Folding e misfolding delle proteine - liceojoyce.gov.it didattici/Ariccia 2015... ·...
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Prof. Niccolò TaddeiUniversità degli Studi di Firenze
Folding e misfolding delle proteine
15 Aprile 2015, Liceo Scientifico “James Joyce” Ariccia (RM)
ATCGATCGATCG… DNA
UAGCUAGCUAGC… RNA
Trascrizione
Il folding delle proteine è la “seconda metà” del codice genetico
LE PROTEINE – Folding
UAGCUAGCUAGC… RNA
AlaProLeuGlu… Proteina
Traduzione
Proteina
funzionale
Folding
LE PROTEINE – Folding
Premessa: la denaturazione di una proteina
Denaturazione indotta da agenti:• Fisici – Elevata temperatura, elevata pressione, forze di torsione e stiramento
• Chimici – Valori estremi di pH, tensioattivi, agenti caotropici, sali, solventi
native
ribosoma
partially
unfolded
unfolded
Le possibili conformazioni di una
proteinaLE PROTEINE – Folding
native
ribosoma
partially
unfolded
unfolded
Legame del ligando
o modificazioni covalenti
LE PROTEINE – Folding
Fibre
funzionali
Oligomeri
funzionali
native
ribosoma
partially
unfolded
unfolded
Legame del ligando
o modificazioni covalenti
LE PROTEINE – Folding
native
ribosoma
partially
unfolded
unfolded
Fibre
funzionali
Oligomeri
funzionali
Legame del ligando
o modificazioni covalenti
LE PROTEINE – Folding
Frammenti
degradati
native
Aggregati
disordinati
ribosome
partially
unfolded
unfolded
Fibre
funzionali
Oligomeri
funzionali
Legame del ligando
o modificazioni covalenti
LE PROTEINE – Folding
Aggregati
Native-like
Aggregati
disordinati
Frammenti
degradati
native
Aggregati
disordinati
ribosome
partially
unfolded
unfolded
Fibre
funzionali
Oligomeri
funzionali
Legame del ligando
o modificazioni covalenti
LE PROTEINE – Folding
Aggregati
native-like
Aggregati
disordinati
Aggregati con struttura ββββ(es. protofibrille)
Fibrille
amiloidi
Frammenti
degradati
Lo stato conformazionale esistente negli aggregati
proteici strutturati (fibrille amiloidi o loro precursori)
è il più stabile per una catena polipeptidica.LE PROTEINE – Folding
Lo stato conformazionale esistente negli aggregati
proteici strutturati (fibrille amiloidi o loro precursori)
è il più stabile per una catena polipeptidica.
Le fibrille amiloidi sono
il buco nero dell’universo proteico
LE PROTEINE – Folding
native
Aggregati
disordinati
ribosome
partially
unfolded
unfolded
Fibre
funzionali
Oligomeri
funzionali
Legame del ligando
o modificazioni covalenti
LE PROTEINE – Folding
Aggregati
native-like
Aggregati
disordinati
Aggregati con struttura ββββ(es. protofibrille)
Fibrille
amiloidi
Frammenti
degradati
ribosome
NAC?
