Esempio

Regressione lineare

Esempio (1)L'attività enzimatica della catalasi si perde durante l'esposizione alla luce del sole in presenza di ossigeno. Sia y la concentrazione di catalasi (in g/10 ml) in funzione del tempo t (in minuti). Allora si ha approssimativamente con determinati parametri a e q …

Stimare a e q graficamente usando i seguenti dati:

y=aqt (0t80)T 0 10 30 50 60 70 80Y 128 71 50 15 6.7 3.7 1.2

Dati sperimentali0

2040

6080

100

120

140

y

0 10 20 30 40 50 60 70 80x

•

•

•

••• •

0

1

2

3

4

5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Ln

Log10

t

Scala logaritmica

regress Ln x

Source | SS df MS Number of obs = 7-------------+------------------------------ F( 1, 5) = 135.05 Model | 17.0821358 1 17.0821358 Prob > F = 0.0001 Residual | .632460319 5 .126492064 R-squared = 0.9643-------------+------------------------------ Adj R-squared = 0.9572 Total | 17.7145961 6 2.95243269 Root MSE = .35566

------------------------------------------------------------------------------ Ln | Coef. Std. Err. t P>|t| [95% Conf. Interval]-------------+---------------------------------------------------------------- x | -.0555142 .0047771 -11.62 0.000 -.0677942 -.0432343 _cons | 5.105332 .2449202 20.84 0.000 4.475744 5.734919------------------------------------------------------------------------------

regress Log10 x

Source | SS df MS Number of obs = 7-------------+------------------------------ F( 1, 5) = 135.05 Model | 3.22189037 1 3.22189037 Prob > F = 0.0001 Residual | .119289403 5 .023857881 R-squared = 0.9643-------------+------------------------------ Adj R-squared = 0.9572 Total | 3.34117977 6 .556863295 Root MSE = .15446

------------------------------------------------------------------------------ Log10 | Coef. Std. Err. t P>|t| [95% Conf. Interval]-------------+---------------------------------------------------------------- x | -.0241095 .0020747 -11.62 0.000 -.0294426 -.0187764 _cons | 2.217217 .1063675 20.84 0.000 1.943791 2.490644------------------------------------------------------------------------------

Equazione di Michaelis-Menten

Nella pratica e' utile avere parametri che esprimano in maniera

quantitativa l'efficienza di un enzima. Questo può essere fatto

studiando la cinetica della reazione enzimatica.

Per molti enzimi le informazioni sufficienti per descrivere la loro

cinetica sono contenute in due soli parametri, proposti nel 1913

da Maud Menten e Leonor Michaelis. Vediamo lo loro equazione.

20

[ ] [ ][ ]M

k S EV

K S

Modello di Michaelis-Menten Quando la cinetica di una reazione enzimatica segue il modello di Michaelis-Menten, la costante di velocita' k2 caratterizza in genere lo stadio lento della reazione in condizioni di saturazione.

Questa costante viene spesso chiamata Kcat ,espressa come tempo-1 e viene detta numero di turnover. E' una misura del numero di molecole di substrato trasformate nell'unita' di tempo da una molecola di enzima.

La kcat per l'acetilcolinesterasi e' di 140 000; per la catalasi, 40.000.000.

Possiamo esprimere V0 anche in funzione della velocita' massima che puo' raggiungere la reazione:

MAX 2 0dove V =k [E]0

[ ][ ]

MAX

M

V SV

K S

Da questa espressione di V0 si puo' facilmente ricavare il significato chimico della costante di Michaelis-Menten KM : è la concentrazione di substrato a cui Vo = 1/2 Vmax.Notare che il valore di Vmax dipende dalla quantità di enzima impiegata nell'esperimento, mentre KM e' una costante.

Determinazione sperimentale dei parametri dell'equazione:

Se vogliamo determinare sperimentalmente i valori di Vo e KM per una reazione

enzimatica possiamo determinare la velocita' iniziale V0 della reazione a

differenti concentrazioni di substrato [S]. L'equazione di Michaelis-Menten puo'

essere linearizzata facendo il reciproco di entrambi i termini:

M

0 MAX MAX

K1 1 1si ottiene = +

V V V [S]

Questa relazione e' nota come equazione di Lineweaver-Burk. Possiamo

portare in grafico 1/V0 contro 1/[S], per una data concentrazione di enzima.

