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Enrico Colombo Biologia molecolare e cellulareBiologia molecolare e cellulare

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CORSO DI BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE

II semestre 2007/2008

Prof.ssa Marina Colombi

Indice…


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Introduzione.

La Biologia è lo studio degli esseri viventi sulla terra, delle loro strutture, dei loro meccanismi vitali.

Individua delle caratteristiche comuni e procede alla classificazione degli esseri viventi e all’approfondimento delle specifiche caratteristiche di ogni regno, classe, specie.

Per essere vivente si intende un qualsiasi sistema molecolare in grado di nascere, crescere, dar vita a nuovi viventi con caratteristiche simili.

Ciascun vivente può raggiungere questo obbiettivo solamente perché è in possesso di un materiale genetico, che contiene in sé tutte le caratteristiche dell’individuo.

La vita è permessa da complessi meccanismi che avvengono a livello delle macromolecole biologiche, che sono formate sostanzialmente da pochi elementi chimici, con caratteristiche idonee alla vita:

- carbonio- ossigeno- idrogeno- azoto- zolfo.

I regni

La teoria dell’evoluzione ha permesso di individuare le tappe con cui è avvenuta la formazione dei singoli individui. La classificazione, quindi, avviene su scala evolutiva e parte inizialmente in una divisione per stadio macroevolutivo.

Si possono individuare due grandi regni cellulari: procarioti ed eucarioti.

I procarioti sono cellule estremamente semplici, per quanto riguarda l’evoluzione. Il loro materiale genetico non è racchiuso in alcun tipo di involucro, ma immerso nel citosol.

Le cellule eucariotiche invece, possiedono un nucleo che è racchiuso in un involucro, la membrana nucleare, che scambia informazioni con il citoplasma della cellula.

Le cellule eucariotiche formano due grandi regni dei viventi:

- protisti: sono cellule eucariotiche che permangono nello stadio unicelulare e non si associano in organismi complessi.

- Organismi pluricellulari: sono dei complessi di cellule specializzate e differenziate, che assieme concorrono per il mantenimento e l’espletazione della vita.

L’evoluzione ha portato gli individui pluricellulari a suddividersi in tre grandi regni:

- animali- vegetali- funghi

L’origine della vita sulla terra.

4,6 miliardi di anni fa, l’atmosfera della terra era molto differente rispetto a quella che si presenta adesso.

L’atmosfera terrestre era composta da:

- vapore acqueo (H2O)- anidride carbonica CO2.- Monossido di carbonio CO.- Idrogeno molecolare H2.- Azoto molecolare N2.

Inoltre, la forte presenza di radiazioni UV permetteva la produzione di:


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- Ammoniaca NH3.- acido solfidrico H2S.- metano CH4.

Formazione di molecole organiche.Nell’atmosfera terrestre di quegli anni, vi era totale assenza di ossigeno libero (O2), quindi la possibilità di formare molecole organiche senza andare incontro ad ossidazione.

Vi erano, oltre all’assenza di ossigeno, altre condizioni molto favorevoli alla formazione di molecole:

- presenza di enormi fonti energetiche: c’erano innumerevoli vulcani, tempeste di scariche elettriche, radiazioni ultraviolette (UV) e continui bombardamenti da parte di meteoriti.

- Presenza di precursori chimici: c’era acqua sottoforma di vapore, minerali inorganici che fungevano da catalizzatori (rocce argillose e numerose bocche idrotermali e sulfuree), ad esempio Zn e Fe.

- Tempo sufficientemente lungo: queste condizioni si protrassero per un tempo adeguato.

L’esperimento che provò la probabilità della formazione di molecole organiche da elementi inorganici fu fatto da due coppie di scienziati in due epoche differenti:

- 1920, da Oparin e Haldane- 1950, da Miller e Ury, da cui prese il nome.

L’esperienza di Miller e Ury, consisteva nel simulare, all’interno di un’ampolla le condizioni dell’atmosfera primordiale:

- misero vapore acqueo, metano, ammoniaca e idrogeno.- Li bombardarono con delle scariche elettriche.

Il risultato fu sorprendente: si trovarono degli amminoacidi, piccoli acidi nucleici, altre piccole molecole organiche.

Questa dimostrazione permette di formulare la teoria dell’origine della vita:

- le prime molecole organiche si sono formate in piccole lagune- in seguito si accumularono in ciò che venne definito brodo

primordiale.

Dal brodo primordiale si rese possibile la formazione di macromolecole quali proteine, RNA, DNA, zuccheri, ecc…

La polimerizzazione, in assenza di O2, avvenne su rocce argillose e in prossimità delle sorgenti sulfuree:

- si univano i monomeri con l’eliminazione di una molecola d’acqua.

- La reazione era catalizzata dai numerosi elementi metallici presenti nelle rocce argillose, come zinco e ferro, rame metallico, magnesio, ecc…

Nascita dei viventi.Grazie alla formazione dei polimeri di maggiori dimensioni, questi, si associano, dopo un lunghissimo lasso di tempo. La prima cellula procariote comparse circa 3,5 miliardi di anni fa:

- ebbero origine i procarioti che vivevano facendo respirazione anaerobia.

- Erano organismi eterotrofi, molto semplici.- Successivamente divengono autotrofi, ovvero capaci di

sintetizzare le proprie molecole vitali.

Gli eucarioti comparvero circa 2 miliardi di anni orsono, secondo la teoria simbiotica, per internalizzazione e fusione di batteri, cloroplasti, mitocondri:

- questi iniziano la produzione di ossigeno molecolare- Pian piano, si forma l’atmosfera odierna, ricca di ossigeno e di

azoto.- Col passare del tempo si estinguono gli anaerobi e nascono gli

organismi a respirazione aerobica.

In queste modalità si ha la nascita della vita, che dall’acqua, si sposta sulla terra ferma.


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dogma centrale della biologia.Ciascun essere vivente ha una peculiarità, un proprio ciclo vitale, che è scritto nel suo codice genetico:

- racchiude il progetto biologico di ciascun individuo.- Ogni patrimonio genetico è unico.- Il patrimonio genetico è costituito da una o più molecole di

acido desossiribonucleico, il DNA.

Il dogma centrale della biologia, in cui è racchiuso il progetto biologico di ciascun individuo, riassume le seguenti tappe:

- il DNA può duplicare sé stesso (replicazione) o codificare per RNA (trascrizione)

- l’RNA codifica per le proteine (traduzione).

Il corretto funzionamento di uno di questi meccanismi può causare aberrazioni cromosomiche, le quali possono avere sia effetti positivi che negativi:

- evoluzione- malattie genetiche.

La vita è garantita dal DNA, che codifica per le proteine, le quali svolgono tutte le azioni di catalizzazione e di funzionamento per la sopravvivenza di ogni cellula.

Il genoma umano.

Gli acidi nucleici

Il genoma di un individuo è l’insieme di geni e di informazioni circa la sua struttura e le sue funzioni, con i relativi meccanismi che le regolano.

Negli anni ‘40 s’iniziò a porre il quesito della natura chimica del patrimonio genetico umano. Era chiaro, che il patrimonio genetico dovesse risiedere in una qualche struttura molecolare.

Risultò, dopo esperimenti condotti da numerosi ricercatori, che il genoma di qualsiasi cellula era composto di molecole di DNA: acidi desossiribonucleici.

Prima della scoperta della struttura della molecola di DNA da parte di Watson e Crick, era chiaro che il DNA era formato da una unità chimica chiamata nucleotide, formato da:

- Uno zucchero pentoso (a cinque atomi di C).- Un gruppo fosfato posizionato in posizione 5’ sullo zucchero- Una base azotata.

Zuccheri pentosiNel caso della molecola di DNA, lo zucchero fondamentale è il D-2’ ribofuranosio, altresì detto desossiribosio, poiché deriva dalla deidrossilazione del carbonio 2’ del ribosio.


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È altrettanto chiaro, oggi, che la molecola di RNA, che si origina a stampo dal DNA è composta da ribosio, come zucchero pentoso.

Sia nel DNA che nell’RNA il carbonio in 5’ è esterificato da un gruppo fosfato, che consentirà anche all’altro anello zuccherino di legarsi allo zucchero successivo.

Il legame tra il desossiribosio e lo zucchero successivo avviene sempre in posizione 3’:

- si vedrà che sulla lunga catena di DNA e di RNA si possono individuare due estremità, una 3’ e l’altra 5’.

Basi azotate.Esistono due tipi di basi azotate nei nucleotidi:

- pirimidine: ad anello singolo.- purine: ad anello doppio, uno esagonale e l’altro pentagonale.

Le purine sono due, identiche sia nel DNA che nell’RNA, e sono:

- adenina- guanina

Le pirimidine sono due nel DNA:

- citosina

- timina

Nell’RNA la pirimidina timina è sostituita dall’uracile, che differisce per la mancanza di un metile sul C-2.

Nucleotidi.I nucleotidi sono delle strutture formate da uno zucchero pentoso a cui si legano una base azotata e un gruppo fosfato.

Sono presenti anche più gruppi fosfato, legati tra loro da legami fosfodiesterici. Tra questi si può annoverare l’ATP (adenosintrifosfato) e altri nucleotidi di o trifosfato, che svolgono funzioni differenti nella cellula, non solamente quelle di codice genetico.

La nomenclatura dei nucleotidi prende il nome del nucleoside da cui parte, cioè la parte di molecola formata dallo zucchero e dalla base, che si lega in posizione 1 sullo zucchero.

Al nome del nucleoside si fa seguire il numero dell’atomo di carbonio cui si lega il fosfato e mono-, di-, tri-fosfato.

Base azotata

Nucleoside nucleotide

Adenina (desossi)adenosina (desossi)adenosina-5’ monofosfato

Guanina (desossi)guanosina (desossi)guanosina 5’-monofosfato

Citosina (desossi)citidina (desossi)citidina 5’-monofosfato

Timina (desossi)timidina (desossi)timidina 5’-monofosfato

Uracile Uridina Uridina-5’ monofosfato

Ovviamente, il prefisso desossi- si inserisce qualora lo zucchero che costituisce il nucleoside sia il desossiribosio.


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La struttura della molecola di DNA.

I vari nucleotidi si dispongono ordinatamente tra loro, in un filamento che costituisce la stampella primaria del DNA.

Il filamento singolo di DNA e RNAUna molecola di oligonucleotide è formata da una catena di nucleotidi che si dispongono in serie, che differiscono solamente per le basi azotate.

I legami sono di tipo fosfodiesterico e si instaurano tra:

- il carbonio in 3’ di uno zucchero- il fosfato posto in 5’ sullo zucchero precedente

Questo tipo di legame permette di individuare una certa polarità nella molecola di DNA. Si individuano infatti, agli estremi della catena, due estremità differenti:

- l’estremità 3’ in cui si ha un –OH - l’estremità 5’ in cui si ha legato un –PO3

2-.

Le scoperte di ChargaffLe prime analisi a diffrazione di raggi X dimostrarono che un nucleotide impilato su un altro nell’ambito della molecola di DNA occupava uno spazio verticale di 0,34 nm.

Si suggerì inoltre la presenza di una ripetizione ogni 10 nucleotidi, circa, di 3,4 nm.

Erwin Chargaff, nel 1950, scoprì importanti informazioni che permisero a Watson e Crick di elaborare il modello della molecola:

- smentì la teoria del tetra nucleotide, che prevedeva che i nucleotidi si ripetessero con la medesima sequenza di basi, il che faceva pure dubitare del ruolo informazionale della molecola.

- Studiando i rapporti della composizione in basi dei nucleotidi scoprì che una purina si appaia sempre con una pirimidina, nello specifico, in coppie:

o Adenina - timinao Guanina - citosina

Era dunque presupposto, che la molecola era composta da coppie di basi che si legavano tra loro.


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Il modello di Watson e CrickAnche sulla base dei dati elaborati da diffrattometrie a raggi X da parte di Franklin e Wilkins, i due scienziati che scoprirono la struttura della molecola di DNA poterono formulare la loro ipotesi.

Il modello prevedeva:

- la molecola è composta da due catene di nucleotidi.- Le catene si avvolgono a spirale formando una doppia elica

destrorsa.- I due filamenti scorrono in direzioni antiparallele, uno da 5’ a 3’,

l’altro da 3’ a 5’.- Lo scheletro formato dalle molecole zucchero – fosfato –

zucchero – fosfato, è situato all’esterno. Il fosfato porta una carica negativa alla molecola.

- Le basi sono impilate una sull’altra con un decorso perpendicolare all’asse del filamento.

- Le varie basi, seguendo la regola AT CG, sono appaiate mediante legami idrogeno:

o Gli atomi di azoto legati a C4 della citosina e C6 dell’adenina sono nella configurazione amminica (-NH2), piuttosto che in quell’imminica

o Gli atomi di ossigeno legati a C4 della timina e a C6 della guanina sono nella forma chetonica (-C=O), piuttosto che in quell’enolica.

- Ne consegue che i legami a idrogeno sono facili da scindere e avvengono in numeri differenti:

o Tre per le coppie G-Co Due per le coppie A-T.

- La larghezza della catena, poiché un singolo nucleotide è largo 10 nm, è di 20 nm.

- L’avvolgimento delle due catene avviene con un solco maggiore e un solco minore. Nel solco maggiore si inseriscono le proteine associate al DNA.

- La doppia elica, forma un giro completo ogni 10 coppie di basi.- I due filamenti seguono la regola della complementarietà tra

basi azotate.

L’importanza del modello di Watson e CrickAffinché il materiale genetico sia effettivamente portatore dell’informazione, deve soddisfare a tre fondamentali funzioni:


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1) deposito dell’informazione genetica: deve contenere le istruzioni precise per il mantenimento e l’espressione dei caratteri dell’organismo.

2) Auto duplicazione ed ereditarietà: il DNA deve essere in grado di essere trasmesso alla progenie.

3) Espressione del messaggio genetico: deve poter stabilire l’ordine con cui alcuni amminoacidi che codificano per proteine o enzimi, vengono espressi. Deve regolare il centro direzionale delle attività cellulari.

Dal punto di vista del primo e del secondo punto Watson e Crick avevano azzeccato:

- la sequenza di basi azotate codificava per amminoacidi corrisposti nell’ordine in cui comparivano nel peptide corrispondente. Un certo numero di basi sarebbe un gene.

- Anche per quanto riguarda la replicazione. Le due catene si slegano e ognuna funge da stampo per la cellula figlia. Il DNA risulterebbe quindi un materiale semiconservato.

Per quanto riguarda la regolazione dell’espressione genica e altre specifiche funzioni regolative a livello cellulare, se si accetta la proposta di Watson e Crick, ogni futura teoria sul DNA deve essere coerente con tale modello.

Vi è da aggiungere che la conformazione del DNA come descritta da Watson e Crick non è l’unica possibile, ma quella più stabile che riguarda il DNA inattivo o in particolari condizioni.

Questa forma è detta B-DNA, mentre ne esistono altre, tra cui la forma A e la forma Z:

- la forma A è sempre una doppia elica destrorsa ma con un passo più elevato

- la forma Z è un avvolgimento sinistrorso e irregolare, senza solchi difformi.

Ordine e lunghezza dei nucleotidi

Quanto DNA nell’uomoLa unità di misura del DNA sono le coppie di basi. Un filamento di DNA contiene miliardi di coppie di basi, infatti sono utilizzati i multipli del “B”:

- chilo base (kb)- megabase (Mb)- gigabase (Gb).

Nel DNA umano sono presenti circa 6 gigabasi:- equivale a circa 60 libri di 600 pagine, ciascuna con circa 1000

caratteri per pagina.

come sono ordinati i nucleotidiLe sequenze di basi portano in sé l’informazione genetica. Tutta l’informazione contenuta in un nucleo è detta genoma.

L’ordine con cui le basi si dispongono è stato dato dall’evoluzione, che attraverso la selezione naturale ha selezionato gli individui che possedevano sequenze più vantaggiose.

Ogni specie ha generalmente un assetto nucleotidico proprio.

I nucleotidi, all’interno del DNA sono ordinati con specifiche sequenze che portano informazioni per la codifica delle proteine:

- geni: sono sequenze di nucleotidi che codificano per una proteina.

- Cassette di sequenza con raggruppamenti specifici: sono delle stringhe ripetute che portano informazioni non codificanti, funzionali alla regolazione dell’espressione genica o all’assunzione della conformazione della molecola stessa di DNA.

Cassette di sequenza specifiche sono le TATA box, ad esempio, che sono facilmente scindibili poiché hanno per lunghi tratti solo due legami idrogeno da scindere:


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- sono segnali riconoscibili da proteine specifiche.- Attraverso queste sequenze il DNA è in grado di interagire con

le proteine specifiche per la sua regolazione, duplicazione, espressione, ecc…

i geni

cosa sono i geni?Un gene è una specifica sequenza di DNA che codifica per un RNA funzionale o per un RNA messaggero, quindi per una proteina.

Il quantitativo di geni presenti in una specie è sintomo della sua complessità:

- se vi sono pochi geni, l’organismo sarà molto più semplice, - se ve ne sono molti, l’organismo avrà specifiche funzioni.

Negli umani (homo sapiens), il contenuto in geni nel nucleo è pari al 2% dell’intero genoma:

- il restante 98% ha funzioni strutturali e regolative- i geni sono assai scarsi, se non assenti, a livello dei telomeri e

dei centromeri. Questo permette di evitare errori di delezione degli estremi del DNA.

In organismi più semplici, con un minore rapporto geni/basi, il DNA è utilizzato e sfruttato al massimo:

- possono presentarsi i geni policistronici.Omologia di sequenza: se due specie possiedono almeno un 20% di genoma in comune, è un indice di origine comune dal punto di vista evolutivo.

Solamente in seguito, l’evoluzione introdurrà delle differenze specie-specifiche.

Il crossing-over inegualeIl crossing-over ineguale è un sorprendente meccanismo che porta talvolta alla duplicazione genica, su un filamento, e alla delezione su un altro.

L’evento di crossing-over ineguale avviene quando nella meiosi i cromosomi omologhi non si appaiano perfettamente, avendo uno scambio genetico difforme, in cui:

- un cromosoma possiede un tratto di DNA in più che può essere un gene duplicato

- l’altro possiede un tratto di DNA in meno, quindi la delezione dei geni in esso contenuto.

La maggior parte delle duplicazioni viene persa nell’evoluzione, ma alcune si rivelano vantaggiose e passano alla generazione successiva:

- si origina un gruppo di geni disposti in tandem - successivamente, i geni possono subire delle mutazioni, che li

porta a codificare delle proteine che tra loro sono isoforme.

Sono numerosi i casi in cui le proteine sono delle isoforme, che formano monomeri a funzione più specializzata:

- tubuline- actine- globine,

I loro geni sono disposti in tandem o capita che possano trovarsi, in seguito, anche su cromosomi differenti (come nel caso dei monomeri dell’emoglobina), a causa di altri eventi sul DNA.

Pseudogeni: geni con sequenze analoghe a quelle funzionali che hanno subito mutazioni che non gli permettono di funzionare correttamente.

