birra; • detersivo liquido; • un kiwi; • alcol etilico (etanolo); • cloruro di sodio. PERICOLI: • L’alcol è una sostanza infiammabile e pertanto bisogna tenerlo lontano dalle fiamme. PRINCIPIO La cellula del lievito è una cellula eucariota ed ha una membrana plasmatica, composta in larga parte da fosfolipidi. Il DNA del lievito è contenuto nel nucleo composto da fo- sfolipidi. Per estrarre il DNA occorre rompere le due membrane. Allo scopo si impiega il detergente. Quando esso viene a contatto della membrana fosfolipidica la destabilizza distruggendola e permettendo al DNA di fuoriuscire. Il DNA fuoriuscito è unito alle proteine istoniche. Per liberare il DNA dalle proteine istoniche si impiega un enzima proteolitico che le idrolizza. Infine per far raccogliere i cristalli del DNA si impiega l’etanolo che riduce la solubilità del DNA. Nell’esperimento verrà estratto il DNA dalle cellule eucariote del lievito di birra Saccharomyces cerevisiae. L’estrazione avverrà in due fasi: nella prima si avrà la lisi (rottura) delle cellule per mezzo dell’utilizzo di un detergente per i piatti. Inoltre il detersivo elimina una parte di materiale proteico legato al DNA. Si utilizza poi un enzima proteolitico, che catalizza l’idrolisi dei peptidi. Allo scopo si utilizza del succo di kiwi. Si estrae infine il DNA utilizzando etanolo freddo. METODICA Si preleva un cucchiaio di lievito e lo si ripone nella beuta. Successivamente si aggiun- gono circa 50 millilitri di acqua distillata. Si agita lentamente, per evitare la formazio- ne di schiuma, ottenendo così una sospensione. A questo punto si aggiunge una punta di spatola di cloruro di sodio che neutralizza le cariche negative dei gruppi fosforici del DNA. Il sale serve inoltre ad assorbire, per coordinazione, l’acqua che circonda la doppia elica del DNA. Si aggiunge poi un cucchiaio di detergente liquido per piatti e si agita lentamente per evitare la formazione di schiuma. Successivamente si aggiungo- no 20 millilitri di succo di kiwi che contiene l’enzima proteolitico e lo si lascia reagire per 30 minuti. L’ultima fase dell’esperienza prevede l’aggiunta di alcol etilico freddo alla temperatura di 4°C (la temperatura dei comuni frigoriferi). Quando si aggiun- ge l’alcol bisogna avere l’accortezza di eseguire l’azione molto lentamente in modo da farlo stratificare sul liquido acquoso. Per ottenere questo risultato è consigliabile operare con un contagocce e inclinare la beuta durante l’operazione. Dopo qualche minuto nella fase alcolica si osserverà la presenza di cristalli fioccosi bianchi formati da agglomerati di DNA.
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Estrazione del DNA dal lievito di birra
Materiale occorrente:• cucchiaiodalaboratorio;• beutada100ml;• spatola;• spruzzetta.
reattivi:• lievitodibirra;• detersivoliquido;• unkiwi;• alcoletilico(etanolo);• clorurodisodio.
Pericoli:• L’alcolèunasostanzainfiammabileepertantobisognatenerlolontanodallefiamme.
PrinciPioLacelluladellievitoèunacellulaeucariotaedhaunamembranaplasmatica,compostainlargapartedafosfolipidi.IlDNAdellievitoècontenutonelnucleocompostodafo-sfolipidi.PerestrarreilDNAoccorrerompereleduemembrane.Alloscoposiimpiegaildetergente.QuandoessovieneacontattodellamembranafosfolipidicaladestabilizzadistruggendolaepermettendoalDNAdi fuoriuscire. IlDNAfuoriuscitoèunitoalleproteineistoniche.PerliberareilDNAdalleproteineistonichesiimpiegaunenzimaproteolitico che le idrolizza. Infineper far raccogliere i cristalli delDNAsi impiegal’etanolocheriducelasolubilitàdelDNA.Nell’esperimentoverràestrattoilDNAdallecelluleeucariotedellievitodibirraSaccharomycescerevisiae.L’estrazioneavverràinduefasi:nellaprimasiavràlalisi(rottura)dellecellulepermezzodell’utilizzodiundetergenteperipiatti.InoltreildetersivoeliminaunapartedimaterialeproteicolegatoalDNA.Siutilizzapoiunenzimaproteolitico,checatalizzal’idrolisideipeptidi.Alloscoposiutilizzadelsuccodikiwi.SiestraeinfineilDNAutilizzandoetanolofreddo.
MetodicaSiprelevauncucchiaiodilievitoelosiriponenellabeuta.Successivamentesiaggiun-gonocirca50millilitridiacquadistillata.Siagitalentamente,perevitarelaformazio-nedischiuma,ottenendocosìunasospensione.AquestopuntosiaggiungeunapuntadispatoladiclorurodisodiocheneutralizzalecarichenegativedeigruppifosforicidelDNA.Ilsaleserveinoltreadassorbire,percoordinazione,l’acquachecircondaladoppiaelicadelDNA.Siaggiungepoiuncucchiaiodidetergenteliquidoperpiattiesiagitalentamenteperevitarelaformazionedischiuma.Successivamentesiaggiungo-no20millilitridisuccodikiwichecontienel’enzimaproteoliticoelosilasciareagireper30minuti.L’ultimafasedell’esperienzaprevedel’aggiuntadialcoletilicofreddoalla temperaturadi4°C(la temperaturadeicomuni frigoriferi).Quandosiaggiun-ge l’alcolbisognaavere l’accortezzadieseguire l’azionemolto lentamente inmododafarlostratificaresulliquidoacquoso.Perottenerequestorisultatoèconsigliabileoperareconuncontagocceeinclinarelabeutadurantel’operazione.DopoqualcheminutonellafasealcolicasiosserveràlapresenzadicristallifioccosibianchiformatidaagglomeratidiDNA.
