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EPIDEMIOLOGIA MOLECOLAREEPIDEMIOLOGIA MOLECOLAREPt. 2

BIOMARCATORI- BIOMARCATORI -

Dr. Massimo Moretti

Università degli Studi di PerugiaUniversità degli Studi di PerugiaDipartimento di Specialità Medico-Chirurgiche

e Sanità Pubblicae Sanità Pubblica(Sez. Sanità Pubblica)

PREMESSA

MalattiaEsposizione

PREMESSA

Xenobioticomutageno/cancerogenog / g

DetossificazioneAttivazioneCellula normale

Detossificazionee escrezione

Attivazionemetabolica

Celluladanneggiata

C ll l C ll l

RiparazioneDel DNA

… … … oppure … !!!

Cellulapre-iniziata

Cellulanormale

PREMESSA

Xenobioticomutageno/cancerogenog / g

DetossificazioneAttivazioneCellula normale

Detossificazionee escrezione

Attivazionemetabolica

Celluladanneggiata

C ll l C ll l C ll l C ll lCellulapre-iniziata

Cellulainiziata

Cellulapre-neoplastica

Cellulaneoplastica

PREMESSA: MUTAZIONI GENICHE

PREMESSA: MUTAZIONI CROMOSOMICHE

PREMESSA: MUTAZIONI CROMOSOMICHE

Traslocazione 9→22 (cromosoma “Philadelphia”):

EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE: BIOMARCATORI

MalattiaEsposizione

Suscettibilità geneticaRiparazione Risposta

Dose Effetti Alterata

Metabolismo del DNA immunitaria

Doseinterna

Dosebiologicaefficace

EffettiBiologiciprecoci

Alteratastrutturafunzionep

Metaboliti Danno ossidativoAddotti al DNA

Alterazionicitogenetiche

Attivazioneoncogeni

Esposizione Effetto biologico

g g

EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE: BIOMARCATORI

Un “biomarcatore” è rappresentato da una modificazione (ditipo molecolare biochimico genetico immunologico otipo molecolare, biochimico, genetico, immunologico ofisiologico) che consente di rilevare un evento in un sistemabiologico che possa influenzare o predire l’insorgenza og p p gl’evoluzione di una malattia.

Pertanto, l’impostazione di uno studio di epidemiologiae ta to, posta o e d u o stud o d ep de o og amolecolare è del tutto paragonabile a quella di uno studio diepidemiologia tradizionale, con la differenza che l’end-point

è ùche viene valutato non è più la malattia conclamata (tassi diincidenza o prevalenza) o l’esito della malattia stessa (tassidi mortalità) ma uno o più biomarcatoridi mortalità), ma uno o più biomarcatori.

BIOMARCATORI DI ESPOSIZIONE: DOSE INTERNA

Forniscono indicazioni riguardo la quantità di xenobioticoassorbita dall’organismo in un determinato tempo Possonoassorbita dall organismo in un determinato tempo. Possonoessere costituiti dall’agente esogeno stesso, oppure da unprodotto del suo metabolismo o, ancora, dall’attivitàpbiologica del composto in studio.

Esempi di biomarcatori di dose interna:se p d b o a cato d dose te a

concentrazione eritrocitaria e/o linfocitaria di cromo;

concentrazione urinaria di aflatossina-B1 (indicatore diesposizione alimentare);

concentrazione urinaria di 1-idrossipirene in soggettiesposti ad idrocarburi policiclici aromatici;

mutagenicità urinaria (Salmonella/microsomi test).


Salmonella/microsomi test (test di Ames):



mutagenicità urinaria.

Controllonegativo

Fumo Fumo + S9-mixnegativo



mutagenicità urinaria vs. determinazioni chimico/analitiche

BIOMARCATORI DI DOSE BIOLOGICA EFFICACE

Forniscono indicazioni riguardo l’entità della interazionedello xenobiotico assorbito (o dei suoi metaboliti) condello xenobiotico assorbito (o dei suoi metaboliti) conmacromolecole coinvolte nel processo della cancerogenesi(es. DNA) o con molecole surrogate (es. albumina o( ) g (l’emoglobina), causando alterazioni reversibili.

Tra i marcatori di dose biologica efficace maggiormentea a cato d dose b o og ca e cace agg o e teutilizzati vi sono:

addotti al DNA;addotti al DNA;

addotti alle proteine;

danno primario al DNA.


È stata osservata una stretta correlazione tra presenza diaddotti al DNA (il termine “addotto” deriva dall’ingleseaddotti al DNA (il termine addotto deriva dall inglese“adduct”, acronimo di addiction product = prodotto diaddizione covalente) e cancerogenesi.) g

Molti studi hanno confermato che la formazione di addotti alDNA è n e ento ne e io n he e non ffi iente peDNA è un evento necessario, anche se non sufficiente, perlo sviluppo di tumori da parte di cancerogeni chimici.