Perché possono avvenire gli errori?Le basi azotate, formano i legami idrogeno con l’azoto e l’ossigeno presenti nella parte interna della catena di DNA.


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Gli ossigeni sono normalmente nella conformazione chetonica, ma per azioni esterne o condizioni chimico-fisiche particolari, si possono portare alla forma enolica, per quel fenomeno che si chiama tautomeria cheto-enolica.

La medesima cosa avviene per le terminazioni dell’anello che possiedono un gruppo amminico, che per eventi chimici o fisici particolari si possono portare nella forma imminica, per quell’evento che si chiama tautomeria immino-amminica.

Proprio per questa serie di fenomeni possono avvenire le mutazioni, che coinvolgono le basi azotate:

- si possono avere appaiamenti scorretti (AC, AG, TC, ecc..) a seconda della configurazione atomica che si viene a creare sul margine interno del filamento.

- Sono eventi inevitabili, scritti nella natura stessa del DNA.

La molecola di RNA

Struttura e funzioni.La molecola di acido ribonucleico è formata da nucleotidi che comprendono:

- uno zucchero a 5 atomi di carbonio, il ribosio;- un gruppo fosfato legato su 5’ del ribosio- una base azotata scelta tra due pirimidine (citosina e uracile) e

due purine (guanina e adenina), legata al carbonio in 1’.

L’RNA è una molecola a singolo filamento, legatosi con legami fosfodiesterici tra il carbonio 5’ di uno zucchero e il 3’ del successivo.

Nonostante sia una molecola a singolo filamento, l’RNA può appaiarsi in vari punti per formare delle strutture particolari che gli permettono di svolgere le proprie funzioni.

Si classificano vari tipi di RNA, che possiedono funzioni specifiche:

- rRNA: il più frequente (80%), che si compone di differenti frammenti che vanno a costituire i ribosomi.

- tRNA: è la molecola che porta l’amminoacido al ribosoma durante la sintesi proteica. È formato da 76 nucleotidi circa, a forma di trifoglio, possiede varie anse. L’amminoacido si lega sull’anticodone, un sito di legame sull’ansa complementare a quello dell’mRNA che passa nel ribosoma, corrispondente all’amminoacido che trasporta, al suo estremo terminale (estremità 3’). Sono circa il15% degli RNA della cellula.

- mRNA: è un RNA a un solo filamento, anche se può effettivamente ripiegarsi a formare un loop, che porta l’informazione per la proteina.

- RNA serie U: sono molecole poco frequenti, la cui funzione non è del tutto chiara.

- microRNA: sono piccoli frammenti che possono legarsi all’mRNA a formare porzioni di doppio filamento. Sembra che abbiano la possibilità di inibire un punto di trascrizione.

Gli rRNAGli rRNA sono gli acidi ribonucleici più frequenti:

- i tratti di DNA che li codificano sono sequenze mediamente ripetitive disposte in tandem

- esistono vari frammenti di rRNA che portano alla formazione di un ribosoma, anche con modifiche post-trascrizionali.

Negli eucarioti, gli rRNA che formano un ribosoma, sono:

- 28 S- 18 S- 5,0 S- 5,8 S

L’assemblamento e la modifica di questi rRNA di dimensioni e caratteristiche differenti porta alla costituzione delle due subunità del ribosoma eucariotico, con coefficiente di sedimentazione 80 S:

- 60 S (subunità maggiore)


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- 40 S (subunità minore).

Trascrizione

La trascrizione è un fenomeno per cui dal DNA si trascrive un filamento di RNA.

La trascrizione in generale

Gli enzimi responsabili della trascrizione, sia in procarioti che eucarioti, sono detti RNA-polimerasi:

- sono in grado di assemblare i nucleotidi uno alla volta, a partire da un tratto di DNA che funge da stampo.

- Le RNA polimerasi possono riconoscere e legare delle specifiche sequenze sul DNA.

Le sequenze a cui si lega RNA polimerasi sono definite promotore:

- affinchè le RNA polimerasi si leghino ai promotori è necessaria la presenza di numerosi fattori di trascrizione, delle proteine ancillari es. GTF.

- Il promotore contiene anche informazioni addizionali, ad esempio il filamento su cui avviene la trascrizione.

La RNA polimerasi muove in direzione 3’ >> 5’ lungo il filamento di stampo:

- il filamento di DNA si srotola localmente - la polimerasi assembla un filamento complementare di RNA

che cresce dal suo 5’ in direzione 3’. (filamento antiparallelo al DNA).

La reazione catalizzata dalla RNA polimerasi è:

RNAn + nuc-PPP RNAn+1 + PPi

In cui i ribonucleosidi trifosfato vengono idrolizzati in nucleosidi monofosfati e polimerizzati covalentemente nell’RNA corrispondente.

Non appena la polimerasi ha oltrepassato una certa soglia di nucleotidi funzionali, la doppia elica del DNA si riavvolge. La RNA-polimerasi, infatti, incorpora da 20 a 50 nucleotidi alla volta: dietro di sé non ha alcun ibrido, ma la catena di DNA si riavvolge.

Più polimerasi funzionano contemporaneamente e trascrivono geni differenti sulla medesima molecola di DNA.

La DNA polimerasi non ha una velocità prettamente costante nella trascrizione:

- può arrestarsi per vari motivi e riprendere- è più veloce quando ha a che fare con la rottura di basi

appaiate AT, piuttosto che CG sul DNA, poiché possiedono un legame idrogeno in meno.

La RNA-polimerasi si slega quando incontra una sequenza di nucleotidi sul DNA che porta un’informazione specifica di termine, detta sequenza di termine.

La trascrizione nei procariotiNei batteri come E. Coli è presente un solo tipo di RNA polimerasi, che per legarsi correttamente al promotore necessita di alcuni fattori opzionali, detti fattori sigma ().

La RNA polimerasi batterica è formata da un nucleo enzimatico composto da 5 subunità proteiche (di cui 2 alfa e 2 beta).

Il nucleo enzimatico della polimerasi batterica è formato da una sorta di chele che arpionano in mezzo il filamento di DNA, facendolo scorrere in un canale carico positivamente.

I promotori batterici si trovano a monte del gene, subito in prossimità di esso e sono composti da due sequenze di consenso:

- CAAT box: è una sequenza che inizia a -35, sull’estremità 3’ rispetto al gene, ed è un tratto di circa 35 basi


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- TATA box: è la sequenza di consenso che indica precisamente il punto in cui viene aperta la catena (notare che TATA è formato per la maggior parte da nucleotidi con solo 2 legami idrogeno, quindi più facili da scindere).

Possono esistere, a seconda delle condizioni, differenti fattori sigma.

La sintesi avviene seguendo le seguenti tappe:

1) il fattore sigma interagisce con il promotore, quindi l’enzima completo (2alfa, 2beta e sigma) si legano alla CAAT box

2) l’enzima completo, detto anche oloenzima, dopo alcuni tentativi separa le due catene avvolte di DNA.

3) Dopo che vengono incorporati alcuni enzimi nel complesso di RNA nascente (ricordare 3’ >> 5’), l’oloenzima subisce un cambiamento conformazionale che lo fa diventare complesso di allungamento della trascrizione, che si muove poi processivamente lungo il DNA.

4) La trascrizione si interrompe a livello della sequenza di termine.

Talvolta il termine della trascrizione avviene ad opera di una proteina detta fattore rho (), un anello che scorre lungo l’RNA neosintetizzato per poi scindere l’RNA poli dal DNA.

Trascrizione negli eucarioti Le cellule eucaristiche possiedono tre differenti tipi di RNA polimerasi, ciascuna delle quali sintetizza per un determinato gruppo di RNA.

Questi tre tipi di polimerasi sono identici in tutte le cellule eucariotiche:

- differiscono dalle procariotiche solamente per la presenza di alcune subunità aggiuntive, mentre il nucleo resta sostanzialmente lo stesso.

- Le subunità aggiuntive hanno la principale funzione nell’interazione con i numerosi fattori di trascrizione.

Le proteine accessorie, denominate fattori di trascrizione, svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione e nello svolgimento della trascrizione negli eucarioti:

- legame della polimerasi allo stampo- allungamento, - terminazione- inizio della trascrizione, - ecc…

I principali tipi di RNA derivano tutti da molecole di RNA-precursori, detti preRNA, o trascritti primari:

- è un segmento perfettamente complementare a quello del DNA che è funto da stampo.

- I trascritti primari sono subito associati a proteine, dopo la copia dell’unità di trascrizione sul DNA.

Lo stadio finale in cui si possono raggiungere tRNA, mRNA, rRNA viene raggiunto grazie ad operazioni di processing:

- è una sorta di taglia e incolla in cui le catene di preRNA vengono tagliate e ricucite in punti specifici.

- Perché avvenga il processing è necessario che vi sia una gran varietà di piccoli RNA, lunghi circa 90-300 basi, e le proteine che vi si associano.

I tipi di RNA polimerasi eucaristica sono riassunti in tabella:

enzima RNA di sintesi

RNA polimerasi I RNA ribosomi ali più grandi (18, 28, 5,8 S)

RNA polimerasi II mRNA, maggior parte dei piccoli snRNA e sno RNA, microRNA e RNA delle telomerasi

RNA polimerasi III Piccoli RNA, tRNA, rRNA 5S e RNA serie


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U6.

Sintesi e maturazione degli rRNA

Nelle cellule eucariote l’80% dell’RNA è RNA ribosomiale:

- i ribosomi sono numerosissimi e devono continuamente sintetizzare le proteine più disparate.

- Nel DNA le sequenze che codificano per rRNA (dette anche rDNA) sono sequenze mediamente ripetitive, ripetute circa 100 volte in tandem in 5 macroregioni

Le 5 regioni di rDNA sono responsabili della formazione dei nucleoli:- questi contengono le neo codificate subunità ribosomiali- hanno un aspetto granulare, di primo acchito.

Sintesi e precursori di rRNANei nucleoli, seguendo l’analisi che Oscar Miller fece nel 1960, si può osservare una grande fibra circolare che risulta composta da una “catena di alberi di natale”:

1) i geni che codificano per gli rRNA sono disposti in tandem su un filamento di DNA

2) l’albero di natale si compone di:a. tronco: il DNAb. rami: rRNA neo sintetizzatoc. base dei rami: RNA-poli I.d. il tratto di DNA compreso tra il primo ramo (quello più

corto, con sintesi appena iniziata) e l’ultimo ramo (il più lungo, con sintesi completata) si chiama unità di trascrizione.

3) Le fibrille di rRNA precursore contengono gruppi di particelle associate, che sono responsabili della formaizone delle subunità ribosomiali:

a. Proteineb. RNA

4) Tra le due unità di trascrizione è presente una fibra che non codifica per nessun RNA, detta spacers non trascritto.

Gli spacers non trascritti sono spesso presenti tra i codificanti con media ripetitività.

Maturazione dell’rRNA precursore.I ribosomi eucaristici contengono quattro rRNA distinti:

- subunità maggiore: 28S, 5,8S, 5S- subunità minore: 18S.

Sul DNA vi due sequenze differenti:

- preRNA: 28S, 18S, 5,8S- rDNA 5s: 5s.

Il preRNA è composto da un unico filamento che contiene in sé il 28S, il 18S e il 5,8S, che poi vengono separati ad opera di varie nucleasi.

Le caratteristiche peculiari del preRNA sono:

- gran numero di metilazioni e residui di pseudouridina.- Vengono aggiunti come modificazioni post-trascrizionali.

I nucleotidi metilati e i residui di pseudouridina sono rimasti sui preRNA nel corso dell’evoluzione sulle sequenze immutate:

- le nucleasi non tagliano in prossimità dei nucleotidi segnati con metilazioni

- discheratosi: mutazione mortale nell’enzima che promuove la conversione di uridina in pseudouridina.

Nel processo di maturazione, dal trascritto 45S primario di preRNA di circa 13000 nucleotidi ne rimangono circa 7000 nei tre segmenti risultanti dalla maturazione.


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Gli snoRNA: la maturazione del preRNA avviene grazie all’aiuto di piccolo RNA nucleo lari (snoRNA) che, assieme ad altre proteine formano le ribonucleoproteine piccole nucleolari:

- queste snoRNP si associano all’rRNA ancora prima del termine della trascrizione

- alcuni possono recidere l’estremità 5’ del trascritto- altre recisioni sono ad opera di esonucleasi specifiche (circa 12

differenti).- Alcuni snoRNP presenti in quantità minore svolgono funzioni

quali:o Indicare quali nucleotidi vengono metilati sul ribosioo Indicare quali uridine devono essere convertite in

pseudo uridine.

Questi snoRNP contengono piccole sequenze di RNA, che possono ibridarsi e formare, per brevi tratti, dei doppi filamenti di RNA con il neotrascritto.

Il nucleolo non è solamente il sito di elaborazione di rRNA ribosomiali, ma anche quello del montaggio delle due subunità:

- vi si associano due tipi di proteine:o proteine ribosomiali: sono stabili e formano le subunitào proteine accessorie: si associano in maniera transitoria

e catalizzano le reazioni di maturazione (elicasi x riarrangiamenti strutturali, esonucleasi, ecc..)

Sintesi e maturazione dell’rRNA 5SUna molecola di rRNA 5S, lunga circa 120 nucleotidi, è presente come componente della subunità maggiore del ribosoma.

Negli eucarioti le molecole di rRNA 5S sono codificate fuori dal nucleolo, su una serie di sequenze identiche inframezzate a quelle che codificano per gli altri rRNA:

- sono codificate dalla RNApoli III.

- Vengono poi trasportate nel nucleolo e assemblate assieme agli altri rRNA

La RNA polimerasi III è particolare poiché si lega ad un promotore che si trova all’interno della sequenza che viene trascritta:

- codifica per tipi differenti di RNA, compreso il tRNA, ma per questi tipi il promotore si trova a monte

Gli RNA transfer (tRNA)Le cellule animali hanno circa 50 tipi differenti di RNA transfer, uno per tripletta codificante:

- si trovano all’interno del genoma più sequenze che codificano per lo stesso tRNA

- i geni che codificano per tRNA sono raggruppati in cluster, ovvero gruppi di sequenze brevi che codificano per differenti tRNA

- la sequenza che codifica per un dato tRNA si trova generalmente in più di un cluster.

I tRNA sono trascritti dalla RNA polimerasi III e la sequenza promotrice si trova all’interno della parte codificante del gene, anziché all’estremità 5’.

Il trascritto primario di una molecola di RNA transfer è più grande del prodotto finale:

- devono essere rimossi dei tratti sulle due estremità 5’ e 3’.- Uno degli enzimi che tagliano il pre-tRNA è la ribonucleasi P.

Sintesi e maturazione degli mRNA (messaggeri).

Nella trascrizione dei messaggeri eucariotici sono presenti numerosi fattori, sia sul DNA che a livello di proteine (fattori di trascrizione e RNA polimerasi):

- RNA poli II


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- Promotore distaleo Enhancero Silencer

- Promotore prossimaleo Pseudo CAAT boxo TATA box

- Fattori di trascrizione o elementi in trans (non sul filamento di DNA)o elementi in cis (sul filamento che deve essere trascritto).

- sequenza di termine.

Il promotore distaleIl promotore distale si compone di sequenze sul DNA che si possono trovare a notevole distanza dalla sequenza da trascrivere, da -500 a -10'000.

Possono essere presenti o non esserci. Quando ci sono possono essere situati sia a valle che a monte del gene.

La sequenza enhancer è una sequenza di circa 200 nt che potenzia la trascrizione:

- è legato a fattori di trascrizione specifici, proteine che si legano alla sequenza e ne permettono la regolazione.

I silencer sono sequenze a cui normalmente si lega un inibitore, che quando si slega, al passaggio di fattori di trascrizione, reprimono la trascrizione dell’mRNA o di altri RNA.

Il promotore prossimaleIl promotore prossimale si compone di due tipologie di sequenze:

- delle pseudo CAAT box,- la TATA box.

Le CAAT box sono sequenze che consentono il legame delle proteine che formano il complesso dell RNA polimerasi II:

- sono elementi regolatori in cis, ovvero sul filamento che viene trascritto

La TATA box è una sequenza di nucleotidi ricchi in adenina e timina posta sul DNA tra -20 e -35:

- è la cassetta di sequenza che indica il punto in cui deve essere aperta la bolla di trascrizione.

Fattori di trascrizione o elementi in transI fattori di trascrizione in trans sono elementi che interagiscono con il DNA, ma non appartengono al filamento:

- si legano agli elementi regolativi in cis (promotore prossimale e distale)

- hanno una struttura quaternaria particolare.

I più comuni fattori di trascrizione in trans sono proteine che pinzano il DNA e ne modificano la conformazione, quali:

- zinc finger,- leucine-zipper- helix turn helix.

Il processo di trascrizione.Il processo di trascrizione avviene in varie tappe, che comprendono:

- l’ancoraggio di RNA poli II- la cascata di GTF sulla TATA box


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- l’elongazione del filamento di pre-mRNA- il termine della trascrizione.

L’ancoraggio di RNApoli II sul filamento dipende dall’interazione di fattori di trascrizione specifici in trans che si legano all’enhancer e al promotore:

- questi complessi proteici legati a enhancer e promotore ripiegano la catena e si legano tra loro

- formano una trappola sterica per l’RNApoli II- permettono la formazione dell’enhanceosome, un complesso

proteico di 12 proteine fondamentale per la trascrizione.

Con la formazione dell’enhanceosome si ha una cascata di GTF sulla TATA box:

- alla TATA box si lega una proteina detta TATA binding protein (TBP)

- Questa proteina richiama numerosi GTF (general transcription factors) che si legano alla TBP, che sono chiamati TF II (transcription factors II)

- I TF II sono sette proteine che si legano al complesso TATA-TBP, che permettono il legame della RNA polimerasi II.

Quando la polimerasi si lega, la trascrizione ha inizio e numerosi TF II si distaccano dal complesso.

L’elongazione è quel processo in cui la polimerasi allunga il filamento di RNA, con la regola della complementarietà delle basi rispetto al DNA.

Il termine della trascrizione avviene quando l’RNA polimerasi arriva alla sequenza TTATTT, che è posta circa 25 nucleotidi a monte del 3’ del filamento da trascrivere:

- sull’RNA si trascrive la sequenza AAUAAA, che richiama una endonucleasi che taglia il filamento di RNA dopo il passaggio della polimerasi.

- Con il taglio, si ha il distacco della polimerasi.

Vi sono delle eccezioni alla regola dei promotori con TATA: dei geni detti TATA-less promoters. Questi, a monte della sequenza, non hanno una TATA box, ma delle sequenze analoghe ricche in C e G, che occupano la medesima posizione della TATA:

- sono più difficili da aprire- sono derivati da geni ripetuti in tandem- sono per le proteine in cui vi è un enorme bisogno in qualsiasi

momento (istoni, rRNA, ecc…)- hanno una efficienza generalmente minore per le proteine che

sono rare.

