ESPERIENZE E RICERCHE Proprietà fisico-chimiche...

ESPERIENZE E RICERCHE

Proprietà fisico-chimiche, biologiche e sierologiche di due Enterovirus isolati dal bovino

ZEFFIRINO ORFEI, ANGELO PERSECHINO (• ). PAOLA LUPJNI (••) e LUIGI BELLANI (•••)

Laboratori di Veterinaria

Riassunto. - Gli AA. rifer iscono sull'identificazione di due agenti virali (EV-130 ed EV-150) isolati in coltura di tessuti , da feci di vit elli con affezioni entero-respiratorie acute. Entrambi i virus svilup_pano su cellule renali di embrione bovino e su cellule renali di scimm1a ; in colture primarie di rene bovino formano placche di citonecrosi ; la loro fase di eclissi è di circa l ora , dopodichè essi entrano nella fase di sviluppo raggiungendo il massimo t itolo dopo 48-72 ore. Non posseggono potere emoagglutinante, nè potere emoadsorbente. Osservati al microscopio elettronico, pr~sentano un diametro di circa 15-20 m fl.; sono resist~nti al trattamento con et ere (20 %), cloroformio (10 %) e saponina {0,1 %) e sono abbastanza st abili in un'ampia zona di pH (2,13 - 9,7) . La loro moltiplicazione in vitro, mentre non viene per nulla infiuen7ata dalla presenza di 50-lOOy/ml di 5-iodo-2 ' -deossiuridina nel terreno colturale, risulta invece completamente inibita dal 2-( IX-idrossibenzil) benzimidazolo alla concentrazione 219-493 !J.M. La loro termoresistenza a 560C viene notevolmente potenziata dalla presenza di cationi bivalenti (Mg++, Ca ++) in concentrazione l M.

Inoculati per diverse vie, non inducono disturbi clinici apprezzabili nel bovino, scimmia, coniglio, cavia e topino.

Nelle prove di siero-neutralizzazione crociata, i due virus mostrano solo una lieve differenza antigenica. I due agenti isolati posson.o quindi essere compresi in un unico prototipo, fra gli Enterovirus del Bovino.

Summary. (Physico-chemical, biologica[ and serological properties of two enterovimses isolated (rom cattle). - This paper concerns the identification of two virai agents (EV-130 and EV-150) isolat ed b y tissue cultures from faeces of calves suffering from an acute entcric-respiratory syndrome. Phy-

(•) Istituto Clinica Medica Vet erinaria, Università d i Napoli. Ospite dei Laboratori di Veterinaria.

(•.• ) Borsist a dei Laborator i ùi Vet~rinariu.

(• ••) Ospite dei Laborat ori di Veterinaria.

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sico-chemical properties of the two agents, their experimental pathogenicity in cows and in laboratory animala, their development in various celi cultures, their replication cycle in primary cultures of. bovine kidney cells and their hemagglutination power are studied .

The two viruses multiply in bovine emhryo kidney celi cultures (Fig. l) as well as in monkey kidney celi cultures, either at 33oC or 37oC. They do not multiply in pig kidney celi cultures. In bovine kidney primary celi cuitures both the virai agents studied form round and clear outlined cytonecrosis <t plaques ))' which appear on the 3rd_4th day. Their latency time is about one hour, then the growth phase starts, and the highest t1tre is reached on the 48th-72th hour (Fig. 2).

Bovine, sheep, monkey, guinea-pig, chicken, rat and mouse erythrocytes are not agglutinated by thcm. They also do not show hemoadsorbent power at 4oC with guinea-pig erythrocytes. Both viruses observed at the electron microscope in negatively stained preparations (Platea I and II), showed 15-20 mfJ. in diameter. They were resistant to treatment with ether (20 % ), chloroform (lO % ) and saponin (0.1 %) (Table 2). Both agents are stable over a large pH area (2.13-9.7) (Table 5). They multiply in a medium containing 50-100 yfml of 5-iodo-2'-deoxyuridine (Table 6), but they do not multiply in m edium containing 2-(cx-hydroxyhenzyl) benzimidazole 219-493 fJ.M (Fig. 3 and 4). They survive more than lO' at 56°C, more than 7 days a t 37oC, more than 8 days a t 26oC and more than 75 days at 4oC temperature (Table 3). They are more resistant at 56o C temperature in solutions containin g MgCI2 or CaCl2 lM (Table 4).

Both the viruses studiM seem to be deprived ' of pathogenicity for calves, monkeys, rabbits, guinea-pigs and newborn mice. In the cross-sérological t esta, thcy show only a little antigenic difference by the ratio R calculation (Table 1). These findings seem to demonstrate that the two virai agents, isolated by the Authors, can be included in only one prototype, related with Bovine Entcroviruses. -[