P32 post-labelling:

Controlli Esposti


Il danno primario al DNA, biomarcatore aspecifico maestremamente sensibile viene valutato utilizzando il testestremamente sensibile, viene valutato utilizzando il testdella cometa in condizioni alcaline (generalmente su linfocitidi sangue periferico).g p )

Le principali lesioni evidenziabili con il test della cometasono:

single-strand breaks;

double-strand breaks;

siti alcali-labili;

basi ossidate.


Test della cometa:Cellula inclusa nel gel di agarosio

Membrana cellulare

Citoplasma

inclusione delle cellule inmicrogel di agarosio; [A]

Strato protettivo digel LMA 0,7%

Nucleo

Membrana nucleare

lisi delle membranecellulari e nucleari; Vetrino da microscopio

pretrattato con NMA 1%

Strato di gel LMA 0,7%con incluse le cellule

elettroforesi (condizionialcaline).

[B]

Lisi delle membrane cellulari

colorazione dei vetrini;

analisi al microscopio a[C]

e nucleari

Idrolisi alcalina delle proteine eanalisi al microscopio afluorescenza.

[D]

Idrolisi alcalina delle proteine edell’RNA;“denaturazione”del DNA

Migrazione elettroforetica deiframmenti di DNA nelle magliedel gel

_ +


Test della cometa:

campo al microscopio a fluorescenza.

(A)

(C)

(A)

(A)

(B)

(A)

(A)

(A) cellule con DNA non danneggiato;(B) cellule con DNA moderatamente danneggiato(B) cellule con DNA moderatamente danneggiato(C) cellule con DNA fortemente danneggiato.


Test della cometa:

valutazione del danno al DNA in una singola cellulacon sistema computerizzato di analisi di immagini:

Measure

Edit

Li

Frozen

Live

Delete

Head Length 21 97 Tail Length 47 60 Head % intensity 81 47Head Length 21.97Tail % intensity 18.53Tail Moment 3.16

Tail Length 47.60Total Area 639.36

Total Intensity 476477.11

Head % intensity 81.47Mean Grey Level 69.98

1 cell scored Image is frozenx50 (Olio immersione)

BIOMARCATORI DI EFFETTO BIOLOGICO PRECOCE

I biomarcatori di effetto biologico precoce sonorappresentati da alterazioni irreversibili funzionali orappresentati da alterazioni irreversibili, funzionali ostrutturali, a carico del genoma e vengono distinti in:

biomarcatori citogeneticibiomarcatori citogenetici,

alterazioni in “reporter genes”.


I biomarcatori citogenetici possono essere rilevati mediante:

analisi in metafase (aberrazioni cromosomiche numerichee strutturali, scambi tra cromatidi fratelli);

analisi in interfase (micronuclei).


Aberrazioni cromosomiche (strutturali e/o numeriche) :

risultano dalla rottura di interi cromosomi e dal lorosuccessivo riarrangiamento in forme abnormi:

Dicentrico InterscambioDelezione + “Gap”


Scambi tra cromatidi fratelli:

si formano tipicamente in caso i danni al DNA simanifestino durante la metafase, in questo caso la cellulamette in atto dei meccanismi di riparazione durante imette in atto dei meccanismi di riparazione durante iquali porzioni uguali dei due cromatidi opposti delcromosoma possono scambiare la loro posizione (scambic o oso a posso o sca b a e a o o pos o e (sca bsimmetrici):

Scambi tra cromatidi fratelli (SCE)


Micronuclei:

corpuscoli di forma rotondeggiante, di dimensioni chepossono variare da 1/16 a 1/3 del nucleo principale,contenenti materiale genetico e che possono trovarsi nelcontenenti materiale genetico e che possono trovarsi nelcitosol al termine del ciclo cellulare.

Micronuclei


Micronuclei:

si formano, durante l’anafase della mitosi, dallacondensazione di frammenti di cromosomi acentrici o dacromosomi interi che non vengono incorporati nei nucleicromosomi interi che non vengono incorporati nei nucleiprincipali delle cellule figlie;

i i l i i tt ii micronuclei possono generarsi attraverso varimeccanismi, riconducibili essenzialmente:

all’azione di agenti clastogeni, che causano rotturecromosomiche dirette;

a disfunzioni del fuso mitotico, che possono esseregenerate da agenti aneuploidizzanti;

alla combinazione di entrambi i meccanismi.


Micronuclei:

meccanismi di formazione.

