ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN

FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE)

SALVATORE GIRLANDO

LABORATORIO PATOLOGIA MOLECOLAREANATOMIA PATOLOGICA

TRENTO

Estrazione acidi nucleici

• Estrazione DNA primo passo nelle applicazioni di biologia molecolare

• Metodi si basano sul tipo di acido nucleico che si vuole estrarre (DNA/RNA)

• Materiale di partenza ad esempio sangue o tessuti o altro materiale

• Risultato desiderato (quantità, purezza)

• Applicazione prevista post-estrazione ad esempio tipo di indagine molecolare

Estrazione acidi nucleici

• DNA molecola molto lunga soggetta a frammentazioni

• Difficile estrarlo in forma intatta

• Frammenti di 50 – 100 kilobasi (kb) sono ottimi per effettuare tutte le indagini di biologia molecolare

• Da materiale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) il DNA si presenta molto degradato ed è consigliabile amplificare al massimo frammenti di 300 bp

Estrazione degli acidi nucleici

• Può essere estratto da qualsiasi tessuto o cellula nucleata

• Da materiale fresco e/o congelato

• Da materiale fissato in formalina e incluso in paraffina

• Altro (sangue, plasma, capelli, frammenti di tessuti, ecc.)

Estrazione degli acidi nucleici (DNA/RNA) da campioni fissati in

formalina e inclusi in paraffina (FFPE): fasi

1. Taglio 8-10 fette da biopsie, 2-3 da pezzo operatorio dello spessore di 10 µm

2. Sparaffinatura/digestione O.N. con tampone di lisi più proteinasi K

3. Purificazione dell’acido nucleico (più metodi)

4. Precipitazione DNA

5. Valutazione quantitativa

6. Conservazione

1. Taglio delle fette di tessuto

• Da pezzo operatorio: 3-4 fette spesse 10 µm in provetta o su vetrino

• Da biopsia: 7-8 fette sempre dello stesso spessore (10µm )

• Altri metodi prevedono lo scraping, direttamente da vetrino, di cellule o fette di tessuto precedentemente colorate e utilizzati per diagnosi cito o istologiche

Fase 2. Processo di Sparaffinatura

• Aggiungere 1 ml di xilene e mescolare per 10 minuti

• Centrifugare a 12000 rpm per 5 minuti

• Eliminare il surnatante facendo attenzione al pellet

• Si ripete una seconda volta il passaggio

2. Processo di sparaffinatura

• Aggiungere 1 ml di Etanolo Assoluto

• Mescolare per 5 min

• Centrifugare a 12000 rpm per 2 min

• Eliminare l’Etanolo assoluto facendo attenzione a non toccare il pellet

• Fare asciugare i campioni e aggiungere il tampone di lisi (TRIS-HCl 50 mM ph 8.3) e proteinasi K (20 mg/ml)

3. Purificazione acidi nucleici

� Metodo fenolo/cloroformio (miscela fenolo:cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1)

� Metodo del salting out (precipitazione delle molecole proteiche)

� Kits commerciali (molto in uso), maggiore velocità di estrazione

Purificazione Fenolo/Cloroformio

• Inattivazione della proteinasi K ad alta temperatura

• Purificazione con miscela fenolo: cloroformio: isoamil alcool (25:24:1)

• Separa una componete organica inferiore contenete lipidi, proteine e estratti cellulari

• Fase acquosa superiore contenente gli acidi nucleici

• Fase intermedia proteine denaturate e in parte dissolte dal fenolo

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� Precipitazione DNA

- Aggiunta etanolo assoluto (1 mL) e tampone ad alta forza ionica (50 µL)

(Na acetato 3 M pH 5.2)

- Precipitazione DNA (formazione gomitolo)

- Centrifugazione a velocità alta (12.000 rpm)

- Lavaggio pellet con etanolo 70 %(1 mL) per rimuovere sali in eccesso

- Evaporazione etanolo (potente inibitore enzimatico), per almeno

15 min a provetta aperta

- Il DNA precipitato e asciutto può essere conservato a -20°C.

� Risospensione DNA precipitato

- Il DNA viene risospeso in H2O o nel tampone previsto dalla metodica.

- Può essere conservato a +4°C per qualche settimana o a - 80°C per molti anni (evitare i congelamenti e scongelamenti ripetuti

che danneggiano il DNA)

Estrazione fenolo/cloroformio

• Precipitazione del DNA in etanolo assoluto e in presenza di Sali ad alte concentrazioni (100 – 500 mM) per eliminare i residui di Fenolo e cloroformio

• Eliminazione surnatante e successivo lavaggio con EtOH 70% per eliminare i cationi

• Centrifugazione ed eliminazione dell’ETOH 70%

• Risospendere il pellet con buffer TE o con H2O

Purificazione con metodica salting-out

• Dopo inattivazione della proteinasi K mediante alta temperatura vengono aggiunte 200µl di ammonio acetato (sale) 4 M favorendo la precipitazione delle proteine

• Campioni vengono vortexati e centrifugati ad alta velocità per 3 min.

• Trasferimento del surnatante in altra provetta e aggiunta di isopropanolo (600 ul)

Purificazione con metodica salting-out

• Centrifugazione ad alta velocità per 5 min.

• Pellet lavato con ETOH 70% e centrifugazione sempre ad alta velocità per 1 min

• Eliminazione del surnatante

• DNA sciolto in 50 µl di TE o H2O

Estrazione con kit commerciale (Qiagen)

• QIAmp DNA mini kit

• QIAmp DNA FFPE kit (specifico per tessuti paraffinati)

• Accorciamento dei tempi di estrazione

• Minore resa in termini di concentrazione di DNA (solo se si usa sistema automatizzato)

Purificazione DNA da tessuti FFPE

• Lasciare asciugare il pellet facendo attenzione a non seccarlo

• Risospendere in 180 µl di buffer ATL contenente detergenti più 20 µl di proteinasi k

• Incubare a 56°C per almeno 3 ore o fino a che il pellet non sia completamente digerito

• Procedere con la fase di purificazione

Purificazione DNA da tessuti FFPE

• Aggiungere 200 µl di buffer AL contenente agenti caotropici e incubare per 10 min a 70°C;

• Aggiungere 200 µl di ETOH ass.

• Trasferire il tutto in una colonnina con una base di silice, centrifugare

• Fare lavaggi con due passaggi con buffer AW1 e AW2 per lavare il DNA legati alla membrana

• Eluire con 50 – 200 µl di buffer AE o H2O

Blocchetto paraffina Ematossilina/eosina Fetta in bianco

MACRODISSEZIONE

Biopsia bronchialecolorazione EE

Dopo microdissezione

MICRODISSEZIONE

Dopomicrodissezione

Agoaspiratopolmonare citologico

MICRODISSEZIONE

BAL > 50 tumor cells

Esperienza di Modena