Antonella Ronchi, GENETICA II per Sc. Biologiche aa. 2008-2009Modalità di esame: orale

Testi utilizzati

alberts

orario

• Martedi’: 8.30 -10.30 U3-04• Mercoledi’: 10.30 -12.30 U3-01• Venerdi’: 8.30 -10.30 U3-05

Programma:*come si studia un gene: come si definisce la struttura di un gene

come si studiano le sequenze regolative di un genecome si studia la funzione di un gene

* micro RNA: struttura e funzione * elementi trasponibili: struttura e funzione*mutazione e riparazione del DNA: principi di base* retrovirus *genetica dei tumori*genetica dello sviluppo in drosophila*genetica delle immunoglobuline

che cosa è un gene???

Come si isola un gene e se ne definisce la struttura? (librerie, clonaggio)

Come si puo’ studiarne l’espressione (cellule, sviluppo)? (studio seq. regolative)

Come si puo’ studiarne la funzione? Overespressione / silenziamento

COSTRUZIONE DI UNA BANCA GENOMICA DI DNA :collezione di cloni contenenti almeno una copia di ogni sequenza contenuta nel genoma di un dato organismo

1) generazione frammenti di DNA-digestione enzimatica totale o parziale-rottura meccanica (sonicazione)

2) loro clonaggio in vettori appropriati (plasmidi, fagi, cosmidi, yac)3) amplificazione in organismi ospiti (batteri, lieviti)

4) identificazione dell’inserto di interesse (screening della libreria)5) caratterizzazione dell’inserto6) ricostruzione della struttura del gene7) studio funzionale

Si puo’ partire da: - DNA totale - singoli cromosomi di un organismo, linea cellulare..

Isolamento estudio genedi interesse

…..come si isola un gene…

CTTGTATATATTTTACATAAATACACATAGTGCATGCATATCTATAGAATAGATTCATATATTGATTGATATATGTAATGCCAAGTATTAGATATGTTTGGGCTCAATAAAAGATGACAATACTGGCTATTACATGGAGTAAGAATTGAAATGATTTTTTTTTGTTTTGTTTTGTTTTAGGGTCTCTCTATTTAGAATTGCTTGTCTTGTAACTCACTATGTAGACCAGGCTGTCCTCAGAAATCTGTCTGCCTCTGCCTCCTAAGTGCTAGATCTAGAATGTTTTAATGTTGTGCGTGTTTAACTGCCTGTGAGGTATATATGCCACAGAGCCATAGATCCCTATCCATTCTAGCGTTCATTTGAACTCACTTTAACAGTTCCTTTGTGCGGTTCTAACATATTTGTGATGGGCTGGCTTTGAAAACTTTCTCGCCCTATCTCCACACCCAGTACCTCAATCATAATTGAACTCATAGTTTACTTTCTTGAGATCTTAAGGGCAGCCTAATGTTTGTCACCAAAATATGCGGACTATAGCTATAATCTGAAAACCCCTTTTTTCTTTGGCAGAGAACATTGTAAAAGGCAAGGAAAAATAAGCTTAAAATTAAAAACTTTGCTTTGGTTAAAATAAACTCTATGGGCATGCATATGACTGGTGCACTAATAGCTTAGGGAAGTCAGAGTCTCAAAGGAAATATTATTAACGTGAGAAGGTGTTTTATTGATTAAAGGAGATTTTTCCTCTCGCAAACACTCATGGAGATAGTGTTCCTATTACTTCTCTCTCGGTGTTGGCTTTTACACAGAAGTTCATTAACATGTGGATATGTGGTGATTGAAGTCAGACCGCTTTTCACAGTGGAGCTGTCTTGATATAATGAGCTCCTCTTTAATGTTCAAAAATTGTTGTTACTTTCTAAAAGGGGTTGTTTGTGAATTTCATTAAATTTAATCTCCTCTT

genoma umano 3x 109 bp

TIPI DI LIBRERIALibreria genomica: tutto il DNA (seq. codificanti, non codificanti, promotori, introni, seq intergeniche).

Libreria cDNA: sequenze codificanti (si parte dall’mRNA)Dato che tipi cellulari diversi esprimono geni diversi, la composizione della libreria di cDNA riflette la diversa abbondanza dei trascritti nei tessuti di partenza

Banche di cDNA: -clonaggio-espressione

Banche da tessuti diversi e/o a stadi di sviluppo diversi contengono cloni diversi e/o in proporzioni diverse

3 metodi di preparazione:1. Digestione completa (tutti i siti di restrizione

per un dato enzima)*Produce un gran numero di piccoli frammenti diDNA.*Geni contenenti due o più siti di restrizione per l’enzima utilizzato possono esserespezzati e clonati in due o più pezzi

Si usano enzimi che riconoscono siti poco frequenti nel genoma2 Digestione parziale

*Si usano enzimi che tagliano poco frequentementee si riduce il tempo di digestioneinsieme di lunghi frammenti sovrapponibili

3 Rottura meccanica*Si possono produrre frammenti di DNA più lunghi*Le estremità non sono uniformi, e occorre una modificazione enzimaticaper poter inserire i frammenti generati in un vettore di clonaggio

LIBRERIE GENOMICHE

-Isolare DNA da un organismo (estrazione di DNA)

-Tagliare DNA per ottenere frammenti della misura desiderata-con enzimi di restrizione-rottura fisica

-Inserire i pezzi di DNA in un vettore di clonaggio(che ne permette la replicazione in un organismo ospite (ex. Batteri)

Come si costruisce una libreria?

Enzimi di restrizione: endonucleasi batteriche che riconoscono specifiche sequenzechiamate “siti di restrizione” e tagliano il DNA idrolizzando il legame fosfodiesterico.

La nomencaltura tipicamente inizia con 3 lettere corsive tratte dal nome del batterio.EcoRI E. coli RY13HindIII Haemophilus influenzae RdBamHI Bacillus amyloliquefaciens H

..per tagliare un DNA:

Molti siti di restrizione sono palindromi di 4-, 6-, o 8-coppie di basi.Maggiore è la lunghezza del sito riconosciuto dall’enzima di restrizione, minore è la probabilità di trovare nel genoma siti riconosciuti da quell’enzima

Alcuni enzimi generano estremità piatte,altri generano estremità coesive

Estremità di DNA ottenute dal taglio possono essere riligate (se compatibili)utilizzando l’enzima “DNA Ligasi”

molecola di DNA ricombinante

-Plasmidi-Fago λ-Cosmidi-Yeast artificial chromosomes (YACs)-Bacterial artificial chromosomes (BACs)

- molecole piccole e di sequenza nota- replicazione indipendente dalla cellula ospite- marcatori che permettano il riconoscimento della cellula trasformata

(p.es. resistenza a antibiotici)- presenti in più copie per cellula: * alto numero di copie

* basso numero di copie

Vettori di Clonaggio

Differenza sostanziale:LUNGHEZZA DELL’ INSERTOCHE POSSONO OSPITARE

Vettori PLASMIDICI trasformazione in batteriORIGINE DI REPLICAZIONEper moltiplicazione nei batteri

MARCATORE DI SELEZIONE(resistenza antibiotico)

SITO DI CLONAGGIOmultiplo -MCS-

SELEZIONE COLORE:- se non c’è inserto, il gene intatto LacZ è in grado di metabolizzareUn substrato COLONIE BLU-Se c’è INSERTO, il gene LacZ è interrotto colonie bianche

senza inserto

con inserti diversi

con inserti diversi

Fago lambda virus batteriofago che puo’ dare :-ciclo litico (infezione e lisi della cellula batterica con rilascio di nuove particelle fagiche)-ciclo lisogenico (integrazione nel genoma del fago nel DNA della cellula ospite)

I geni che controllano il ciclo lisogenicopossono essere rimossi (non essenziali) esostituiti con l’inserto di interesse

lambda puo’ essere utilizzato come vettore

Dimensione media dell’inserto clonabile=lunghezza della regione genica rimossa =

15kb circaciclo lisogenico ciclo litico

Estremità laterali: sequenze “COS” riconosciute dalsistema di impaccamento nel capside

Inserti molto maggiori o inferiori di 15kbnon si clonano perché il sistema di impaccamentonel capside riconosce solo molecole lunghe piu’o meno come il DNA di lambda wt

placche di lisi

1. Caratteristiche congiunte di plasmidi e fagi

2. Non presente in natura

3. Sequenza origine (ori) per E. coli.

4. Marcatore selezionabile, e.g. ampR.

5. Siti di restrizione per clonggio.

6. Siti COS del fago λ per permetterel’impacchettamento nei capsidi fagicidi λ e quindi l’infezione di E. coli

Cosmidi

Permettono il clonaggio di inserti di 37-52 kb

caratteristiche:1. Telomeri di lievito alle estremità.2. Sequenza centromerica del lievito (cen)3. Marcatore selezionabile (dipendenza aminoacidica,

URA, TRP,etc.) su entrambe le braccia.4. Sequenza di replicazione autonoma (ARS) 5. Siti di restrizione (per il clonaggio del DNA).6. Trasformazione nel lievito e crescita in terreno

selettivo

YAC Cromosomi artificiali del lievito (Yeast Artificial Chromosomes):

INSERTI molto grandi, fino a 500 kb.

1. Sequenza origine (ori) derivata dal plasmide “fattore F” di E. coli

2. Multipli siti di clonazione (siti di restrizione).3. Marcatori selezionabili4. Propagazione in batteri

BAC Cromosomiartificiali batterici(Bacterial Artificial Chromosomes):

INSERTI FINO a 350 kb

Numero di cloni richiesti per avere una libreria rappresentativa di tutto il genoma umano a seconda dei vettori di clonaggio

Per avere il 99% di probabilità di avere tutto il genoma rappresentato: 820.000 cloni

una volta costruita la libreria genomica nel vettore scelto,come si fa a recuperare il clone (i cloni) corrispondenti al gene di interesse?

come si analizza la libreria?

screening library

Isolamento di cloni portantil’inserto di interesse

Screening della libreriagenomica

IbridazionePresuppone la conoscenza di una sequenza nella regione di interesse, che viene utilizzata come PROBE

probe marcata radioattivamenteo rilevabile per chemiluminescenza

II lezione

1. I vettori plasmidici contenenti il DNA genomico digerito sono trasformati in E. coli e piastrati in terreno selettivo (e.g., ampicillina).

2. Le colonie cresciute sono replicate su una membrana (E. coli continua a cresceresu membrana).

3. I batteri sono lisati e il DNA è denaturato4. Il DNA legato alla membrana è poi ibridato con un DNA complementare (e.g., DNA

marcato con 32P).5. Le sonde in eccesso non ibridate sono lavate via dal filtro. 6. L’ibridazione delle sonde è rilevata attraverso esposizione su pellicola

autoradiografica (o attraverso rilevazione per chemioluminescenza).7. I cloni positivi vengono riamplificati dalla piasta “copia” per le analisi successive

Screening di una biblioteca genomica (ex plasmidica)

Il cDNA è derivato da mRNA, quindila libreria di cDNA riflette l’attivitàgenica al momento in cui sono isolatigli mRNA Varia: -da tessuto a tessuto-a secondo del momento nello sviluppo

1. Isolamento di mRNA2. Sintesi di cDNA3. Clonaggio di cDNA in vettori

LIBRERIE DI cDNA

Isolamento RNA

trascrittasi inversaRNAsi H, DNA polimerasi, DNA ligasi

attacco di “linker” per poter ligarei cDNA in vettori

Costruzione di una libreria di espressione

*promotore: forte, inducibile*segnali terminazione

Marcatore di selezione per cellule mammifero(resistenza ad antibiotici: neomicina, puromicinaigromicina)

In aggiunta alle sequenze per il mantenimento/Propagazione in batteri in cui la libreria viene Mantenuta e amplificata

“cassetta di espressione”:

A) -ibridazione acidi nucleici(come per libreria genomica)

B)-screening immunologico

per clonare geni da proteine note(purificate, e contro le quali siadisponibile un anticorpo)

Screening di una libreria diespressione (cDNA):

caratterizzazione dell’insertoricostruzione della struttura del gene

studio funzionale

Isolamento e studio gene di interesse

costruzione libreria: *generazione frammenti di DNA *clonaggio in vettori appropriati*identificazione dell’inserto di interesse

Chromosome walking

Probe A

Probe a

Probe b

Allineamento cloni sovrapposti ricostruzione regione

Ricostruzione della sequenza di una regione di DNA

Analisi dei cloni positivi

-Analisi di restrizione

-Southern blot

-Amplificazione (PCR)

Southern blot:

*Sul DNA cellulare*Sul DNA dei cloni

In che banda si trova il DNAChe ibrida con la probe???

ritaglio

clono

Cicli ripetuti di:Denaturazione del DNA a 94˚C.Annealing dei primers alle sequenzecomplementari fiancheggianti laregione bersaglio.Estensione dei primers a 72˚Cutilizzando una DNA polimerasiresistente al calore Taq polimerasi( derivata da Thermus aquaticus).

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

SEQUENZIAMENTO INSERTI• Il sequenziamento automatico utilizza didesossiNTPs (incorporati, non permettono l’allungamento

della catena) marcati con coloranti fluorescenti.• Combina 4 ddNTPs colorati in una provetta di reazione e l’elettroforesi avviene in una

corsia unica, o in un capillare contenente poliacrilamide.• Laser UV individua i coloranti e legge la sequenza.

• cromatogrammi:che corrispondono allaposizione di ciascunnucleotide nella sequenza.

fantoni, tripodi..Genetica PICCIN

Sviluppo e integrazione di:- mappatura genetica (linkage analysis): localizzazione di un gene su un cromosoma,

relativamente ad altri geni, usando incroci e genealogie.- sequenziamento- approccio bioinformatico per analizzare il genoma degli organismi

1. Genomica strutturale – genetica e mappaggio fisico dei genomi.

2. Genomica funzionale – analisi delle funzioni geniche (annotazione del genoma).

3. Genomica comparativa – confronto dei genomi di diverse specie, storia evolutivadei genomi. Genomica evoluzionistica

4. Genomica medica- polimorfismi, geni malattia, variabilità genetica, farmacogenomica etc

GENOMICA: SEQUENZIAMENTO ED ANALISI DI INTERI GENOMI

Obiettivo primario: sequenziamento del genoma2 metodologie:

1. Mappatura e sequenza: divisione del genoma in cromosomi segmenti adiacentisovrapposti lungo il cromosoma ricostruzione della mappa della regione e sequenziamento.