Hsp70/40
PFD Hsp70/40
PFD
Hsp70/40
PFD/TriC
Hsp90
Hsp
104Hsp
104
proteasoma
Fibre
funzionali
Oligomeri
funzionali
Legame del ligando
o modificazioni covalenti
Hsp90
Hsp90
Hsp70/40
PFD/TriC
Hsp90
sHSP
Hsp70/40
PFD/TriC
Hsp90
sHSP
proteasoma
LE PROTEINE – Folding
Aggregati
native-like
Aggregati
disordinati
Aggregati con struttura ββββ(es. protofibrille)
Fibrille
amiloidi
proteasoma
Frammenti
degradati
Malattie da Misfolding proteico
Malattie dovute all’impossibilità di una proteina specifica o di un peptide ad adottare una struttura nativa stabile
1. Malattie in cui si ha una diminuita efficienza di “folding” di una proteina e in
LE PROTEINE – Misfolding
1. Malattie in cui si ha una diminuita efficienza di “folding” di una proteina e in cui quindi il paziente non beneficia di una quantità sufficiente di proteina funzionale Esempio: fibrosi cistica
2. Malattie in cui si ha un folding “scorretto” di una data proteina con conseguente difficoltà della proteina stessa a raggiungere il tessuto bersaglioEsempio: enfisema precoce
3. Malattie dovute alla conversione di una data proteina o peptide dalla sua forma solubile in aggregati fibrillari insolubili.Esempio: malattia di Alzheimer
LE PROTEINE – Misfolding
1. Malattie in cui si ha una diminuita efficienza di “folding” di una proteina e in cui quindi il paziente non beneficia di una quantità sufficiente di proteina funzionale Esempio: fibrosi cistica
CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
∆∆∆∆F508 = 70% dei casi di FC
LE PROTEINE – Misfolding
protease in the elastic tissues of the lungs (neutrophil elastase)
Alpha1 antitrypsin
2. Malattie in cui si ha un folding “scorretto” di una data proteina con conseguente difficoltà della proteina stessa a raggiungere il tessuto bersaglioEsempio: enfisema precoce
Forma attiva
reactive loop
neutrophil elastase
Alpha1 antitrypsin
Forma latente (+ stabile)
LE PROTEINE – Misfolding
3. Malattie dovute alla conversione di una data proteina o peptide dalla sua forma solubile in aggregati fibrillari insolubili (tossici).Esempio: Malattia di Alzheimer
proteina
nativa
aggregati
fibrillari
insolubili
LE PROTEINE – Misfolding
Alcuni esempi:
- Patologie neurodegenerative proteina che aggregaMalattia di Alzheimer peptide Aβ (1-40, 1-42)
Circa 40 patologie umane sono associate alla formazione di fibrille amiloidi
extracellulari o inclusioni intracellulari con caratteristiche amiloidi
Malattia di Alzheimer peptide Aβ (1-40, 1-42)
Encefalopatie spongiformi prione (intero o frammenti)
- Amiloidosi sistemiche proteina che aggregaAmiloidosi da catene leggere catene leggere delle immunoglobuline
Amiloidosi sistemica senile transtiretina
- Amiloidosi localizzate proteina che aggregaDiabete di tipo II amilina (IAPP)
Medullary carcinoma of the thyroid calcitonina
LE PROTEINE – Misfolding
1. Morfologia fibrillare osservabile con microscopio elettronico a trasmissione
2. Struttura “cross-β” monitorabile con diffrazione a raggi X
Le tre caratteristiche peculiari delle fibrille amiloidi
2. Struttura “cross-β” monitorabile con diffrazione a raggi X
3. Birifrangenza verde in presenza di Rosso Congo in luce polarizzata
LE PROTEINE – Misfolding
Prima caratteristica:
Morfologia fibrillare osservabile con microscopio elettronico
Amyloid fibrils of the Aβ1-40 peptide
by transmission electron microscopy
(Walsh et al. 1999. J. Biol. Chem. 274, 25945)
Amyloid fibrils of Aβ1-42 peptide
by atomic force microscopy(Harper et al. 1997, Chem. Biol. 4, 119)
200 nm200 nm
100 nm
LE PROTEINE – Misfolding
4.8 Å 4.8 Å
Seconda caratteristica:
Struttura “cross-β” monitorabile con diffrazione a raggi X
X-ray diffraction of Aββββ fibrils
Serpell, 2000, Bioch. Biophys. Acta 1502, 16-30
10-11 Å 10-11 Å
LE PROTEINE – Misfolding
Terza caratteristica:
Birifrangenza verde in presenza di Rosso Congo in luce polarizzata
Fibrillar deposits of ββββ2-microglobulinIvanova et al., 2003, Biochemistry 42, 13536-13540
LE PROTEINE – Misfolding
- Le fibrille amiloidi sono formate da
protofilamenti (diametro di 2-5 nm) che
si avvolgono o si associano lateralmente
a formare fibrille di diametro maggiore
(generalmente 7-13 nm o maggiore)(generalmente 7-13 nm o maggiore)
- Nei protofilamenti è presente una
struttura a foglietto ββββ. I singoli
filamenti ββββ sono paralleli tra di loro e
perpendicolari all’asse maggiore della
fibrilla.