La derivazione di questa tipologia di promotore è arcaica ed eucariotica.

La differenza tra endonucleasi e esonucleasi, quando tutte e due sono impiegate nel taglio di una sequenza di nucleotidi è:

- Endonucleasi: sono enzimi che rompono i legami fosfodiesterici tra due nucleotidi della catena.

- Esonucleasi: sono enzimi che depolimerizzano una catena nucleotidica dalle estremità del filamento.

-


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Maturazione del RNA messaggero

Le modifiche che avvengono per la maturazione di un RNA messaggero sono:

1) capping2) poliadenilazione3) splicing

Il capping di un mRNAIl capping consiste nell’aggiunta di una 7-metil-guanosina sull’estremità 5’ del filamento di RNA neotrascritto, appena è iniziata la trascrizione:

- una guanosinatrifosfato (GTP) viene metilata ad opera di numerosi enzimi in 7-metil-guanosina

- la 7-metil guanosina si lega con il suo gruppo fosfato al fosfato del 5’ del filamento di RNA

- si ha un legame fosfodiesterico 5’ – 5’ invertito al capo dell’RNA nascente.

La funzione del capping è multipla:

- protezione dalle esonucleasi, per impedire che il filamento venga depolimerizzato

- esportazione e riconoscimento dal nucleo al citoplasma- inizio della sintesi proteica, permettendo il riconoscimento al

ribosoma.

Poliadenilazione della coda del mRNALa poliadenilazione è un avvento post-trascrizionale che permette di portare tranquillamente l’mRNA nel citoplasma:

- dopo la sequenza AAUAAA sul filamento neotrascritto vengono aggiunti da 50 a 250 nucleotidi di adenina, formando la coda poli(A).

- Questa non è codificata da alcun gene, ed è aggiunta un enzima chiamato poli(A)polimerasi.

Le sue funzioni sono di protezione dall’azione di esonucleasi e di trasporto nel citoplasma.

I geni sprovvisti della TATA box non subiscono la poliadenilazione, poiché vengono subito tradotti, appena sono trascritti.

SplicingLo splicing è un evento post trascrizionale che avviene nel nucleo:

- comporta la rimozione degli introni dal filamento.

Il procedimento avviene nel seguente ordine:

- l’hnRNA (mRNA nucleare) si associa con un complesso detto spliceosoma, che riconosce gli introni tagliando le estremità 5’ e 3’ di questi

- lo spliceosoma, poi, riunisce le estremità degli esoni, a dare l filamento di mRNA maturo.

Nel processo di splicing intervengon numerose molecole:

- snRNA che con proteine formano le snRNP (ribonucleoproteine nucleari)

- U-RNA, altri complessi ribonucleoproteici.

Lo splicing alternativo è un procedimento di regolazione dell’espressione genica che permette la formazione di proteine differenti ma analoghe a partire da un solo trascritto:

- avviene nel 60 % dei trascritti- il meccanismo comporta una scelta differente degli introni da

tagliare.- Solitamente la scelta degli esoni avviene in base alla specificità

del tessuto.


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Sequenze UTR.Negli mRNA maturi sono presenti spesso delle sequenze non tradotte (UTR, untranslated regions):

- sono regioni che si trovano alle estremità degli RNA- proteggono questi filamenti dalle RNAasi (esonucleasi che

degradano gli introni eliminati)- vengono trascritte, ma non tradotte.

La traduzione

Il codice genetico

Il codice genetico è una tabella che mette in relazione le triplette di nucleotidi su un filamento di RNA con gli amminoacidi corrispondenti per la sintesi delle proteine.

Le triplette che si trovano sugli mRNA sono dette codoni, che hanno sequenze complementari sui tRNA, dette anticodoni.Sul fondo dei tRNA si trovano gli amminoacidi corrispondenti agli anticodoni, montati sui trifogli di tRNA dagli enzimi amminoacil-tRNAsintetasi.Il codice genetico gode di determinate proprietà:

- è degenerato: codoni differenti possono codificare per lo stesso amminoacido. Fanno eccezione met e trp e i codoni di STOP.

- Non è ambiguo: a ogni codone corrisponde perfettamente un aa o uno STOP.

- È universale: è presente ugualmente in tutti i nuclei di tutti gli organismi cellulari. Fanno eccezione solamente i mitocondri, che nel loro unico filamento circolare hanno dei geni con differenti codici genetici a seconda delle classi di appartenenza degli organismi.

Mutazioni geniche o puntiformi.Le mutazioni geniche sono mutazioni che coinvolgono solamente un nucleotide. Si contrappongono a quelle cromosomiche, in cui si ha la mutazione di un tratto di nucleotidi consistente.


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Le mutazioni sono modificazioni permanenti spontanee del DNA, dovute alla tautomeria delle basi azotate, in cui si ha l’appaiamento scorretto di determinate basi.

I tipi di mutazione puntiforme sono:

- sostituzione: è la più frequente, e può essere casualmente reversibile. Può portare a:

o codoni missenso: triplette che codificano per un altro amminoacido, poco gravi.

o Codoni non senso: codoni che codificano per uno stop. Hanno una discreta gravità.

- Inserzione, delezione o duplicazione: sono spostamenti reciproci dei due filamenti. Possono provocare delle frame shift, ovvero lo slittamento dell’intera cornice di lettura nel DNA. Molto spesso si ha un ptc, codone di terminazione prematura.

Può capitare, che proprio la proprietà di essere degenerato del codice genetico, non porti ad una mutazione significativa:

- molto spesso, un codone può trasformarsi in un codone degenere, che codifica per lo stesso aa, pur essendo differente.

il ruolo dei tRNA.

Gli RNA sono gli intermediari del processo di traduzione:

- da un lato sono legati ad un aa, formando u aa-tRNA- dall’altro possiedono l’anticodone, che può riconoscere la

sequenza sull’mRNA corrispondente all’aa.

Bidimensionalmente, le molecole di tRNA hanno una struttura a trifoglio, con:

- 3 anse in cui non v’è complementarietà delle basi appaiate- quattro bracci in cui le basi si appaiano

La molecola di tRNA presenta inoltre numerose particolarità:

- possiedono spesso dei nucleotidi modificati, che permettono il legame di specifiche proteine.

- all’estremità 3’ hanno sempre la sequenza CCA – OH, a cui si lega l’aminoacido

- sull’ansa centrale presenta un anticodone formato da una tripletta complementare al filamento di DNA.

La struttura tridimensionale della molecola invece presenta una forma di L rovesciata con due doppie eliche.

In realtà non esistono 61 tRNA, tanti quanti i codoni del messaggero, ma in minore quantità:

- questo è reso possibile dalla regola del vacillamento in relazione alla degenerazione del codice genetico:

o l’amminoacido codificato da più codoni è caratterizzato dalle prime due basi, mentre la terza è meno importante.

o Quindi vi sono tRNA che possono instaurare legami differenti con la terza base.

Gli aa sono legati covalentemente al tRNA corrispondente da un enzima chiamato amminoacil-tRNAsintetasi:

- Ve n’è uno per ogni aa- Utilizza ATP per formare prima amminoacil-AMP, poi

amminoacil-tRNA e AMP- il legame tra l’aa e il tRNA è un legame altamente energetico,

che permette di attuare facilmente la formazione dei futuri legami peptidici.

- se avviene l’appaiamento sbagliato, l’amminoacil-tRNAsintetasi è in grado di correggere le bozze, tramite un meccanismo detto di proofreading.


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Il procedimento di traduzione

Il processo di traduzione è uno dei processi più complessi che si verificano all’interno della cellula, che porta alla sintesi dei componenti funzionali della cellula stessa: le proteine.

Per la sintesi proteica sono necessari:

- tutti gli amminoacil-tRNA- i ribosomi- l’mRNA- proteine con funzioni ausiliarie- cationi e GTP.

Il processo può essere diviso in varie fasi:

- inizio della catena- elongazione della catena- terminazione.

L’inizio della sintesi.Affinchè il ribosoma si leghi nel punto di lettura corretto, esso deve riconoscere la sequenza d’inizio AUG, codone sull’mRNA che codifica per la metionina:

- una volta che il ribosoma ha riconosciuto il punto d’inizio si è posto nell’appropriato modulo di lettura.

- Proseguirà leggendo una tripletta alla volta e codificando e sintetizzando gli amminoacidi del peptide.

Il processo avviene in varie fasi che si sintetizzano di seguito.

Fase 1. La subunità minore del ribosoma si porta al sito d’inizio. L’mRNA si lega prima alla subunità minore del ribosoma, con il suo codone AUG, che è la sequenza d’inizio.

Per riconoscere la sequenza d’inizio corretta e non una all’interno della catena che codificherebbe per la proteina i ribosomi si avvalgono di una sequenza che si trova 5 o 10 nucleotidi prima dell’AUG:

- per gli eucarioti è detta sequenza Kozak ed è ACCAUGG- per i procarioti è la sequenza Shine-Dalgarno, GGAGGA

Le sequenze tipo Shine-Dalgarno sono poste all’estremità 3’ dell’mRNA e vengono ricononosciute da una sequenza complementare presente sul ribosoma.

Fattori di inizio. La sintesi, per iniziare necessitano di proteine solubili, dette fattori di inizio (IF o eIF per eucarioti).

Nei procarioti si trovano:

- IF1: facilita l’attacco della subunità minore all’mRNA e impedisce un aggancio errato.

- IF2: lega GTP richiesta per legare il primo amminoacil-tRNA- IF3: impedisce il legame prematuro della subunità maggiore.

Negli eucarioti son presenti invece 8 IF.

Fase 2. Il primo aa-tRNA si inserisce sul ribosoma. AUG è l’unico codone che codifica per la metionina. Infatti, la metionina è sempre il primo amminoacido incorporato in una catena peptidica, anche se nella maggior parte dei casi viene poi rimosso enzimaticamente.

Nei procarioti solitamente la met N-terminale viene formilata, mentre negli eucarioti non si presenta formilazione.

Esistono però due distinti tRNA:

- uno per la metionina d’inizio- e l’altro per incorporare la metionina in una catena.

La sintesi inizia quando il tRNAMet iniziatore si lega ad AUG sull’mRNA:

- si lega a IF2- vengono rilasciati IF1 e IF3.

Fase 3. Assemblaggio del complesso d’inizio completato. Quando il tRNA iniziatore si lega alla subunità minore si ha l’idrolisi di GTP su IF2:

- si lega la subunità maggiore- si rilascia il complesso IF2 GTP.


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Particolarità negli eucarioti. Negli eucarioti gli eIF sono 12, ma anche in questo caso si ha il legame di eIF2-GTP, quando il tRNA iniziatore si lega alla sequenza d’inizio.

La subunità minore cerca quindi il cap metilguanosinico sull’estremità 5’ di mRNA e avviene il legame.

Quando il complesso 43S che si è formato dall’aggancio del cap, il messaggero scorre fino alla sequenza Kozak (5’ – CCACCAUGC – 3’):

- viene raggiunto il codone appropriato AUG- eIF2-GTP viene idrolizzato e - la subunità maggiore si lega al complesso.

Il ruolo dei ribosomi. I ribosomi sono macchine molecolari che con funzione meccaniche ripetitive permettono lo scorrimento del filamento di mRNA, la selezione dei tRNA, la formazione dei legami peptidici, tramite l’utilizzo di energia rilasciata dall’idrolisi di GTP.

La peculiarità dei ribosomi è il contenuto di rRNA, che permette:

- accuratezza della traduzione- lega fattori proteici- seleziona i corretti tRNA- polimerizzano gli amminoacidi.

Ogni ribosoma presenta tre siti in cui i tRNA scorrono nei vari passaggi della sintesi e dell’elongazione della catena peptidica:

- sito A, amminoacidico- sito P, peptidico- sito E, di uscita, exit.

I tRNA che si legano a questi siti hanno:

- codone legato alla subunità minore >> decodificazione delle informazioni contenute nell’mRNA

- sito amminoacidico a contatto con la subunità maggiore >> catalizza la formazione del legame peptidico.

ElongazioneLa elongazione è il vero e proprio processo di costruzione della catena polipeptidica della proteina.

Fase1. Selezione dell’amminoacil-tRnA. Quando il tRNA iniziatore è nel sito P, il sito A è pronto ad accettare il secondo amminoacil-tRNA.

Per poter essere idrolizzato, l’amminoacil-tRNA deve essere legato ad un altro fattore di elongazione detto EF-Tu-GTP, che possiede GTP:

- tutti i tRNA legati a EF-Tu possono essere immagazzinati nel sito A, ma solamente quel tRNA complementare al codone si lega

- quando amminoacil-tRNA-EF-Tu-GTP è legato viene idrolizzato GTP e rilasciato il fattore di elongazione.

-

Fase 2. Formazione del legame peptidico. I due amminoacidi legati ai loro tRNA sono vicini l’uno all’altro e possono reagire tra loro:

- L’estremo N-terminale dell’amminoacido nel sito A reagisce con il carbonile dell’aa nel sito P.

- Si forma il legame peptidico catalizzato dalla peptidil transferasi, complesso enzimatico (ribozima) della subunità maggiore

- A legame formato il tRNA del sito P si distacca dall’amminoacido.

Fase 3. Traslocazione. La traslocazione è un processo mediante il quale il ribosoma slitta di tre nucleotidi sull’mRNA:

- è catalizzato da EF-G, che attua una modifica conformazionale con l’utilizzo di GTP.

- Si rompono i legami idrogeno e il tRNA con legato il dipeptide si sposta nel sito P

- Il tRNA deacilato si sposta dal sito P al sito E.

Fase 4. Rilascio del tRNA deacilato. Nella tappa finale, il tRNA deacilato si sposta ed esce dal ribosoma liberando il sito E:


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- nel processo di elongazione vengono utilizzate 2 GTP per ogni aa.

- Ogni ciclo dura circa un ventesimo di secondo.- Il sito A è nuovamente libero per poter iniziare un altro ciclo.

Terminazione.La terminazione ha inizio quando sul messaggero sono presenti uno dei tre condoni di STOP, che inducono il ribosoma a slegare l’ultimo amminoacido dal tRNA nel sito P, anche senza la presenza di un nuovo tRNA.

Affinchè la terminazione abbia fine, è necessaria la presenza di fattori di rilascio, RF o eRF per gli eucarioti, che riconoscono i codoni di stop.

Quando entrano nel sito A del ribosoma e riconoscono un codone di stop (UAA, UAG, UGA), inducono la rottura del legame estereo tra l’ultimo tRNA e la catena polipeptidica ad esso legata.

Per la rottura del legame è necessaria la presenza di un altro EF, EF-G, che lega ed idrolizza GTP.

Dispositivi di correzione degli erroriIn caso del cambiamento di una base o dell’inserzione di un nucleotide nel mRNA o nel DNA sono facilmente pervenibili delle mutazioni nonsenso, che comportano la presenza di un codone di STOP prematuro:

- le cellule possiedono un meccanismo di sorveglianza dell’mRNA in grado di rivelare la presenza di codoni di stop prematuri

- sono tradotte solitamente una sola volta prima di andare incontro a distruzione ad opera di un meccanismo chiamato nonsense-mediated decay o NMD.

L’NMD protegge le cellule dalla produzione di proteine tronche e non funzionali.

Quando si ha l’unione tra due esoni ad opera dello spliceosoma, un agglomerato di proteine detto complesso di giunzione esonica (EJC), rimane associato all’mRNA fino a che non viene tradotto:

- quando passa nel ribosoma, prima dell’ingresso, l’attività elicasica e altre attività lo rimuovono

- se si inserisce un codone di stop prematuro, parte del filamento resta attaccato al ribosoma con addosso alcuni EJC

- quando un mRNA possiede ancora EJC dopo essere stato tradotto viene identificato come aberrante e distrutto enzimaticamente.

PoliribosomiIl filamento di mRNA, quando è trascritto, può esserlo ad opera di numerosi ribosomi contemporaneamente, poiché questi si legano al cap e si dirigono verso il 3’ uno dopo l’altro.

Il complesso che si forma con i numerosi ribosomi sul filamento di mRNA è detto poliribosoma.


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La replicazione del DNA

La replicazione del materiale genetico è un evento unico, che ha permesso il tramandarsi della vita stessa e l’evoluzione ad organismi complessi.

Infatti, la vita in sé, non sarebbe potuta progredire se non avesse conservato il proprio patrimonio informazionale:

- inizialmente si aveva tramite RNA,- solo successivamente l’informazione venne tramandata tramite

DNA.

Teorie sul tipo di replicazione.

La replicazione dei due filamenti di DNA, che sono complementari tra loro lasciava intendere a Watson e Crick dei diversi modelli di comportamento re plicativo, che potevano essere:

- replicazione semiconservativa: ogni doppia elica figlia riceve metà della struttura parentale.

- Replicazione conservativa: ogni filamento avrebbe fatto da stampo per un nuovo filamento. I nuovi si uniscono tra loro e i vecchi ritornano uniti. Una cellula figlia ha ancora il vecchio patrimonio genetico.

- Replicazione dispersiva: il DNA si replica a tratti, l’integrità dei filamenti parentali viene dispersa.

Il modello semiconservativo, a seguito degli esperimenti di Mesleson e Stahl, prevalse:

- fecero crescere e riprodurre dei batteri in terreno di coltura con un isotopo pesante dell’azoto

- quando posero in coltura batteri in terreno neutro, con azoto-14, si vide, analizzando la densità dopo centrifugazione, che si ottenevano degli ibridi pesante-leggero, senza il mantenimento di una molecola di DNA pesante

- l’esperimento si confermò valido anche nelle generazioni successive e si concluse che il DNA si replica con un modello semiconservativo.

La replicazione nei procarioti

Con lo sviluppo delle tecniche biochimiche di laboratorio, oggi è possibile studiare anche i meccanismi di replicazione del DNA eucariotico.

Tuttavia, alcuni anni fa, non era possibile fare per gli eucarioti due passi fondamentali per lo studio del processo di replicazione:

1) avere disponibilità di mutanti incapaci di sintetizzare qualche proteina necessaria per il processo di replicazione

2) avere sistemi di coltivazione in vitro che consentissero di studiare la replicazione in cellule purificate di determinate proteine.

In questo modo, si poté conoscere le proteine che intervengono nella replicazione dei batteri (circa 30 in E. Coli). Oggi è possibile studiare anche il processo in cellule eucariotiche e si dimostra sensibilmente simile.

Forcella di replicazione e replicazione bidirezionale.Nella molecola circolare di DNA double strend batterico la replicazione inizia in un punto detto origine, in cui sono presenti sequenze dette oriC:

- il doppio filamento si apre ad opera di proteine specifiche- si forma la forcella di replicazione.- La replicazione avviene in entrambe le direzioni rispetto all’ori,

è quindi una replicazione bidirezionale.

A livello della forcella di replicazione corrispondono punti in cui:

- la doppia elica va incontro a separazione dei due filamenti paterni


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- i nucleotidi complementari a quelli paterni vengono incorporati nel DNA della cellula figlia.