-lento ma abbastanza accurato-consorzio pubblico

2. “Shotgun ” e sequenza: rottura casuale del genoma in frammenti sovrapponibili, sequenza e riassemblaggio al computer

-piu’ veloce ma impreciso (problema sequenza ripetute, che si trovano in tuttoil genoma)-Celera corporation

PROGETTO SEQUENZAMENTO GENOMA UMANO

1. Mappatura e sequenza: divisione del genoma in segmenti, raffinamento della mappa, e sequenziamento.

Rottura meccanica dei cloni BAC in frammento sovrapponibili di ~2 kb .Isolati in agarosio, purificati, e clonatiin vettori plasmidici standard.Sequenziati ~500 bp da ciascun latodell’inserto di 2 kb

Si ripete il processo fino a sequenziare6.5-8.0 volte la lunghezza totale del genoma

Si assemblano centinaia di migliaia di sequenze sovrapposte di ~500 bp con computers che lavorano in parallelo.

“Shotgun” e sequenza: rottura casuale del genoma in frammenti sovrapponibilisequenza e riassemblaggio al computer

progetto genoma movie

� 32,000 geni stimati (erano stati previsti50,000-100,000).

� Solo 50% in più rispetto a C. elegans (nematode).� Solo 1-1.5% del genoma codifica proteine.� 50% è costituito da DNA ripetitivo.� >95% del genoma è in comune con lo scimpanzè

Caratteristiche del genoma umano

Lewin Il gene Zanichelli

ANIMAZIONEhttp://www.genome.gov/25019879

19.000 pseudogenes

human genome project: http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtmlPUB MED

ATACAGAGTTTAAGTATATAATATAGACTTTAAAATTTCATGGATATATTCCATATCGAAATGTTCAATGATAGAAAATATAAGGAAAAGATATTTGGTAGCCAAAAGACAGATTAATTTAGGACATGAAATCTTCTGTCTTTAGGAAATATGCTTTATTTTCATAGGCTTTTTCTGTTCCAATAATTGAGCCATTAATGTCAACAGAGACTCCCTGGCAGTGATATAGTATGAAGGCATTTGCAGTAATGCAGTGGCACTTCTTTCTAAATCAGAGACTCTGTTGAAGTAATCACTAAAAATATTAAAATTCTGTTCTAGTTGTTCTGAATTTATAATGTGAAAGTGACTGCACCCATCTTTCAAGAACATAAAGAGCATCCATAATTTAATAATTAAGTAACACATAATAACCAATAATTTTTGTTACCTATAAATAGGCCTGTGTAACAAGAGTAAGGAATACTAAAAGAAGTAGCTGATTGTTAATAAAAACTTTTTTTTCAGAATGTGCTCATTTAAAGCATTTTATAACCTTTATTAAATTGCCATCTTACTATGCAATTAGAATGCATTGTCATTTTTCTTTCTTTAAAACATTTGCACTTTATCCTTTTCTAAGCTGGTAGAAGTTGGACTCTCACTGCGTTTCTTTTGCTTTTTAAACTTGTATTGGAGTGATGTAGAACTAGGCCTTATCACTGCATAGAAAATTAATTTAAATGACATATTGTTGCAGTTTCTATGACAACCATATCATGATGCTCATGTTCTTAAAAATTTATAAACTATAATCTGAAGTATGCTAATTCTAGTGAGTGTAGGCAACAGTCATTTGCTTAATATTCATTTTGCTACTGCGCTCATCAGCTTTGAGAGTCAGATGGTTAACATTCTGCATTCAATCCGAAGAGGTTTATATGAACTCTTGGGTTTATGCATTTTCCTCAGAAGCTACAGTTACTGAACTTTTAAGCATGTATAAGAGAACCTTTCGCTGCCTGTTTTCTTGAAGCAATAGGAATGAATACGGGCGTGAACACATGCTGCTGACTTTCAACATGGCTGCTTTTCTCTCCACCCCTACTGGAAAGACAATATCCTCAAACTAATGTAAAAAAAAAACTAATAAAAACAAAAATTCAATAACATCCAATGATCTACTTAAGCAACAGTGACTATTCAAATCCTTGGGAACACTGGCTTATTCCTTCAACTTTAGTTGTTTGAGTTCAAGAAGCTCATATCGCTATTGTATGGTTATGATGTATGATAATGACATGTATCATCAGTTTAAGGATATTTGCCTAGCACTGATATTAAACATTTTGATTTGAAATACAGGTTGAATTTTTTTTAGGACTGATTCAAAAATAAAATATGCTATTTAGTCTATGGCTTATAACCATGGACTCTCTTGTTAAATAAAGATGCTTTTAGATATACCACTTGAAAAATTAGAAATGTATAATTAAAAAAATTTATTTTAGAAATGTATATAATTTGTTGGTTGATAAAAATTAGGTAATTTAATTTAAACAATATATAATGAATAAGATAATTTAACATCAGGTGGAATTATCAAACACCATTTTTGCTAATATATTTTATAAAAGTCATTTTTAATTCGTGTTCATTGAATTATAAAAATGCAAAACATAAATCCTTGGTTAACATGCTTTTAATTATTTTCTTTTCACATGTTAGGCTCTCGGTGAATGCAACAGAAATCCTATACTTAGACATTTTAAAAAGCAATCTGTAGTTTCAAAAGAGAGATTGTTAAGAAACACATTTTAAAATTATAGGACACCAAATTCAGTTTTAAAAACACAATGCATAAAACATAAAATTCTAAAGCAACTAATCAAACTTCTGAAGAAGGACAATGTCAGTAAGCTGCTTTGCTGGCAGCAACTGGTGAGCGGACCCTTGTCTGTCTTTTATGAGGCAATTACAACAGGTGTCATATTGATTTGCCTACTGTTTCCTGTGTAGCTCGAGTGTATCCTAAATGGAATGACAGTCATCGTAGCGAGTGGTAAACTTCTGGTCTGGAAGGAAGGTTTAGTCAGTCAGTCAGCACCTATGAGGCAGTGTGACAGTGGGCCACGGTGCAAAGGCAACTCAGTATCACACTCACTGAGAGGGGGTACTGGGGAGTTTTAGTGAGGGAGTTTACTGCTGTGTTTGAAACATAACTTTTCATTGTATCCCCCCACCCTGTGTGTTAAATTTGTAAATTGTCCAGATCACTTTTATTTTGGTTAAAAAAAACCCCAAATTCCATATAGGCTTTTCAAAGGAGCATTTGGATGTGTGATAAGCCTTTCTATTTCCTGTGACTGTTTGCCTGGCATTAGCTTCAGTGGCATCCAGTGGTAAAGCAGCTGTAATCCTGACTTGTTCTTTCATGGAGCAGTTCAAACAGGTTAGCTTGATGATTTTAAAGCACGGTTGGTTTATATGGGGCTTGGAGCGGTGGTAGGGGTTACAGTGGTTTCCAACCAGATCCTTGTATTTTTGATGGCGTAATTTCATTACATTTTCCTATTTATTTTCTATTTATAGTAATGTGAAGTATGCCCATTGAATAATGTCAGCTTAATATTGCAAGGATTTTTGTTTAAAAATTATGGAATTGGTCTCTACACATTCAATGTATTTTCCAGTTCTTTGATATTTCTACCTAAGCTTGGTTTCTGCCAGTTATGTTGGCTCTAGTGTTTGCCCGTCTCATTTAAGATAAAATGAATGGCCAGTATTATGTATAGTAAAGCCAAGCTTCCTTTGAGTTAAGGCTTTGGAGCATTGTGCAAGCCTAATGTTCTTCCATGAAGTTGGCCCACCCCACTGTGACTAAGAAATGAGATGATTTGAGGGCTATTACATACTTACGATTTTCATAGTGGATTAGAATAACATTACTTAG

???

genetica + matematica/computerApplicazioni:1. Identifica geni entro la sequenza completa del DNA.2. Allinea e confronta sequenze geniche in un database per

determinare la funzione.3. Predice struttura e funzioni dei prodotti genici.4. Descrive interazioni tra geni e prodotti genici.5. Stima relazioni filogenetiche e di popolazioni

Bioinformatica

Ricerca “open reading frames” (ORFs)piu’ lunghe possibili all’interno della sequenza.

ORF = sequenza potenzialmentecodificante che inizia con un codone di start (ATG) e finisce con un codone di terminazione.

6 possibili frames, 3 per ogni strand

Efficace per procarioti: NON ci sono introni

PROCARIOTI

EUCARIOTI……molto piu’ complesso per eucarioti: ci sono introni!

ANALISI INFORMATICA-Conservazione in SPECIE DIVERSE

-Algoritmi di ricerca segnali specifici:- segnali di splicing, giunzioni esoni/introni- isole CpG (promotori e 5’ geni)-promoter prediction (tata box, CCAAT, CACC)-segnali terminazione

ANALISI SPERIMENTALE-Ibridazione con RNA: NORTHERN BLOT-Conservazione in SPECIE DIVERSE: ZOOBLOT(le sequenze codificanti sono preferenzialmente conservate)

allineamento genomispecie diverse

per poter ricostruire la struttura ESONI - INTRONIdi un gene, il sito di inizio e fine della trascizione

devo ricorrere all’ mRNA e confrontarlo con la strutturadel DNA

Primer extension: mappaggio del 5’ del gene

5’ 5’

regolazione

strutturaevoluzione

Nuovi geni relati

funz

ione

utilizzo

GENOMA

OK!

VISTA ENHANCER BROWSERThe goal of this project is to identify distant-acting transcriptional enhancersin the human genome by coupling the identification of evolutionary conservednoncoding sequences with a moderate throughput mouse transgenesis enhancer assay.

http://enhancer.lbl.gov/

esoni

identificazione sequenze regolative sulla base della loro conservazione in specie diverse

http://genome.ucsc.edu

utr

http://enhancer.lbl.gov/

LacZPromotore

enhancer reporter

expression

chr1:63,155,555-63,156,905

chr1:63,176,303-63,177,738

chr1:63,081,370-63,082,915

chr1:63,377,240-63,378,143

APG4C-FOXD3

location gene

esprimono

STUDIO SEQUENZE REGOLATIVE

Ricerca sequenze conservate in organismi diversi all’esterno delle sequenze codificanti:

seq. regolative conservate

Ex: blocco conservato uomo/pollo

blocchi conservati: siti di legamePer fattori trascrizionali

rVISTA

RICERCA DI SITI CONSENSUS PER FATTORI TRASCRIZIONALI

http://www.biobase-international.com/pages/guided_tours/transfac

Test di ipersensibilità alla DNAsiI : le regioni regolative sono piu’ accessibili al taglio daparte dell’enzima DNAsiI (o altre nucleasi)

*identificazione regioni regolative*identificazioni regioni regolative tessuto specifiche: legate da fattori trascrizionali“aperte” solo nei tipi cellulari dove il gene è espresso

accessibile

Gel shift: legame in vitro DNA marcato-proteina*Legame DNA/proteina* specificità proteina * identità proteina (uso anticorpi specifici)*modalità legame

Outline of chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay. Protein:DNA crosslinks are formed withformaldehyde followed by chromatin fragmentation by sonication. The DNA:protein complexes are immunoprecipitated with antibodies specific for the protein of interest and Protein A agarose beads. The crosslinks are reversed and the DNA is isolated for analysis.

Immunoprecipitazione della cromatina ChIP:*legame in vivo di un fattore trascrizionale ad una sequenza*modificazioni istoniche struttura cromatina*identificazione nuovi target di un fattore trascrizionale

Lega la sequenza di interesse??(PCR)

*Ibridazione su vetrini con probes per migliaia di sequenze(ChIP on Chips)*clonaggio e sequenziamentoframmenti recuperati

Nuove Sequenzetarget

TRANSFEZIONE: introduzione nella cellula di costrutti di DNA *transiente (costrutti non integrati)*stabile (costrutti integrati nel genoma)

(Calcio fosfato, elettroporazione, lipidi cationici)DOMANDE*La sequenza che ho identificato è effettivamente in grado di attivare/reprimere la trascrizione? E’ un Promotore, un Enhancer, un silencer?* che cosa succede se muto dei siti specifici?*In quali tipi di cellula funziona questo elemento?(ha effetto tessuto specifico o ubiquitario?)*quale proteina è in grado di legarlo? (ex cotransfezione con vettori di espressione per diversi membri di una famiglia di fattori trascrizionali che legano la stessasequenza ex: GATA1, GATA2, GATA3…)

Gene reporter: GFP, LacZ , CAT, Luc

Gene di cui posso misurare l’ attività saggi colorimetrici, enzimatici, fluorescenza

Sequenza regolativa da studiare

Vettore di espressione

Promotore forte,Inducibile, etc.