Diagramma di Lineweaver-Burk

Nel grafico, le diverse rette corrispondono ciascuna ad una data concentrazione di enzima. Ricordare cha VMAX dipende dalla concentrazione iniziale di enzima E0, mentre KM e' una costante.

Se otteniamo una retta la reazione segue la cinetica di Michaelis-Menten, e possiamo calcolare facilmente (metodo dei minimi quadrati) la coordinata all'origine 1/VMAX e la pendenza della retta KM/VMAX

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

0 0.5 1 1.5 2

1/ [V1]

1 / [V2]

1 / [S]

regress v s Source | SS df MS Number of obs = 19-------------+------------------------------ F( 1, 17) = 199.83 Model | 21188.2128 1 21188.2128 Prob > F = 0.0000 Residual | 1802.52402 17 106.030825 R-squared = 0.9216-------------+------------------------------ Adj R-squared = 0.9170 Total | 22990.7368 18 1277.26316 Root MSE = 10.297

------------------------------------------------------------------------------ v | Coef. Std. Err. t P>|t| [95% Conf. Interval]-------------+---------------------------------------------------------------- s | 29.99017 2.121523 14.14 0.000 25.51415 34.46619 _cons | 36.842 2.362429 15.59 0.000 31.85771 41.82629

Vmax=0.02714293

Km= 1104.8979

s

v1 v2

0 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000

0

.01

.02

.03

.04

.05

.06

.07

.08

v1= .000075+.001987uss

uss0 .5 1 1.5 2

0

.001

.002

.003

.004

• clear• input id uss usv1 usv2 • 1. 0 34 12 • 2. .2 45 24 • 3. .4 50 36 • 4. .6 55 48 • 5. .8 66 60 • 6. 1 70 72 • 7. 1.2 75 84 • 8. 1.4 80 96 • 9. 1.6 90 108 • 10. 1.8 100 120 • end• set obs 200• gen s=(_n-1)*20• regress usv1 uss• sca vmax=1/_coef[_cons]• sca km=_coef[_cons]*_coef[uss]• gen v1=vmax*s/(km+s)• regress usv2 uss• sca vmax=1/_coef[_cons]• sca km=_coef[_cons]*_coef[uss]• gen v2=vmax*s/(km+s)• graph v1 v2 s,s(..) c(ll) ylabel(0 0.01 to 0.08 ) xlabel(0 400 to 4000)

. regress usv1 uss Source | SS df MS Number of obs = 10-------------+------------------------------ F( 1, 8) = 712.70 Model | 3821.60302 1 3821.60302 Prob > F = 0.0000 Residual | 42.8969784 8 5.36212231 R-squared = 0.9889-------------+------------------------------ Adj R-squared = 0.9875 Total | 3864.50 9 429.388889 Root MSE = 2.3156------------------------------------------------------------------------------ usv1 | Coef. Std. Err. t P>|t| [95% Conf. Interval]-------------+---------------------------------------------------------------- uss | 34.0303 1.27471 26.70 0.000 31.09082 36.96979 _cons | 35.87273 1.361018 26.36 0.000 32.73421 39.01124------------------------------------------------------------------------------. sca vmax=1/_coef[_cons]. sca km=_coef[_cons]*_coef[uss]. gen v1=vmax*s/(km+s). regress usv2 uss Source | SS df MS Number of obs = 10-------------+------------------------------ F( 1, 8) = . Model | 11880.00 1 11880.00 Prob > F = . Residual | 0.00 8 0.00 R-squared = 1.0000-------------+------------------------------ Adj R-squared = 1.0000 Total | 11880.00 9 1320.00 Root MSE = 0.00------------------------------------------------------------------------------ usv2 | Coef. Std. Err. t P>|t| [95% Conf. Interval]-------------+---------------------------------------------------------------- uss | 60 . . . . . _cons | 12 . . . . .-------------------------------------------------------------------------