La forcella di replicazione si ampia fino a quando i due filamenti neo sintetizzati si incontrano dalla parte opposta e si staccano dal DNA paterno.

Le sequenze di origine sono generalmente ricche in T e A, poiché sono più facili da scindere i legami idrogeno che le tengono unite.

Srotolamento della doppia elica e separazione dei filamenti.La doppia elica batterica, essendo circolare, presenta il problema dello srotolamento:

- quando si apre la forcella di replicazione, infatti, la doppia elica tende a super avvolgersi a seguito della trazione esercitata dalle porzioni di filamento scisse all’origine

Il problema di questo eccessivo avvolgimento è risolto da un corredo enzimatico detto di topoisomerasi, tra cui la DNAgirasi:

- è una proteina che è in grado di eliminare, in E. Coli, lo stress torsionale derivato dallo svolgimento dell’elica

- taglia i due filamenti del duplex, li fa passare dalla parte opposta e li risalda perfettamente.

- Il processo necessita di energia, fornita mediante l’idrolisi di ATP.

Le proprietà delle DNA polimerasiLa replicazione del DNA avviene ad opera di enzimi chiamati DNA polimerasi, che sono presenti in varie forme sia negli eucarioti che nei procarioti.

Nei procarioti vi sono tre DNA polimerasi principali: la I, la II, la III. Quest’ultima è la principale artefice del processo di replicazione.

Affinché avvenga la reazione di replicazione del DNA è necessaria la presenza di tutti i desossiribonucleotidi trifosfato, che vengono poi incorporati nei nuovi filamenti (GTP, ATP, CTP, TTP).

Affinché la DNA polimerasi possa formare l’inizio, sono necessarie due condizioni:

- un filamento di DNA da cui copiare i nucleotidi (stampo)- una breve sequenza che fornisce una estremità 3’ OH alla

polimerasi, detta sequenza primer.Solamente una doppia elica con l’apertura di una bolla di replicazione può soddisfare queste condizioni.

Con la scoperta delle varie DNA polimerasi si vide che l’unica direzione di replicazione consentita era quella della scrittura da 5’ a 3’ e della lettura del filamento stampo 3’ > 5’.

La replicazione è semidiscontinuaEntrambi i nuovi filamenti sul filamento stampo vengono sintetizzati in direzione 5’ > 3’, poiché la polimerasi non è capace di sintetizzare nella direzione opposta.

Nella replicazione il gruppo fosfato del desossiribonucleotide trifosfato si lega all’estremità 3’ OH del filamento in sintesi, muovendosi lungo lo stampo.

Il filamento che viene sintetizzato in maniera continua, secondo la direzione della forcella di replicazione, è detto filamento guida, e procede senza interruzioni.

L’altro filamento, detto filamento in ritardo, avanza nella direzione opposta rispetto a quella della forcella di replicazione:

- viene sintetizzato a frammenti, detti frammenti di Okazaki.- Solo in seguito, la DNA polimerasi si porta indietro per

reiniziare, partendo da una nuova sequenza primer, dalla forcella replicativa.


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- A quel punto, la sequenza primer verrà rimossa e si avrà la sintesi di DNA che si collega al filamento precedentemente trascritto, grazie all’enzima DNA ligasi.

Appunto perché la sintesi del filamento che ha come stampo di DNA la direzione 5’ > 3’ avviene a piccoli frammenti di 1000/2000 nucleotidi, la replicazione viene detta semidiscontinua.

Ma se la DNA polimerasi da sola non è capace di dare inizio ad un filamento, l’inizio è dovuto da un altro particolare enzima, la RNA primasi:

- questa sintetizza una sequenza di RNA detta sequenza primer- queste sequenze primer servono come inizio per la DNA

polimerasi, la quale poi inizia dal primer a sintetizzare il filamento di DNA.

- I primer vengono poi rimossi e viene sintetizzato DNA e unito al filamento mediante DNA ligasi.

Il macchinario che opera a livello della forcella replicativa.La replicazione richiede non solo l’incorporazione dei nucleotidi, ma moltissimi altri processi che avvengono a livello del DNA.

Uno tra i processi più complessi è lo srotolamento del duplex e il mantenimento dei filamenti slegati. Questi compiti sono attuati da:

- elicasi: srotolano il duplex ad elica del DNA mediante l’energia fornita dall’idrolisi di ATP.

- Proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSB): coadiuvano l’azione dell’elicasi legandosi al filamento singolo e mantenendolo slegato, impedendone il riavvolgimento.

L’azione dell’elicasi avviene in contemporanea con quella della primasi, poiché i due enzimi si associano formando un complesso detto primosoma:

- l’elicasi si muove in direzione 5’ > 3’ sul filamento stampo (DNA) in ritardo

- la primasi si lega a intervalli regolari sulla elicasi rilasciando le sequenze primer.

È stato dimostrato inoltre che i differenti frammenti di Okazaki sono sintetizzati dalla medesima DNA polimerasi III. Affinché ciò avvenga è necessario un meccanismo particolare:

- si ritiene che le due DNA polimerasi dei due filamenti si muovano assieme, legate una all’altra.

- Si possono muovere assieme, nonostante si sintetizzi in direzione opposta, poiché sul filamento in ritardo si forma un occhiello (ansa circolare) che permette di portare il filamento in cui si sta sintetizzando il frammento nella stessa direzione del filamento stampo guida (3’ > 5’ sul DNA)

- Questo meccanismo permette alle due polimerasi di muoversi assieme senza violare il meccanismo della direzione 5’ – 3’.

- Quando la polimerasi che forma il filamento in ritardo raggiunge l’estremità 5’ del frammento di Okazaki sintetizzato durante il ciclo precedente, abbandona il filamento stampo, sposta l’occhiello e si dirige, assieme alla primasi, su un nuovo stampo.

Strutture e funzioni delle DNA polimerasi.

L’enzima che opera nella formazione del filamento di DNA nella replicazione di E. Coli è la DNA polimerasi III, che è parte di un grande complesso chiamato repli soma o oloenzima DNA polimerasi III, formato da varie subunità:

- pinze ß: Sono pinze che circondano il filamento di DNA e restano associate allo stampo. Hanno una struttura a ciambella che formano una pinza scorrevole formata da due subunità.

o Le pinze sul filamento in ritardo vengono costantemente sostituite ad opera di una pinza caricatore.

- Pinza caricatore: pinza legata ad ATP, che permette il cambio della pinza ß a livello del filamento in ritardo, al termine della sintesi del frammento di Okazaki.


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- Polimerasi: è la parte funzionale nella sintesi dei nucleotidi sul complesso enzimatico. Addossata alla pinza ß.

La DNA polimerasi I ha sostanzialmente alcune funzioni di riparazione, ma la maggiore funzione che ha è quella di rimuovere i primers.

La DNA polimerasi II è invece impiegata interamente nel riparo e nella correzione del DNA neosintetizzato.

Attività esonucleasica della DNA polimerasi ILa DNA polimerasi I ha tre tipi di attività:

- polimerizzazione- esonucleasica nelle due direzioni.

L’attività esonucleasica 5’ – 3’ viene esplicata quando la DNA poli I deve rimuovere i primer:

- degrada le sequenze primer che prima sono state lasciate dalla primasi.

Dopo aver degradato l’RNA primer, la polimerasi sintetizza per la sequenza mancante al posto del primer un filamento di DNA.

Alta fedeltà della replicazione del DNAUn errore nella replicazione del DNA rappresenta un fatto molto più grave rispetto ad un errore di trascrizione su un filamento di mRNA:

- sull’mRNA un errore incide per un solo ciclo sintetico di una proteina.

- Sul DNA invece, si trasforma in una mutazione ereditaria.

A causa della tautomeria cheto-enolica e di quella immino-amminica, le basi possono essere riconosciute in maniera scorretta dalla DNA polimerasi, che le prova una ad una:

- la polimerasi ruota come le dita di una mano, mentre ha il filamento nel palmo.

- Se l’appaiamento avviene in modo errato, si ha una conformazione scorretta, e la polimerasi non può attuare il cambiamento conformazionale corretto per l’attività catalitica.

- se nel tentativo di appaiamento una base che non rispetta AT CG è in una conformazione tautomerica scorretta si ha un appaiamento errato,

o la frequenza è di uno ogni 10’000 nucleotidi incorporatio le tre polimerasi batteriche possiedono un sito di

esonucleasi 3’-5’.o La catena tende automaticamente a spostarsi in basso

verso il sito esonucleasico poiché preferisce restare a filamento singolo.

o Questo meccanismo di correzione di bozze funziona nel 99% dei casi.

Tuttavia i batteri prevedono anche la possibilità di un altro meccanismo detto riparazione dell’appaiamento scorretto:

- entra in azione dopo la replicazione- corregge quasi tutti gli errori sfuggiti alla correzione di bozze- abbassa a 10-9 il tasso di mutazione spontanea.

In definitiva, la precisione e la fedeltà della replicazione del DNA è dovuta a:

- accurata selezione dei nucleotidi- immediata correzione di bozze (sito esonucleasico 3’-5’)- riparazione dell’appaiamento scorretto (post-replicazione)

Replicazione nelle cellule eucariotiche

L’analisi della replicazione nelle cellule eucariotiche è stata molto più difficile rispetto a quella dei batteri per la maggiore complessità e per i minori meccanismi a disposizione dei ricercatori.

Oggi, con nuove tecniche e scoperte di metodiche, è stato possibile conoscere più a fondo la replicazione del patrimonio genetico di una cellula eucariotica.


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Inizio della replicazioneLa replicazione di un batterio inizia in un solo punto chiamato origine, mentre nelle cellule degli organismi superiori, che possiedono un DNA molto più complesso, avviene in più punti, detti repliconi:

- ciascun replicone ha una propria origine di replicazione- apre una forcella replicativa e la sintesi avviene in entrambe le

direzioni.- In una fase S di un ciclo cellulare sono attivi un 10-15% dei

repliconi, che iniziano la loro sintesi nello stesso momento anche nei cicli successivi.

- Probabilmente, nella scelta dei repliconi, è implicato lo stato di condensazione della cromatina e l’eventuale acetilazione degli istoni ad essa legati.

Mentre nelle cellule eucariotiche di lievito la replicazione inizia su delle specifiche sequenze, dette ARS, negli eucarioti dei vertebrati il punto di inizio non sembra avere delle sequenze preferenziali, ma dipende probabilmente da:

- dallo stato di condensazione- dal tipo di modificazione istonica- dallo stato di metilazione del DNA- dal grado di superavvolgimento,- ecc…

Restrizione della replicazione a un unico evento per ciclo cellulareÈ fondamentale che durante la duplicazione, poiché l’origine avviene in più punti, ogni parte del genoma venga replicata una volta sola.

Deve quindi esistere un meccanismo che eviti che si apra una forcella su un filamento che si è già duplicato, che consiste pressappoco in:

- un complesso di riconoscimento dell’origine (ORC) lega l’origine di replicazione e resta associato durante tutto il ciclo cellulare

- proteine autorizzanti (fattori Mcm2 – Mcm7) legano l’ORC, costituendo un complesso di pre replicazione (pre-RC), autorizzando l’inizio della replicazione.

- Una ciclina protein-chinasi, la Cdk, durante la fase S resta attivata ad alta concentrazione durante la fase S della mitosi, impedendo la formazione di nuovi complessi di replicazione.

- Una sola volta per ciclo si ha il legame di una Cdk, quindi non si avrà apertura di nuove origini.

Una volta che il complesso pre-RC è stato attivato le Mcm2 e Mcm7 si attivano e formano un complesso attivo durante la replicazione:

- si ritiene che possano avere attività elicasica.- Nei mammiferi, le proteine Mcm si dissociano e restano nel

nucleo quando hanno finito la loro attività.- Non si possono associare ad un pre-RC già attivato.

La forcella di replicazione negli eucariotiLa replicazione degli eucarioti è praticamente identica a quella dei procarioti, la replicazione effettiva avviene sempre nello stesso modo.

Gli attori di questo meccanismo non sono proprio gli stessi in termini molecolari, ma sono totalmente analoghi:

- elicasi- proteine che si legano al filamento singolo (RPA)- topoisomerasi- primasi- DNA polimerasi (sono maggiori e differenti)- DNA ligasi.

Come avviene nei procarioti, il Dna delle cellule eucariotiche è sintetizzato in maniera semidiscontinua, con differenze minime:

- il replisoma è anche in questo caso formato da un dimero di DNA polimerasi, che sintetizza con lo stesso metodo i frammenti di Okazaki (formazione dell’ansa per rendere complementari i due filamenti).

- I frammenti di Okazaki sono sensibilmente più corti (150 nt).


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Nelle cellule eucariotiche sono finora state individuate cinque DNA polimerasi classiche, ovvero presenti in tutte le cellule eucariotiche:

- solamente due di queste 5 non sono coinvolte nella replicazione del DNA nucleare

o La DNA polimerasi è coinvolta nella replicazione del DNA mitocondriale.

o La DNA polimerasi è implicata nei processi di riparazione del DNA.

- Le altre tre DNA polimerasi hanno invece funzioni di sintesi particolari:

o La DNA polimerasi è associata all’RNA primasi, codifica un piccolo tratto di DNA dopo il primer (20 nt) poi abbandona la replicazione.

o La DNA polimerasi si pensa che sia la principale polimerasi implicata nella sintesi del DNA. Come nei batteri, questa è formata da:

Una pinza scorrevole, simile alle subunità ß dei batteri, chiamata PCNA

Un caricatore della pinza sulla polimerasi chiamato RFC.

Questa polimerasi completa la sintesi dei frammenti di Okazaki sul filamento in ritardo, che poi vengono uniti tra loro da una DNA ligasi.

o La DNA polimerasi è ancora non ben definita. Ha comunque funzione sintetica di nuovo DNA e possiede un sito esonucleasico per la correzione degli errori.

Come nei batteri, le polimerasi sintetiche ( hanno caratteristiche triplici:

- Allungano il filamento neosintetizzato in direzione 5’ – 3’- Non possono iniziare replicazione senza un primer.- Possiedono dei siti esonucleasici per la correzione degli errori

di appaiamento.

La funzione delle telomerasiI frammenti di RNA primer posti alle estremità dei cromosomi lineari lasciano un gap di DNA non sintetizzato quando sono rimossi dal sito:

- Nessuna DNA polimerasi è in grado di sintetizzare nuovo DNA su quelle sequenze senza la presenza di un Primer.

- Le estremità 3’ dei filamenti sono sempre più corte.

Al margine dei cromosomi sono sempre presenti delle sequenze non codificanti, dette telomeri, che servono appunto per proteggere l’informazione da delezioni o rimozioni locali nei punti più esposti:

- Nell’uomo sono formati da circa 100-1500 unità di sequenze ripetute

- ad esempio TTAGGG.

Per ovviare all’inconveniente dei “buchi” di DNA al termine 3’ dei filamenti neo sintetizzati vi sono degli enzimi detti telomerasi:

- Aggiungono le stesse sequenze di desossiribonucleotidi trifosfato.


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La riparazione del DNA

All’interno della cellula, il DNA è la molecola più importante, ma anche la più fragile.

Delle alterazioni alle basi azotate o delle rotture nella catena nucleotidica si possono verificare in qualsiasi momento (una cellula ne subisce circa 10000 al giorno), ad opera di differenti fattori:

- agenti chimici- radiazioni termiche- radiazioni ultraviolette- onde elettromagnetiche - ecc…

Se queste lesioni non vengono riparate si trasformano automaticamente in mutazioni, che si trasmettono alla progenie della cellula.

La cellula ha dei sistemi di riparazione formidabili e molto vari, quasi capaci di recuperare qualsiasi danno subito:

- solo 1 lesione su mille circa sfugge ai sistemi di riparazione cellulare

- vi sono numerosi sistemi enzimatici capaci di riparare i danni subiti dal DNA, che funzionano secondo differenti meccanismi:

o riparazione istantaneao escissione

La grande proprietà che permette al DNA una possibile correzione delle aberrazioni è la sua complementarietà delle basi, che permette di ricostruire il filamento che deve essere corretto su stampo delle basi del filamento complementare.

Il processo tuttavia è complesso e richiede il rimodellamento della cromatina, poiché questa limita l’accessibilità ai complessi enzimatici di correzione.

Riparazione per escissione nucleolitica.

I sistemi di riparazione per escissione nucleolitica (NER) agiscono attraverso la rimozione di un piccolo tratto di filamento di DNA che contiene una grossa lesione, quale ad esempio:

- dimeri di pirimidina- nucleotidi con legati gruppi chimici non propri

Questo sistema di riparazione può procedere per due vie:

- via associata alla trascrizione: viene di preferenza riparato il filamento stampo che contiene i geni che vengono trascritti.

o La riparazione del filamento stampo avviene in contemporanea alla trascrizione del DNA

o La segnalazione avviene attraverso il meccanismo della RNA polimerasi.

o I geni che vengono trascritti maggiormente, ovvero quelli più importanti, hanno la massima priorità nell’ordine di riparazione.

- via globale: più lenta e meno efficiente che corregge i filamenti di DNA nel resto del genoma.

Il fulcro di questo meccanismo è il fattore di trascrizione TFII H, che legge le sequenze scorrette del DNA durante la trascrizione. Questa proteina possiede tra le sue subunità due siti elicasici, che qualora venga ravvisato un errore separano il duplex e inizia il processo:

- il filamento viene tagliato ai lati della sequenza scorretta dalle endonucleasi e viene rimosso

- la DNA polimerasi riempie il gap- delle DNA ligasi legano a livello dei nicks.

Nei procarioti vi è un sistema simile, che è ad opera di due proteine Mut (H, L e S).


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Riparazione per escissione di base

Per la rimozione di singoli nucleotidi alterati dovuti a composti chimici alterati introdotti con la dieta o prodotti dal catabolismo cellulare interviene un meccanismo chiamato riparazione per excisione di base (BER).La BER inizia attraverso una DNA glicosidasi che legge il DNA e rimuove, attraverso rottura del legame glicosidico, la base scorretta:

- esistono DNA glicosidasi per ogni possibile base alterata.- La DNA glicosidasi scorre lungo il filamento di DNA facendo

flippare di 180° le basi ed analizzandole- Quando trova una base scorretta, la recide, lasciando soli lo

zucchero e il fosfato.

Il meccanismo, dopo la rimozione della base alterata, prosegue nel seguente modo:

- una particolare endonucleasi (AP) taglia lo scheletro del DNA- la DNA polimerasi ß reinserisce il nucleotide corretto- una DNA ligasi ripara i legami.

Nei procarioti come E. Coli, il meccanismo per excisione di base avviene ad opera di proteine Uvr A, B e C.

Riparazione degli appaiamenti scorretti.

Si è già visto come nel successivamente alla replicazione del DNA vi sia un meccanismo di controllo che si chiama meccanismo di riparazione degli appaiamenti scorretti:

- questo prosegue risistemando le basi male appaiate che sono sfuggite alla correzione di bozze fatta dalla polimerasi

- riconosce le distorsioni della catena causate dal mal appaiamento delle basi.

