POLICLINICO DI MODENA MEDICINA NUCLEARE

CONTROLLI DI QUALITA DEI RADIOFARMACI

Dr. Antonella FranceschettoUniversit degli Studi di Modena e Reggio EmiliaModena, 11 dicembre 2004

I radiofarmaci sono composti radioattivi usati per la diagnosi e la terapia di patologie delluomo. La maggior parte dei kits di radiofarmaci sono preparati usando il 99mTc. Il 99mTc si lega ad una molecola nel kit, chiamata ligando, studiata per localizzarsi in uno specifico organo/sistema.

La maggior parte del 99mTc deve legarsi al ligando e pertanto pochissimo 99mTc libero deve essere presente nel prodotto finale. Il 99mTc idrolizzato, altro prodotto secondario del processo di marcatura, deve essere presente anchesso in minima concentrazione. Sia il 99mTc libero che quello idrolizzato possono dare artefatti nelle immagini scintigrafiche (conseguenze: netta riduzione dellaccuratezza dellinterpretazione e della diagnosi).Dovendo essere somministrati alluomo, imperativo che i radiofarmaci siano sottoposti a stretti controlli di qualit.

CONTROLLI DI QUALITA

identit del prodotto sicurezza biologica

GARANZIA

efficacia del radiofarmaco

purezza radionuclidica

purezza radiochimica

CONTROLLI DI QUALITA

TESTS FISICO-CHIMICI

TESTS BIOLOGICI

TESTS BIOLOGICI Sterilit Apirogenicit Tossicit

Sterilit Apirogenicit TossicitAssenza di ogni tipo di batteri o microrganismi vitali in una preparazione radiofarmaceutica METODO PIU COMUNE DI STERILIZZAZIONE: filtri Millipore: -membrane di esteri della cellulosa -pori: 0,22-0,45 m TESTS DI STERILTA sono effettuati a campione dalla casa farmaceutica: - campione incubato a 30-35 C per 14 gg in un medium di tioglicolato - campione incubato a 20-25 C per 14 gg in un medium di caseina - valutazione della 14CO2 prodotta dal metabolismo del 14C-glucosio aggiunto nel campione, da eventuali microrganismi; durata test: 3-24 h

Sterilit Apirogenicit TossicitPirogeni: polisaccaridi o proteine prodotti dal metabolismo di microrganismi, in genere solubili e stabili al calore; : 0.05-1 m; es. endotossine, ma anche sostanze chimiche presenti nella soluzione del radiofarmaco. Reazioni: febbre, freddo, malessere, leucopenia, artralgie, vampate, sudorazioni, emicrania, dilatazione pupillare. Inizio sintomi: 30 min-2 h dopo la sommnistrazione Fine sintomi: 10-12 h dopo linizio della sintomatologia METODO PIU SEMPLICE PER OTTENERE LAPIROGENICITA: assicurare la sterilit TESTS: - Risposta febbrile nei topi entro 3 h dalliniezione del campione - LAL (limulus amebocyte lysate) test: formazione di un gel entro 1560 min se nel campione ci sono i pirogeni

Sterilit Apirogenicit Tossicit

TEST effettuato prima dellapprovazione per luso umano: - Somministrazione del radiofarmaco ad animali di laboratorio per 2-6 settimane e valutazione di eventuali cambiamenti fisiologici ed istologici

TESTS FISICO-CHIMICI Caratteristiche fisiche pH Purezza radionuclidica Purezza radiochimica

Caratteristiche fisiche pH Purezza radionuclidica Purezza radiochimica

CONTROLLO: visivo a) Colore soluzione chiara

b) Stato della soluzione soluzione priva di particelle

Caratteristiche fisiche pH Purezza radionuclidica Purezza radiochimica

pH ideale di un radiofarmaco 7,4 (2 pH 9) CONTROLLO: - pHmetro - metodo colorimetrico (cartine di tornasole)

Caratteristiche fisiche pH Purezza radionuclidica Purezza radiochimica

Frazione della radioattivit totale nella forma del radionuclide desiderato presente in un radiofarmaco. IMPURITA: es.99Mo

nelle preparazioni 99mTc-marcate isotopi dello I nelle preparazioni 131I-marcate

CONSEGUENZE: irradiazione indebita del paziente degradazione delle immagini scintigrafiche CONTROLLO: misurazione del T1/2 e delle radiazioni caratteristiche emesse dai singoli radionuclidi [ es. per i -emittenti, rivelatore NaI(Tl)]