Le prime segnalazioni sull'isolamento di agenti virali su colture cellulari, a partire da materiale fecale di bovini, risalgono al 1957 ad opera di KuNIN & MINUSE (1957), KLEIN & EARLY tl957), MoLL & FINLAYSON (1957). Sia questi AA., sia quelli che successivamente (MoLL & DAVIS, 1959; BoGEL & MussGAY, 1960; BoGEL, 1961; DINTER & BAKos, 1961; H ucK, 1961; FLORENT et al., 1961 ; BoNTSCBEV, CHRISTOV & ANDREEV, 1963; SPRADBROW, 1964 ; H ucK & CARTWRIGHT, 1964 ; McFERRAN, 1958 ; McFERRAN, 1961 ; McFERRAN, 1962; SoLIMAN, 1959; INABA et al., 1962; Moscovici et al., 1961 ; LUGINBUHL & BLACK, 1960 ; LIESS & HoPKAN, 1962 ; Bi.iRKI, 1962; CLIVER & BooL, 1962; LA PLACA, 1963; MoLL & ULRICH, "1963;

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FALK, 1964; YA?tiADA, 1964) hanno isolato dal bovino altri agenti riportabili fra i virus enterici, sono concordi nell'ammettere l' inesistenza di una correlazione tra presenza di tali virus nell'organismo ospite e processi morbosi in atto. Anche i risultati di infezioni sperimentali su bovini ed animali di laboratorio depongono per uno scarso potere patogeno di questi virus.

I criteri che vengono seguiti per la caratterizzazione degli Enterovirus Bovini possono essere così riassunti : isolamento dall'intestino del bovino; dimensioni oscillanti tra 15-30 m(.L circa ; mancanza di lipidi essenziali ; acido nucleico di tipo RNA ; stabilità in un 'ampia zona di pH ; t ermo-resistenza a 370 c S6o C, potenziata dalla presenza di cationi bivalenti, in concentrazione l M.

R ecentemente, allo scopo di poter meglio differenziare questi virus enterici dai Rinovirus e dal virus dell'Mta Epizootica, è stato proposto l'impiego del 2-(oc-idrossibenzil)-benzimidazolo (HBB) e del cloridrato di guanidina (EccERS & TAMM, 1961 ; DINTER, 1964), sostanze che permettono di rilevare un diverso meccanismo nella sintesi dell'acido ribonucleico di questi virus.

Da qualche anno vengono da noi condotte !ndagini epi:wologiche nei riguardi delle malattie infèttive e contagiose dell'apparato respiratorio d el bovino, in collaborazione con l'Istituto di Patologia Speciale e Clinica Medica Veterinaria dell' Università di Perugia, allo scopo di poter accertare il ruolo esercitato dagli agenti virati nel det erminismo di tali processi morbosi.

Nel corso di queste indagini ci è stato possibile isolare, durante enzoozie respiratorie, alcuni agenti virati in coltura di t essuti. Abbiamo già riferito sulla identificazione del virus della Rinotracheite Infettiva del Bovino in precedenti note (MonETTI et al., 1964 ; AvEL.LINI et al., 1965 ; STEVE-BOCCIA· BELLI et al., 1965 a; b ; PERSECHINO, MERUCCI & 0RFEI, l965a) ; in questa riportiamo l'isolamento e lo studio delle proprietà fisico-chimiche, sierologiche e biologiche di due agenti virati isolati da materiale fecale di vitelli con affezioni entero-respiratorie acute.

Lo studio dei virus enterici degli animali domestici e del bovino in particolare, riveste infatti grande importanza, poichè, mentre per l'uomo si è giunti ad identificare una serie numerosa di tipi antigeni (circa 59), nel bovino lo studio di alcuni prototipi ha permesso di definire solo due gruppi sierologici fondamentali (LA PLACA, 1963) variamente correlati fra loro, e ciò, forse, per lo scarso numero di virus enterici isolati finora.

MATERIALI E METODI

Colture di tessuti. - Sono state allestite colture primarie in monostrato di cellule renali di embrione di bovino mediante tripsinizzazione secondo il metodo di Du LBECCO & Voc T (1954) modificato da YouNGNER (1954), e fatte

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sviluppare in soluzione di Hanks (HANKS & WALLACE, 1949) contenente il lO% di siero di agnello, lo 0,5 % di idrolisato di lattalhumina ed antibiotici (100 U.I. di penicillina, lOOy di streptomicina, 3y di fungizonefml). La sospensione cellulare (200.000 cellulefml) è stata distribuita in tubi-coltura {l ml), in matracci a fondo pianeggiante da 100 ml (6 ml) ed in bottiglie di Kolle {15 ml). Il medesimo procedimento è stato usato per ·allestire le cellule renali di embrione di suino e di scimmia. Le colture sono state poi messe ad incubare in posizione stazionaria a 37o C. Dopo 4-5 giorni il liquido colturale è stato sostituito con terreno di mantenimento (Earle) preparato secondo quanto riportato da LÉPINE (1964), contenente il 2 % di siero di agnello, lo 0,5 % di idrolisato di lattalbumina ed antibiotici nella concentrazione descritta per il terreno di Hanks.

Isolamento del virus. - P er l' isolamento del virus dalle feci è stata se· guita la tecnica descritta da MAYR & BocEL (1961) : l g di materiale fecale è stato sciolto in 9 mi di soluzione tamponata PBS (DuLBECCO & VocT, 1954) mediante agitazione in matracci contenenti palline di vetro; successivamente il materiale è stato centrifugato per 30' a 3.000 g.p.m. ed il sopranatante, al quale era stato aggiunto il lO % di cloroformio è stato posto a 4° C per 12 ore. Dopo un 'ulteriore centrifugazione per 30' a 3.000 g.p.m., con il sopranatante di ogni campione sono stati insemenzati 5 tubi-coltura (0,1 mi), messi ad incubare a 37o C e controllati ogni 24 ore per 5-7 giorni, prima di effettuare nuovi passaggi. I'er ogni campione si sono compiuti tre passaggi ciechi. Le colture dell'ultimo passaggio anche se non presentavano alcun effetto citopatico sono state esaminate col test dell'emoadsorbimento (VoGEL & SHELOKOV, 1957), usando eritrociti di cavia.