Wt mut. costrutti

Attiv

itàrep

orter

COTRANSFEZIONE CONVETTORE di espressione

EFFETTO MUTAZIONI

TF

TF

regolazioneOK!

strutturaOK!

evoluzione

Nuovi geni relati

funzione

utilizzo

GENOMA

IV lezione

regolazioneOK!

strutturaOK!

evoluzione

Nuovi geni relati

funzione

utilizzo

GENOMA

SILENZIAMENTO GENICO: RNA interference*sfrutta un meccanismo fisiologico identificato originariamente nelle piante e nei nematodi

*il meccanismo dell’ RNAi è presente in tutte le cellule degli organismi multicellularie si è probabilmente evoluto come meccanismo di difesa contro l’infezione di virus a RNA (dsRNA) doppio filamento*Le molecole dsRNA sono processate in corti RNA (siRNA) a singolo filamento dal complessoenzimatico citoplasmatico DICER, che vengono indirizzati al RNA-induced silencing complex(RISC). *RISC media il legame sequenza specifico del siRNA sulla sequenza complementare del mRNAbersaglio corrispondente, impedendone la traduzione attraverso 2 meccanismi

Blocco traduzione Degradazione RNASILENZIAMENTO DEL GENE

DICER

L'enzima appartiene alla famiglia delle RNasidi classe III (specifiche per i dsRNAs). Contiene una regione carica positivamenteche lega i dsRNA e li taglia

in modo ATP dipendente RISCguida l’appaiamento dell’RNAinterferente con il suo target

RNA ds viene legato dal complesso DICER

DICER taglia dsRNA in frammenti piu’ piccoli

l’RNA ss viene legato dal complesso RISCe si appaia all’mRNA complementare

l’mRNA viene *degradato* ne viene bloccata la traduzione

NON VIENE FATTA LA PROTEINA

Elbashir, S. M. et al.

Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature (2001). 2nt increase stability

easier synthesis

Immunostaining western blot

Scomparsa proteina

RNAi specifico RNai controllo -aspecifico-

(anticorpo contro lamina A/Crilevabile in fluorescenza)

(gel separazione proteine-trasferimento su filtro proteine-ibridazione con anticorpo specifico contro Lamina A/C

rilevabile in chemioluminescanza)

RNAi

specif

ico

RNAi

aspeci

fico

cellule nontrattate

promotori RNA pol.IIIsintesi di short hairpinRNA(shRNA) e siRNA in

vivo

: VETTORI PLASMIDICI

VETTORI RETROVIRALI MoMuLV or MSCVsilenziamento del provirus durante lo sviluppole cellule devono essere nel ciclo cellulare per poter essere infettate

VETTORI LENTIVIRALI HIV-1nessun silenziamento: Topi transgeniciinfettano cellule quiescenti (cellule staminali….)

COME si possono introdurre in cellula??Transfezione diretta o transfezione con vettori che li esprimono

Silenziamento specifico del mutante ras cheinduce tumore (con RNAi in vettore retrovirale)

Cellule interferite non sviluppano tumorein topo nude (immunosoppresso)

……RNAi come farmaci: specificità

……RNAi come farmaci

Silenziamento apoB > riduzione livelli colesteroloin modello murino

…postgenomica: RNAi library: libreria di RNAi fenotipo gene silenziato

funzione del gene

analisi sistematica per perdita di funzione di geni

..in organismi diversi

Tecnologia RNAi: * strumento per il silenziamento genico*meccanismo endogeno cellulare

miR (micro RNA): * codificati dal genoma* derivano da intermedi a doppio filamento che vengono poi processati* ruolo fondamentale nella regolazione genica:

alcuni sono evolutivamente conservatialcuni sono tessuto-sviluppo specifici

RNAi: prodotti primariamente extracellularmente da virus (sia a Dna sia a RNA).Nel regno vegetale come difesa antivirale

microRNA: prodotti quasi esclusivamente per via endogena, tipici regno animale. Ruolodi regolazione genica, rappresentano circa 1-2% RNA totale e regolano circa 30% dei geni

meccanismo molecolare simile

miRNA

STUDIO DEL CONTROLLO DELLO SVILUPPO DEL NEMATODE C. elegans:

LIN4 reprime LIN14la scomparsa della Proteina LIN14 segna latransizione fra le fasi di sviluppo larvale L1 e L2

959 cellule

2 loci identificati geneticamente come importanti per il controllo dello sviluppo larvale

*LIN4 reprime LIN 14, che codifica per una proteina nucleare

*LIN 4 non codifica per una proteina ma solo per un RNA complementare al 3’UTR di LIN14

*LIN4 codifica per un RNA di 63nt *poi processato 22 mer*22mer si appaia con RNA di LIN14

NO proteina LIN14

Leve

ls

L1 L2 L3 L4

lin-14 protein

lin-4 micRNA

Lin-14 RNA, non viene piu’ tradottoCon la comparsa di LIN-4

Stadi dello sviluppo larvale di C.Elegans

Transizione fra fasi larvali successive L1 e L2determinato dalla scomparsa della Proteina lin14: lin14 serve per specificare la fase L1, deve poi essere eliminata per passare a L2

Leve

lsL1 L2 L3 L4

lin-14 proteinlin-4 micRNA

perdita funzione LIN 14: ridotta L1:sviluppo precoce di una larva tardiva con poche celluleacquisto funzione (troppo) LIN14: L1 estesa:non c’è passaggio alla fase tardiva

precoce

tardiva

LIN-14 and LIN-28 expression levels are decreased by lin-4 RNA expression at the end of the first larval stage to allow progression to late larval stages. In late larval stages, the expression of LIN-41 and other genes may besimilarly downregulated by the let-7 RNA, relieving their repression of LIN-29 protein expression and allowingprogression to the adult stage. Because the lin-29 mRNA does not contain sites complementary to the let-7 RNA, lin-29 is not likely to be a direct target of let-7.

*Lin4 reprime lin 14 e lin 28

Progressione late stages

*Let7 reprime lin41

Progressione adult stage

NB: un singolo miR puo’ regolare contemporaneamentepiu’ geni (nell’esempio, LIN4 reprime LIN14 e LIN28)

PASSO SUCCESSIVO: I MiR SONO CONSERVATI IN ALTRI ORGANISMI??*nematodi*insetti*piante*mammiferi

OMOLOGIA per identificare nuovi miR e miR target in organismi diversi

PREDIZIONE DI GENI TARGET del silenziamento

STUDI FUNZIONALI (overespressione/silenziamento)

miRNAs sono coinvolti in numerosi processi cellulari, inclusi sviluppo, differenziamento, proliferazione, apoptosi e risposta a stress ambientali.

Ricerca:

ESEMPIO: il genoma di topo codifica per 11 membri della famiglia di LET-7 (OMOLOGIA)DOVE SONO ESPRESSI? Mansfield et al. Nature Genetics, 2004

MicroRNA-responsive 'sensor' transgenes uncover Hox-like and otherdevelopmentally regulated patterns of vertebrate microRNA expression

a: gene reporter LacZ (sotto il controllo di un promotore ubiquitario) contenente una sequenzatarget del miR di interesse nel 3’UTR. Dove il miR non è espresso colore blu.b: nelle cellule in cui è espresso il miR complementare alla sequenza target, l’mRNA di LacZ viene degradato non ho colore blu

sequenze target

miR

gal on blu

gal off bianco

Dove miR è espresso,

LacZ è silenziato

Zona chiara

abbozzi degli arti

Geni HOX:Molto conservati evolutivamenteFondamentali per *lo sviluppo assi corporei

*definizione identità cellulare

Regione target molto conservata

evolutivamenemiR regolano processi di sviluppoe differenziamento

I microRNA sono coinvolti nellaregolazione dei geni Hox

Ogni cellula ha un suo repertorio di miR: sistema flessibile DI REGOLAZIONE DI RNA esistenti*on/off di un target*regolazione fine di un target*un miR puo’ controllare piu’ geni contemporaneamente

Importante meccanismo regolazioneProcessi sviluppodifferenziamento

precursoremieloide

precursorelinfoide

NF1A deve essere spento perché ci sia differenziamentomieloide (sia granulocitario, sia momo/macrofagico)

modello di zebrefish-l’abolizione di miR451 (miR451-MO) riducefortemente la maturazione eritroide

riduzione espressione globine

miR TESSUTO SPECIFICO REGOLATO DA GATA1

abolizione GATA1abolizione miR451

*miR specifici contribuiscono al mantenimento dellostato indifferenziato della cellula staminale

*Altri sono espressi in modo differenziale in cells diversee la loro overespressione spinge la cellula a destinidifferenziativi diversi

The vertebrate HOX b cluster includes miR-10a and miR-196a genes. miR-196a reprime Hoxb8

C. elegans: formazione di tipi cellulari neuronali diversi,ASEL e ASER

*in molti tumori umani (leucemie, tumore gastrico, polmonare) c’è un pattern di espressionedi miR alterato.Tumori che originano da stesso tessuto, hanno lo stesso pattern di miR alterati(ex gastrici, liver, colon endoderma)

*13q31-32: regione amplificata in linfoma, codifica per miR (He, NATURE2005)

coopera con myc: tumori con minore latenza e maggior penetranza in topi trapiantati concellule che overesprimono myc (Eµ-myc) e la regione amplificatarispetto a cellule che overesprimono solo myc

*myc (oncogene) attiva E2F (progressione ciclo cellulare)(O’Donnel, Nature 2005) attiva miR che reprime traduzione E2F

controllo fine

MICRO RNA E TUMORI

E2F

miRmyc

E2FmRNA

http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2005.06.036

causano mutazioni genetiche complesse e danno un importante contributo all’evoluzionedel genoma (altra fonte di variabilità genetica oltre mutazione e ricombinazione)

*Mutazioni geniche (Inserimenti nei geni), mutazioni cromosomiche(riarrangiamenti, traslocazioni)

* modifiche nell’espressione genica (Inserimenti nelle sequenze regolatorie).* concorrono alla struttura di geni codificanti (4% geni umani contengono seq.

relate a trasposoni)significato evolutivo

Sono presenti nei genomi sia diPROCARIOTIdove si possono spostare dal/al cromosoma cellulare, plasmide, cromosoma fagico.EUCARIOTI (20% genoma in Drosophila, 10-20% nell’uomo)dove si possono spostare dallo/allo stesso cromosoma o a un cromosoma diverso.

Elementi Genetici Trasponibili (TGE): elementi genetici che hanno la capacità di cambiare posizione nel genoma attraverso meccanismi molecolari diversi

TRASPOSONI

STRUTTURA MOLECOLARE, molto varia:*DNA*altri simili a virus a RNA ma non fanno particelle→ non trasmessi orizzontalmente

IDENTIFICAZIONE:*Evidenze indirette: *TASSI DI MUTAZIONE MOLTO ELEVATI

*ALTE FREQUENZE DI REVERSIONEInstabilità genetica del mais (McClintock)Disgenesi degli ibridi in Drosophila

*Evidenze dirette: instabilità è riconducibile a sequenze di DNA che si spostanonel genoma

*Criteri molecolari: *duplicazioni di sequenze caratteristiche4 -15------------------4 -15

*presenti in punti diversi del genoma*presenti in punti diversi in individui diversi

Data la loro eterogeneità rimane un margine di incertezza nella loro identificazione

2 esempi:1. Elementi Sequenze di Inserzione (IS). Il più semplice tipo di elementi

trasponibili, in cromosomi batterici e plasmidi.

2. Transposoni (Tn). Simili a elementi IS ma di maggiore lunghezza, piùcomplessi strutturalmente e portano geni aggiuntivi.

per esempio geni di resistenza ad antibiotici, che attraverso plasmidi possono essere trasferiti da una specie all’altra

ELEMENTI TRASPONIBILI NEI PROCARIOTI

1. Diversi IS possono integrarsi in diversi punti specifici del cromosoma2. Vanno da 768 bp a 5 kb.3. Codificano solo geni per inserzione e excisione.4. IS1 il primo identificato in E.coli, è presente in 4-19 copie nel cromosoma. 5. Ai margini di tutti gli elementi IS conosciuti ci sono ripetizioni terminali invertite di 20-

40bp (ITRs).

SEQUENZE DI INSERZIONE (IS)

importanti per definire se c’è stato evento di trasposizione

• Trasportano geni (e.g., un gene per la resistenza agli antibiotici) fiancheggiati in entrambi i lati da elementi IS.

• Tn10 è di 9.3 kb e include 6.5 kb di DNA centrale (include un gene per la resistenza allatetraciclina) e 1.4 kb di elementi IS invertiti.

• Gli elementi IS forniscono transposasi e segnali di riconoscimento ITR.

TRASPOSONI (TN) COMPOSTI

L’integrazione di un elemento IS può:

*Interrompere una sequenza o una regione regolatoria.*Alterare l’espressione dei geni vicini.*Causare delezioni o inversioni nel DNA adiacente.*Provocare ricombinazioni ( ex. cromosomi/plasmidi)*Conferire nuove caratteristiche (ex. resistenza ad antibiotici)

INSTABILITA’ GENETICA NEL MAIS1938 Marcus Rhodes:incrociando linee pure di mais pigmentate si ottenegono pannocchie con cariossidi gialle oa macchie con proporzioni che spiegate in termini mendeliani implicherebbero

*alte frequenze di mutazione (A →a, colore → incolore; dt →Dt giallo →dotted)*alte frequenze di reversione (A →a; Dt →dt)

Il carattere dotted è fortemente instabile

Mc Clintockc/c = pannocchie gialle C/- = pannocchie viola

Il carattere del colore della pannocchia è “instabile”.

•Se avviene “reversione” in una cellula, questaprodurrà pigmento viola e conseguentemente unamacchia.

•Prima avviene la reversione nello sviluppo e più grandesarà la macchia.

•McClintock concluse che l’allele “c” è dovuto ad un transposone non autonomo chiamato “Ds” inserito nelgene “C” gene (Ds = disassociazione).

•transposone autonomo“Ac” controlla iltrasposone “Ds” (Ac = attivatore).

Pigmento (C=color)

quando AC (activator) promuovela transposizione di Ds (defettivo)in C → perdo colore

quando AC (activator) promuovela transposizione di Dsfuori da C → recupero colore nella progenie della cellula in cui è avvenutal’excisione

NB: Se, attraverso una serie di incroci viene perso AC, il carattere C si stabilizza

L’ elemento Ac è autonomo, mentre l’ elemento Ds è non autonomo (defettivo).Ac è 4,563 bp con 11 bp ITRs e 1 unità di trascrizione codificante una transposasidi 807 aminoacidi.Ac attiva Ds; Ds varia in lunghezza e in sequenza, ma ha gli stessi ITRs di Ac.