Caratteristiche fisiche pH Purezza radionuclidica Purezza radiochimica

Frazione dellattivit totale dovuta al radionuclde considerato presente nella forma chimica desiderata.IMPURITA: decomposizione dovuta a -solvente -cambiamenti di temperatura e pH -luce -presenza di agenti ossidanti o riducenti -radiolisi CONSEGUENZE: -degradazione delle immagini scintigrafiche per aumento del background -irradiazione indebita del paziente -precipitazione -cromatografia planare -gel cromatografia -scambio ionico -estrazione con solvente -cromatografia liquida ad elevate prestazioni -distillazione

CONTROLLO:

CROMATOGRAFIAMETODOLOGIA ANALITICA CHE CONSENTE LA SEPARAZIONE DI DIFFERENTI SOSTANZE PRESENTI NELLO STESSO CAMPIONEGli elementi costitutivi di un campione sono separati per mezzo di una migrazione differenziale legata alla combinazione di 2 sistemi di forze: 1) 2) ritenzione su una fase stazionaria trascinamento di una fase mobile

INTERAZIONI FASE MOBILE - CAMPIONE - FASE STAZIONARIA

adsorbimento

scambio ionico

ripartizione

esclusione

Spesso il meccanismo che porta alla distribuzione delle sostanze tra le due fasi non mai univoco, ma coinvolge spesso uno o pi dei fenomeni riportati sopra.

LA FASE MOBILE: I SOLVENTI Il solvente usato rappresenta la fase mobile della procedura cromatografica. Con la salita del solvente nei media (fase stazionaria), possono essere separate le differenti specie presenti nel campione. La selezione di un solvente per un particolare test di purezza di un radiofarmaco si basa sulla conoscenza della solubilit di tutte le specie nel campione e della polarit dei media cromatografici. Pertanto una particolare combinazione di solvente e media pu fornire il test di purezza pi accurato.

SOLVENTI PIU COMUNEMENTE USATI IN CROMATOGRAFIAAcetone NaCl 20% Metanolo 85% Acqua distillata n-Butanolo HCl NaCl 0,9% Etanolo anidro Etil-acetato Acetonitrile Tetroidrofurano Cloroformio

LA FASE FISSA: I MEDIA I media che costituiscono la fase fissa sono dei solidi o dei liquidi, depositati su una superficie od introdotti in una colonna. I materiali utilizzati sono vari: carta (Whatman), film sottili (ITLC Gelman), colonne (Sep-Pak: gel di silice, allumina, idrossiapatite, acido silicidico derivatizzato con catene idrocarburiche, celite, resine o gel a cui sono legati gruppi ionizzabili, gel agarosici, poliacrilamidici e destranici).

MEDIA PIU COMUNEMENTE USATI IN CROMATOGRAFIA ITLC-SG Whatman 31 Whatman 3MM Colonne Sep-Pak ITLC-SA Whatman 17 Lamine di ossido di alluminio Solvent Saturation Pads

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TCL) TLC (Thin Layer Chromatography) tecnica pi utilizzata in medicina nucleare per controllare la purezza radiochimica. FASE STAZIONARIA: film sottilissimo su supporti di vari materiali, tagliati in varie lunghezze e larghezze. ITLC (Instant Thin Layer Chromatography) metodica pi utilizzata, riduce i tempi di analisi; supporto di fibra di fibra di vetro + fase stazionaria di gel di silice (ITLC-SG) o di acido silicico (ITLC-SA).Camera cromatografica

Fs

Fc

Fs: distanza punto origine-fronte del solvente Fc: distanza punto origine-centro della macchia del composto daanalizzare

Fs

Fc

Fs: distanza punto origine-fronte del solvente Fc: distanza punto origine-centro della macchia del composto da analizzare

Rf: Relative front; distanza relativa che un composto percorre rispetto alladistanza del fronte del solvente. Tipica del composto.

Rf = Fc / Fs

La distribuzione della radioattivit pu essere misurata con uno scanner TLC dove un integratore di dati pu estrapolare i grafici della distribuzione stessa in funzione della lunghezza della lastrina:

Origine

Fronte del solvente

Le specie presenti in un radiofarmaco marcato con essenzialmente tre: 99mTc idrolizzato (H) 99mTc pertecnetato (F; free) 99mTc complesso (B; bound) allora la purezza radiochimica (P.R.) data da:

99mTc

sono

P.R. (%): B / (B + H + F) x 100

dove B, H, F in cpm

Se B non separabile da H o F, si utilizza un sistema a doppia lastrina (ITLC) sfruttando il fatto che B ha un Rf differente se si utilizza acetone o fisiologica come fase mobile.