Virus. - Si sono usati i due agenti citopatici isolati, denominati virus enterici 130 e 150 (EV-130, EV-150) ed il virus della Rinotracheite Infettiva del bovino ceppo R/63 (MORETTI et al., 1964).

Campioni di sieri. - Si sono usati sieri prelevati da vitelli all'atto della raccolta dei campioni di feci e dopo circa 60 giorni.

A ntisieri da coniglio e da bovino. - Sieri specifici contro i virus isolati sono stati prodotti. su conigli mediante due inoculazioni in vena, con un inter· vallo di 14 giorni l'una dall'altra, ciascuna di 2 ml di virus al 40 passaggio (titolo dei virus EV-130, EV-150 rispettivamente di 106, 106.5 TCID50fO,l ml). Dopo 15 giorni dall'ultima inoculazione si è proceduto al salasso, ed il siero ottenuto è stato posto a - 30° C.

Sono stati anche usati sieri di bovini (età media 18 mesi) inoculati spe· rimentalmente per diverse vie con i ceppi di virus isolati (4° passaggio). I prelievi dei campioni di sangue sono stati fatti prima e dopo 3, lO e 17 giorru dalla prova d'mfezione.

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Tito/azione dell'attivita infettante. - Sono state effettuate diluizioni scalari in ragione lO di virus in terreno di Earle privo di siero, e con ciascuna diluizione si sono inoculati (0,1 ml) 5 tubi-coltura contenenti 1,9 ml di terreno di mantenimento.

Con il metodo di REED & MuENCH (1938) si è calcolata la dose infettante 50 per le colture di tessuti (TCID50 ) in 0,1 ml.

Curva di sviluppo dei virus. - Tubi-coltura in sa. giornata d 'incubazione, contenenti 0,9 mi di terreno di Earle, sono stati infettati con 300 TCID50 in 0,1 ml di virus al 7° passaggio e posti ad incubare a 37° C. Dopo un'ora di adsorbimento, il liquido colturale è stato rimosso ed il tappeto cellulare lavato 3 volte con PBS ; quindi in ciascun tubo è stato posto l mi di nuovo terreno di Earle. Ad intervalli diversi di t empo (l-3-6-10-16-24-48-72-96-120 ore) si è proceduto al prelevamento di gruppi di 4 tubi-coltura per ciascun virus, ponendoli di volta in volta a conge1are a - 30°C. Effettuato l'ultimo prelevamento si è proceduto allo scongelamento e centrifugazione (270 g per lO') del materiale contenuto nei tubi, e quindi alla titolazione del virus.

Produzione di placche. - I monostrati di cellul~ di rene bovino sono stati fatti sviluppare in matracci'da 100 ml ed in bottiglie di Kolle, come è stato già riportato ; l'infezione è avvenuta con 0,2 ml di sospensione di virus a varie diluizioni, previo lavaggio con PBS del tappeto cellulare. Dopo adsorbimento per un'ora del virus a 37°C, le colture sono state di nuovo lavate, quindi, nei matracci e nelle bottiglie di Kolle sono stati aggiunti rispettivamente 8 e 16 ml di terreno-agar così costituito : a parti uguali di terreno nutritivo [Eagle contenente il 2 % di siero di pollo, l' l % di siero di vitello ed arginina nella quantità di 0,126 gflitro secondo PHILIPSON (1961)] ed agar (Nohle Difco al 2 %) è stato aggiunto rosso neutro alla concentrazione finale di 1{30.000.

Il conteggio delle placche è stato fatto dopo 3-4-5 giorni dall'infezione, a seconda della concentrazion e di virus usata.

Osservazione al microscopio ottico. - Sono state utilizzate colture di cellule renali di embrione bovino fatte sviluppare in tubi di Leighton ; prima e ad intervalli diversi di tempo dopo l'infezione (100 TCID50 in 0,1 ml) , monostrati sono stati fissati in Bouin c colorati con ematossilina-eosina.

Osservazione al microscopio elettronico. - P er la preparazione e purificazione del virus, il matenale colturale (con effetto citopatico completo) è stato centrifugato a 1.085 g per 30'; il supernatante fissato con una soluzione di formolo e acetato di magnesio (l ml di formolo ; 4 ml di magnesio acetato 0,001 M) alla concentrazione del lO %, è stato poi centrifugato a 40.000 g.p.m. (Spinco-L rotore 40) per 90' . La sospensione virale è stata

.d1m. 1st. Super. Sa11 i tà (1966) 2, 12·28 .


mescolata con fosfotungstato di potassio (PT A) ed osservata m contrasto negativo (BRENNER & HORNE, 1959).