Molti elementi Ds sono versionidelete o riarrangiate di Ac:Ds derivano da Ac.Ac/Ds transpongono solo durantela replicazione del cromosoma

movie!march 2009

disgenesi: dovuta a elemento trasponobile P che si inserisce nei geni disattivandoli:-alto tasso di mutazione e reversione a carico di singoli geni-alto tasso riarrangiamenti cromosomici e aberrazioni cromosomiche

DISGENESI DEGLI IBRIDI IN DROSOPHILA 2 ceppi di Drosophila: linea Mlinea P

disgenesi

..speciazione

*perché la disgenesi si manifesta solo nell’incrocio femmina M x maschi P e non nel reciproco?

*perché le Drosophile P non muoiono a seguitoriarrangiamenti/mutazioni?

www.mun.ca/biology/scarr/P_element

Elemento P: transposone, porta:* gene transposasi, che permettetrasposizione (espresso nelle cellule germinali)*repressore trasposasi, che previenetrasposizione (espresso nelle cellule somatiche)

La presenza nel citoplasma della CELLULA UOVO del repressoreinibisce la trasposizione

Nell’uovo non c’è repressore: trasposizione e disgenesi

l’elemento P si comporta da “parassita”:* SI MUOVE SOLO IN GERM LINE (minimizzai danni per l’ospite, costituito dalla linea P)

Lewin, genes VIII

STOP

STRUTTURA MOLECOLARE, molto varia:*DNA*altri simili a virus a RNA MA non fanno particelle→ non trasmessi orizzontalmente

IDENTIFICAZIONE:*Evidenze indirette: *TASSI DI MUTAZIONE MOLTO ELEVATI

*ALTE FREQUENZE DI REVERSIONE

*Evidenze dirette: instabilità è riconducibile a sequenze di DNA che si spostanonel genoma

*Criteri molecolari: *duplicazioni di sequenze caratteristiche4 -15------------------4 -15

*presenti in punti diversi del genoma*presenti in punti diversi in individui diversi

Elementi Genetici Trasponibili (TGE): elementi genetici che hanno la capacità di cambiare posizione nel genoma attraverso meccanismi molecolari diversi

Nature 2006

ELEMENTI TRASPONIBILI IN EUCARIOTI*costituiscono parte rilevante del genoma di piante e animali.

*lo spostamento puo’ essere * neutro per l’ospite* dannoso (aberrazioni cromosomiche/ Mut/riarr)* potenzialmente positivo: contribuiscono alla diversitàgenetica dell’organismopossono essere “reclutati” ex. come sequenze regolative

nuove funzioni

Trasposoni a DNA

I trasposoni a DNA tendono ad avere una vita breve nelle specie:

la trasposasi non distingue fra elementi attivi e inattivi

accumulo di elementi inattivi nel genoma

trasposizione sempre meno efficiente

estinzione :”fossili”

miniatureinverted-repeat TE

Trasposoni con intermedi a RNA: retro trasposoni:*elementi retrotrasponibili autonomi a RNA (LTRgag-pol) duplicazione*retrotrasposoni senza LTR (LINEs) (endonucleasi)*non coding retrotrasp (SINEs), derivanti da geni per tRNA, 5S e 7SLsfruttano per la trasposizioni enzimi dei retrotrasposoni autonomi

DNA

RNA

DNA

DNA

trascrittasi inversa

10.5%6.5%3.1% 44.4%All TEs

5.1% 5.3%0.7% 2.8%DNA

4.8% 0.0%1.5% 8.1%LTR

0.5% 0.4%0.7% 33.4%LINE/SINE

ArabodopisWormFly HumanElement

http://nitro.biosci.arizona.edu/courses/EEB600A-2003/lectures/lecture26/lecture26.html

Alu1 SINEs (short-interspersed sequences)~300 bp, ripetuti 300,000-500,000 volte

Fiancheggiati da 7-20 bp di ripetizionidirette.inserzioni AluI SINEs possono esserecausa di malattia >proteina non funzionale.

L-1 LINEs (long-interspersed sequences)Elementi 6.5 kb, (~5% del genoma).Contengono ORFs con omologia allatrascriptasi inversa; non hanno LTRs.Alcuni casi di emofilia (OMIM-306700) sono il risultato di nuove inserzioni di L1.

iNon-LTR retrotransposons

L1 è l’unico elementoLINE attivo nell’uomo

conseguenze

• mutazioni loss of function

• nuove funzioni gain of function

– sequenze codificanti– sequenze regolative– rimodellamento cromatina e struttura cromosomi

(centromeri, telomeri)

DOMESTICATION

Eur J Hum Genet. 1993;1(1):30-6.

Haemophilia B due to a de novo insertion of a human-specific Alu subfamily member withinthe coding region of the factor IX gene.

..mutazioni indotteda transposoni:ex nell’uomo

alterazione espressione genicaL1 determina un rallentamento della polimerasic’è correlazione fra velocità di trascrizione e n° di L1 presenti negli introni di un gene

*Prevalenza TE nelle sequenze regolative:cooptati*possono regolare espressione genica:

trascrizionetraduzione

*possono essere cooptati come promotorialternativi:

ex: l’espressione di cyp19 (aromatasi,sintesi estrogeni) placenta-specifica presente in uomo ma non in topo è guidata da un ERVEndogenous Retroviral like element)

RECLUTATI COME ELEMENTI REGOLATORI(circa25% promotori nell’uomo contengonoseq. derivate da TE)

conseguenze

• mutazioni loss of function

• nuove funzioni gain of function

– sequenze codificanti– sequenze regolative– rimodellamento cromatina e struttura cromosomi

(centromeri, telomeri)

DOMESTICATION

alternative startpromoter disruption

cis addition

antisense transcriptionsilencing

alternative polyAmiRNA targeting

alternative splicing

protein modification

DNA binding proteinsproteine centromerichefattori trascrizionali

rag1/rag2catalizzano i riarrangiamenti somatici“Ricombinazione VDJ” che permettono la formazione degli anticorpi.Agiscono tagliando specifiche sequenze di DNA (RSS) che fiancheggiano gli elementi V, D,J.

RAG1 deriva dagli elementiTransib (trasposoni di invertebrati)

http://biology.plosjournals.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1371/journal.pbio.0030181

conservazione aa conservazione RSS

elementi dinamicilineage specific activity & extinction: alcuni genomi ne hanno piu’ di altri

genomi diversi ne hanno di tipo e varietà diversidovuto a –diverso successo nell’espansione/estinzione

lineage specific introduction: in specie diverse attraverso infezione e trasferimento orizzontale (elementi retrovirali derivanti da retrovirus)

lineage specific formation: ex SINE da geni per tRNA (seq. Alu nell’uomo)

dennis C 220 NAture

topi geneticamente identici

…uso retrovirus endogenicome “marcatori” genetici

“retrotype”

ricostruzione storia evolutiva

Retrovirus: virus a RNA*si replicano attraverso intermedi di DNA a doppia elica. *infettano solo cellule eucariotiche

*conseguenza per la cellula ospite (oltre all’infezione stessa):

-sequenze retrovirali integrate (provirus) possono modificare la cellula ospite(se l’integrazione avviene a carico di cellule germinali la modificazione puo’trasmettersi alla progenie)-sequenze cellulari (ospite) possono ricombinare con le sequenze virali ed essere trasposte insieme al retrovirus riarrangiamenti-sequenze cellulari trasportate dal retrovirus possono cambiare le proprieta’della cellula infettata virus oncogeni

*2 copie di un genoma costituito da 7-10 kb di ssRNA*Nucleo virale proteico*Involucro glicolipidico (glicoproteine che mediano il riconoscimentodella cellula ospite)

Struttura del retrovirus:

trascrittasi inversa: VIRALE

trascrizione ad opera della pol.IIdell’ospite

3 RNA: * tradotto a dare proteine virali* impaccato nel capside(informazione geneticadel virus)

1 RNA è convertito in DNA dall’enzima virale trascrittasiinversa, che si trova nella particellavirale e manca di attivitàesonucleasica 3’ - 5’ (no proofreading ⇒ molte mutazioni).

2 il DNA si integra nel genomadell’ospite ed è trascritto.

RU5---------------U3R

U3RU5-----------------U3RU5

genomic RNA

integrated provirus (DNA)

LTR LTR

IRS: inverted repeat sequencesLTR: long terminal repeats, segnali di regolazione. Forti enhancer, in grado di attivare la trascrizione di geni cellulari adiacentiall’inserzione. NB: le sequenze promotrici sono al 3’ sull’RNA, al 5’ nel DNA

alterazione espressione geni cellulari adiacenti l’integrazione

Geni retrovirali: gag (group antigen): codifica il nucleo proteicopol (polymerase): codifica la trascrittasi inversa per l’ enzima

per l’integrazione provirale.env (envelope): codifica l’involucro glicoproteico.

i 3 geni sono processati a dare piu’proteine attraverso diversi meccanismi molecolari:

-reading frames diversi-splicing alternativi-tagli proteolitici delle proteine

lewin il geneVIII

HIV infetta e distrugge le cellule dei linfociti Tesempio di retrovirus:

…….conseguenze integrazione elementi retrovirali nel genoma dellacellula ospite

come vettori per gene therapy

..proliferation

mutagenesi inserzionale

*efficiente trasferimento genico alla cellula bersaglio*livello di espressione del transgene appropriato*mantenimento dell’espressione genica nel tempo*espressione genica regolata*tolleranza immunitaria verso il prodotto del transgene*sicurezza

perché abbia successo bisogna avere:

MoMLV based retrovirus: PRO: alta efficienza infezionestabilità costrutto

CONTRO: infettano solo cells proliferantimutagenesi inserzionale

vettori lentivirali: infettano anche cells quiescentialti livelli di espressione

no mutagenesi inserzionale

1

MUTAZIONE

cambiamento che altera la sequenza del DNA. La mutazione puo’essere trasmessa alla progenie della cellula in cui si verifica.

Selvatico (Wild type, wt) Mutato (Mut.)Mutazione in avantiReversione

2

GENOMICHE: alterano il numero cromosomicoCROMOSOMICHE: alterano la struttura dei singoli cromosomiGENICHE: alterano la funzione dei singoli geni

Mutazioni

Riarrangiamenti grossolani nel gene: delezioni, duplicazioni, inversioni Mutazioni che interessano singole

coppie di basi: mutazioni puntiformiA ↔ G e T ↔ C

A ↔ T, G ↔ C, A ↔ C, G ↔ TDelezioni inserzioni coppie di basi

3

Mutazioni Somatiche avvengono in cellule somatiche e coinvolgono solo l’individuo in cui avviene la mutazione

Mutazioni Germinali alterano i gameti e passano alla generazione successiva.

La conseguenza della mutazione negli organismi pluricellulari dipende da:-cellula in cui si verifica (somatica o germinale)-momento dell sviluppo in cui si verifica (precoce o tardivo)

tessuto somaticotessuto germinale

Clone cellulare mutante

Progenienormale

Progenie mutante

Progenienormale

Mutazione somatica

Mutazione germinale

4

Insorgenza precoce: maggior numero di cells mutate

La conseguenza della mutazione negli organismi pluricellulari dipende da-cellula in cui si verifica:

-germinale-somatica

-momento dello sviluppo in cui si verifica (precoce o tardivo)svi

luppo

5

La mutazione è un evento raro che si verifica con frequenze variabili dagene a gene e nei diversi organismi

tasso di mutazione = probabilità di un particolare tipo di mutazione per generazione per un certo gene

frequenza della mutazione nella popolazione = numero di volte in cui unaparticolare mutazione si ritrova in una popolazione di cellule o individui

Mutazione in avanti: ordine di grandezza: 10-6-10-9

Reversione: ordine di grandezza 10-9 – 10-12

Piu’ rara !!!

6

Mutazioni puntiformi:1. Sostituzioni di coppie di basi.A ↔ G T ↔ C A ↔ T G ↔ C A ↔ C e G ↔ T

2. Delezioni e inserzioni di coppie di basi

MUTAZIONI GENICHE

A carico di:-sequenze codificanti: conseguenze su STRUTTURA DELLA PROTEINA-sequenze regolative: conseguenze su DOVE, QUANDO, QUANTOil gene è espresso

7

STOP

8

9

La mutazione inserisce un codone di STOP

10

Pierce

mutazioni regolative

11

Reversione: la soppressione della mutazione puo’ avvenire all’interno dellostesso gene*Reversione allo stesso aminoacido ripristina la funzione

Reversioni vere UCC (Ser) → UGC (Cys) → UCC (ser)Reversioni equivalenti UCC (Ser) → UGC (Cys) → AGC (Ser)

*Reversione a un altro aminoacido ripristina parzialmente o pienamente la funzione

*II mutazione in un sito diverso dalla mutazione originale e maschera o compensa la mutazione originale senza ripristinare il tipo selvatico.

ex: inserzione vicina ripristina il frame di lettura perturbatoda una delezione o viceversa

NOTA BENE: la reversione è un fenomeno è talmente raro che si evidenziapraticamente solo nei microrganismi –elevati numeri di individui-

12

A B C D

I mut. riduce efficienzaproduzione B II mut. aumenta efficienza

conversione B>C

Le 2 mutazioni si compensano

Reversione: la soppressione della mutazione puo’ avvenire grazie ad unaseconda mutazione che avviene in un gene diverso originariamente mutato

13

Mutazioni spontanee:Errori della DNA polimerasi:-errori di incorporazione durante la replicazione del Dna (che possono essere riparati

dalla attività proofreading della polimerasi stessa)-errori di allineamento (SEQ: RIPETUTE!!!)Alterazioni chimiche spontanee-Depurinazione: Comune; A o G sono rimossi e rimpiazzati con una base a caso-Deaminazione: Gruppo aminico rimosso da una base (C → U);nel successivo giro di replicazione (CG → TA)-Tautomerizzazione delle basi

Elementi trasponibili

MUTAZIONI SPONTANEE E INDOTTE

14

Appaiamento errato

Errori della DNA polimerasi:

1:4

15

ERRORI DELLA DNA POLIMERASI: PIU’ FREQUENTI IN PRESENZA DI SEQUENZE RIPETUTE

16

Malattie da espansione di triplette nell’uomo: un caso particolare di sequenza ripetute che costituiscono regioni di instabilità, la cui errata copiatura è causa di malattia

17

ESPANSIONI ALTO NUMERO DI COPIE IN REGIONI NON CODIFICANTI-DISTRUZIONE REGIONE CROMATINICA E ABOLIZIONE TRASCRIZIONE DEL GENE (STESSO EFFETTO DI MUTAZIONI CHE LO INATTIVANO, Ex: Xfragile)

-CTG (distrofia miotonica) Ipotesi: l’RNA CUG sequestra fattori di splicing utili per il processamentodi altri trascritti (non sono note altre mutazioni inattivanti il gene legate alla malattia).