In E. Coli, il riconoscimento del filamento neosintetizzato avviene grazie alla metilazione del filamento stampo, quindi il complesso enzimatico di riparazione non può sbagliare.

Nelle cellule eucariotiche non esiste la metilazione del DNA, quindi è probabile che vi siano altri meccanismi per permettere di riconoscere il filamento idoneo.

Riparazione delle rotture a doppio filamento

Quando radiazioni ionizzanti attraversano la cellula e colpiscono il DNA o quando vengono introdotti degli agenti chimici che causano rotture, può avvenire che il doppio filamento si rompa.

Le rotture del doppio filamento (DSB) possono essere riparati attraverso vari meccanismi di riparazione.

Il più comune meccanismo di riparazione è chiamato unione delle estremità non omologhe (NHEJ), in cui in complesso di proteine catalizza una serie di reazioni per unire le estremità rotte del DNA:

- se non è possibile appaiarsi al punto corretto intervengono proteine Ku, che hanno attività elicasica sui due filamenti e attività chinasica

- permettono alle due estremità del DNA ss di trovare delle regioni di micromologia, attraverso le quali i due filamenti si appaiano.

- Le porzioni di filamenti che restano esclusi vengono rimossi.- La DNA ligasi salda i Nick.

Si ha perdita di un tratto di gene.


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La vita della cellula e la trasmissione del patrimonio ereditario.

Il patrimonio genetico umano sta racchiuso nel nucleo e, durante le fasi di divisione meiotica o mitotica, si organizza in strutture allungate in cui il filamento di DNA sta ripiegato su se stesso e su uno scheletro proteico, mediante vari superavvolgimenti.

Queste strutture allungate sono i cromosomi.Un cromosoma è formato da due cromatidi fratelli, dopo che è avvenuta la replicazione del patrimonio genetico nella fase S:

- i due cromatidi contengono una molecola di DNA identica- sono il risultato della replicazione del patrimonio genetico.- Sono uniti tra loro in un punto detto centromero, in cui le fibre

del fuso si legano per separare i due cromatidi.- I due estremi dei cromosomi sono detti telomeri.

Il cariotipo umano

Il corredo cromosomico umano è, nelle cellule somatiche, diploide:

- è formato da due coppie di cromosomi omologhi, uno di origine materna e uno paterna

- due cromosomi omologhi contengono le medesime sequenze di geni e solitamente, solo uno è utilizzato come filamento di stampo per la sintesi delle proteine, l’altro è di riserva.

L’Homo sapiens ha un corredo cromosomico di 22 coppie di cromosomi omologhi, più una coppia di cromosomi sessuali:

- ha in totale 46 cromosomi, 23 derivanti dal padre e 23 dalla madre.

- I cromosomi sessuali differiscono tra maschio e femmina:o Un maschio avrà una coppia detta XY

o Una femmina una coppia XX.

Le divisioni cellulari

Negli organismi sessuati, le divisioni cellulari differiscono a seconda del tipo di cellule che si prendono in considerazione:

- le cellule somatiche si dividono per mitosi, processo in cui da una cellula madre 2n derivano due cellule figlie 2n

- le cellule sessuali (gameti) sono invece generate dagli oogoni e dagli spermatogoni mediante meiosi, in cui da un patrimonio 2n, mediante due successive divisioni, vengono generate quattro cellule figlie con patrimonio aploide n.

La mitosi.Formazione dell’apparato mitoticoAll’inizio della fase M:

- i cromosomi si spiralizzano- si formano i costituenti dell’apparato mitotico

L’apparato mitotico si compone di:

- centrioli- materiale pericentriolare- fuso mitotico (fasci di microtubuli che collegano i due

centrioli)

All’inizio della mitosi i diplosomi (coppie di centrioli disposti perpendicolarmente) sono già stati duplicati:

- sono circondati da un’area tondeggiante detta centrosoma- all’inizio della mitosi i centrosomi sono circondati da raggi di

microtubuli che formano le astrosfere.


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- I due centrosomi della cellula si vanno separando e tra loro si evidenzia una struttura fusiforme, è il fuso mitotico.

Il fuso mitotico è costituito da due gruppi di microtubuli polari che partono da ciascun centrosoma e si incontrano al centro del fuso:

- quando la membrana nucleare scompare, compare un secondo fuso che parte dai centrosomi e si lega ai cinetocori dei cromosomi

- i cromosomi si dispongono al termine della profuse lungo l’asse equatoriale della cellula, lungo un piano che viene definito equatoriale, ortogonale alle fibre del fuso.

- In metafase è completo l’apparato mitotico.

Fasi e significato della mitosiIl primo stadio del processo mitotico è denominato profase:

- nel citoplasma si organizza l’apparato mitotico- tutta la cromatina si trova sotto forma di cromosomi al

termine della profase.- Ogni cromosoma appare come un duplice filamento, poiché

costituito da due cromatidi fratelli uniti a livello del centromero.

- Verso la fine i nucleoli si disintegrano legandosi ai cromosomi- Si disgrega l’involucro nucleare (si disperde nel reticolo

endoplasmatico o si addossa alle fibre del fuso)

Con il termine prometafase si individua uno stato intermedio che intercore tra:

- la dissoluzione dell’involucro nucleare- l’organizzazione dei cromosomi sul piano equatoriale da

opera dei microtubuli del fuso

Il secondo stadio è detto metafase, in cui i cromosomi si trovano allineati sul piano equatoriale della cellula con i centromero diretti verso il centro:

- i cromosomi costituiscono una figura a forma di stella detta aster o piastra metafasica.

- I cromosomi raggiungono il massimo livello di spiralizzazione, salvo che a livello del centromero.

- Ai due cinetocori del centromero di ogni cromosoma sono collegate le fibre del fuso mitotico che dividono i due cromatidi

La localizzazione dei cromosomi al piano equatoriale dipende dalla capacità dei cinetocori di legarsi ai microtubuli del fuso e dall’azione di proteine motore.

La terza fase è definita anafase e viene distinta in due sotto-momenti:

- anafase I: i cromosomi sono tirati verso i due poli dalle fibre del fuso, verso i centrosomi. I cromatidi identici si scindono e ognuno migra verso un polo differente

- anafase II: all’allontanamento dei cromosomi dal piano equatoriale si somma anche un allontanamento dei due poli, che divergono.

L’ultimo stadio è rappresentato dalla telofase, in cui si ha la ricostruzione dell’involucro nucleare:

- i cromatidi sono diventati cromosomi delle cellule figlie- ogni polo possiede un corredo cromatidico identico- i cromatidi si vanno despiralizzando- si riforma il nucleolo

La formazione della membrana nucleare avviene per la fusione di:

- lamine defosforilate che ricreano la lamina nucleare (strato proteico sottostante al nucleo)

- vescicole sintetizzate nuovamente nel RER- vescicole appartenenti al vecchio nucleo

Con la formazione dei due nuovi nuclei intorno ai cromosomi figli si riformano anche i pori nucleari e tutte le proteine di membrana presenti nel nucleo:


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- l’apparato mitotico si va depolimerizzando- i centrioli restano inalterati.

L’ultimo processo che completa la divisione delle cellule è quello di citodieresi:

- la cellula presenta una strozzatura in posizione equatoriale, ad opera di fibre di actina e miosina disposte a circonferenza sotto la membrana nucleare.

- le membrane si introflettono, si fondono e si staccano le due nuove cellule con i nuclei figli.

- le nuove cellule sono geneticamente identiche, la mitosi è un processo conservativo.

La meiosiLa divisione meiotica avviene esclusivamente per le cellule germinali, quelle destinate alla formazione dei gameti:

- è l’ultimo evento di divisione della gametogenesi- ha come scopo la formazione di cellule aploidi, differenti tra

loro per quanto riguarda il patrimonio genico.

La meiosi è quindi la base della riproduzione sessuata, che consente un ampio rimescolamento del patrimonio genico:

- ha determinato la scelta di questo meccanismo riproduttivo nell’evoluzione

La fonte di diversità tra gli individui figli rispetto ai genitori è data da:

- rimescolamento delle informazioni presenti- unione di due genomi differenti- mutazioni.

La riproduzione sessuale di un individuo è data dalla fusione di due cellule aploidi dette gameti:

- il gamete maschile è lo spermatozoo

- il gamete femminile è l’ovulo, una cellula di grandi dimensioni poiché contenente parecchi materiali di riserva.

L’unione tra i due gameti è detta fecondazione, che da origine ad una cellula diploide detta zigote:

- dallo zigote, per successive mitosi si origina il nuovo individuo

Le cellule somatiche degli organismi pluricellulari sono generalmente diploidi:

- i cromosomi sono sempre presenti in doppia copia- si presentano copie di cromosomi omologhi, corrispondenti

per forma, dimensioni e contenuto genico.

I gameti, dopo la divisione meiotica, possiedono solamente metà del patrimonio genico della cellula diploide che li ha formati:

- di ciascuna coppia dei cromosomi omologhi viene ereditato solamente uno

- ricostituendosi con il gamete dell’altro sesso, si ricostruisce il patrimonio genetico diploide nello zigote

Ciascuna delle coppie di omologhi presenti nelle cellule di un organismo a riproduzione sessuale è costituita da:

- un cromosoma di origine materna- un cromosoma di origine paterna

La meiosi porta alla formazione di quattro cellule aploidi a partire da una cellula diploide che ha solamente una fase S, mentre vede due divisioni nucleari consecutive.

Il passaggio di un cromosoma paterno o materno in un gamete è totalmente casuale, cosicché si possono ottenere 223 combinazioni differenti solamente in un gamete.

Un altro processo di rimescolamento dei geni è dato dal crossing-over:

- geni presenti su cromosomi differenti possono in seguito trovarsi su un solo cromosoma


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- permette un ampio rimescolamento genico.

Né deriva che i gameti di un individuo sono sempre differenti tra di loro dal punto di vista genetico:

- si possono avere eventi che danno luogo ad una ampia variabilità anche tra loro

- questo processo aiuta enormemente il processo di selezione naturale.

IL MECCANISMO DELLA MEIOSIIl meccanismo della meiosi porta alla formazione di un gamete aploide, con patrimonio genetico 1n, dopo una sola fase S seguita da due divisioni nucleari cosecutive.

I processi delle divisioni consecutive sono simili a quelli meiotici (profase, metafase, anafase, telofase), tuttavia presentano caratteristiche peculiari. Si parla di:

- prima divisione meiotica (meiosi I)- seconda divisione meiotica (meiosi II).

Il primo stadio della meiosi I è la profase I, che è un processo molto lento che si può dividere in 5 parti:

- leptotene : inizio della spiralizzazione della cromatina che si avvolge in filamenti. I telomeri sono tutti rivolti verso un polo dell’involucro nucleare

- zigotene : i cromosomi iniziano ad appaiarsi e ogni cromosoma (formato da una coppia di cromatidi fratelli) si sovrappone al suo omologo mediante una struttura proteica chiamata complesso sinaptemale (CS), formando i bivalenti o tetradi (formati da 4 cromatidi dei due cromosomi omologhi)

- pachitene : i bivalenti si spiralizzano ulteriormente pur rimanendo gli omologhi appaiati. Avviene il crossing-over.

- Diplotene : i bivalenti iniziano a separarsi e rimangono in contatto solamente nei punti in cui è avvenuto il crossing-over, detto chiasmo.

- Diacinesi : i chiasmi scorrono verso le estremità e si distaccano tra loro. Scompare l’involucro nucleare e i cromosomi iniziano a legarsi ale fibre del fuso.

Il secondo stadio è lo stadio della metafase I:- le tetradi (o bivalenti) si orientano sul piano equatoriale della

cellula- i cinetocori delle tetradi sono orientati verso un polo cellulare- a ogni coppia di omologhi si attacca una fibra del fuso.

La terza fase è la anafase I:- i due cromosomi di ogni coppia si separano e si muovono

verso i poli opposti- ogni cromosoma è ancora formato da due cromatidi fratelli

uniti a livello del centromero.

Segue la telofase I:- la cellula di partenza si divide in due cellule figlie, ciascuna

contenente un numero aploide di cromosomi con una quantità 2c di DNA.

- si forma un involucro nucleare- ha inizio la citodieresi

Tra la prima e la seconda divisione meiotica v’è una intercinesi molto breve poiché i cromosomi non si sono ancora despiralizzate ed è necessario solamente costruire un nuovo apparato mitotico in ciascuna cellula figlia.

La profase II: - i centrioli migrano ai poli opposti della cellula - si riforma l’apparato del fuso

La metafase II comporta l’allineamento del numero aploide di cromosomi all’equatore della cellula.


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Con l’anafase II i cromosomi figli (cromatidi fratelli) migrano verso i poli opposti della cellula.

Il processo meiotico si conclude con la telofase II, in cui:

- si riforma l’involucro nucleare- avviene una seconda citodieresi

la seconda divisione meiotca è equazionale, ha cioè il solo scopo di smistare ai gameti la metà ordinata dei cromatidi fratelli presenti nelle cellule della prima divisione.

I quattro gameti che si formano sono tutti geneticamente differenti tra di loro, poiché hanno subito una ricombinazione casuale con lo scambio di quelli paterni e materni, oltre che al crossing-over.

Il crossing-over è un meccanismo di ricombinazione che avviene nel pachitene della profase I:

- i cromatidi corrispondenti di due cromosomi omologhi possono subire ricombinazioni, scambiandosi porzioni di cromosoma tra loro

- il punto di incontro è detto chiasma.- Vengono scambiati segmenti corrispondenti tra cromatidi non

fratelli appartenenti a cromosomi differenti.

Il ciclo cellulare eucariotico.

In una popolazione di cellule, ciascuna cellula passa attraverso numerosi stadi ben definiti, che nel complesso individuano il ciclo cellulare.

Il ciclo cellulare si può dividere inizialmente in due principali fasi:

- fase M: include il processo di mitosi, in cui i cromosomi si separano, e di citodieresi.

- Interfase: è una fase che può avere varia durata (o essere addirittura permanente) in cui la cellula svolge le proprie attività metaboliche, di sintesi e di duplicazione del proprio patrimonio genetico.

Fase G1Fase S

Fase G2Fase M

Il ciclo cellulare

Fase G1Fase SFase G2Fase M

L’interfase si compone di tre differenti fasi:

- fase G1.- Fase S- Fase G2

La fase G1 è una fase compresa tra la fase M e la fase S, in cui:

- la cellula accresce le proprie dimensioni- svolge le sue attività si sintesi di RNA e proteine.

La fase S è la fase in cui la cellula duplica il DNA e sintetizza gli istoni che devono duplicare il numero di nucleosomi.

La fase G2 è la fase che precede la fase M e si costituisce di un periodo in cui la cellula prepara il proprio apparato mitotico:

- sintesi del fuso mitotico- formazione dei cromosomi.

In base alla durata e alle peculiarità del ciclo cellulare, che corrispondono alle funzioni delle cellule, si possono individuare tre grandi categorie di cellule:


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⇀ cellule estremamente specializzate (nervose, muscolari, globuli rossi) che perdono la capacità di dividersi

⇀ cellule che non si dividono in condizioni normali, ma possono rigenerarsi in seguito a stimoli appropriati (epatociti, linfociti)

⇀ cellule che possiedono normalmente un livello relativamente alto di attività mitotica.

La notevole variabilità della durata del ciclo cellulare ha permesso di individuare una nuova fase particolare, che è presente nelle cellule che temporaneamente si bloccano in fase G1:

- questa fase, che precede la replicazione del DNA è detta fase G0

- in G0 la cellula è temporaneamente ferma, si porta in fase S solamente a seguito di uno stimolo, quando ciò è possibile.

Meccanismi di controllo del ciclo cellulare

Numerosi esperimenti condotti nel 1970 da Rao e Johnson in Colorado, dimostrarono che le cellule subiscono meccanismi di controllo positivo, quindi con presenza di fattori di stimolazione in due passaggi:

- dalla fase G1 alla fase S - dalla fase G2 alla fase M

Questi due passaggi erano dunque indotti da fattori che stimolavano, nel primo caso la replicazione e nel secondo la divisione cellulare (mitosi o meiosi).

I check-point del ciclo cellulareNella cellula sono presenti due punti di controllo principali, che, come si è già detto, provvedono a verificare che vi siano le condizioni per il passaggio alla fase successiva.

Inoltre, un tale meccanismo di controllo, permette anche lo svolgimento delle attività di crescita e di ciclo cellulare nell’ordine corretto.

La stimolazione di un passaggio e l’attivazione del check point dipende da condizioni esterne quali ad esempio:

- presenza di fattori di crescita- quantità di nutrienti- stimolazione ormonale.

Il primo punto di controllo è al termine della fase G1 e verifica:

- la dimensione della cellula- la presenza di nutrienti- la presenza di fattori di crescita- l’assenza di danni al DNA

Il primo punto di controllo, in assenza di queste condizioni, può anche indurre il passaggio in fase G0.

Il secondo punto di controllo è situato al termine della G2 e verifica:

- dimensione della cellula- completamento della replicazione del DNA- assemblaggio dei cromosomi

Esiste in realtà un terzo punto di controllo che però si trova all’interno della fase M:

- verifica il corretto appaiamento delle fibre del fuso ai centromeri dei cromosomi.

Il ruolo delle protein-chinasiLa maturazione e i passaggi attraverso le fasi del ciclo cellulare sono regolati da dei fattori di promozione della maturazione (MPF), che sono composti da:

- proteina chinasica: proteina responsabile del trasferimento di gruppi fosfato (fosforilazione) di specifici substrati proteici

- cicline: subunità di tipo regolatorio.


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La concentrazione della ciclina varia da una fase all’altra e, quando si trova a concentrazione sufficientemente elevata si ha l’attivazione della protein-chinasi corrispondente.

La protein chinasi attivata fosforila determinati substrati che intervengono nelle fasi di replicazione o di divisione.

Negli ultimi anni si è scoperto che il ciclo cellulare è controllato da chinasi ciclina-dipendenti (Cdk):

- si attivano in seguito alla concentrazione di cicline- fosforilano determinati substrati, attivandoli o inattivandoli.

Nei due punti di regolazione principali (al termine delle fasi G1 e G2) intervengono rispettivamente:

- ciclina G1- ciclina mitotica

La ciclina mitotica viene sintetizzata nel periodo che va da G1 a G2 ed aumenta costantemente di concentrazione:

- ha una specifica Cdk che al termine del ciclo lega la ciclina mitotica per fosforilazione

- forma il complesso Cdk-ciclina mitotica che promuove il passaggio dal check point G2 alla mitosi.

Le proteine che vengono fosforilate (con ATP) dal complesso Cdk-ciclina mitotica sono:

- lamine nucleari, permettendo quindi la disintegrazione della membrana nucleare.

- Istoni H1, inducendo la condensazione della cromatina.

La ciclina G1 con la sua Cdk controlla il check-point G1 attraverso la fosforilazione della proteina Rb:

- la proteina Rb, quando non è fosforilata, inibisce il fattore di trascrizione E2F, che promuove la trascrizione e la sintesi degli enzimi necessari per la replicazione

- quando la proteina Rb viene fosforilata, libera l’E2F sequestrato e rende possibile la sintesi degli enzimi replicativi, permettendone la trascrizione dei geni.