Prove di siero-neutralizzazione. - Con i sieri in esame inattivati, si sono allestite diluizioni scalari in base 2 in terreno di Earle. Ciascuna diluizione è stata mescolata ad uguale quantità di virus (100-300 TCID60 in 0,1 mi) e tenuta a contatto per 90' a 37°C, quindi inoculata in 5 tubi-coltura {0,2 mi) contenenti 1,8 ml di terreno di mantenimento. Sono stati altresì inoculati tubi-coltura controllo, con virus a varie diluizioni, per poter controllare le TCID60 usate. Quale dose protettiva 50 del siero è stata considerata quella diluizione che ha protetto completamente dall'effetto citopatico il 50 % dei tubi-coltura inoculati.

Emoagglutinazione ed emoadsorbimento. - Nelle prove di emoagglutinar;ione sono stati impiegati globuli rossi di bovino, montone, scimmia, coniglio, cavia, pollo, ratto e topo, lavati con soluzione di PBS e conservati in soluzione di Alsewer. Sono state fatte diluizioni seriali in base 2 delle sospensioni virali, (0,5 mi) e, a ciascuna diluizione, sono stati aggiunti 0,5 mi delle varie sospensioni di globuli rossi allo 0,5 % ; la lettura è stata effettuata dopo l ora per le sospensioni tenute a 370C, dopo 2 ore per quelle mantenute a + 40C. La prova di emoadsorbimento è stata eseguita immettendo in ciascun tubo-coltura con effetto citopatico iniziale, previo lavaggio con PBS, 0,5 mi di sospensione di emazie di cavia allo 0,5 %· La lettura è stata fatta dopo permanenza delle colture a + 40C per 30' .

. Prove di resistenza al clwo(ormio, etere e saponina. - L'azione del cloro-

formio è stata saggiata col metodo proposto da MAYR & BoGEL ~61). Le sospensioni virali (4° passaggio) sono state unite a cloroformio per analisi (9 mi di virus, l mi di cloroformio), agitate per l ora a 40C e poste in frigorifero per 18 ore; dopo una successiva agitazione sono state centrifugate per l ora a 1.085 g, ed-il' liquido dello strato superiore è stato usato per la determinazione del titolo.

L'effetto dell'etere è stato saggiato col metodo di ANDREWES & HosTMAN (l949). Le sospensioni di virus-coltura sono state unite con etere puro per anestesia (8 mi di virus, 2 mi di etere) e poste in contenitori chiusi ermeticamente. Dopo agitazione c mantenimento per 18 ore a 40C, le mescolanze sono state tenute sotto cappa sterile in piastre di Petri, fino all'evaporazione dell'etere (30' circa), e successivamente titolate.

La tecnica seguita per la prova ùi resistenza alla saponina è quella descritta da BoGEL & MAYR (1962). Le sospensioni di virus contenenti lo 0,1 % di saponina sono state tenute per circa 18 ore in frigorifero (40C), prima della determinazione del titolo di infettività. In tutte le prove è stato eseguito il relativo controllo.

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Prove di resistenza a varie temperature in presenza. ed in assenza di cationi bivalenti. - - Le temperature prese in esame con i due virus (6o passaggio) sono state : 4-26-37-56°C per tempi diversi. L e sospensioni virali mantenute a + 4°C sono state titolate dopo 5-10-15-20-30-45-60-75 giorni, quelle poste a temperatura ambiente (26°C) dopo 5-10-24 ore e dopo 2-4-6-8 giorni, quelle tenute a 37°C dopo 6-12-24 ore e dopo 2-4-7 giorni. Nella prova di stabilità con cationi ci si è attenuti alla tecnica riportata da WALLIS & MEL· NICK (1962). I virus, diluiti 1/10 in acqua bidistillata, sono stati uniti in parti uguali con le soluzioni saline (CaCl2 l M e MgClt l M) c saggiati alla tcmpe· ratura di 56°C ; le mescolanze e relativi controlli sono stati titolati dopo 10'-30' e 60' .

Prova di resistenza a vari pH. - P er portare le sospensioni virati alle concentrazioni di ioni idrogeno desiderate, si sono usate diverse soluzioni tampone al Veronal-Acetato. In una prova preliminaze le sospensioni virali (7° passaggio), diluite 1/10 nelle soluzioni a vari pH (2,13 • 2,7 • 4,3 · 5,3 · 6,0 • 6,7 • 6,9 • 7,3 • 7,8 · 8 ,5 · 8,7 • 9,7), sono state lasciate a temperatura ambiente (260 C) per 5'-10'-20'-30'-60' ; quindi i valori dei pH sono stati riportati a 7 con HCl 0,3N o con NaOH 0,3N, e con ciascuna mescolanza sono stati -inoculati 5 tubi-coltura (O, l mi) allo sc~po di evidenziare la pre· senza o meno di virus. In' prove successive, seguendo la stessa metodica, i due virus sono stati saggiati solo a pH 5,3 e 2,7 ; le mescolanze virali, tenute a bagnomaria a 37° C per 30' , sono state poi titolate.

Determinazione del tipo di acido nucleico. - Tubi-coltura contenenti l mi di terreno di Earle con 50 e 100 y di 5-iodo-2'-deossiuridina (IDU), sono stati infettati con 300 TCID50 in 0,1 mi di virus (So passaggio) e poste ad incubare a 37°C. Il titolo d'infettività è stato det erminato dopo permanenza delle colture in termostato per 3 giorni, prcvio congelamento e scon· gelamento del materiale colturale. Le relative prove di controllo sono state eseguite con i due ceppi di virus in assenza di IDU e con il ceppo R/63 del virus della Rinotracheite Infettiva del Bovino in presenza di JDU.