ESPANSIONI MODERATE SEQ. CODIFICANTI (CAGn) POLIGLUTAMINE* neurodegenerative a insorgenza tardiva*non sono note altri tipi di mutazione associate alla malattia*la sequenza espansa è trascritta e tradotta*soglia critica di n° di ripetizioni associata all’insorgenza malattia*maggiore è il numero di ripetizioni, piu’ precoce è l’insorgenza della malattia *?? formazione di aggragati proteici

18

MUTAGENI FISICI: RADIAZIONI (e.g., raggi-X, UV)radiazioni ionizzanti: elevata energia, rompono i legami covalenti nel DNA, causandorottura di singolo o doppio filamento.

UV (254-260 nm): causa formazione di dimeri di purine e pirimidine adiacenti nellacatena del DNA.

mutazioni indotte da mutageni fisici o chimici

NB: la presenza di mutazioni anche in DNA di cellule che non replicano-ex cells nervose, muscolari- suggerisce che la mutazione possa essere causataanche da meccanismi che non coinvolgono la replicazione del DNA

19

MUTAGENI CHIMICI:1) Analoghi di Basi Simili alle basi normali, incorporate nel DNA durante la

replicazione, causano misappaiamenti (ex 5BrDu) e blocco della replicazione del DNA. - ex farmaci ANTITUMORALI

2) Agenti modificatori delle basi: la base modificata si appaia in modo scorretto(Agenti deaminant,i idrossilanti, alchilanti)

20

Nota Bene:*La mutazione spontanea e indotta, una volta generate, sono indistinguibili,quello che cambia è l’evento che le ha generate

*La possibilità di indurre elevate frequenze di mutazione grazie all’uso di mutageni è un prezioso strumento di analisi genetica in quanto la frequenza dimutazione spontanea è molto bassa

3) Agenti intercalanti:sottili molecole idrofobiche che si inseriscono tra coppie di basiadiacenti (e.g., proflavina, bromuro di etidio).Causano inserzioni/delezioni durante la replicazione del DNA.

21

Sistemi di riparazione del DNA

FONDAMENTALI PER LA SOPRAVVIVENZA

-vede molti geni dedicati

-sistemi molto conservati evolutivamente

Soprattutto negli eucarioti superiori (vita lunga, n° divisioni cellulari altissimo) sono

Lewin, Il gene zanichelli

H. sapiens

22

-identificazione sito mutato(DISTINZIONE DA PROCESSI FISIOLOGICI)

-segnalazione alla cellula

-blocco ciclo cellulare

-attivazione risposta

-decisione cellulare:-riparazione -bypass lesione -morte cellulare (apoptosi)

Attivazione programmispecifici

La riparazione del DNA richiede:

23

Meccanismi di riparazione del DNA:-RIPARAZIONE DIRETTA DEL DANNO ATTRAVERSO SISTEMI ENZIMATICI

-RIPARAZIONE PER EXCISIONE DI NUCLEOTIDI

Eliminazione del DNA danneggiato e uso dellasequenza complementare come stampo per la sintesi di nuovo DNA integro

Ex: DNA fotoliasialchiltransferasi

Griffiths, Zanichelli

24

La riparazione per excisione è un meccanismo fondamentale di riparo anche nell’uomo. Diverse malattie sono associate a malfunzionamento dei sistemi riparativi

25

identificazione geni coinvolti: analisi di complementazione su fibroblasti da pazienti XP diversi

Xp1 Xp2 Xp1 Xp3

fusionefibroblasti

UV

geni diversi

RIPARA

fusionefibroblasti

UV

NONRIPARA

stesso gene

26

XPA XPG

27

Legend:The nucleotide excision repair pathway involves several different disorders including xeroderma pigmentosum,Cockayne syndrome and trichothiodystrophy and at least eleven genes.

Xeroderma pigmentosum variant. XPVPolH

Xeroderma pigmentosum group G.RAD2 ERCC5

Xeroderma pigmentosum group F.ERCC4

Xeroderma pigmentosum group E.DDB2

Xeroderma pigmentosum group DXPD ERCC5

Xeroderma pigmentosum group C.XPC

Xeroderma pigmentosum group B.XPB

Xeroderma pigmentosum group A. XPA

28

MECCANISMO DI RIPARAZIONEPOSTREPLICATIVO

Problema: qual è il filamento corretto?quello Metilato

La perdita/mutazione degli omologhi umanidei geni MutS, MutL, Muth è coinvolta nell’insorgenza di una forma di tumore al colon

“geni mutatori”

E Coli

29

Riparazione rotture doppio filamento

SOS: Bypass della lesioneche rimane e viene trasmessaalle cellule figlie

SISTEMI ERROR-PRONEMeccanismo SOS: sintesi translesioneprocarioti

eucarioti

30

DANNO

SISTEMA DIRIPARAZIONE

RIPARO

MORTE CELLULA

ACCUMULO

31

32http://www.weizmann.ac.il/Livneh/JNCI/intro.htmlTUMORI

TUMORE: malattia genetica dovuta all’accumulo in un clone cellulare di mutazioni in geni che presiedono al controllo del bilanciamento fra proliferazione e differenziamento cellulare e che controllano l’integrità dell’informazione genetica

-oncogeni -oncosoppressori-geni implicati nella riparazione del DNA(mutator genes)

*Virtualmente le cellule di ogni tessuto possono dare origine a tumori ⇒ eterogeneita’

*Il tipo cellulare da cui ha origine il tumore ne determina l’evoluzione:

-velocita’ di crescita-capacita’ di colonizzare tessuti adiacenti-trasporto nel circolo sanguigno-capacita’ di colonizzare tessuti diversi (metastasi)

carcinomi ⇒ epitelisarcomi ⇒ fibroblasti, ossa, muscoli, vasilinfomi, mielomi ⇒ sangue

Mutazione che conferisce vantaggio proliferativo

Proliferazione clonale: clone amplificato= bersaglio per mutazioni successive

tumore in situ tumore che invadetessuti

circostantidisseminazione in tessuti

e organi distantimetastasi

destino cellulare normale:differenziamento

Tumore: accumulo di mutazioni all’interno dello stesso clone cellulare che porta a proliferazione incontrollata2 meccanismi concorrono all’accumulo di mutazioni nella stessa cellula:*insorgenza di mutazioni che conferiscono vantaggio proliferativo*mutazioni che riducono la stabilità genetica ⇒ genetic instability ⇒ accumulo

mutazioni

Origine clonale dei tumori

Tutti i tessuti femminili sonomosaici per inattivazione di XFemmine eterozigoti G6PD (su X) hanno nei tessutisani sia cellule sia cellulementre i tumori sono o o

*Tumori femminili

*traslocazioni in alcuni linfomiIn alcuni tumori tutte le cellule presentano lo stesso riarrangiamentocromosomico caratteritico

“prove:”

-oncogeni -oncosoppressori

-geni implicati nella riparazione e segregazionedel DNA (mutator genes)

lewin gene VIII

ACCUMULO MUTAZIONI

EquilibrioProliferazionedifferenziamento

Segnali attivatori Segnali inibitori

Eccesso segnali proliferatori

Perdita segnali inibitoriProliferazioneincontrollata

Attivazione oncogeni

oncosoppressori

ATTIVAZIONE ONCOGENI:Mutazioni acquisto di funzione

dominanti

INATTIVAZIONE ONCOSOPPRESSORI:Mutazioni con perdita di funzione

recessiveTUMORE

…quasi sempre….

VIRUS TRASFORMANTI: tumori virus a DNAvirus a RNA

portano geni in grado di promuovere la trasformazione tumorale

*virus a DNA: producono proteine che INATTIVANO GENI ONCOSOPPRESSORI

*virus a RNA: attivano pathways oncogenici

VIRUS TRASFORMANTI: tumor virus a DNAPOLYOMA, PAPILLOMA, ADENOVIRUS

1919 Rous:virus del Sarcoma di pollo: prima dimostrazione cheesistono GENI in grado di contribuire all’insorgenza di tumori

induce tumori in animali e trasforma cellule in coltura

il genoma virale ha dimensioni ridotte

identificazione gene responsabile induzione tumore: V-src(presente oltre a gag, pol env, costituisce differenzafra virus oncogeni e non)

1976:Verma & Bishop: identificazione controparte cellulare: c-src(per ibridazione con DNA genomico cellulare)

gli oncogeni virali derivano da geni cellulari “catturati” da virus

virus a RNA

gene cellulare

genoma virale

NB: mancano introni!!

virus trasducenti defettivi

l’ integrazione di un gene di origine cellulare porta alla perdita di geni viraliIl virus non e’ piu’ in grado di trasdursi a meno che la stessa cellula non vengainfettata da un virus wt che fornisce le funzioni mancanti (virus helper)

delezione-fusione

virus trasducente defettivo

mRNA di fusione gag-onc

La maggior parte dei virus oncògeni sonodefettivi:

l’ integrazione di un gene di origine cellulareporta alla perdita di geni virali

Il virus non e’ piu’ in grado di trasdursi a menoche la stessa cellula non venga infettata da un virus wt che fornisce le funzioni mancanti(virus helper)

a) non trasformanti, hanno lunga latenza (per indurre tumore deve integrarsi in vicinanzadi protooncogeni cellulari, evento a bassa probabilita’)

b) virus defettivi, necessitano di un helper per riprodursi. Hanno potere trasformante(conferito dal v-onc)

c) si riproducono autonomamente e hanno potere trasformante (v-onc) ROUS

CLONAGGIO NUOVI ONCOGENI:ricerca GENI capaci di *indurre trasformazione colture cellulari

*indurre tumori in vivo

*crescono indefinitamente in colturatrasformazione

*crescono in assenza di segnali mitogeni(fattori di crescita)

*non risentono inibizione da contatto(segnali inibitori da cells vicine)⇒ formazione di foci

*sviluppano tumori in topinude

in coltura

in vivo

immortalizzazione

metastasi*le cellule migrano a formare nuovecolonie

IDENTIFICAZIONE DI ONCOGENI CELLULARI *BASATA SULLO STUDIO DEI RETROVIRUSA) studio di retrovirus contenenti v-onc, in grado di*trasformare cellule in coltura

*indurre tumori in animali

ex v-src-retrovirus hanno genoma piccolo: facile identificazione v-onc: v-src-ibridazione con genoma cellula ospite ⇒ identificazione c-onc: c-src-confronto v-onc vs. c-onc ⇒ mutazioni oncogene ⇒ mutazioni che trasformano

protooncogene src in oncogeneProtooncogene: gene cellulare che normalmente regola la proliferazione cellulare. A seguitodi mutazioni gain of function si trasforma in oncogene in grado di concorrere allo sviluppodel tumore

B) clonaggio e studi di geni adiacenti nel genoma di cellule tumorali ad LTR virali

non trasformanti, hanno lunga latenza (per indurretumore deve integrarsi in vicinanzadi protooncogeni cellulari, evento a bassa

probabilita’)

il DNA di cellule tumorali contiene geniin grado di trasformare cellule in coltura e di indurre tumori in topi nude

isolamento sequenza responsabile ⇒ oncogene

*BASATA SULLO STUDIO DI CELLULE TUMORALIC) isolamento da cellule tumorali delle sequenze di DNA con potere trasformante(che trasferite in cellule sane sono ingrado di trasformarle in cells tumorali)

sfrutta la presenza di sequenzeripetute Alu nel genoma umano,assenti nel topo(⇒ “marcano il DNA umano”)

“prova”: se il DNA isolato contiene l’ oncogenedeve essere in grado di:* trasformare cellule sane seintrodotto per transfezione*indurre tumori in topi “nude”.

uso come probe per screeningdella libreria seq. Alu chepermettono di recuperare DNAumano ⇒ sequenza trasformante

Approccio sperimentale:

ONCOGENI : geni implicati nella trasmissione segnali mitogeni: -fattori di crescita

-recettori per fattori di crescita-molecole trasduzione del segnale(chinasi associate alla membrana e citoplasmatiche)-fattori trascrizionali nucleari

v-scr ROUS

MECCANISMI DI ATTIVAZIONE DI ONCOGENI( mutazioni che trasformano un protooncogene in oncogene)

-in gene viene a trovarsi sotto il controllo di un LTR virale ⇒ attivazionecostitutiva (continua, anche in assenza di stimoli mitogeni), ad alti livelli-riarrangimenti -amplificazione genica

(piu’copie del gene= piu’ prodotto genico)-fusioni con proteine virali-traslocazioni (proteine di fusione)-mutazioni

LTR

il protooncogene acquista nuove funzioni⇒ oncogene

ex riarrangiamenti:

lo stesso gene ABL è riarrangiato *nel virus defettivo leucemia murina di Abelson* a seguito di traslocazione in leucemie umane

traslocazione 9:22 CROMOSOMA PHILADELPHIA

proteina di fusione gag-abl

proteina di fusione bcr-abl

ABL: codifica per una tirosina kinasi

glivec

ex: overespressione MYC, FATTORE TRASCRIZIONALE NUCLEARE

overespresso in *leucemia aviaria in cui finisce sotto il controllo dell’LTR virale *leucemia umane traslocazione 8:14 linfoma Burkittsotto il controllo enhancer Immunoglobuline (espresse solo in cells B)