L’apoptosi

L’apoptosi è un processo che avviene normalmente negli organismi e segue una sequenza ben precisa di eventi che portano alla morte cellulare programmata.

È un processo pulito, ordinato e naturale, che prevede:

- diminuzione complessiva del volume della cellula- scomparsa del nucleo e frammentazione del DNA- perdita di adesione alle molecole e rottura delle membrane

cellulari- rilascio di enzimi idrolitici dai lisosomi e idrolisi generalizzata- la membrana plasmatica si mantiene intatta- fagocitosi da parte dei macrofagi.

Perché avviene l’apoptosiIl significato dell’apoptosi è molto ampio e generalmente è quello di eliminare cellule invecchiate o dannose all’organismo:

- durante l’embiogenesi ha un’azione morfogena, ovvero serve ad eliminare strutture transitorie

- nell’adulto di homo sapiens, vi sono parecchi esempi di apoptosi:⇀ regressione della ghiandola mammaria dopo

l’allattamento⇀ perdita di capelli⇀ formazioni delle superfici cornee nella pelle.

- Eliminazione di neuroni che non terminano correttamente sugli organi bersaglio

- Eliminazione di linfociti T potenzialmente autoimmuni- Eliminazione di qualsiasi cellula invecchiata.


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L’apoptosi può essere indotta o repressa, da differenti segnali:

- segnali antiapoptotici: ⇀ segnali di adesione tissutale ⇀ fattori di crescita⇀ segnali di adesione alla matrice extracellulare

- segnali apoptotici:⇀ TNF, tumor necrosis factor⇀ Virus (granzimi)⇀ Anoikis (integrine)⇀ Danni del DNA

L’azione delle caspasi.L’apoptosi è causata da una serie di enzimi che è oggi denominata caspasi.Le caspasi sono una serie di enzimi proteolitici che sono attivati dai vari fattori apoptotici. Agiscono tagliando un gruppo selezionato di proteine e strutture bersaglio nella cellula quali:

- alcune protiein chinasi: la distruzione fa saltare le adesioni intercellulari

- lamine: distruzione dell’involucro nucleare.- Proteine del citoscheletro: actina, tubulina, gelsolina, ecc…

vengono tagliate, devastando la forma della cellula e delle sue strutture.

- Attivazione della DNasi attivata da caspasi: è un enzima che viene attivato dalle caspasi e frammenta in piccoli pezzi la cromatina.

Le vie dell’apoptosiL’apoptosi può essere indotta da due differenti vie, una estrinseca, e una intrinseca.

La via estrinseca è attivata da stimoli esterni alla cellula, come ad esempio i TNF, che invitano la cellula ad andare a farsi fottere.

Nella via intrinseca la cellula si accorge da sola di essere ormai inutile e dannosa al tessuto e, grazie a stimoli interni, si fa fuori da sola.

La necrosi

La necrosi, a differenza dell’apoptosi, è un processo che è dovuto a stimoli esterni e non è programmato: presume che vi sia un danno.

Le cause di necrosi possono essere danni causati da:

- urti meccanici- radiazioni elettromagnetiche radioattive- corrosioni chimiche.

In seguito al danno subito, la cellula inizia la sua distruzione:

- scoppia e rilascia nell’ambiente le sue macromolecole, provocando una risposta infiammatoria

- il tessuto leso si trasforma in una massa amorfa friabile- secerne pus.- Viene a crearsi una zona scura.

Il sistema immunitario di macrofagi provvede, quando possibile, a riparare il danno subito.


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I virus

I virus sono degli oggetti macromolecolari dotati di patrimonio genetico, che ne dirige il ciclo vitale una volta che ha infettato una cellula ospite:

- i virus sono infatti definiti parassiti, ovvero riproducono sé stessi sfruttando i meccanismi sintetici delle cellule ospiti.

I virus sono sostanzialmente formati da:

- molecola di RNA o DNA, a doppio o a singolo filamento, a doppia elica o lineare.

- involucro proteico detto capside, che comunemente ha forma di icosaedro.

Quando il virus si trova al di fuori di una cellula vivente si dice che è sottoforma di virione:

- un virione può avere nel proprio patrimonio genetico da pochi ad alcune centinaia di geni.

- Il capside è solitamente formato da subunità tutte uguali.⇀ Può avvenire, come nel caso del virus HIV nell’uomo,

che il virione abbia anche un rivestimento fosfolipidico, derivante dalla membrana plasmatica della cellula che lo ha prodotto e esocitato.

- Ogni virus ha sulla sua superficie alcune proteine che sporgono e interagiscono con le proteine di membrana della cellula ospite.

Ogni virus ha una propria gamma di cellule ospiti:

- può accadere che un virus abbia numerosissime cellule che lo possono accogliere

- nella maggior parte dei casi, però, sono solamente alcuni tipi di cellula che possono ospitare un dato virus.

Le tipologie di infezioni virali.

Il virus può infettare la cellula con due differenti modalità:

- rubando le attività sintetiche- inserendosi nel DNA della cellula ospite, diventando cioè

provirus.

Infezione liticaNella maggior parte dei casi il virus che penetra nella cellula ospite vi inserisce il proprio patrimonio genetico e sfrutta gli apparati di sintesi della cellula:

- duplica il proprio patrimonio genetico- sintetizza le proteine del proprio capside.- La cellula, alla fine viene indotta a rompersi (lisi cellulare) e

a liberare i virioni neosintetizzati.

Formazione di provirusIn alcuni casi, tuttavia, i virus non infettano la cellula inducendola alla lisi, ma si inseriscono integrandosi nel patrimonio genetico della cellula ospite.

Il DNA virale integrato si chiama provirus e ha differenti effetti a seconda del tipo di virus e della cellula ospite:

- le cellule batteriche che contengono un provirus:⇀ il Dna virale è solitamente silente⇀ viene attivata la sintesi dei geni virali solamente a

seguito di stimoli esterni come radiazioni UV o innalzamenti della temperatura.

- Alcune cellule animali infettate da provirus, sintetizzano una nuova progenie sfruttando la cellula ospite senza indurla a lisi:


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⇀ Il virus HIV infetta le cellule continuando a produrre virioni che infettano le cellule vicine.

- Alcune cellule animali che contengono un provirus divengono cellule maligne:⇀ Perdono il controllo della loro crescita⇀ Questo tipo di virus causa l’insorgenza di tumori.

I batteriofagi

I virus batterici, o batteriofagi, sono virus che infettano le cellule procariote e sono generalmente formati da:

- capside proteico a forma di icosaedro- lunga coda proteica- placca di adesione con alcune punte.

Vi sono differenti classi di virus che, ad esempio, infettano il caro E. Coli:

- T2, T6, T4: virus con DNA a doppio filamento lineare molto lungo

- Fago : virus a DNA ds lineare più breve.- T1, T3, T5: fagi con DNA ds lineare intorno alle 38 000 nt. - X174: è un virus a DNA con singolo filamento circolare. Il

genoma virale è molto corto. Non possiede la coda.

Il fago T4Il DNA a doppio filamento del fago T4 è formato da 166000 bp che codificano per 130 geni. È un virus abbastanza complesso.

Il meccanismo di azione di questo batteriofago è quello della lisi cellulare:

- viene assorbito dalla cellula ospite: la cellula batterica deve possedere i recettori di membrana adeguati per il fago in questione.

- nel batterio penetra il genoma virale

- vengono trascritti i messaggeri del DNA virale e sintetizzate le proteine dell’involucro

- si assemblano i virioni con il patrimonio genetico duplicato- si ha la lisi batterica e l’espulsione di nuovi virioni.

Fagi della serie .I fagi di questa serie hanno una interazione più mite con la cellula che li ospita:

- immettono il loro DNA nella cellula- questo DNA si integra con il DNA batterico, restando nello

stato di profago.- La lisi deve venire indotta da agenti esterni, come ad

esempio radiazioni UV.⇀ In presenza di radiazioni UV i virioni vengono prodotti e

viene indotta la lisi.

Virus animali

I virus animali sono di differente natura ed hanno delle specificità proprie, come ad esempio la possibilità di effettuare la retro trascrizione da RNA a DNA.

Vi sono alcuni virus a DNA, quali l’Herpesvirus o i numerosi virus oncogeni (SV40, Adenovirus, Epstein-Barr, ecc…).

I Virus a RNA comprendono il virus dell’HIV o il retrovirus del sarcoma di Rous, (oncogeno).

SV40 – simian vacuolating virus 40.Il SV40 è un virus a DNA circolare formato da 5240 bp e da istoni. Possiede due classi di geni dette:

- geni precoci: codificano per 2 proteine T, funzionali alla replicazione del DNA.

- geni tardivi: codificano per VP1, VP2, VP3.


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Nell’uomo il suo ciclo si struttura nelle seguenti tappe:

1. la cellula viene infettata e rilascia la sua molecola di DNA2. il DNA viene trasferito nel nucleo, in cui vengono trascritti gli

antigeni T, che codificano per proteine funzionali alla replicazione del DNA virale.

3. Viene degradato il DNA cellulare e vengono utilizzati i nucleotidi per la replicazione del DNA virale.

4. Vengono sintetizzate le proteine del capside VP1, VP2, VP3.5. Si assemblano i nuovi virioni e vengono rilasciati all’esterno

della cellula.

Nel criceto, l’interazione con l’SV40 ha un effetto differente:

- l’immissione del DNA nel nucleo della cellula e la sintesi degli antigeni precoci induce la duplicazione cellulare

- ha l’effetto di virus oncogeno.

Provirus a DNA e integrazione.L’integrazione del DNA virale nel genoma della cellula ospite può avvenire in due differenti modalità:

- ricombinazione: si ha la rottura di sequenze omologhe presenti in entrambi i DNA e la loro ricombinazione scambiandole.

- Inserimento in siti fragili: nei siti di rottura del DNA genomico si inserisce il DNA virale.

Anche le cellule animali, come quelle batteriche, possono avere un’interazione temperata con la cellula ospite:

- il Dna virale si integra con la cellula ospite e rimane latente fino a quando non è scatenato da fattori esterni

- si trova nello stato di provirusNel caso dell’Herpesvirus, virus a DNA, il genoma virale è integrato nel genoma ospite:

- resta normalmente inattivo trascrizionalmente

- ha proprietà litiche qualora sia attivato da cause esterne come stress, farmaci, raggi UV, antibiotici, ecc…

Virus a RNA e retrovirusI retrovirus RNA sono una famiglia di virus provvisti di un genoma diploide a RNA monocatenario con polarità negativa.

La peculiarità dei virus a RNA è quella di poter fare la trascrizione inversa, da RNA a DNA, attraverso un enzima detto trascrittasi inversa:

- è una DNA polimerasi RNA dipendente- forma una molecola di doppio filamento ibrida DNA-RNA a

partire dal genoma virale a RNA- mentre sintetizza il primo filamento di cDNA depolimerizza

l’RNA virale- in seguito sintetizza anche il secondo filamento, in modo da

formare il cDNA a doppio filamento.

Il genoma di un retrovirus RNA è formato da tre sequenze particolari che sono:

- gag: codifica per le proteine strutturali del capside, i capsomeri

- pol: codifica per la trascrittasi inversa.- Env: codifica per le glicoproteine del pericapside.

Le sequenze LTR stanno per long terminal repeat:


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- la LTR sul 5’ costituisce il promotore per la sintesi del messaggero

- quella sul 3’ è la sequenza di termine.

Il ciclo di un retrovirus a RNA prevede:

1. penetrazione del pericapside per endocitosi.2. liberazione dell’acido nucleico.3. Retro trascrizione e sintesi del doppio filamento di cDNA4. Trasporto nel nucleo della cellula e integrazione con il DNA

con la formazione di un provirus.5. Traduzione delle proteine virali.6. Sintesi di nuovi RNA7. Assemblaggio del capside8. Esocitosi dei virioni.

Un famoso virus con retro trascrizione è quello del sarcoma di Rous, che induce sarcomi nel pollo, comportandosi come un virus oncogeno.


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Regolazione dell’espressione genica nei procarioti

Una cellula batterica è strettamente legata all’ambiente in cui vive, il quale può mutare la propria composizione chimica in ogni momento:

- un composto può essere presente in determinati periodi, mentre non esserci in altri.

Si considerano ora due casi in cui dal terreno minimo si aggiungono:

1. lattosio2. triptofano.

Il lattosio è un disaccaride che viene scisso in due monosaccaridi dal batterio mediante l’enzima ß-galattosidasi:

- in condizioni minime la presenza di tale enzima è bassissima- all’aggiunta di lattosio al terreno la presenza dell’enzima ß-

galattosidasi e dell’mRNA che lo codifica aumentano sensibilmente.

- Il lattosio ha indotto la produzione dell’enzima funzionale alla propria digestione.

Il triptofano è un amminoacido necesario per la sintesi delle proteine. Se nel terreno di coltura questo amminoacido non è presente, il batterio spende determinata energia per sintetizzarlo:

- qualora si immettesse del triptofano nel terreno di coltura, le cellule non producono più gli enzimi adatti alla sintesi del triptofano.

- In presenza del triptofano, la sintesi degli enzimi è stata repressa.

L’operone batterico

Nei batteri, i geni che codificano gli enzimi per una determinata attività metabolica sono raccolti insieme in un unico complesso funzionale detto operone.

Gli operoni batterici operano secondo meccanismi ben precisi e possiedono tutti delle determinate sequenze chiave quali:

- geni strutturali: son i geni che codificano effettivamente per gli enzimi. Tutte le sequenze che codificano per gli enzimi della via metabolica sono disposte una a fianco all’altra, senza alcun introne, e vengono trascritte generalmente in un unico filamento di mRNA.

- Promotore: è il sito in cui la RNA polimerasi si lega al DNA prima di iniziare la trascrizione.

- Operatore: è una sequenza associata al promotore che serve come legame per il repressore. Il repressore è una proteina regolatrice di geni, ovvero che può selettivamente legare una sequenza di DNA, regolandone la trascrizione dell’operone.

- Gene regolatore: codifica per la proteina repressore.

La chiave di controllo dell’espressione genica è quindi il repressore:

- quando esso è legato all’operatore, non permette alla RNA polimerasi di legarsi al promotore, quindi di trascrivere i geni strutturali.

- Quando la concentrazione del metabolita invece è alta, il repressore viene stericamente indotto a slegarsi dalla sequenza per permettere la trascrizione dei geni strutturali.


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L’operone lattosio, inducibile.L’operone lattosio è un esempio di operone inducibile, ovvero che induce la trascrizione dei messaggeri necessari per produrre gli enzimi funzionali alla digestione del lattosio.

L’operone lattosio contiene tre geni strutturali disposti in tandem che codificano per la ß-galattosidasi e altri enzimi:

- se il lattosio è disponibile nel terreno di coltura, all’aumentare della sua concentrazione nella cellula, questo si lega al repressore, modificandone la conformazione.

- Il repressore, normalmente legato all’operatore sul DNA, si stacca e permette la trascrizione dei tre geni strutturali.

La proteina repressore, in un operone inducibile, si lega all’operatore in assenza di lattosio, l quale è un induttore.Quando la concentrazione di lattosio scende, il repressore torna a legarsi alla molecola di DNA.

Controllo positivo mediante cAMP I repressori come quelli degli operoni lac e trp esercitano la loro influenza mediante controllo negativo, poiché quando interagiscono con il DNA la trascrizione è repressa.

L’operone lac è anche sotto il controllo positivo dell’AMP ciclico, in presenza di un fenomeno detto effetto del glucosio:

- quando nel terreno di coltura è presente il glucosio in contemporanea ad altri substrati (lattosio o galattosio, ecc…) il batterio ignora gli altri substrati e metabolizza il glucosio.

- Il glucosio nel terreno di coltura, determina quindi la soppressione della produzione degli altri enzimi catabolici.

Con studi effettuati su E. Coli nel 1965, si scoprì che nel metabolismo era coinvolto il cAMP:

- maggiore era la concentrazione di glucosio, minore era quella di cAMP

- con l’aggiunta di cAMP nel terreno di coltura, la cellula produceva rapidamente tutti gli enzimi per il metabolismo degli altri nutrienti (enzimi per lattosio, galattosio, ecc…)

Una molecola di cAMP non è in grado di stimolare direttamente l’espressione di una batteria di geni:

- nei procarioti agisce legandosi ad una proteina recettore del cAMP (CAP) che è capace di legare il DNA quando è associata al cAMP.

- In presenza di cAMP la CAP lega una regione di controllo sull’operone lac, che determina un cambiamento conformazionale del DNA.

- Il DNA con la nuova conformazione indotta da cAMP-CAP è in grado di trascrivere i geni strutturali del lattosio anche quando il repressore è inattivo per la presenza comunque di lattosio.

Fino a quando i livelli di glucosio sono elevati, l’enzima adenilato-ciclasi non produce cAMP:

- i livellli di AMP ciclico restano al di sotto della soglia di trascrizione dell’operone.

Operone triptofano, operone reprimibile.L’operone triptofano è un classico esempio di operone reprimibile:

- il repressore non è in grado di legare da solo il DNA, ma deve essere complessato con un co-repressore.

- Il co-repressore, in questo caso, è lo stesso triptofano.

In assenza di triptofano l’operatore non possiede legato il repressore:

- il DNA è libero di fare trascrivere i geni strutturali alla RNA polimerasi

- vengono sintetizzati gli enzimi per la sintesi del triptofano.


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Quando il triptofano diventa disponibile, gli enzimi della via sintetica non sono più necessari:

- il complesso triptofano-repressore si lega al DNA- la trascrizione dei geni strutturali dell’operone trp è repressa.


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La regolazione genica negli eucarioti.

Ogni cellula possiede l’intero patrimonio genetico dell’individuo, ma in seguito a specializzazione, ne trascrive solo una parte per poi codificare le proteine che vi sono necessarie.

Questo significa che vi sono alcuni geni che vengono trascritti ed altri che vengono repressi:

- ci si accinge quindi a capire quali siano gli stimolatori della trascrizione di determinati geni.

- Devono esserci segnali dall’esterno che inducono una regolazione interna della cellula specializzata.

Meccanismi di trasduzione del segnale.

I segnaliI segnali tra una cellula e l’altra possono essere di varia natura:

- ormoni steroidei- ormoni proteici- fattori circolanti o secreti- fattori derivati dall’ambiente:

⇀ contatti tra cellule mediante molecole di adesione⇀ segnali nutrizionali⇀ shock termico.

Ognuno di questi segnali ha una precisa tipologia di trasduzione all’interno della cellula:

- in seguito attiva dei meccanismi che intervengono nei vari livelli della regolazione dell’espressione genica.

Meccanismo degli ormoni steroidei.La peculiarità degli ormoni steroidei è quella di oltrepassare senza ostacoli la membrana plasmatica:

- il loro recettore si trova nel citoplasma.- L’ormone si lega al recettore, il quale interagisce

direttamente con la cromatina.