Prova di inibizione con 2-(rJ.·idrossibenzil)-benzimidazolo (HBB). Per differenziare i virus enterici dai rinovirus si è impiegato l'HBB, anzichè 1l cloridrato di guanidina, poichè la sua azion e inibente non viene bloccata dalla presenza di alcuni amminoacidi contenuti nei vari terreni colturali (DIN· TER & BENGTSSON, 1964). La sostanza (cortesemente inviataci dalla ditta Merck Sharp and Dhome) è stata usata alla concentrazione 219 ILM e 493 !J.M, sciolta in terreno di Eagle privo di siero e proteine, mediante agitazione a 370 C per 8 ore. Per ogni ceppo di virus sono stati infettati tre gruppi di 25 tubi-coltura, privi di terreno, con 300 TCID50 in 0,1 mi di virus (7° passaggio). Nei tubi del primo ~uppo è stato aggiunto, subito dopo l'infe·

..4ml . Tal. Super. Sanità (1 966) 2, 12·28.


zione, l ml di terreno contenente HBB 219 !J.M; in quelli del secondo gruppo è stato aggiunto l ml di terreno contenente HBB 493 !J.M ; nei rimanenti tubi del terzo gruppo è stato aggiunto l ml di solo terreno di Eagle. A diversi intervalli di tempo (10-24-48-72-96 ore dall'infezione) sono stati prelevati da ogni serie, 5 tubi-coltura e messi a congelare a - 300C. Dopo l'ultimo prelievo si è proceduto allo scongelamento del matenale colturale ed alla titolazione del virus.

Prova d'infezione su bovini ed animali da laboratorio. - Sono state impiegate 4 vitelle (numerate da l a 4) di razza Marchigiana, di circa 18 mesi di età. La vitella N. l è stata infettata col ceppo EV-130, la N. 2 col ceppo EV-150; le vitelle N. 3 e N. 4 sono state tenute a contatto rispettivamente con la N. l e la N. 2 come controllo. L'infezione è stata effettuata per via endovenosa (0,5 ml), per via orale (20 mi) e per instillazione nasale (2 ml). Prima della prova d'infezione le vitelle sono state tenute in osservazione per un periodo di 5 giorni, durante il quale sono risultate clinicamente sane e nel loro sangue non è stato possibile mettere in evidenza anticorpi neutralizzanti nei confronti dei due virus impiegati. Anche la ricerca per l'isolamento di agenti virali dalle feci è risultata negativa. Dopo l'infezione sono stati con· trollati quotidianamente e per 8 giorni, la temperatura, il polso ed il respiro ; inoltre le vitelle sono state sottoposte ad esami clinici e ematomor· fologici.

Dopo 3-10-17 giorni dall'infezione, sono stati fatti prelievi di sangue per le prove di siero-neutralizzazione. Tra gli anqnali da laboratorio sono stati infettati sperimentalmente scimmie (l ml in peritoneo ; 0,2 ml per via intracerebiale), cavie del peso medio di 400 g (0,5 ml in peritoneO"; 0,1 ml per via intracerebrale), conigli del peso di Kg 2 circa (l ml in peritoneo; 0,2 ml per via intracerebrale) e topini neonati (0,05 ml in peritoneo; 0,02 ml per via intracerebrale). Gli animali sono stati tenuti sotto controllo per un periodo di 15-20 giorni elica. In tutte le prove d'infezione sperimentale sono stati usati i virus del 4° passaggio su cellule.

RISULTATI

Isolamento dei virus. - Dai campioni di feci bovine esaminati sono stati isolati, su colture di cellule renali di embrione bovino, due agenti citopato· geni che sono stati denominati EV-130 · EV-150.

Effetto citopatico e produzione di placche. - L'effetto citopatico riscon· trato al 1° passaggio è comparso dopo 48-72 ore dall'inoculazione, interes· sando solo parzialmente il tappeto cellulare ; nei successivi passaggi si è riprodotto dopo 5-6 ore dall'infezione, con la completa distruzione del tap· peto in 24-48 ore. La citopatogenicità ha presentato le caratteristiche tipiche

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di quella dei virus enterici, ed è risultata identica per i due agenti virati isolati. Effetto citopatico analogo si è osservato con ambedue i ceppi anche su cellule renali di scimmia, ma non su quelle di suino.

Lo sviluppo dei due virus su cellule si è ottenuto tanto a 33oc che a 37°C, tuttavia la temperatura di 37°C deve considerarsi ottimale per la moltiplicazione dei virus, come si può desumere dalla più rapida distruzione del tappeto cellulare a tale t emperatura.

Nei preparati colorati con ematossilina-eosina si è evidenziato un addensamento della cromatina nucleare con segni di picnosi ed accumulo di materiale eosinofilo diffuso, in sede citoplasmatica, che si raccoglitwa successi· vamente in un ammasso, fino a comprimere il nucleo contro la membrana cellulare (Fig. 1).