NB: il primo esone di myc non è tradotto, quindi entrambi i riarrangiamenti (in cui vieneperso il primo esone) portano alla produzione di proteina myc normale MA a livelli costitutivi-indipendenti da stimoli mitogeni- ed elevati

ex1 ex2 ex3

ATG

Reflecting on 25 years with MYCNatalie Meyer and Linda Z. Penndec 2008

deregolazionedi myc

MAX MAX

mad

myc

stimolimitogeni

mad MAX

MAXmyc

proliferazionegeni proliferazione

attiva

reprime

NB: myc mRNA e proteina sono fortemente instabili, per avere l’accumuloè necessario uno stimolo mitogeno sostenuto e persistentel’eterodimero mad max reprime i target attivati da myc max

equilibrio proliferazione/differenziamento

DNA polymerasi,cycline, etc.

nella traslocazione 8:14 myc finisce sotto il controllo del locus Igg, che va incontro a ipermutazionesomatica

*myc oltre ad essere overespresso puo’ accumulare mutazioni

*le diverse mutazioni myc determinano diverse caratteristichedella leucemia ex: minore latenza e maggiore penetranza

Igg Myc WT proliferazione tumore

I evento p53 II evento (perdita 53)

tumore perché myc è insensibile al controllo da p53

Igg Myc MUT.

richiede 2 eventi

basta 1 eventoI evento

Reflecting on 25 years with MYCNatalie Meyer and Linda Z. Pennnat. rev cancer 2008

ex mutazioni: ras, protein kinasi

proliferazione

costitutivamente attiva

Recettore troncocostitutivamente attivato

in assenza di ligando

dimerizzazione costitutiva in assenza di ligando

de carli genetica generale e umana

ex mutazioni oncogeniche di recettori per fattori di crescita

-fattori di crescita-recettori per fattori di crescita-molecole trasduzione del segnale(chinasi associate alla membrana e citoplasmatiche)-fattori trascrizionali nucleari

MUTAZIONI

GENI

COOPERAZIONE FRA ONCOGENI: *nella trasformazione cellulare* in vivo nel topo

La mutazione contemporanea di piu’ oncogeni accelera la progressione tumorale

MouseMammaryTumorVirus

50 25

100

(myc + ras mut.)

topi transgenici

oncogeni: forme attivate di geni cellulari che da soli o cooperando con altri geni induconotumoriimplicazione: l’attivazione del gene ha effetto dominante

MA……

alcune evidenze suggeriscono che esistono elementi genetici nella cellula normale ingrado di ripristinare funzione defettiva nella cellula tumorale

Tfusione di cellula tumorale con cellula normale:

*risponde a fattori di crescita*non da tumori in animali

fusione fra 2 cellule da tumori diversi:*risponde a fattori di crescita*non da tumori in animali COMPLEMENTANO

esistono geni ONCOSOPPRESSORI, persi nella cellula tumorale

esistono piu’ geni ONCOSOPPRESSORI

T1 T2

WT

M M WT

microcellula contenenteun unico cromosoma

…se l’introduzione di un allele funzionante ripristina la funzionededuco che nella cellula tumorale entrambi gli alleli devono esserepersi

mutazione “loss of function” di entrambi gli alleli

l’inattivazione puo’ avvenire attraverso meccanismi diversi:* mutazioni funzionali* delezioni regione contenente il gene

WT WT WTMut. Mut. del.

I II

ex.

Modello di gene oncosoppressore: RETINOBLASTOMA, Rb

60% casi: *sporadico (non famigliare)*unilaterale*insorgenza in età adulta

40% casi: *famigliare*autosomico, DOMINANTE*, alta penetranza*bilaterale, con piu’ tumori indipendenti*insorgenza in età pediatrica*i pazienti sviluppano spesso osteosarcomi

WT WT WTMut. Mut. del.

Ievento

IIevento

Forma sporadica: sono necessari 2 eventi di mutazione nella stessa cellula a carico dei 2 alleli Rb⇒ bassa probabilità, evento raro (monolaterale, età adulta)

Forma ereditaria: tutte le cellule ereditano già un allele mutato (+/-) e quindi basta unsolo evento di mutazione che distrugga l’allele Rb in una qualsiasi dellecellule della retina (bilaterale, età precoce)

WT Mut. del.

Ievento

Mut.

NB: la trasmissione della malattia è DOMINANTE maa livello cellulare devo perdere i 2 alleli: RECESSIVO

ereditato già mutato da tutte le cellule

+/+ +/- -/-

-/+ -/-

Meccanismi di perdita dell’allele sano

oppure silenziamento oncosoppresore per meccanismi epigenetici

CLONAGGIO DEL GENE RB COME SCHEMA GENERALE PER CLONAGGIO DIGENI ONCOSOPPRESSORI

per Rb, 5-10% dei tumori ereditari hanno delezioni nella regione 13q14

*studi citologici per definire la regione minima di delezione comune in pazientidiversi ⇒ regione in cui si trova l’oncosoppressore

T1 T2 T3 WT

gene oncosoppressore

perdita di eterozigosi, LoH: confronto fra tessuto sano e malato DELLO STESSOINDIVIDUO per la perdita di eterozigosi di loci polimorfici a posizione NOTA sul genoma

il gene oncosoppressore è “vicino” ai loci L1 ed L2 (la perdita di un loro allele coincide conl’insorgenza del tumore)conoscendo la posizione di L1 e L2 nel genoma ⇒ risalgo alla posizione dell’oncosoppressore

cellule sane:eterozigoti cellule malate: omozigoti per L1 e L2Locus1locus2locus3locus4

I II

-/-+/-+/+

delezione

ex: ho a disposizione un pannello di 4 marcatori (L1-L4) distribuiti sul cromosoma 13 che sonopresenti allo stato eterozigote nell’individuo in esame

confronto

l’oncosoppressoresta qui!

*posso partire da un pannello di marcatori che coprono tutto il genoma*maggiore è la densità di marcatori, piu’ preciso è il mappaggio

marcatori possibili:*isoforme proteina (poche)*polimorfismi di restrizione*SNP: polimorfismi singolo nucleotide

PAZIENTI DIVERSI

virus a DNA

ex myctimidina kinasiDNA polimerasi

RB: controllo del ciclo cellulare: entrata in fase S

RB -/- cells

cicline D ed E: controllo G1>Sciclina D: dipendente da mitogeni, agisce su Rbciclina E: progressione irreversibile, svincolata da mitogeni

p53*Mutazioni in p53 sono implicate in ~50% dei tumori umani, tra cui:

seno, cervello, fegato, polmoni, colon retto, vescica, e sangue*Lo sviluppo dei tumori richiede mutazione nei due alleli p53.*Codifica una proteina di 393 aa coinvolta nella trascrizione, nel controllo del ciclocellulare, nella riparazione del DNA e nell’apoptosi.*p53 interagisce con numerose altre proteine, agendo come controllo superiore delcheckpoint

forma ereditaria di perdita di un allele di p53sindrome di Li-Fraumeni: insorgenza precoce

vari tumori

Modello murino : topi p53-/- nascono ma sviluppano tumori 100% casi entro 10 mesi di etàtopi transgenici che overesprimono p53 ⇒ invecchiamento precoce

p53 induce apoptosi *in modo diretto (attivando e reprimendo geni)*in modo indiretto

bax

bcl2

bax

bcl2

bax bcl2

apoptosi

proliferazione

p53 attiva la trascrizione di baxreprime trascrizione bcl2

p53 attiva mdm2 che ne media la degradazione via ubiquitinazione

mdm2: oncogene amplificato in tumori. Se overespresso ⇒ degradazione p53 ⇒ tumorimeccanismo di inattivazione della risposta da p53

oncogeni!!

myc

p53 è indotto da myc : spegnimento del segnale mitogeno!

myc

P53 lega il DNA come omotetramero

Mut.

Wt

*le mutazioni che inattivano p53 nei tumori sono di varia natura*alcune hanno effetti specifici sulle funzioni diverse di p53

apoptosiarresto ciclo cellulare

Mut dominanti negative

Kim C. Quon et al. Genes Dev. 2001; 15: 2917-2921Haplo-insufficiency increases the probability of completing a multistep tumorigenesis pathway

Haplo-insufficiency increases the probability of completing a multistep tumorigenesis pathway. Strong (A) or partial (B) haplo-insufficiency allows cells that are heterozygous for a tumor suppressor gene to undergo clonal expansion. This increases the size of the target cell population available to complete a multisteptumorigenesis pathway, and thus greatly increases the probability of tumors occurring. For partiallyhaplo-insufficient tumor suppressor genes (B), loss of the remaining tumor suppressor gene allele(loss of heterozygosity, LOH) is required to complete tumorigenesis. (C) In the absence of haplo-insufficiency,no clonal expansion of heterozygous cells occurs, and therefore insufficient numbers of cells are available to

complete the pathway, and tumors fail to occur or only rarely occur. (D) In familial cancers, all cells are heterozygousto begin with, and therefore no clonal expansion is necessary to increase the size of heterozygous target cell population.Therefore, tumors can arise even in the absence of haplo-insufficiency. Cells carrying two wild-type alleles of a tumorsuppressor gene are shown in white; heterozygous cells with one mutant allele are in light pink; tumor cells with one ortwo mutant alleles are in dark pink; (X) mutant tumor suppressor alleles.

permette espansione clonale>maggiore probabilitàulteriori mutazioni

perdita 1 allele

perdita 2 allele

tumori ereditari

INSTABILITA’ GENOMICA E TUMORI-caratteristica comune delle cellule tumorali*INSTABILITA’ CROMOSOMINCA (CIN): *CARIOTIPO ANOMALO

(aneuploidia, riarrangiamenti grossolani)*perdita controllo spindle checkpoint (ex, APC)*replicazione del DNA anche in presenza di danno(geni che codificano per proteine che servono alla riparazione del DNA, ATM/ATR, BRCA1, BRCA2)*telomeri

*INSTABILITA’ MICROSATELLITI (MIN):associata ad errori nel Mismatch repair (MMR)

95% HNPCC Hereditary Non Polyposis Colonrectal Cancer:mutazioni nei geni MLH1&2

perdita 2 alleli geni NER + evento mutageno esterno

perdita 2 alleli per geni del mismatch repair

perdita controllo mitotic spindle checkpoit

spindle checkpoint

angiogenesi

DNA repairmismatch repair

signal transduction

MODELLO MULTISTEP DI EVOLUZIONE TUMORALE

vertebrati: vita lunganecessità di avere continua proliferazione cellulare ⇒ sviluppo (1014 cells)

mantenimentoriparo

“costo”= tumori rischio aumentà con etàrischio maggiore per tessuti ad alta rigenerazione

MECCANISMI CHE LIMITANO L’ESPANSIONE

Dipendenza da segnali mitogeni per la proliferazione: perché una cellula POSSA DIVIDERSI deve:

*essere esposta a segnali mitogeni prolungati+ segnali specifici(ex. contatti cellula-cellula)*superare segnali antiproliferativi (ex. TGF, interferoni)*contrastare il pathway differenziativo di default*riuscire a contrastare esaurimento nutrienti (ex richiamando nuova angiogenesi)*aggirare il segnale di senescenza dato dall’erosione dei telomeri*essere in grado di migrare nei vasi e di attecchire in tessuti diversi da quello di origine

SENESCENZA: blocco in G1 di cellule vitali, insensibili ai mitogeni. Puo’ essere indotta da oncogeni

PUNTI di controllo: checkpoints (riparazione, apoptosi, senescenza)eliminazione cellule precancerose (anossia)pressione selettiva cellule circostantipressione selettiva tessuti diversi

TUMORI possono originarsi da cellule staminali o da progenitori che riacquistano capacità di self renewal a scapito della capacità di differenziare

stessi pathways che controllano stem cell self renewal sono spesso attivati in tumori

tumori eterogenei contengono poche cancer stem cells capaci di automantenersi e differenziareparzialmente.Queste cellule sono le uniche in gradodi trasferire tumore

ex AML: cells CD34+CD38- (HSC), trasferisconoAML in topi nudecells CD34+CD38+ (piu’ differenziate)NON trasferiscono tumore

implicazione per la terapia

….cercare di colpire le cellule staminali tumorali da cui origina il tumorepiuttosto che le cellule tumorali che da essesi originano !!

EPIGENETICA E TUMORI

CROMATINA ATTIVA:Iperacetilata e ipometilata

Il reclutamento di deacetilasi istonichee di altri complessi richiama

DNA metiltransferasi

DNA viene metilato

CROMATINA SILENZIATA(non trascritta)

IN MOLTI TUMORI SI HA PERDITA DI CONTROLLO DELLA METILAZIONE:

*silenziamento oncosoppressori per ipermetilazione

*attivazione di oncogeni dovuta a demetilazione

*mancata metilazione seq. controllano segregazione ⇒ segregazione aberrante

*mutazioni puntiformi causate da deaminazione di sequenze metilate

Mut. puntiformi segregazioneaberrante

silenziamentooncosoppressori

attivazione oncogeni

Cellule normali: metilazione concentrata su sequenze ripetitive del genoma eisole CpG dei promotori sono solitamente non metilate

Cellule tumorali: non c’è “compartimentalizzazione “ della metilazioneDNA ripetitivo non metilato,promotori metilati (silenziati)

*there is altered expression of miRNA genes in several human malignancies, includingchronic lymphocytic leukemia, pediatric Burkitt’s lymphoma, gastric cancer, lung cancer, and large cell lymphoma* tumori stessa origine hanno lo stesso pattern di miR alterati (ex gastrici, liver, colon endoderma)

*13q31-32: regione amplificata in linfoma, codifica per miR (He, NATURE2005)

coopera con myc: tumori con minore latenza e maggior penetranza in topi trapiantati concellule che overesprimono myc (Eµ-myc) e la regione amplificatarispetto a cellule che overesprimono solo myc

*myc (oncogene) attiva E2F (progressione ciclo cellulare)(O’Donnel, Nature 2005) attiva miR che reprime traduzione E2F

controllo fine

MICRO RNA E TUMORI

E2F

miR

mycE2FmRNA

http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2005.06.036

Singola cellula uovo fertilizzata intero organismo

? Come si originano l’asimmetria e la specializzazione cellulare?