P.R. (%): Bcpm / (Bcpm + Hcpm + Fcpm) x 100

B (complesso) (%): 100 F (%) H (%)

CROMATOGRAFIA SU CARTA FASE STAZIONARIA: carta speciale (Whatman) su cui trattenuta lacqua o un adatto solvente apolare (cromatografia a fasi inverse). Leluente corre lungo le fibre di cellulosa trascinando con s in maniera differenziata le specie chimiche che vi sono state depositate. MECCANISMO DI SEPARAZIONE: ripartizione

CARATTERISTICHE DELLA CARTA: peso, spessore, capillarit, cio la velocit di salita delleluente. La velocit con cui si muove la fase mobile influenza lefficienza di una separazione. Il flusso delleluente dipende dalla sua viscosit, e quindi dalla temperatura, dallo spessore e dalla quantit della carta. Analogamente che per la TLC, anche qui abbiamo un Rf (Relative front): distanza relativa che un composto percorre rispetto alla distanza del fronte del solvente. Tipico del composto.

Efficienza inferiore che per la TLC. Infatti le macchie migrando tendono sempre ad ingrandirsi in seguito a fenomeni di diffusione, molto pi accentuati sulla carta che sugli strati sottili.

CROMATOGRAFIA SU COLONNA Si effettua ponendo in testa ad una colonna (pronta alluso, contenente la fase stazionaria) una certa quantit di miscela da separare. Facendo correre leluente nella colonna si ottiene la distribuzione dei componenti della miscela lungo la fase stazionaria. COLONNA: vetro con o senza rubinetto; parte inferiore con setto poroso FASE MOBILE: liquido organico a bassa viscosit o una soluzione tampone acquosa FASE STAZIONARIA: solida; liquida; gel COLLETTORE DI FRAZIONI: serie di provette (es. 100) per la raccolta frazionata delleluato che verr in seguito analizzato.

GEL FILTRATION CHROMATOGRAPHY (GFC) Cromatografia di esclusione sterica che permette di separare i componenti della miscela in esame sulla base delle loro dimensioni molecolari. GEL: eluente + particelle porose (pori ) sferica. Pi usato: Sephadex (polimeri a base di destrano), stabili nei solventi organici, in acqua, nelle soluzioni saline, alcaline o debolmente acide. I componenti del radiofarmaco sono separati in base alle dimensione e al peso delle loro molecole che determinano il percorso e la velocit delle molecle stesse nellattraversare le resine della colonna.

Le molecoli di maggiori dimensioni eluiranno per prime dalla colonna, con la stessa velocit delleluente non potendo passare nelle particelle del gel.

Eluiranno per ultime le molecole pi piccole che penetrano in tutte le particelle del gel restando pi a lungo intrappolate nella colonna.

CROMATOGRAFIA IN FASE LIQUIDA AD ELEVATE PRESTAZIONI (HPLC) Evoluzione strumentale della cromatografia in fase liquida su colonna classica e delle tecniche ad essa collegate. ELEVATE PRESTAZIONI: - in pochi min separazione di miscele anche complesse - determinare automaticamente la composizione quantitativa delle sostanze separate

FLUSSO DELLA FASE MOBILE: sistema di pompe sincrone

Es. colonna di 25 cm di lunghezza e 4 mm con fase stazionaria da 10 m richiede P di ingresso di ca 30 atmosfere perch un solvente come lesano la percorra con un flusso di 1 ml/min

HPLC: Sistema modulare

Esempio di cromatogramma HPLCLanalisi quantitativa di una miscela si basa sul calcolo dellarea o delle altezze dei picchi.