Fig I. -(Sinistra) Coltura di cellule renaJi di embrione bovino in 6• giomata (Ematossiliua· eosina). (Dutra). Coltura di cellule renaJi di embrione bovino infettate con EV-130 (12• ora dall'infezione) (Ematossilina-eosinn). Nuclei picnotici compressi contro la parete cellulare. (400 X).

I due virus formano placche di citonecrosi su colture primarie di rene bovino in agar, di dimensioni uniformi (4-6 mm di diametro in 48 -58 giornata), circolari e a margini netti. Entrambi hanno raggiunto il titolo di circa 107·5 unità formanti placche (PFU/0,1 ml) dopo il 6°-7° passaggio in vitro .

.d nn. 1&1. Super. Sauità (196G) 2, 12·28.

ORFE I , PERSE CIIIN O, L UPINI E BELLANI 21

Curva di sviluppo. - I cicli di sviluppo dci due virus appaiono molto simili (Fig. 2). Per entrambi sono evidenziabili : una fase di eclissi, che dal momento dell 'infezion e si protrae per almeno' un'ora, una fase di sviluppo, che corre dalla 3a alla 72a ora, ed infine un terza di inattivazione, in cui si verifica un lento e graduale declino del titolo infettante.

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Fig. 2. - Curva di sviluppo dei viru.~ EV-l 30, EV-l !;O, al settimo passaggio in coltura di cellule renali d: bovim~.

Osservazione al microscopio elettronico. - Al microscopio elettronico si sono evidenziate unità virali, alcune delle quali costituite da solo capside apparentemente vuoto, il cui diametro oscilla tra i l 5 e 20 m f.t, per entrambi i virus isolati. Il capside delle particelle appare formato da subunità distribuite forse a costituire una forma icosaedrica (T a v. I e II).

Prove di siero-neutralizzazione. - Alle prove di siero-neutralizzazione, eseguite n ei sieri prelevati dai vitelli da cui si sono isolati i virus, al momento della raccolta delle feci e dopo circa 60 giorni, non si sono avute differenze significative tra i titoli (Tab. l). I titoli neutralizzanti degli antisieri da coniglio, cimentati con ceppi omologhi ed eterologhi, al calcolo del fattore R ( ARCHETTI & HoRSF ALL, 1950) rivelano una lieve differcn:r.a antigenica (Tab . l) . Nei presieri dei conigli, iperimmunizzati con EV-130 cd EV-150, i titoli neutralizzanti sono stati rispettivamente d1 1/12 e di l f3.

Le reazioni di siero-neutralizzazione eseguite con n. 8 sieri di sangue, prelevati al momento della raccolta deJle feci da vitelli coabitanti con quelli

.dmo. J sl. Super. Scmilù (1 960) 2, 12 ·28 .

22 ESPERIENZ.E E RICERCH E

da cui si sono isolati i virus, hanno dato risposta ·pos1t1va in un solo siero, al titolo di 1/32 sia con EV-130 che con EV-150.

TABELLA l.

Titoli di slero-neutrallzzazlone del virus EV·130 ed EV-150.

l

Siero da vitello Il Siero da coniglio l V i r u s

l anti· l anti· l anti-EV-130 anti·EV-150 EV-130 EV-150 H

a b a b

EV- no 9 8 n. e. n . e. 436 298 0,68

EV - 1.')0 n. e. n. e. 12 16 255 128 1,99 l

I titoli sono espressi come il r eciproco della diluizione iniziale del siero ; c iascun titolo rappresenta la media geometrica di t~e valori.

a Sieri prelevati al momento della raccolt a delle feci. b Sieri prelevati dopo 60 giorni. R titolo eterologo divi~o titolo omologo. n. e. non eseguito .

• ProL>e di emoaggluti~azione ed emoadsorbimento. - Tutte le prove di

agglutinazione eseguite con ambedue i virus con emazie di bovino, montone, scimmia, cavia, coniglio, pollo, ratto e topo, hanno avuto esito negativo sia a 37oC che a 4oC. Ugualmente n egative sono risultate le prove di emoadsorbimento con emazie di cavia.

Resistenza ai vari trattamenti chimici e fi sici. - · I due virus resistono al trattamento con vari solventi di lipidi : etere, cloroformio e saponina, dopo permanenza per 18 ore a 4oC (Tab. 2). Alle varie t emperature si comportano in maniera analoga ; i titoli di infettività misurati dopo t empi diversi

TABELLA 2.

Resistenza del virus EV-130 ed EV·150 a cloroformio, etere e saponlna.

Titoli Infettanti • (TCJD10/0,1 mJ)

V i r u s

l Sostanze impiegate per Il trattamento

Controllo l l cloroformio etere saponlna

-· l

EV - 130 5, 50 5,25 5,50 5,25

EV - 150 5,35 5,25 4,95 5,25

• Espressi come i! reciproco del log corrispondente alla massima diluizione infettante .

• 4nn. 181. Super. Sanità (1966 ) 2 , 12·28.


sono riassunti nella Tab. 3. A 4°C l'attività infettante si mantiene costante· mente uguale al titolo di partenza fino in 30a giornata, per decrescere poi lentamente di circa l log dopo 60-75 giorni ; a 26oC l'abbassamento del titolo dopo 24 ore è di circa 0,5 Jog e dopo 8 giorni di 2,5 ; a 37oC, dopo 24 ore, il

TABELLA 3.