(A)Effettoclastogeno

Frammenti acentrici

Cromosoma interoclastogeno

Frammenti acentrici

(B)

Effettoaneuploidizzante

Blocco della citocinesi aneuploidizzante


Bonassi S. et al. (2000) Chromosomal aberrations inlymphocytes predict human cancer independently fromlymphocytes predict human cancer independently fromexposure to carcinogens. Cancer Research, 60(6):1619–1625.

… … … Logistic regression models indicated a statisticallysignificant increase in risk for subjects with a high levelg j gof chromosomal aberrations compared to those with alow level in the Nordic cohort (odds ratio, 2.35; 95%

f d l 3 23) d h l hconfidence interval, 1.31-4.23) and in the Italian cohort(odds ratio, 2.66; 95% confidence interval, 1.26-5.62). …… …


Bonassi S. et al. (2006) An increased micronucleusfrequency in peripheral blood lymphocytes predicts the riskfrequency in peripheral blood lymphocytes predicts the riskof cancer in humans. Carcinogenesis, 28(3):625–631.

A significant increase of all cancers incidence was… … … A significant increase of all cancers incidence wasfound for subjects in the groups with medium (RR=1.84;95% CI: 1.28-2.66) and high micronuclei frequency) g q y(RR=1.53; 1.04-2.25). … … …


“Reporter genes”:

geni che non svolgono un ruolo diretto nel processo dellacancerogenesi, ma che se mutati danno origine a fenotipifacili da individuare (bioindicatori della frequenza difacili da individuare (bioindicatori della frequenza dimutazioni somatiche);

i geni epo te di più ampio impiego in epidemiologiai geni reporter di più ampio impiego in epidemiologiamolecolare sono:

d f lgene codificante per la ipoxantina-guaninafosforibosil-transferasi (HPRT);

gene codificante per la glicoforina-A (GPA).

BIOMARCATORI DI SUSCETTIBILITÀ INDIVIDUALE


Mutazioni:interessano geni correlati all’insorgenza di tumori (es geniinteressano geni correlati all insorgenza di tumori (es. genideputati al controllo del differenziamento e del ciclocellulare), risultano poco diffuse nella popolazione(frequenza <1%), ma sono altamente correlate all’eventoclinico (penetranza elevata).

Polimorfismi:sono rappresentati da mutazioni molto diffuse nella

l (f 0%) lpopolazione (frequenza 1-50%), ma scarsamente correlateall’evento clinico (penetranza bassa).


Tra i geni tumore-correlati i proto-oncogeni codificano perproteine coinvolte nella regolazione e nell’induzione del cicloproteine coinvolte nella regolazione e nell induzione del ciclocellulare:

fattori di crescita (FGF3 FGF4);fattori di crescita (FGF3, FGF4);

fattori di trascrizione (JUN, FOS, MYC);

proteine chinasi (ABL-1, FES, RET);

recettori di membrana per fattori di crescita (ERBB2,recettori di membrana per fattori di crescita (ERBB2,CSF1R);

proteine deputate alla trasduzione del segnale (BRAF);proteine deputate alla trasduzione del segnale (BRAF);

I proto-oncogeni possono essere attivati ad oncogeni inseguito a mutazioni puntiformi riarrangiamenti cromosomiciseguito a mutazioni puntiformi, riarrangiamenti cromosomicied inserzione virale.


Gli oncosoppressori, invece, sono geni altamente conservati(APC BRCA1 BRCA2 MEN1 NF1 RB1 TP53) che(APC, BRCA1, BRCA2, MEN1, NF1, RB1, TP53) checodificano per proteine di membrana, citoplasmatiche,nucleari che inibiscono la crescita e la divisione cellulare:

ad esempio, il gene TP53 codifica per la proteina p53 chesvolge un ruolo centrale nella inibizione della crescita digcellule con danni al DNA, per cui la perdita di tale attivitàa seguito di mutazioni nel gene TP53 causa la

d ll l f d ll lpromozione della proliferazione di cellule con genomaalterato.


Molti geni che codificano per gli enzimi coinvolti nelmetabolismo degli xenobiotici o per gli enzimi deputati allametabolismo degli xenobiotici o per gli enzimi deputati allariparazione del DNA sono polimorfici, ovvero esistono nellapopolazione in diverse forme alleliche dello stesso gene.

A varianti alleliche corrispondono attività enzimatichediverse.