Quali processi agiscono nello sviluppo ?

- mammiferi: zigote omogeneo e specializzazione successiva

- Drosophila: cellula uovo già asimmetrica

…..ma fondamentalmente gli stessi pathways e gli stessi meccanismi sono comuni fra Drosophila e mammiferi

la proteina di Drosophila vicaria l’assenza di quella murina in topo

Proteine omologhe in organismi diversi svolgono essenzialmente le stesse funzioni

Attuazione programma trascrizionale specifico per ogni cellula

LOGICA GENETICA ALLA BASE DEI MECCANISMI DI CONTROLLO DELLO SVILUPPO:Cascata di eventi che specificano progressivamente il patrimonio trascizionale(identità) della cellula differenziata

Regolatori della trascizione sono i Fattori trascizionali

Gene A, espresso in cellule eritroidi

Gene B, espresso in cellule epatiche

Gene C, espresso in cellule muscolari

Il repertorio di fattori trascrizionali espresso in una data cellula determina il “programma trascrizionale” che essa è in grado di attuare

Lo stesso gene puo’ essere espresso in tessuti diversi sotto il controllo di sequenze regolative composte da siti per TF diversi

CONTROLLO COMBINATORIO* Ogni gene è controllato da una combinazione di fattori trascrizionali che ne legano le seq. regolative (riconoscono le proprie sequenze consensus -ex AGATAAG-) *Alcuni fattori trascrizionali sono ubiquitari, alcuni tessuto-specifici (T.S)*Un fattore trascrizionale puo’ controllare decine di geni (agisce in trans)

CASCATA

Il repertorio di fattori trascrizionali espresso in una data cellula determina il “programma trascrizionale” che essa è in grado di attuareAd ogni stadio dello sviluppo e del differenziamento cellulare vengono espressecombinazioni diverse di fattori trascrizionali

Lo sviluppo di un determinato organo puo’ essere visto come l’attuazione di una cascata di programmi trascrizionali, da una cellula piu’ indifferenziata ad una piu’specializzata.Ex: sistema emopoietico

Risalendo la cascata, si arriva…….. Allo zigote, totipotente

Circuiti integrati di trasduzione del segnale che convergono su fattori trascrizionali che -in cascata-attuano programmi trascrizionalispecifici

CateneGlobiniche globulo rosso

REGOLATORI

BERSAGLI

CORREDO genetico dello sviluppo:

-ristretto gruppo di geni che controllano sviluppo-la maggior parte sono

*FATTORI TRASCRIZIONALI *COMPONENTI VIE TRASDUZIONE DEL SEGNALE

-l’espressione spazio-temporale di questi geni è quasi sempre strettamente correlata con le regioni in cui questi geni agiscono

-molti di questi geni sono altamente conservati fra i diversi phyla animali

Come due cellule uguali possonodiversificarsi e specializzarsi a fare cose diverse?

1

repressione

induzione

2

2 segnali ambientali che provengono da cellule vicine: REPRESSIONE

Inibizione reciproca:

Le cellule che riescono ad inibire maggiormente le cellule vicine rafforzano la propria specializzazione e impediscono alle vicine di assumere la stessa specializzazione

Piccole fluttuazionicasuali

epidermideCell sensoriale: setole

Delta inattivato in un gruppodi cellule: non c’è inibizionelaterale > tutte cellule fannoPeli sensori

RISULTATO: PATTERN REGOLARI

Tabin C.

penne pollo

baffi topo

occhi insetti..ETC..

Nature, Zelhof et al

2 segnali ambientali che provengono da cellule vicine: INDUZIONE

Ex: WNT, egf, fgf

LIGANDO RECETTORE TRASDUTTORE SEGNALE FATTORE TRASCR.

GENI BERSAGLIO

MORFOGENI: INDUTTORI CHE CONTROLLANO IL DESTINO CELLULAREDI INTERI CAMPI DI CELLULECOME SI CREA UN GRADIENTE DI MORFOGENO che definisce territoricellulari diversi?

SVILUPPO DEI PIANI CORPOREI DI DROSOPHILA

-asse anteroposteriore-asse dorsoventrale

Controllo genetico dei primi eventi di specializzazione cellulare/sviluppo

L’uovo fecondato si sviluppa attraverso una fase di sincizio seguita dalla formazione di cellule separatee dalla formazione di cellule primordiali germinali

schiusa

L’ ORGANIZZAZIONE CORPOREA È SEGMENTALE

larva a 10 h dopo fecondazioneprogramma di segmentazione definitosegmenti:-testa-torace-addomeogni segmento presenta:-compartimento anteriore A-compartimento posteriore Pparasegmenti:-sfalsati di un compartimento

ORGANIZZAZIONE CORPOREASEGMENTALE

A P

Come si identificano i geni che controllano le prime fasi dello sviluppo?MUTANTI :

-Letali embrionali precoci geni espressi nell’oogenesi (MATERNI) e nello zigote (ZIGOTICI)

-Alterazioni struttura embrione geni che controllano numero e polaritàdei segmenti (gap, pair rule, segment polarity)

-Mutanti con alterazioni in strutture geni che controllano identità dei segmenticorporee specifiche “geni selettori” (OMEOTICI)

Strumenti molecolari pervisualizzare -mRNA-proteine

VISUALIZZAZIONEESPRESSIONE GENICANELLO SVILUPPO- mRNA-proteine

A

hairy in redKruppel in greengiant in blue

www.bio.davidson.edu/.../fly/embryred.jpeg

TRAPIANTI

ESPRESSIONE ECTOPICA

Gene territorio specifico eyless (Pax6)

B

C

OVERESPRESSIONE

testa

D

GENI REPORTER iniezione /transfezione

Ftz eve

E

Fenotipo mutanti geniche controllano parti:-Anteriore-Posteriore-Terminali

Non si formano

MUTANTI

MADRE DA’ 4 COORDINATE INDIPENDENTI NELL’UOVO:UOVO STRUTTURA ASIMMETRICA

-Anteroposteriore : -SISTEMA ANTERIOREgradiente bicoid-SISTEMA POSTERIORE (addome) nanos

-Sistema terminale: coda e testaTorso

-Dorsoventrale: Toll receptorDorsal

DEFINIZIONE ASSE CORPOREO: ANTERO-POSTERIORE-alcune informazioni di base sono già contenute nell’uovo

EFFETTO MATERNOEvidenza genetica: Femmine bicoid -/-

uova che producono embrioni morti anche se maschio è bicoid +

Evidenza molecolare: il trascritto è già presente nell’uovoNon c’è bicoid nell’uovo

….alcune informazioni di base sono già contenute nell’uovo, MA-altre informazioni invece devono essere presenti nello ZIGOTE

GENI ZIGOTICIEvidenza genetica: ex engrailed, richiesto per la segmentazione

Evidenza molecolare: il trascritto è presente nello zigote ma non nell’oocita

ZIGOTE -/- MUORE

GENI EFFETTO MATERNO: BICOID

Gradiente di bicoid inibito nella parte posteriore da nanos

overespressione

testa

Le cellule del follicolo in cui l’uovo si sviluppaforniscono i segnali “materni”

Il principale gene attivato da bicoide represso da nanos èhunckback

Bicoid Nanos

Attiva trascrizione blocca

traduzione

bicoid lega in modo cooperativo il promotorehb (il legame ad un sito facilita quello al sitosuccessivo)solo dove c’è tanto bicoid si attiva hb

Bicoid:-attiva trascrizione hunchback-reprime traduzione Caudal

Nanos:-reprime traduzione hunchback

I livelli relativi di Bicoid, Caudal e hunchback lungo l’asse dell’embrione determi-nano l’espressione dei geni GAP lungo l’asse dell’embrione

SEGMENTI

a p

A: Hb altobicoid alto

P: Caudal altoNanos alto

Geni GAP: organizzazione in regionigenerali, ex. Krupper

Pair rule: agiscono su segmenti alterni:-even skipped, hairy: pari-fushi tarazu, odd: dispari

Polarità segmantale: organizzazione interna dei segmenti:-gooseberry-engrailed

gradienti materni

WT

MUT

Espressione di engrailed: polaritàdei segmenti

anticorpo

Gene reporter (b-gal) sotto il Controllo delle seq. Regolativedi engrailed

controllo indipendente di elementi in cis che regolano un gene (ex even skipped)

gradiente materno + geni gap (regioni generali) definisce strisce discrete

? come ?

Il segmento è caratterizzatoda un specifica concentrazione relativa difattori trascizionali (Giant, bicoid, Kr)che riconoscono siti di legame sulla regione regolativa che dirige l’espressionedel gene target (EVE) in quel segmentostriscia 2: Hb++ e bicoid+Giant- Kruppel-R R

A

Gerarchia della segmentazione-risposta concentrazione dipendente a informazioni presenti come gradiente-azione integrata di attivatori e repressori che delimitano la regione di espressionedel gene target-meccanismo combinatorio:diverse combinazioni di attivatori e repressori controllano geni diversi

-combinazioni di fattori trascrizionali (trans)-combinazioni di sequenze regolative (cis)

Sistema gerarchico di specificazione progressiva

Numero e orientamento dei segmenti

Numero e orientamento dei segmenti

Identità dei segmenti GENI OMEOTICI

Geni GAP

Mutante Ultrabithorax: Ubx assente in T3Trasformazione T3 (altere) in T2 (ali)

UBX reprime geni per l’ala in T3

Antennapedia: zampe al posto delle antenne

espressione ectopica di Antp

Casares and Mann showing that if they added the mouse homologue of extradenticle to the anal precursorprecursor develops into an antenna. Since extradenticle mutant legs were produced in flies that lacked wildtypethoracic), wherein Antennapedia represses head-forming genes. (This plan is then modified by Scr which promotes

metathoracic development in the third thoracic segment). In dominant Antennapedia mutants, the homothorax gene in the head formation of legs.

antennal versus leg development in Drosophila. Nature 392: 723 - 726.

a fly's leg. Nature 392: 657 - 658.

, W. J. 1987. Molecular analysis of the dominant homeotic Antennapedia phenotype.EMBO J. 6: 201 - 206.

a leg into an antenna in Drosophila. Nature 292: 635 - 638.

http://zygote.swarthmore.edu/droso4.html

Eyeless (pax6):se assente- non si forma l’occhio

espressione ectopica:-struttura oculare sullazampa

Analogamente pax6 regola la formazione dell’occhio in molti organismi

aniridia

MAN

CAT MOUSE

FATTORI TRASCRIZIONALI:-HOMEODOMAIN 60AA-ESPRESSI COLINEARMENTE:5’ 3’antero posteriore

The vertebrate homeotic complex comprises four distinct Hox gene clusters (Hox A, B, C, D)

COME L’ALTERAZIONE DELL’ESPRESSIONE DEI “DETERMINING GENES”PUO’ INFLUENZARE LA DIVERSITA’ MORFOLOGICA

*ALTERAZIONE REGIONE DI ESPRESSIONE

*ALTERAZIONE DOMINI FUNZIONALE DELLA PROTEINA

*ALTERAZIONE SEQUENZE REGOLATRICI

DIVERGENZA

REGIONE CODIFICANTEREGIONE REGOLATIVA

Diversificazione del piano strutturale generale e dei segmenti corporei…Spostamento spaziale dei confini di espressione dei geni Hox!

VERTEBRE CERVICALI

VERTEBRE TORACICHE

*ALTERAZIONE REGIONE DI ESPRESSIONE

Hox genes determine the form, number, and evolution of repeating parts, such as the number and type of vertebraein animals with backbones.

In the developing chick (left), the Hoxc-6 gene controls the pattern of the seven thoracic vertebrae (highlighted in purple), all of which develop ribs. In the garter snake (right), the region controlled by the Hoxc-6 gene (purple) is expanded dramatically forwardto the head and rearward to the cloaca.