Resistenza del virus EV-130 ed EV-150 a varie temperature.

Titoli Infe ttanti • (TCID60/0, I mi) a diverse tompcmturc od a intervalli sucoosslvi di tempo

Virus 4•C l 26•C l 37•0 1 56•C 5g Jtogll6Q'I~og l 30gl4sg l60g \7sg 5h ltob\24h! ?g 13g 14g log \sg 6h J12h\24bl2g 14g \7g w lao•

l l 6,516,5 EV-130 6,5 6,5 6,5 6,5 •. , ··r'l~·' 5,9 5,6 5,2 5,2 4,5 3,8 6,5 5,8 5,7 4,7 4,5 4,0 l -

EV-150 6,5 6,5 6,5 6,3 6,5 5,8 5,5F>,3 6,5 ,6,2 6,2,5,7 5,5 5,0 4,7 4,0 6,5 6,1 6,2 5,5 4,5 3,5 0,6 -l l l

• Espressi come il reciproco dt>l1og corrispondente alla massima rliluizione infettante. Titolo infettante iniziale per entrambi i virus: 6,5 in 0,1 n .l.

- Con.pleta inattivazione del virus.

titolo si abbassa di circa 0,6 log e dopo 7 giorni..di circa 3 log; a 56oC, dopo 10' , i due virus sono qu~i completamente inattivati; in presenza di cationi bivaleiiti, invece, il titolo infettante per entrambi dopo lO'' è sceso di circa 2 log (Tab. 4) ; tale stabilizzazione si è evidenziata fino a 60' sia con CaC12

che con MgCl2• L'azione stabilizzante esplicata da ioni Mg+ + appare però lievemente superiore a quella degli ioni Ca++ .

-f

TABELLA -t

Effetto del cationi bivalenti sulla stabilità del virus EV-130 ed EV-150 a 56°C.

l Titoli lntcttantl • (TCI 0 60/0,1 m li in presenza di cationi

1\ diversi interva lli di tcmi>O

V l r u " controllo

l CaCI 1 Df

l MgCis 1::\1

l IO' l ~o· IO' l 30' l 60' IO' l 30' l 60'

l l~ EV - 130 l - 4,5 3,5 3,5 4,8 4,5

EV- 150

l 0,6 - 3,8 3,5 3, 3 4,5 3,5 4

• Espressi come il reciproco dellog corrispondente alla massima diluizione infettante. Titolo infettante iniziale per entrambi i virus: 6,5 in 0.1 mi.

- Completa inattivazione del virus.

. l 11n. Jsl. Super . Sanità (1 966) 2, 12-28 .

ESPERIENZE E RlCERCU J::

I Vll'US risultano relativamente stabili in un' ampia zona di pH (2,13 • 9,7). Nella prova ripetuta ai pH 5,3 e 2,?, l'inattivazione dei virus EV-130 ed EV-150, dopo 30' in bagnomaria a 370 C, è risultata rispettivamente di 0,7 e 1,6 log (Tab. 5).

TABEI.LA .'i.

Stabilità del virus EV-130 ed EV-150 a pH acido.

l Titoli infettanti • (TCID60/0, I mi)

v l . u s l pR 7.2 l pH 5.3 p H 2.7

l EV - 130 7,1 5 l 6, 50 5, 50

EV - 150 7,00 l

6,25 5,50

l l

• Espressi come il reciproco del log corrispond~nte alla rr.assima diluizione infettant e.

Effetto dell'l D U e dell' HBB. - Lo sviluppo degli stessi VU'US m vitro non viene per nulla infiuem:ato dalla presenza di 5"·100 y/ml di IDU (Tab. 6), concentrazioni sufficienti ad inibire la moltiplicazione virus contenenti DNA (PERSECHINO & 0RFEI, l965b). L'HBB, alle concentrazioni 219 e 493 11-M, previene completamente la comparsa dell'effetto citopatico dei virus in esame, su cellule renali di embrione bovino, fino alla 968 ora. La curva

TABELLA 6.

Effetto della 5-lodo-2'-deosslurldlna (IDU) sul virus EV-130 ed EV-150.

l Titoli InCettanti • (TCID60/ 0, 1 mi)

Viru s

l l oontrollo 50 Y IDU 100 Y ID U

EV- 130 6, 15 6,15 6,00

EV - ISO 5,80 5, 75 5,50

Rf63 5,75 0,50 n. e.

• E spressi come il reciproco del log cor rispondente alla massima diluizione infettante. n. e. non esegnito.

di sviluppo permette di rile~arc che detta sostanza, alle concentrazioni riportate, è in grado di esplicare una notevole azione inibente nei confronti dci due virus, tanto che il loro titolo dopo lO ore dall'infezione risulta di poco

Anll. Jsl. Su)Jer. Sani tà ( 11166) 2, 12 -28 .

ORFEI, PERSECBINO, LUPINI E BELLANI 25

superiore a l log e dopo 24-48 ore esso si annulla completamente, mentre nei controlli ci si trova nella fase esponenzia~e di moltiplicazione (Figg. 3 e 4).

Fig. 3.