PIntermedio

reattivo( l tt fil )

Pro-cancerogeno

Funzionalizzazione(elettrofilo)(Fase I)

Citocromo P450

Danno al DNAMetabolita

id ofilo

Coniugazione(Fase II)

idrofilo Glutatione S-transferasi

CancerogenoEscrezione


Metabolismo del benzo[a]pirene:

Metabolita attivo


Polimorfismi metabolici:

combinazioni favorevoli / sfavorevoli:

Esempio:I i- Iperattivatore

- Lento eliminatore


Polimorfismi metabolici - “CYP1A1”:

al momento sono noti 4 principali polimorfismi nel geneCYP1A1,ai quali è stato assegnato un numero che siriferisce cronologicamente all’ordine di pubblicazioneriferisce, cronologicamente, all ordine di pubblicazione,preceduto dal simbolo “*” (CYP1A1*1 definisce, quindi, iltipo selvatico);t po se at co);

una mutazione dell’esone 7, la transizione A4889G,conferisce un aumento di almeno 3 volte dell’attivitàconferisce un aumento di almeno 3 volte dell attivitàcatalitica (polimorfismo CYP1A1*3 o Ile Val).


Polimorfismi metabolici - “CYP1A1”:

St St

335 bp

206 bp

129 bp

PCR/RFLP (MspI)


Polimorfismi metabolici - “GSTM1”:

i primi polimorfismi delle GST ad essere determinati sonoquelli di classe µ e sono stati caratterizzati sia misurandol’attività enzimatica in relazione ad un dato substratol attività enzimatica in relazione ad un dato substrato(trans-stilbene ossido), sia isolando ed identificando gliisoenzimi;soe ;

il gene (GSTM1) che codifica per l’isoforma GSTM1 èpolimorfico e presenta 4 varianti alleliche tra queste lapolimorfico e presenta 4 varianti alleliche, tra queste lavariante GSTM1*0 (allele nullo) determina nella formaomozigote la mancanza dell’attività enzimatica: circa il50% della popolazione caucasica manca dell’attività dellaGSTM1.


Polimorfismi metabolici - “GSTM1”:

268bp ( -globina)β

300bp

200bp

268bp ( -globina)β

215bp (GSTM1)

RISCHIO GENOTOSSICO E POLIMORFISMI GENETICI

Esposizione ambientale

Polimorfismo EffettoambientaleAmmine aromatiche del fumo di

Lenti acetilatori(NAT2)

Aumento di rischio per cancro alla

sigaretta( ) p

vescicaArilammine Veloci acetilatori Aumento di rischio eterocicliche da pirolisi di carni cotte

(NAT2) per cancro colonrettale

Idrocarburi policiclici aromatici da fumo di sigaretta

Deficienza di GST(GSTM1*0)

Aumento di rischio per cancro al polmoneda fumo di sigaretta polmone

Esposizione a ossido di etilene

Deficienza di GST(GSTT1*0)

Aumento dei livelli di dannoossido di etilene,

butadiene, stirene(GSTT1*0) di danno

cromosomico

SUSCETTIBILITA’ GENETICA INDIVIDUALE

La suscettibilità genetica all’azione dei cancerogeni siesprime soprattutto ai bassi livelli; da questo discendonop p ; qalmeno due conseguenze rilevanti da considerare nellescelte di politica ambientale:

1) le “soglie accettabili” di esposizione, comunque definite,dovrebbero tener conto dell’esistenza nella popolazionedi sottogruppi a più alto rischio di malattia e, diconseguenza, essere adeguatamente abbassate;

2) nelle indagini epidemiologiche la suscettibilità geneticadovrebbe essere tenuta nella giusta considerazione, in

d d t l b bilità di id imodo da aumentare la probabilità di evidenziarerelazioni causali con agenti ambientali.

SUSCETTIBILITA’ GENETICA INDIVIDUALE

Del tutto privo di fondamenti è invece un uso delleconoscenze sulla suscettibilità genetica per selezionare ig plavoratori meno suscettibili all’azione dei cancerogeni:

1) un principio senza il quale tutta l’etica medica1) un principio senza il quale tutta l etica medicaperderebbe di significato è che “non fare del male”viene prima di “fare del bene”, in altre parole evitarel’esposizione a sostanze tossiche è un obbligo morale diordine superiore rispetto a prevenire i danni attraversoaltri strumenti come lo screening genetico;altri strumenti come lo screening genetico;

2) la selezione genetica avrebbe una ricaduta inaccettabile,l di i i i i l i f tti i li fi iovvero la discriminazione razziale, infatti i polimorfismi

metabolici mostrano diversa distribuzione nei diversigruppi etnicigruppi etnici.

NUOVI BIOMARCATORI ... ...

Nuove tecniche di biologia molecolare, nel campo sia dellagenomica che della proteomica, offrono la possibilità dig p , psviluppare una nuova serie di biomarcatori per valutare ilrischio genotossico.

Particolarmente attraenti sono tecniche come il cDNA-microarray (insieme di sequenze di DNA a elica singolaimmobilizzate su una superificie solida) per lo studio deiprofili di espressione genica:

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