Il recettore citoplasmatico per gli ormoni steroidei è costituito generalmente da una proteina o da una lipoproteina che possiede due siti specifici:

- sito per l’ormone: sequenza di amminoacidi idrofobici che lega stericamente l’ormone.

- Sito per il legame del DNA: è un sito che si lega ad una sequenza specifica sul DNA a monte del gene, nel promotore.

Sul DNA, di contro, sono presenti delle specifiche sequenze, dette elementi di risposta, secondo l’ormone che ne deve regolare la trascrizione:

- GRE: sequenza promotrice per i glicocorticoidi.- ERE: sequenza di regolazione per gli estrogeni.- TRE: sequenza di regolazione per il testosterone.

La sequenza GRE, per esempio, è presente prima di vari geni, quindi un solo stimolo può attivare la trascrizione di più geni, quindi la sintesi di differenti proteine.

Ormoni proteiciUn ormone proteico, a differenza di uno steroideo, non riesce a attraversare il plasmalemma, quindi necessita della presenza di recettori di membrana.


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Quando il ligando si lega al recettore di membrana, nel citoplasma si verificano una serie di reazioni che portano all’attivazione dei secondi messaggeri:

- vi sono proteine che vengono fosforilate, quindi attivate/disattivate da protein-chinasi, che poi intervengono come fattori di trascrizione all’interno del nucleo.

L’attivazione di un secondo messaggero è attuata con il comune meccanismo di fosforilazione o di de fosforilazione:

- per fosforilare una proteina è necessaria l’azione di un fattore proteico detto protein-chinasi, che catalizza l’aggiunta dei gruppi fosfato su residui di serina, treonina o tirosina della proteina effettrice

- la defosforilazioine, invece, avviene ad opera dell’enzima fosfatasi, che rimuove i gruppi fosfato, inattivando la proteina effettrice.

Struttura e attivazione di un recettore con attività tirosin-chinasica.Le tirosin-chinasi sono enzimi che fosforilano residui di tirosina su substrati proteici:

- la fosforilazione della tirosina è un meccanismo per la trasduzione del segnale proprio degli eucarioti

- coinvolge differenti processi cellulari quali:⇀ crescita⇀ proliferazione⇀ differenziamento⇀ sopravvivenza (segnali antiapoptotici)⇀ adesione alla matrice extracellulare⇀ migrazione

Le tirosin-chinasi si dividono in due principali categorie:

- recettori tirosin-chinasi: sono proteine transmenmbrana con un dominio extracellulare in cui si lega un ligando e un dominio tirosin-chinasico intracitoplasmatico

- tirosina chinasi citoplasmatiche: non possiedono recettori nell’ambiente extracellulare.

Le tirosin-chinasi recettoriali sono direttamente attivate da ligandi extracellulari, come ad esempio:

- EGF, epidermal growth factor- PDGF, fattore di crescita delle piastrine- Insulina- Altri regolatori metabolici.

Dimerizzazione del recettore. Il ligando induce la dimerizzazione del recettore, la quale, permetterà poi di giungere alla auto fosforilazione delle code tirosin-chinasiche.

Il recettore per EGF, una volta legato all’EGF, si accoppia con un suo simile recettore EGF - ligando EGF appaiando, sul versante citosolico le code tirosiniche:

- i due domini tirosin-chinasici delle molecole procedono alla trans auto fosforilazione, ovvero un dominio chinasico fosforila la coda dell’altro

- e vice versa.

Attivazione della proteina chinasi. I siti di auto fosforilazione hanno una doppia funzione:

- regolano l’attività chinasica- sono sito di legame per le proteine citoplasmatiche.

La fosforilazione della tirosina modula il rapporto con le proteine citoplasmatiche:

- l’ansa di attivazione, in assenza di fosforilazione, chiude il dominio di legame per ATP e le altre molecole citoplasmatiche


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- con la coda fosforilata, si ha la progressiva fosforilazione di tutti i residui tirosinici, che permette di liberare il sito di legame per i secondi messaggeri.

Interazioni proteina-proteina dipendenti dalle fosfo-tirosine. Le vie di segnalazione intracitoplasmatiche sono catene di proteine segnale che interagiscono l’una con le altre in modo sequenziale.

Le proteine segnale sono in grado di associarsi ai recettori tirosin-chinasi attivati perche contengono dei domini che si legano specificamente a residui tirosina fosforilati.

Una particolarità di questo meccanismo sta nel fatto che si legano a precise sequenze amminoacidiche a partire dal pTyr.

Attivazione delle vie di segnalazione a valle. Nel caso del recettore per EGF, la proteina che interagisce con le code fosfo-tirosiniche del recettore è la proteina Grb2:

- questa si lega alla tirosina fosforilata ed ha legata a sé un complesso Sos o uno Gab.

- Sos attiva una piccola proteina, Ras, che fa parte della superfamiglia delle proteine G ed è associata alla membrana plasmatica sul versante citosolico.

- La proteina Ras è presente in due forme:⇀ Attiva: legata a GTP⇀ Inattiva: legata a GDP.

- La Ras-GTP lega e attiva le proteine segnali e si disattiva idrolizzando GTP a GDP, tornando nella forma inattiva⇀ L’idrolisi GTP >> GDP è mediata e accelerata da

proteine GAP, che inducono e favoriscono la fosfatasi.- Lo scambio in Ras tra GTP e GDP induce l’attivazione di una

proteina Raf, una proteina-chinasi per serina-treonina che induce il ciclo delle Map chinasi

Il ciclo delle MAP-chinasi è una serie di reazioni a catena che portano varie proteine MAP ad interagire direttamente con il nucleo:

- il termine della catena interagisce, nel nucleo, con geni che possono indurre la proliferazione cellulare.

- Vengono quindi sintetizzate cicline, Cdk, ecc… segnali che inducono la cellula a duplicarsi.

Altri sistemi di trasferimento di segnale dal recettore a proteine situate più a valleSono noti altri sistemi di trasduizione del segnale associati ad attività protein-chinasica. Fosforilati da:

- proteine fosforilanti di tipo G: sono proteine GTPasi che dissociano GTP, si legano a recettori-ligandi e trasducono il segnale mediante interazioni con altre proteine

- adenilato ciclasi: converte ATP in cAMP, mediatore della risposta cellulare.

- Fosfolipasi C: converte dei precursori in inositolo-3-fosfato e Diacilglicerolo (DAG) che mediano altre risposte cellulari.

Modello di un’integrina recettrice per la fibronectina.Le integrine sono molecole che legano le cellule alle fibre della matrice extracellulare.

La specificità di alcune integrine è anche quella di essere un recettore di segnali dall’ambiente esterno:

- associata a sé ha spesso meccanismi macromolecolari sul versante citosolico

- in seguito a particolari stimoli, probabilmente meccanici, l’integrina attiva la fosforilazione di tirosina, che interagisce con Grb2

- Grb2 è legata a Sos, che attiva Ras-GTP, che attivano la cascata delle MAP chinasi, inducendo la proliferazione cellulare.


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L’insorgenza di tumori legata alla regolazione dell’espressione genica

I fattori di crescita implicati nell’insorgenza del cancro.Il controllo della crescita cellulare, dal punto di vista della stimolazione, si avvale di 5 classi di geni che codificano per proteine quali:

- sis: fattori di crescita- erb: recettori per fattori di crescita- ras: trasduttori intracellulari- myc, jun: fattori di trascrizione- cicline, Cdk e loro inibitori.

I geni che codificano per queste proteine regolatrici del ciclo cellulare possono essere causa dell’insorgenza del tumore se la produzione delle proteine non è correttamente regolata:

- questi geni, nella loro attività regolare sono definiti proto-oncogeni

- nella loro attività scorretta diventano oncogeni.Questi fattori che regolano il ciclo cellulare, in seguito a delle mutazioni, possono comportare l’insorgenza di tumori. Alcuni esempi:

- Sis: i fattori di crescita come PDGF o EGF possono venir prodotti senza regolazione ed indurre la proliferazione barbara.

- Erb: i recettori per i fattori di crescita possono avere, dietro mutazione del proto-oncogene, il recettore tronco, quindi trasdurre il segnale anche senza ligando.

- Ras: nelle cellule tumorali, ras può essere costitutivamente attiva e non indotta!

- Myc, jun: questi fattori di trascrizione sono espressi nelle cellule tumorali senza controllo, inducendo continuamente la trascrizione

- Cicline e Cdk: possono essere espresse a livelli troppo elevati, o possono mancare i loro inibitori.

Oncogeni e onco-soppressori.I geni implicati nella cancerogenesi sono di due categorie:

- onco-soppressori: agiscono da freni. Codificano per proteine che limitano e regolano la crescita cellulare e impediscono alla cellula di diventare maligna.

- Oncogeni: codificano per proteine che favoriscono la perdita del controllo della proliferazione cellulare. Possono indurre la cellula a raggiungere uno stato maligno.⇀ Le cellule possiedono normalmente alcuni geni che in

seguito a piccole e brevi mutazioni si possono trasformare in oncogeni. Tali geni sono detti proto-oncogeni.

Una mutazione sola, al proto-oncogene o all’onco-soppressore non basta normalmente a far insorgere il tumore:

- il cancro si sviluppa quando si hanno mutazioni simultanee di proto-oncogeni in oncogeni e di onco-soppressori incapaci di svolgere la propria attività.

I virus possono inserire nel DNA dell’ospite degli oncogeni già precostituiti e causare insorgenza del cancro.

Attivazione di proto-oncogeni a oncogeni.L’attivazione dei proto-oncogeni a oncogeni può avvenire per varie cause:

- Amplificazione genica che aumenta il numero di copie del gene trascritto.

- Mutazioni puntiformi che mantengono la proteina ras (trasduttrice del segnale) costitutivamente attiva.


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- Traslocazione cromosomica, che crea un nuovo gene chimerico che codifica per una proteina costitutivamente attiva

- Traslocazione cromosomica che genera un gene chimerico trascritto sotto il controllo di un enhancer forte.

- Inserzioni virali nel genoma della cellula ospite, in cui vengono inseriti direttamente degli oncogeni.

Inattivazione di onco-soppressoriLa trasformazione di una cellula sana in una cellula tumorale è associata alla perdita di funzione dei geni onco-soppressori:

- in un modo o nell’altro, i vari geni onco-soppressori (ne sono identificati 24 nell’uomo) agiscono regolando negativamente la proliferazione cellulare.

- La loro eliminazione promuove la crescita incontrollata.- Sono anche garanti della stabilità genetica.

RB, il retino blastoma. Tumore ereditario.

Il gene che codifica per pRB è stato il primo onco-soppressore che sia stato riscontrato e studiato. Una alterazione di questo gene causa l’insorgenza del tumore della retina, detto retinoblastoma.

Questo tipo di tumore si verifica se entrambi i geni sono alterati, poiché se ne è alterato solamente uno, l’altro cromosoma 13 può codificare per pRB.

Si dimostrò che vi sono alcune famiglie che hanno ereditariamente un cromosoma Rb mutato:

- hanno, nel 90% dei casi la possibilità di sviluppare il tumore. Questo avviene se nelle cellule somatiche avviene una mutazione spontanea al gene RB del cromosoma sano

- la possibilità di sviluppare il retinoblastoma nelle famiglie non a rischio scende notevolmente, poiché devono avvenire mutazioni spontanee su entrambe i cromosomi.

La proteina RB è una proteina che controlla negativamente l’espressione dei geni necessari per il passaggio G1>>S:

- lega, ad esempio, il fattore di trascrizione E2F, agendo da repressore sui geni che codificano per enzimi implicati nella replicazione.

- Quando le cicline-Cdk G1 alzano il loro livello, RB viene fosforilata e rilascia E2F, permettendo la trascrizione degli enzimi replicativi

Qualora la proteina RB sia assente o non sia funzionale, a causa della mutazione di entrambi i geni RB, il passaggio G1>S non può essere inibito, quindi si ha una crescita incontrollata della popolazione cellulare.

La proteina p53.

La proteina p53 è una proteina che ha funzioni rilevantissime nella protezione della cellula e nella sua regolazione:

- blocca il ciclo cellulare per consentire riparazioni del DNA- induce all’apoptosi se le mutazioni sono troppo

compromettenti

La sua azione inibitrice del ciclo cellulare è data dalla capacità di indurre la produzione di CDK p21, che causa direttamente l’arresto del ciclo cellulare:

- questo spiega perché nel 50 % dei tumori, sono mutati entrambi i geni TP53.

- p21, se non è presente nella cellula a causa di mutazioni di p53, permette alle cellule di proliferare con il DNA non riparato, divulgando le aberrazioni cromosomiche.

Inoltre, la mancata produzione di p53, la quale è in grado di indurre apoptosi, blocca il suicidio della cellula a seguito di mutazioni molto dannose:


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- dimostrato dal fatto che se vi è un genoma danneggiato, i livelli di p53 sono molto alti.

I vari livelli della regolazione dell’espressione genica

La regolazione dell’espressione genica può avvenire a vari livelli, non solamente sulla trascrizione, ma:

1) cambiamenti del DNA: metilazione, amplificazione, mutazione somatica, ricombinazione somatica, trasposizione

2) trascrizione: struttura della cromatina, inizio e termine della trascrizione.

3) Maturazione post trascrizionale: capping, poliadenilazione, metilazione, splicing, editing.

4) Stabilità dei messaggeri maturi.5) Modificazioni post traduzionali: modificazione dei prodotti

proteici.

Tutto l’insieme di processi che regolano l’espressione genica sono codificati e regolati geneticamente dal DNA.

Cambiamenti del DNA.Una delle più semplici regolazioni geniche a livello del DNA è quella della metilazione:

- ha la funzione di inibire la trascrizione - vengono metilate le citosine a cui seguono delle guanine in

una sequenza ripetuta CpG.

La metilazione varia a seconda dei periodi della vita di un individuo:

- differenti siti possono essere metlati nel feto e de metilati nell’adulto.

- Uno degli esempi più lampanti è quello delle globine, che hanno differente forma nel feto (due catene alfa e due gamma) nell’embrione (due catene chi e due epsilon) e nell’adulto (due alfa e due beta).

Un altro meccanismo di controllo, che però avviene a livello più evolutivo, è quello della amplificazione dei geni:

- geni che devono essere trascritti più volte - vengono replicate un maggior numero di volte le catene che

necessitano di maggior trascrizione (formazione di double minuts), poi vengono ricombinate nel cromosoma.

- Nell’uomo ciò avviene con l’rRNA.

Regolazione a livello della trascrizioneLe proteine che legano il DNA e lo condensano in eucromatina non lo rendono accessibile alla trascrizione:

- gli istoni sono le proteine deputate all’organizzazione della cromatina e non permettono la trascrizione quando sono legati al DNA.

- In fase G1 gli istoni devono essere rilasciati per permettere la trascrizione dei geni.

Gli istoni sono slegati dal DNA mediante metilazione, acetilazione e fosforilazione:

- vi sono enzimi deputati al rilascio di istoni che vengono attivati a seguito di stimoli del ciclo cellulare (istone acetiltransferasi, HAT)

Anche la conformazione che il DNA assume è un fattore che può influire sulla trascrivibilità di un dato segmento:

- nella forma Z il DNA tende a srotolarsi ed è maggiormente facile raggiungere i nucleotidi

- nella forma B, invece, il DNA è ordinato ed è idonea a legare proteine.

L’inizio di una trascrizione è finemente regolato da vari fattori, detti promotori distale e prossimale.

Il promotore distale si compone di:


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- enhancer: elemento del DNA situato molto distante dalla sequenza promotrice distale e dal gene, lungo circa 200 nucleotidi. È intensificatore della trascrizione.

- Coattivatori: si legano all’enhancer e al promotore prossimale. Sono di due tipi:⇀ Coattivatori in trans: sono elementi proteici che

interagiscono sulla cromatina permettendone il ripiegamento del filamento e l’accessibilità alla trascrizione.

⇀ Coattivatori in cis: elementi che interagiscono direttamente con l’apparato di trascrizione.

Il ripiegamento a livello dell’enhancer sul promotore prossimale favorisce la formazione dell’enhanceosoma, a cui si lega il complesso di proteine GTF (TF II e TBP) e la RNA polimerasi.

Induzione da elevata concentrazione di metalli pesanti. Il gene che codifica per una proteina detta metallotioneina è codificato da sequenze MRE, mettallic response elements:

- codificata da fattori basali di trascrizione.

Modificazione post-trascrizionale dei messaggeri.La modificazione post-trascrizionale dei messaggeri è sostanzialmente legata ai meccanismi di splicing.

Del meccanismo di splicing si è già parlato, ma ciò che regola ancora di più la trascrizione di un determinato gene è il meccanismo dello splicing alternativo:

- permette da un solo pre-mRNA di ottenere proteine differenti- è in funzione di:

⇀ stadio di sviluppo della cellula⇀ tessuto in cui fa parte.

Lo splicing alternativo avviene grazie a specifiche proteine presenti nel nucleo della cellula che vengono sintetizzate nel particolare tipo cellulare:

- se in una cellula sono presenti alcune proteine regolatrici specifiche, queste si legano a siti di splicing deboli e ne impediscono il taglio da parte dello spliceosoma.

- Se nella cellula non viene prodotta alcuna proteina regolatoria, in presenza degli stessi siti può avvenire il taglio.

Un esempio lampante, negli organismi procarioti, è quello dello splicing del pre-mRNA della fibronectina:

- nel fegato vengono rimosse due specifiche sequenze (EDB e EDA) che invece sono prodotte nei fibroblasti.

- La fibronectina in circolo sarà quindi differente rispetto a quella che si trova a livello della matrice extracellulare.

Una cosa simile avviene nelle proteine di troponina T e tropomiosina di ratto:

- tra il ratto e l’uomo vi sono differenti meccanismi di splicing, nonostante il gene sia molto simile.

Un altro caso è il pre-mRNA del gene per la calcitonina, che in tessuti differenti produce:

- calcitonina nelle ghiandole della tiroide.- CGRP nei neuroni

Livello di stabilità dei messaggeri.Il controllo a livello della traduzione degli mRNA già trasportati nel citoplasma avviene su tre livelli:

- localizzazione degli mRNA nel citoplasma- capacità di controllare la frequenza di traduzione e la quantità

di proteine tradotte.- La longevità del filamento di mRNA.


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I meccanismi di controllo a livello della traduzione generalmente operano tramite interazione tra il filamento di mRNA e proteine.

Determinanti nel controllo della stabilità e della traduzione di un mRNA sono le sequenze UTR (sequenze non tradotte):

- 5’-UTR si estende dal cappuccio di metilguanosina fino ad AUG

- 3’ –UTR va dal codone di stop al termine della coda poliA.

Localizzazione citoplasmatica degli mRNA. Verrà trattata in seguito, parlando dello sviluppo embrionale.

Controllo della traduzione dell’mRNA. Nelle cellule eucariotiche umane vi sono differenti meccanismi che regolano la traduzione dell’mRNA in proteine.