10 24

H88 219)JM H88 493)JM Controllo Vir us

48 72 ore 9 6

Inattivazione del virus EV-130 in presenza di 2-(et·idrossibenzil) benzimidazolo (HBB). Colture su cellule renali di embrione di bovino .

•

3

2

10 24

H88 219 J-1M H88 493J-1M Controllo V1rus

48 72 ore 96

Fig. 4. - Inattivazione del virus EV-1 50 in presenza di 2-(et-idrossibenzil) benzimidazolo (HBB). Colture su cellule renali di embrione di bovino.

Ami. 1st. Sttper. S anità (1 9 66 ) 2, 12·28 .

26 ESI'E RTENZE E RICERCHE

Patogmicità. - I due virus risultano completamente apatogeni per il bovino, la scimmia, il coniglio, la cavia ed il topino neonato, infettati per diverse vie. Nei sieri di sangue dci bovini sottoposti ad infezione, prelevati dopo 3, 10 e 17 giorni, si è rilevata una modica risposta anticorpale (anti-EV-130 = rispettivamente l : 6 - l : 6 - l : 24; anti-EV-150 = l : 8 solo in 17a giornata) ; in quelli dei soggetti t enuti come controllo, invece, non si è potuta evidenziare presenza di anticorpi. L'esame clinico ed ematomorfologico praticato su tutti i bovini impiegati nella prova di infezione sperimentale, non ha permesso di fare rilievi degni di nota, durante il periodo di osservazione.

CO "SIDERAZIONI E CONCLUSIONI

Come si può desumere dai risultati ottenuti. i due virus isolati posseggono tutte le proprietà fondamentali degli Enterovirus {ANDREWES, 1964). L 'effetto citopatico da essi prodotto su cellule renali e gli ammassi eosinofili citoplasmatici riscontrati, sono infatti tipici di questi virus. Anch e le dimensioni {15-20 mt-L) determinate al microscopio elettronico, il tipo di acido nucleico da essi posseduto (RNA) e la mancanza di lipidi essenziali denunciata dalla resist enza al trattamento con varie sostan•ze chimiche (etere, cloroformio, saponina), sono proprietà peculiari di tutti gli agenti classificabili tra gli Enterovirus.

L 'isolamento dei virus dall' apparato gastroenterico del bovino, il loro sviluppo ottimale alla t emperatura di 370C, la stabilità in una ampia zona di pH (2,13 - 9,7), la loro termoresistenza a 56°C, potenziata dalla presenza di cationi bivalenti (Mg++, Ca++) in concentrazione l M, nonchè la completa inibizion e degli stessi da parte del 2-{cx-idrossibenzil)-benzimidazolo sono caratteri essenziali che permettono di catalogarli fra gli Enterovirus bovini, separandoli nettamente dai Rhinovirus. Questi ultimi infatti oltre a possedere affinità per l'apparato respiratorio, sviluppano meglio a 330C che a 37°C ; in più non sono stabili a v alori di pH inferiori a 5,3.

In merito alla loro t ermostabilità v a fatto rilevare che il Rhinovirus dell 'equino ed alcuni Rhinovirus umani, o non vengono stabilizzati dai cationi bivalenti oppure lo sono solo parzialmente con MgCI2• Allo stato attuale non si conosce l'intimo meccanismo per cui diversi cationi bivalenti stabilizzano alcuni virus a 50-56° C.

Ancora più oscura appare la ragione p er cui l'HBB, mentre blocca la sintesi dell'RNA di quasi tutti gli ent erovirus, dei virus Coxsackie Bl-6 c Polio I-III (ANDREWES, 1964), non ha alcun effetto invece sul Rhinovirus bovino e sul virus dell'Mta Epizootica (DINTER, 1964).

Analizzando ulteriormenl:e i risultati delle ricerche condotte, si può rilevare che i due virus da noi isolati, oltre a possedere le stesse proprietà fisico-chimiche e biologiche, appaiono anche strettamente correlati antige-

A1111. / st . .'>11/JU. S1111ilti (1966) 2, 12·28.


nicamente. Infatti nelle prove di neutralizzazione crociata, essi dimostrano solo una lieve differenza antigenica. In base a tali reperti possono perciò essere considerati come appartenenti ad un unico prototipo.

In merito alla compartecipazione dei due agenti nel determinismo della sindrome respiratoria osservata nei bovini, benchè essi siano stati isolati da soggetti con affezioni entero-respiratorie acute, non è stato possibile stabilire alcuna correlazione tra la loro presenza e i processi morbosi riscontrati. Ne sono prova i risultati delle reazioni di neutralizzazione eseguite sui sieri di sangue prelevati da vitelli coabitanti nella stessa stalla. Anche i risultati delle prove di infezione sperimentale, effettuate su bovini ed animali da laboratorio, non hanno permesso di evidenziare alcuna patogenicità sperimentale per i due virus.

Si può quindi ntenere che anche questi agenti virali, come molti altri isolati da diversi Autori, rappresentino piuttosto degli ospiti occasionati della mucosa intestinale, incapaci di dare manisfestazioni cliniche apprezzabili, e che perciò possano far parte di quel gruppo di virus in cerca di una malattia.

Gli Autori desiderano ringraziare il Sig. Gherardo Bartoletti per l'assistenza t ecnica.

14 gennaio 1966.

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Ami . lBI . Supu. Sanità (1966) 2, 12·28.

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