Malattia di Alzheimer
Segni e sintomi clinici
- Perdita della memoria
- Decadimento cognitivo
- Instabilità comportamentale
LE PROTEINE – Misfolding
Istologia
- Riduzione delle sinapsi nel cervello
- Morte neuronale nel cervello (neurodegenerazione)
- Presenza di placche senili (amiloide extracellulare)
- Presenza di grovigli neurofibrillari (intracellulari)
Biochemistry
- Fibrille amiloidi extracellulari di peptide ββββ-amiloide
- Filamenti elicoidali appaiati intraneuronali di proteina tau
LE PROTEINE – Misfolding
Encefalopatie spongiformi trasmissibili
Segni e sintomi clinici
- Disfunzione neurologica che conduce a morte in tempi brevi
Forme cliniche:
- Malattia di Creutzfeld-Jacob (nell’uomo); morbo della mucca pazza; scrapie - Malattia di Creutzfeld-Jacob (nell’uomo); morbo della mucca pazza; scrapie
(nelle pecore)
Istologia:
- Formazione di depositi amiloidi extracellulari nel tessuto nervoso. Formazione di
vaste aree cave (spongiformi) nel cervello.
Biochimica
- Depositi amiloidi extracellulariformati da proteina prionica
LE PROTEINE – Misfolding
functional
fibres
functional
oligomersdisordered
aggregates
disordered
aggregates
native
disordered
aggregates
degraded
fragments
ribosome
partially
unfolded
unfolded
toxic!
Le possibili conformazioni di una catena polipeptidica
native-like
aggregates
disordered
aggregates
β-structured aggregates
(e.g. protofibrils)
Amyloid
fibrils
toxic! toxic!
toxic!
LE PROTEINE – Misfolding
Le cause della tossicità
Immagini al microscopioconfocale di cellule in coltura
alla presenza di aggregati proteici
Gli esperimenti mostrano che gli
aggregati possono inserirsi nelle
membrane cellulari
[Bucciantini et al., Nature 416, 507-511 (2002)]
LE PROTEINE – Misfolding
L’analisi in criomicrosciopiaelettronica di aggregati iniziali
di peptide Aββββ e αααα-sinucleina mostra chequesti assumono una forma a ciambella
Le cause della tossicità
Queste immagini sonomolto simili alle strutture generateda tossine batteriche che creano pori sulle membrane delle cellule
LE PROTEINE – Misfolding
Fibrille di dominio SH3 di IP-3K
Le fibrille hanno tutte le caratteristiche proprie delle fibrille amiloidi
LE PROTEINE – Misfolding
Fibrille di mioglobina
Le fibrille si formano rapidamente a seguito di riscaldamento della proteina in presenza di condizioni parzialmente denaturanti
[Fandrich et al., Nature 410, 165-166 (2001)]
LE PROTEINE – Misfolding
Numerose proteine non associate a patologie note sono state convertite in
fibrille amiloidi in vitro
Ecco alcuni esempi:
SH3 domain from PI3 kinase (Bovine)Betabellin 15D (human)Fibronectin type III module (Mouse)GAGA factor (D. melanogaster)Muscle acylphosphatase (Human)Tailspike protein (Bacteriophage P22)
B1 Ig-binding domain of protein G (Human)Amphoterin (Human)Curlin CgsA subunit (E. coli)αααα-lactalbumin (Human)V(L) domain of antibody F11 (Mouse)Prothymosin αααα (mammalian)Tailspike protein (Bacteriophage P22)
Cold shock protein A (human)Monellin (D. camminsii )Phosphoglycerate kinase (Yeast)Apolipoprotein C-II (Human)Glycoprotein B fragment (Herpes S. virus)Fiber protein (Adenovirus)ADA2h (Human)Met aminopeptidase (P. furiosus)HypF N-terminal domain (E. coli)Lysozyme (Hen)Apocytochrome c (H. thermophilus)Apomyoglobin (Horse)
Prothymosin αααα (mammalian)Acidic fibroblast growth factor (N. viridescens)Stefin B (Human)ββββ-lactoglobulin (Human)Endostatin (Human)Barstar (Bacillus amyloliquefaciens)Chaplins (S. coelicolor)fragment of Pmel17 (Human)acylphosphatase (Sulfolobus solfataricus)S6 (Thermus thermophilus)histones (Human)αααα-chymotrypsin (Human)AcPDro-2 (Drosophila melanogaster)
LE PROTEINE – Misfolding
Le proteine sono polimeri “evoluti”
Una fibrilla amiloide rappresenta la struttura “primordiale” di una proteina che è determinata dalle proprietà intrinseche della catena principale del
polipeptide
Le proteina naturali possiedono sequenze altamente selezionate in cui le interazioni fra catene laterali sono tali da impedire lo sviluppo delle
preferenze conformazionali della catena principale e determinanola struttura nativa della proteina stessa