EFFICIENZA Capacit del sistema fase stazionaria-fase mobile nel mantenere stretti i picchiGRADO DI RISOLUZIONE DI UN SISTEMA CROMATOGRAFICO Dato dalla selettivit e dallefficienza

Poiche dalla coppia fase stazionaria-fase mobile che dipende il successo di una separazione, essa deve soddisfare alcune caratteristiche:FASE STAZIONARIAparticelle fini a) Particelle pellicolari di 40-50 m nucleo non poroso sferico, rivestito da sottile strato (spessore 1-3 m) poroso b) Microparticelle morfologia irregolare o sferica di 3-10 m

FASE MOBILEEluente: bassa viscosit non miscibile con la fase stazionaria capacit di solubilizzare il campione compatibilit con il rivelatore non essere corrosivo, tossico, volatile essere limpido, stabile, poco costoso, facilmente reperibile elevata purezza

Radiofarmaci99mTc-MAG399mTc-DMSA 99mTc-HMPAO 99mTc-MDP

(1) 99mTc-MAG399mTc-mercaptoacetiltriglicina

KIT (Mallinckrodt): il LIOFILIZZATO contiene betiatide [NN-N-(benzoil-tio)-acetiltriglicina] + cloruro stannoso + tartrato bisodico

USO: valutazione della funzionalit renale

99mTc-MAG3

MARCATURAGeneratore in uso da non pi di 7 gg99mTcO 4

Stato di ox del Tc: +510 min15 min

100C

pH: 5-6 RESA DI MARCATURA: 96% immediatamente dopo la ricostituzione 95% per 4 h dopo la marcatura USO: entro 4 h dalla ricostituzione T: 2-8 C prima e dopo marcatura, al riparo dalla luce

99mTc-MAG3

(2) 99mTc-DMSA99mTc-acido

dimercaptosuccinico

KIT (Nicomed Amersham Sorin): il LIOFILIZZATOcontiene 90% isomero meso-DMSA + 10% d,l-isomero + cloruro stannoso diidrato + acido ascorbico + bicarbonato di sodio

USO: imaging dellacorticale renale

MARCATURA99mTcO 4

Stato di ox del Tc: +310 minpH acido

Tc +3 pH basico Tc +5: Penta-DMSA Diagnosi per ca midollare tiroide pH: 2-4 EFFICIENZA DI MARCATURA: >95% USO: entro 6 h dalla ricostituzione T: 2-8 C prima e dopo marcatura CONSERVAZIONE: buio

99mTc-DMSA

(3) 99mTc-HMPAO99mTc-esametil-propilen

amino ossimecaptazione cerebrale inferiore NON UTILIZZATO

(99mTc-exametazime)STEREOISOMERI: d,l-HMPAO

meso-HMPAO

HMPAO

99mTc-HMPAOKIT (Amersham): il LIOFILIZZATO contiene d,l-HMPAO + cloruro stannoso diidrato + cloruro di sodio + atmosfera di azoto USO: imaging della perfusione cerebrale marcatura dei leucociti (granulociti)

d,l-HMPAO

d,l-99mTc-HMPAO

MARCATURAeluito da non pi di 2 h da un generatore eluito nelle ultime 24 h99mTcO 4

Stato di ox del Tc: +5EFFICIENZA DI MARCATURA: >80% se i campioni vengono prelevati entro 30 min dalla costituzione USO: entro 30 min dalla ricostituzione CONSERVAZIONE: T ambiente

99mTc-HMPAO

INSTABILE(complesso secondario meno lipofilo):

AGENTI NEI NUOVI KITS*

1) pH elevato dopo la ricostituzione (9-9,8) 2) radicali liberi intermedi 3) eccesso di ioni stannosi

BLU DI METILENETampone FOSFATO< pH = 6 -tampona i radicali liberi -ossida leccesso di ioni stannosi

USO: entro 4 h dalla ricostituzione

* non necessari per marcare i G.B.

99mTc-HMPAO

(4) 99mTc-MDP99mTc-metilen-difosfonato

(fam. fosfonati), pi usato

KIT: varia concentrazione di metilen-difosfonato + ionestannoso (dipende dalla casa farmaceutica) + antiossidanti

USO: imaging osseostabile in vivo: P-C-P non rotto dalla fosfatasi

MARCATURA

Stato di ox Tc: +3EFFICIENZA DI MARCATURA: >95% T: 2-8 C prima della marcatura 15-25 C dopo la marcatura USO: entro 6 h dalla ricostituzione

99mTcO 4

99mTc-MDP

DEGRADABILE CON IL TEMPO ( un chelato debole): produzione di impurit in presenza di O2 e radicali liberi da radiolisi

AGENTI ANTIOSSIDANTI NEI KITS

99mTc-MDP