The Origins of Form By Sean B. Carroll“Ancient genes, recycled and repurposed, control embryonic development in organisms of striking diversity”

HOXc6

pollo serpente

*ALTERAZIONE DOMINI FUNZIONALE DELLA PROTEINA…..perché gli insetti non hanno arti addominali

Ubx di insetto reprime Ubx di artopodo NON reprime

Dll, che specifica per gli arti

NB: nel torace degli insetti l’espressione di Dll e Ubx non si sovrappongono temporalmente

Dll

drosophila crostaceoT1 T2 T3

T

Ubx di insetto e artropode hanno C-ter diverso

espressione ectopica di Ubxinsetto e artropode in toracedi drosophila

Ubx di insetto Ubx di artropode

Homeotic Genes and the Evolution of Anthropods and Chordatesby Sean B. CarrollFigure 4 (from page 78 of Shaking the Tree: Readings from Nature in the History of Lifeedited by Henry Gee)

*ALTERAZIONE SEQUENZE REGOLATRICI che riconoscono il fattore trascr.Ubx reprime II paio di alinegli insettiNON reprime nei lepidotteri ecoletteriperché sono mutate le sequenze target

DorsalGradiente nucleare zen

snail

Sog, laterale

Asse dersoventrale

GENETICA DEL SISTEMA IMMUNITARIOAssicura protezione contro infezioni provocate da virus, batteri, funghi

RISPOSTA ASPECIFICA : INFIAMMATORIACOMPLEMENTO

RISPOSTA SPECIFICA: CELLULE B T

Riconoscimento aggressione estranea

Attivazione cellule appropriate

Eliminazione agente estraneo

Risposta infiammatoriaSistema del complemento:“complementano” l’azione del sistema immunitario.20 proteine sintetizzate nel fegato poi rilasciatenel sangue dove si attivano in presenza di infezione

lisi batteriattirano fagociti

RISPOSTA SPECIFICA

cellule B: produzione anticorpiT killer: riconoscono e uccidono cellule infetteT helper: stimolano proliferazione cellule B e Killer

T soppressori: attenuazione della risposta

B e T di memoria: assicurano maggior efficacia nella risposta a seguito di una seconda esposizione allo stesso antigene

Macrofagi:inglobano agenti infettanti e processano i loro antigeni presentandolialle cellule B e T helper

antigene: sostanza esogenain grado di indurre la produzione di anticorpi(tipicamente, proteine e polisaccarididerivanti dall’agente infettante)

SPECIFICITA’ DELLA RISPOSTA SI BASA SU:

ANTICORPI, PRODOTTI DALLE CELLULE B

RECETTORI DELLE CELLULE T

superfamiglia delle immunoglobuline

parte variabilesuperficie di riconoscimentodell’antigene (>1010 antigeni diversi)-parte variabile catena leggera e pesante-

parte costantefunzione effettricediversi tipi di risposta

2 catene leggere2 catene pesanti

IgM: risposta precoceprimariaIgG:primaria e secondariasistema digerente,lacrime, lattederma, tonsilleimplicate allergie

IgMSwitch di classedurante la rispostaFunzione effettrice diversa, stesso antigene riconosciuto IgA

IgG

IgE

cummings Eredità

Come agiscono gli anticorpi

cummings Eredità

NB: una cellula B produce un solo tipo di anticorpo(NB:, cfr esclusione allelica!)

eliminazione cells B autoreattiveproduzione di immunoglobuline

rilascio nel circolo sanguigno: quiescenzaincontro con antigene

ESPANSIONE CLONALE del clone la cui IgM riconosce l’antigenesecrezione IgGmaturazione Ig memoria

Switch di classe: passaggio alla produzionedi IgG, IgE, IgA con stessa specifitàper antigene e diversa funzione effettriceDeCarli Genetica Generale e Umana

Da dove deriva la capacità di generare un repertorio dianticorpi in grado di riconoscere un numero di antigenipraticamente illimitato?

-RICOMBINAZIONE SOMATICA dei loci codificanti per le immunoglobuline

-VARIABILITÀ NEI SITI DI RICOMBINAZIONE

-IPERMUTAZIONE SOMATICA

VARIABILITA’250VH 10D 4JE= 250x10x4= 10000 catene pesanti H250VK 4JK= 250x4 = 1000 catene leggere K2Vλ 3Jλ = 6 catene leggere λ

107 combinazioni H x L

con i meccanismi aggiuntivi (riarrangiamenti giunzione e ipermutazione somatica)

1010

DeCarli Genetica Generale e Umana

Uomo: cr.14=catene pesanti Hcr. 2 =catene leggere Kcr.22=catene leggere λ

RICOMBINAZIONESOMATICADNA dei loci IGGriarrangiatonelle cellule B rispettoalla linea germinale

CATENA PESANTE

la ricombinazione fra sequenze con spaziatori diversi (12 o 23) impone ordine VDJ, impedendo che vengano saltati i frammenti D

CATENA LEGGERA

VARIABILITA’250VH 10D 4JE= 250x10x4= 10000 catene pesanti H250VK 4JK= 250x4 = 1000 catene leggere K2Vλ 3Jλ = 6 catene leggere λ

107 combinazioni H x L

con i meccanismi aggiuntivi (riarrangiamenti giunzione e ipermutazione somatica)

1010

anche migliaia di basi!

1 giro di elica 2 giro di elicastruttuta riconosciuta dalle proteine che effettuano il taglio (Rag1 & Rag2)

rag1/rag2catalizzano i riarrangiamenti somatici“Ricombinazione VDJ” che permettono la formazione degli anticorpi.Agiscono tagliando specifiche sequenze di DNA RSS che fiancheggianogli elementi V, D,J.

RAG1 è simile agli elementiTransib (trasposoni di invertebrati)

http://biology.plosjournals.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1371/journal.pbio.0030181

conservazione aa conservazione RSS

Variabilità al sito di giunzione

se il riarrangiamento non è in frame, presumibilmente viene introdotto unoSTOP a valle > riarrangiamento non produttivo

persi o aggiunti

IPERMUTAZIONE SOMATICA

activation-induced cytidine deaminase (AID)=durante trascrizione deamina la citosina (C>U)sul DNA.

Se DNA viene replicato CG> TA

RIPARAZIONE:*corretta, BER> CG* creazione sito abasico ad opera diUracil-N glicosilasi > sito abasico >

inserzione base a caso* mismatch repair, error prone >A oT

NB

Tutte le IGG possono essere in membrana o essere secreteGENI PER LE CATENE PESANTI: splicing alternativo x selezione Igg

*di membrana*secrete

poliA alternativi

SWITCH DI CLASSE:*splicing alternativo SOLO per IgM e IgD, le uniche a poter essere coespressesulla stessa cellula

*RIARRANGIAMENTO DEL DNA *IRREVERSIBILE*INDOTTO DA SEGNALI SPECIFICI nel corso della risposta

*tipo antigene*tipo T helper*interazione con altre cellule del sistema immunitario

IgM IgD

RIARRANGIAMENTO DEL DNA

IgE

IgA

Ziqiang Li et al. Genes Dev. 2004; 18: 1-11

Figure 2. Model of class switch recombination

Sµ: promotori attivatidifferenzialmente nella risposta

fanno partire trascritti steriliche richiamano fattori/cofattoriche mediano il taglio del DNA

ESCLUSIONE ALLELICA: ogni cellula produce un solo tipo di anticorpo…

M P M P M P

Chr 2 Lk Chr 14 H Chr 22 Lλ

Riarrangiamenti casuali in successione temporale in cui un riarrangiamentoproduttivo + blocca l’ulteriore riarrangiamento sull’altro allele (che viene escluso)

..ma ogni cellula possiede 2 alleli (di origine materna, M e paterna P) perciascun locus…

le cellule B in cui non si verificano riarrangiamenti produttivi per una catena He una catena L, vengono eliminati

CELLULE T: presentano un TCR T Cell Receptor che riconosce l’antigene presentatoinsieme ad una molecola MHC

MHC I antigeni da trapianto: espressi su tutte le cellule, permettono riconoscimentoself/non self da parte dei linfociti killer. Riconoscimento di ogni cellula dell’organismo che viene infettataMHC II: espressi su linfociti B e macrofagi: riconosciuti da linfociti T helper>attivazione risposta

MHC: complesso maggiore di istocompatibilità, topoHLA: human leucocyte associated antigen, uomo

riconoscono poco il self:riconosceranno il proprio MHC solo

se associato a antigeni esterni

riconoscono troppoil selfno TRC non riconoscono

self

MHC: complesso maggiore di istocompatibilità, topoHLA: human leucocyte associated antigen, uomo

superfamigliaimmunoglobuline

MHC* allelismo multiplo* siti molto polimorfici * codominanti

microrganismi: evoluzione peptidi che non complessano MHCsistema immunitario:evoluzione continua di nuovi polimorfismi

elevata varietà nella popolazione

linkage disequilibrium: forte associazione allelica differenziale(combinazione alleliche con frquenza maggiore dell’atteso)che presumibilmente conferisce protezione contro un dato antigene

chr 6 Mchr 6 Pchr 6 Mchr 6 P

esistono *molti geni HLA *ogni gene HLA ha molti alleli codominanti (ex A1…..A9)milioni di combinazioni alleliche diverse

gemelli monozigotici > identicifratelli (vedi ex) 25% probabilità di essere compatibiliestranei: bassissima (nulla) probabilità <1/200.000APLOTIPO: combinazione genotipica degli alleli sul cromosoma

aplotipo A3B18C2D1aplotipo A9B21C3D6ogni individuo 2 chr 6 2 aplotipi HLA

MHC estraneo + peptide proprio se somiglia a MHC proprio + peptide estraneo

reazione immuntaria dirigetto

HLA: antigeni da trapiantoSUCCESSO TRAPIANTI: compatibilità HLA fra donatore e ricevente

correlazioni fra specifici alleli HLA e malattie:

correlazione fra HLAe suscettibilità a infezioni

linkage disequilibrium

Common west African HLA antigens are associated with protection from severemalaria.Hill AV, Allsopp CE, Kwiatkowski D, Anstey NM, Twumasi P, Rowe PA, Bennett S,Brewster D, McMichael AJ, Greenwood BM.Institute of Molecular Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital,UK.A large case-control study of malaria in West African children shows that ahuman leucocyte class I antigen (HLA-Bw53) and an HLA class II haplotype(DRB1*1302-DQB1*0501), common in West Africans but rare in other racial groups,are independently associated with protection from severe malaria. In thispopulation they account for as great a reduction in disease incidence as thesickle-cell haemoglobin variant. These data support the hypothesis that theextraordinary polymorphism of major histocompatibility complex genes has evolvedprimarily through natural selection by infectious pathogens.

Association between an MHC class II allele and clearance of hepatitis B virus inthe Gambia.Thursz MR, Kwiatkowski D, Allsopp CE, Greenwood BM, Thomas HC, Hill AV.

BACKGROUND. The course of hepatitis B virus (HBV) infection does not appear tobe determined by variations in viral virulence and may be influenced by the hostimmune response. CONCLUSIONS. The MHC class II alleleDRB1*1302 was associated with protection against persistent HBV infection amongboth children and adults in the Gambia.

GATA1

proteina eritroide-specifica che legaenhancer β-globina

*Gel shift, competizione, footpronting

*deduzione consensus

“GATA”

*ricerca consensus su altri geni eritroidi

tutti geni eritroidi hanno consensus GATA

“master gene” del differenziamento eritroide

Cloning of cDNA for the major DNA-binding protein of theerythroid lineage through expression in mammalian cells

Shih-Feng Tsai*†, David I. K. Martin*†, Leonard I. Zon*†, Alan D. D'Andrea*‡, Gordon G. Wong§ & Stuart H. Orkin*†

Nature 339, 446-451 (8 June 1989)

Genes expressed in erythroid cells contain binding sites for a cell-specific factor believed to be an important regulatorfor this haematopoietic lineage. Using high-level transient expression in mammalian cells, we have identified complementaryDNA encoding the murine protein. The factor, a new member of the zinc-finger family of DNA-binding proteins, is restrictedto erythroid cells at the level of RNA expression and is closely homologous between mouse and man.

clonaggio da cDNA expression library cDNA

*clonaggio DNA da cellule di topo 1 struttura gene

*studio proteina zinc finger 2 domini proteici

*pattern di espressione erithroid cells , megaKaryocites, eosinophils,mast cells, Sertoli cells of the testis

famiglia

ruolo

A

B

C

A: clonaggio e caratterizzazioneFamiglia di fattori trascrizionali : 1-3 ematopoietici 1 eritroide

2 progenitori3 T cells

GATA 4-6: altri tessuti

FUNZIONE DEL GENE

ABOLIZIONE FUNZIONE

OVERESPRESSIONE

ESPRESSIONE ECTOPICA

ESPRESSIONE LIVELLI DIVERSIin sistemi cellulariin sistemi animali: topo, zebrafish

Vannucchi A.

SU CELLULE ESGATA1 -/- RESCUING:

IN TOPO

*PROTEINA WT

*PROTEINA MUTATA (DELEZIONI VARI DOMINI, MUTAZIONI PUNTIFORMI ETC…)

*ALTRE PROTEINE GATA

NF CF

-Né GATA-1 ∆NF né ∆CF riescono a fare “rescue”

-Entrambi i domini Zinc-Finger sono necessari per la funzione di GATA-1(funzionano anche ZFs di altri geni!)

ruolo dominio proteico NFinger

E9.5 E15.5wt

∆ΝΤNF∆NF

−/− wt ∆NF

FOG

I VARI GATA SONO INTERSCAMBIABILI?

il livello si GATA è importante??delezione sequenze regolative

overespressione

CONTROLLO CICLO CELLULARE : bilanciamento proliferazione/differenziamento

differenziamento

autoregolazione

induzione bclxl ha effetto antiapoptotico

Fattori di crescita

struttura del gene e sequenze regolative

come????DNAseI etc…reporters etc.. in vivo in vitro

TRANSCRIPTIONAL REGULATION

TRANSLATIONAL REGULATION: alternative ATG

POSTTRANSLATIONAL REGULATION: *acetylation*phosphorilation*SUMOilation*protein degradation

PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS

synergism (FOG1, Cp2)Modulo GATA-1-Cp2Attivazione di geni eritroidi(GATA-1, NF-E2p45, EKLF)

antagonism (Pu.1)

ACUTE MEGAKARYOBLASTIC ANEMIA

TRANSIENT MYELOPROLIFERATIVE DISEASE

..modello multistep

MUTANTI: LINEA SOMATICA LEUCEMIEAcquired somatic mutations in GATA1 occur in virtually all children with Down Syndrome (DS) and congenital transient myeloproliferative syndrome (TMD) or acute megakaryocytic leukemia (AMKL, M7-ANLL). The mutations have also been detected in umbilical cord blood of DS patients and in fetal liver of aborted DS embryos. The mutations occur in-utero probably during fetal liverhematopoiesis. They consist of insertions, deletions and base substitution in exon 2 and vicinity and all result in elimination of the full length GATA1 protein with preservation of the GATA1s isoform. The presence of GATA1s in the absence of full length GAT A1 blocks megakaryocyticdifferentiation and promote proliferation of megakaryob lasts . The genes on chromosome 21 that promote this abnormality are unknown. GATA1 mutations are almost always associated withthe M7 leukemia in DS although they were also described in a pair of twins with acquired trisomy 21and in one adult non DS patient with M7. The down-regulations of genes regulated by GATA1 mayexplain the exquisite sensitivity of DS leukemic blasts to ACA-C.

modello di zebrefish-l’abolizione di miR451 (miR451-MO) riducefortemente la maturazione eritroide

riduzione espressione globine

miR TESSUTO SPECIFICO REGOLATO DA GATA1

abolizione GATA1abolizione miR451