Alcuni meccanismi possono essere definiti globali, poiché influenzano la traduzione di tutti gli mRNA.

Un meccanismo è quello che influenza eIF2:

- questa proteina, in seguito a stress della cellula, è fosforilata da una particolare chinasi.

- La fosforilazione inibisce la traduzione di tutti gli altri trascritti.- Esistono quattro tipi di chinasi per diversi stress:

⇀ Termico⇀ Infezione virale⇀ Presenza di proteine mal piegate⇀ Carenza di amminoacidi

Altri meccanismi agiscono alterando la frequenza di traduzione di mRNA specifici. Uno degli esempi è quello del mRNA per la ferritina, proteina che regola la quantità di ferro nel citoplasma:

- la traduzione è regolata da una proteina regolatrice del ferro (IRP), che dipende dalla concentrazione di ferro nella cellula.

- Quando la concentrazione di ferro è bassa, il repressore si lega ad un UTR dell’mRNA chiamato elemento di risposta al ferro.

- Questo impedisce fisicamente la sintesi di altre ferritine.- Quando la concentrazione di Fe resta elevata, viene rimosso

IRP dal 5’ dell’UTR e sintetizzate nuove ferritine.

È ancora in fase di studio il ruolo dei microRNA.

Controllo della stabilità dell’mRNA. La lunghezza della vita di un RNA dipende dalla necessità della cellula ad avere pronta sintesi nel citoplasma.

Uno dei principali meccanismi di controllo è quello della coda poli(A):- un mRNA che è necessario per maggior tempo, esce con

una maggiore coda poliA- la coda viene gradualmente degradata dall’enzima poli(A)

ribonucleasi.- Quando la coda si riduce a meno di 30 residui di adenosina,

il messaggero viene rapidamente degradato da ribonucleasi generiche.

La longevità di un mRNA non dipende solo dalla coda poli(A), ma anche da specifiche sequenze che ne regolano il tempo di accorciamento a livello dell’estremità 3’-UTR:

- se un mRNA deve avere un’emivita lunga, la sua coda UTR sarà ricca di sequenze CCUCC, che legano proteine che stabilizzano il messaggero

- se deve avere vita breve, la coda UTR sarà ricca di sequenze AUUUA, che legano proteine destabilizzanti.

Se una coda AUUUA viene rimossa, la proteina di cui ne serve una modica quantità viene prodotta in maniera superiore alla necessità:

- la cellula può diventare maligna.


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Controllo post-traduzionale.Le modificazioni post-traduzionali di proteine sintetizzate possono essere di varia natura. Tra i più comuni processi vi sono:

- l’acetilazione (aggiunta di – CH3 - OH) come protezione della degradazione

- la fosforilazione su residui di serina, treonina e tirosina- l’aggiunta di gruppi lipidici.- La glicosilazione, che conferisce proprietà funzionali e

recettoriali.

Alcune proteine, poi, appena sono sintetizzate possono andare incontro al taglio proteolitico di alcune sue estremità e di parte delle sequenze amminoacidiche:

- il pre-pro collagene, ad esempio necessita del taglio delle sequenze che gli impedivano di essere dannoso nell’apparato di Golgi per poter funzionare

- altri enzimi o ormoni possono andare incontro a questo destino.

La degradazione di alcuni peptidi in una proteina ne può modificare la conformazione, ma ottenere una proteina comunque funzionale, talvolta anche dannosa.

La ricombinazione somatica dei geni delle immunoglobuline

Negli organismi vertebrati sono presenti degli efficaci meccanismi di difesa contro agenti estranei agli organismi.

Vi sono generalmente due tipi di difesa:

- immunità innata: è una risposta aspecifica, mediata da TLR, proteine recettori che si scagliano contro qualsiasi agente ritenuto estraneo all’organismo.

- Immunità acquisita: è una risposta specifica e dotata di memoria.

La risposta immunitaria acquisitaA differenza dei meccanismi aspecifici della risposta innata, che vedono cellule killer sempre pronte a degradare qualsiasi non self, l’immunità acquisita richiede un tempo di preparazione:

- deve essere organizzato un attacco specifico contro il patogeno in questione.

- Le cellule che mediano la risposta acquisita sono cellule capaci di memoria.

Esistono due tipi di risposte immunitarie acquisite:

- immunità umorale: assicurata dagli anticorpi, proteine della superfamiglia delle immunoglobuline. Mediata dai linfociti B

- immunità cellulare (cellulo-mediata): assicurata da cellule quali i linfociti T.

La risposta umorale è mediata dai linfociti B, che quando vengono attivati si differenziano in cellule che secernono anticorpi (plasmacellule), i quali sono diretti verso agenti estranei alla cellula:

- alcune volte gli anticorpi si legano a capsidi virali, particelle proteiche, ecc… e ne impediscono l’ingresso nella cellula ospite.

- Altre volte le Ig marcano dei patogeni per indicarne la distruzione a macrofagi.

La risposta cellulo-mediata è invece mediata dal linfociti T, che quando sono attivati sono in grado di riconoscere una cellula infetta in maniera specifica e ucciderla.

Le cellule B e T originano da una unica cellula staminale ematopoietica, nel midollo osseo:

- in seguito si differenziano maturando nel timo (linfociti T) o nel midollo osseo (linfociti B)


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La selezione clonale per cellule B.Nel 1955, Jerne propose un processo per la selezione degli antigeni che prevedeva che i linfociti producessero degli anticorpi, che vengono poi selezionati a seconda del loro rapporto con l’antigene.

La teoria venne poi perfezionata ed accettata da Brunet, come teoria della selezione clonale, che prevede che:

1. ogni cellula B produce un tipo di anticorpo: i linfociti B originano da cellule non differenziate, ma appena si differenziano, grazie a riarrangiamenti del DNA, possono produrre anticorpi differenti.

2. Le cellule B producono anticorpi in assenza di antigene: le cellule B producono anticorpi e li espongono con la porzione recettoriale sulla loro membrana. Vengono prodotti prima della stimolazione di un dato ag, e sono pronti a legarsi ad esso.

3. La produzione di antucorpi segue la selezione delle cellule B da parte degli ag: il legame di una cellula B con il determinato antigene ne stimola la proliferazione che da vita a due popolazioni di cellule clonali:

a. Plasmacellule: estremamente differenziate, che producono notevole quantità di anticorpi.

b. Cellule B memoria: alcune cellule che sono poco differenziate ma mantengono la memoria del dato clone.

4. La memoria immunologica produce immunità a lungo termine: le cellule B memoria possono rispondere rapidamente a una successiva comparsa del dato antigene. Se stimolate nuovamente dall’antigene, producono una risposta immune secondaria, che dura solo poche ore, a differenza dei giorni necessari per la prima

5. La tolleranza immunologica previene anticorpi contro sé stessi: I geni che codificano per anticorpi sono combinati a caso per ottenere la variabilità quindi esiste una possibilità di sintetizzare degli autoanticorpi. Per la necessaria tolleranza immunologica verso il self le cellule che riconoscono come

antigene il proprio organismo vengono subito inattivate o distrutte.

Linfociti T. Attivazione e meccanismo d’azione.Come le cellule B, anche i linfociti T possono essere attivate da un processo di selezione clonale:

- possiedono sulla loro membrana il recettore delle cellule T, che permette loro di interagire con un dato antigene. Ogni cellula T possiede un solo TCR.

- Le cellule T sono attivate da frammenti di antigeni che sono presentati da cellule presentanti l’antigene (APC) che possono essere mostrati in differenti modalità:⇀ Sulla superficie di cellule infettate da virus il linfocita T

può riconoscere particelle del capside⇀ In altri casi l’APC è un macrofago o una cellula

dendritica che ha degradato enzimaticamente l’antigene e lo presenta sulla sua membrana in piccoli pezzi.

- L’antigene presentato dalle APC viene poi riconosciuto dalle cellule T, che attivano la risposta.

- A risposta terminata alcune cellule T clonali vengono mantenute come cellule T memoria, mentre altre vengono degradate o muoiono per apoptosi.

Contrariamente alle cellule B, le cellule T interagiscono direttamente con altre cellule (macrofagi, altre cellule T, cellule B, ecc…), inducendo l’inattivazione o la morte della cellula bersaglio come risultato finale:

- i mediatori chimici di queste risposte sono le citochine, una classe di proteine molto attive che funzionano a concentrazioni basse:⇀ sono prodotte da vari tipi di cellule e comprendono gli

interferoni (IFN), le interleuchine (IL) e i fattori necrotici tumorali TNF.


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⇀ Queste citochine si legano alle cellule bersaglio, modificandone l’attività, inducendo produzione di altre citochine o la proliferazione cellulare.

⇀ Una classe particolare, le chemiochine, inducono la migrazione dei linfociti nelle zone infiammate.

Esistono differenti tipi di cellule T, le cui classi più importanti sono:

- linfociti T citotossici: sono cellule che controllano la presenza di anomalie nelle cellule del corpo. Inducono apoptosi nelle cellule bersaglio, secernendo perforine e granzimi (questi attivano le caspasi, segnali apoptotici). Identificate dal CD8.

- Linfociti T helper: riconosciuti da CD4, sono attivate da APC professionali (macrofagi, cellule dendritiche, ecc…) regolano l’attivazione delle cellule B o di altre cellule T secernendo interleuchine.

- Linfociti T regler: complesso CD4+ CD25. Sopprimono l’attività di altre cellule immunitarie, soprattutto per evirare fenomeni autoimmuni.

La struttura modulare degli anticorpi.L’organismo umano produce milioni di molecole anticorpali differenti, capaci di legarsi praticamente a qualunque sostanza estranea si inserisca nel corpo.

Nonostante la grande diversità e complessità del sistema immunitario, una specifica Ig può interagire solamente con uno o pochi antigeni.

Gli anticorpi sono proteine globulari chiamate immunoglobuline, costituite da differenti catene unite da ponti disolfuro, a livello delle cisteine:

- catene pesanti.- catene leggere.

Vi sono 5 tipi di Ig: A, D, E, G, M:L

- ogni tipologia di Ig è sintetizzata in tempi differenti di esposizione alla sostanza estranea.

- Hanno differente funzione biologica.- Ogni tipo di Ig ha una catena pesante- Ogni Ig ha due tipi di catene leggere.

Una molcola di IgG è composta, formando una Y, da:

- due catene pesanti identiche- due catene leggere identiche.

Vi sono due tipi di catene leggere presenti in tutti gli anticorpi:

- kappa: metà di ogni catena ha una sequenza identica in tutte le Ig, l’altra metà differisce.

- lambda: avviene la medesima cosa che in kappa.

Anche le catene pesanti possiedono:

- parte costante (C)- parte variabile (V).

Le catene leggere sono composte:

- metà da una parte variabile, situata all’estremo dell’Fc, VL.- metà da una parte costante CL.

Le catene pesanti sono formate:

- nel quarto distale da catene variabili VH.- per i tre quarti prossimali da 3 catene costanti CH1, CH2, CH3.

Ogni porzione costante di una catena si lega tramite ponti disolfuro con l’omologo della catena pesante o leggera che ha a fianco.

I siti di legame per l’antigene sono situati alla fine di ogni braccio della molecola a forma di Y e sono identici da entrambe i lati:

- sono costituiti dalla porzione variabile della catena pesante unita con quella della catena leggera

- l’assemblaggio delle differenti porzioni variabili causa la enorme variabilità delle Ig.


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- La porzione terminale delle due catene variabili (pesanti e leggere) presenta delle porzioni ipervariabili, che giocano il ruolo chiave nel riconoscimento di Ag.

- Il sito di legame per un particolare antigene si chiama epitopo.

Le porzioni costanti delle catene pesanti, giocano un ruolo determinante nella determinazione della classe di Ig, che ne determina la specifica funzione.

Base genetica per le sequenze condivise e differenti nelle Ig. L’ipotesi prevalente in materia di formazione delle Ig è quella del riarrangiamento del DNA.

Si scoprì che nell’embrione le sequenze che codificavano per sequeze V e C erano molto separate sul Dna, ma erano molto vicine nelle cellule mieloidi che secernevano anticorpi.

Ad esempio, si possono considerare le sequenze del DNA umano in cui sono comprese le catene leggere k:

- una sequenza di geni Vk differenti e ripetuti sono separati da un singolo gene Ck posto ad una certa distanza.

- Si scoprì che le catene leggere V sono più corte della sequenza necessaria per la sintesi di una catena leggera k completa.⇀ Vi è una certa regione che codifica per i 13

amminoacidi rimanenti ad una certa distanza da Vk, chiamata segmento J.

⇀ Il segmento J è formato da 5 distinti segmenti Jk

disposti in tandem.- L’intero gene completo Vk è formato dall’unione di uno

specifico gene Vk con una cassetta Jk, mediante un complesso proteico chiamato V(D)J ricombinasi, che piega il DNA in un anello in modo da appaiare il gene Vk scelto casualmente con il gene Jk scelto casualmente.

- Vengono tagliati gli estremi dell’anello mediante due proteine associate al V(D)J ricombinasi, dette RAG1 e RAG2:⇀ I Vk e Jk scelti vengono uniti tra loro ed entrano a fare

parte del trascritto mRNA⇀ I geni che facevano parte dell’anello formano una

catena di DNA circolare che viene allontanata dal cromosoma.

- Nel processo di splicing, dall’mRNA vengono allontanati gli introni, che si frappongono in maniera consistente tra VJ e C.

- Viene poi tradotta la catena dell’IgG corrispondente.

Da quando vengono allontanate le sequenze dell’anello, la cellula che ha subito questa trasformazione è in grado di produrre un solo clone di Ig.

Per le catene pesanti il riarrangiamento avviene con simili modalità, ma sono 3 i frammenti genici che compongono VH: V, D, J.

Con la formazione di catene pesanti e catene leggere e una variazione enzimatica, unita allo splicing alternativo si possono ottenere circa 200’000'000 di combinazioni.

Ulteriori variazioni possono per giungere a livello delle mutazioni ipersomatiche, che avvengono parecchio tempo dopo la formazione del DNA riarrangiato:

- il tasso di mutazione è di circa 100 000 volte più alto in quel luogo rispetto al resto del genoma

- ciò avviene a opera di specifici enzimi, come la terminal-deosossi-nucleotidil-transferasi (TDT), che aggiunge nei punti di rottura dei nucleotidi in modo casuale, comportando delle mutazioni di piccola entità.

- Queste mutazioni possono avere effetti di sensibile miglioramento nel riconoscimento dell’antigene.


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Differenziamento cellulare

Gli stadi del differenziamento

Il differenziamento cellulare è un processo che avviene quando la cellula uovo viene fecondata dal gamete maschile ed avvengono le condizioni per la crescita del nuovo individuo.

La fusione dei due pronuclei da vita allo zigote, che è formato da poche cellule indifferenziate e totipotenti.

Lo stadio successivo è quello di blastula, in cui le cellule iniziano ad assumere una forma differente, ma sono ancora multi potenti.Il differenziamento dei tre foglietti embrionali primitivi avviene a livello della gastrula, in cui si possono individuare:

- endoderma- ectoderma- mesoderma: il mesoderma è ancora composto da cellule

indifferenziate che potranno poi sviluppare linee notevolmente differenti.

Al termine dell’embiogenesi, ll neonato avrà una notevole quantità di tessuti diffrenziati, che si calcolano intorno ai 210 differenti.

Il foglietto embrionale endodermico da origine a:

- epatociti, da cui derivano anche le cellule della tiroide- trachea- polmoni- vescica- pancreas esocrino

L’ectoderma forma:

- tessuto nervoso- cellule ghiandolari

- cellule specializzate come quelle della retina, dei denti, della tuba uditiva.

- Midollare del surrene

Il mesoderma da origine a notevoli tessuti differenti:

- osseo- cartilagine- gonadi- reni- muscoli- corticale del surrene- cuore, cellule endoteliali - cellule sanguigne- ecc…

i morfogeni.

Hans Spemann si mise a cercare nella cellula uovo dei fattori citoplasmatici che influenzassero lo sviluppo.

Prese due uova di salamandra e le divise in maniera differente:

- una cellula uovo venne divisa in due metà comprendenti uguale quantità di citoplasma > si ottenevano due individui normali

- l’altra venne divisa lasciando solamente il nucleo in una e nell’altra il nucleo con la gran parte del citoplasma. >> si ottennero un individuo normale e uno anormale.

Spemann fu il primo ad elaborare la teoria del trasferimento del Nucleo, e ne ottenne una formidabile prova di validità:

- i nuclei erano trasferibili da una cellula somatica ad uno zigote senza alcun problema, ma importante era il citoplasma per lo sviluppo effettivo dell’individuo


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- gettò le basi della clonazione.

Nelle cellule uovo di Drosophila melanogaster, si scoprì che determinati mRNA prodotti ancora prima della fecondazione si situavano in posizioni specifiche:

- il gene bicoid aveva il suo trascritto posizionato nella parte anteriore dell’uovo

- il gene oskar si situava nella parte posteriore.

Questa differente disposizione degli mRNA materni nel citoplasma dell’uovo viene detta gradiente morfogenetico, poiché vede la disposizione ordinata di determinati morfogeni.Un morfogene è un gene che specifica per la forma di un organi nell’individuo in fase di sviluppo.

Nella Drosophila si individuarono tre morfogeni, che si disponevano a gradienti:

- bicoid: specificava per la regione cefalica

- nanos: specificava per la regione caudale- Toll: determinava lo sviluppo ventrale non legando un altro

fattore Dorsal.

In relazione allo sviluppo della drosophila si scoprì che esistono dei geni del differenziamento:

- si attivano a cascata tra loro, per permettere di codificare per fattori di crescita specifici al momento giusto.

- I morfogeni si esprimono con una sequenza specifica, perché deve esserci una specifica gerarchia nell’espressione di geni che regolano lo sviluppo embrionale.

Tre tipi di geni del differenziamento per la Drosophila.Il moscerino della frutta si scoprì che aveva uno sviluppo controllato da tre tipologie di geni:

- geni materni: sono mRNA presenti nella cellula uovo, espressi durante l’oogenesi. Esprimono la polarità di sviluppo e l’organizzazione spaziale.

- Geni di segmentazione: regolano lo sviluppo dei vari segmenti (la drosophila è un animale segmentato, l’uomo no). Sono espressi dopo la fecondazione in seguito all’attivazione dei geni materni.

- Geni omeotici: sono geni che specificano l’identità, la forma e la funzione dei segmenti corporei. Si esprimono nella gastrula in seguito all’attivazione dai geni di segmentazione (nella drosophila) o dei geni materni (nell’uomo).

Queste tipologie di geni che codificano per proteine di sviluppo hanno anche la capacità, una volta prodotti, di indurre il bloccaggio, l’eliminazione o l’inattivazione dei geni della tappa precedente.

La specificità di questi geni attiva una cascata di fattori di trascrizione che codificano per le proteine necessarie allo sviluppo della parte del corpo individuata dal morfogeno.

Nell’uomo, dopo i geni materni, sono utilizzati i geni omeotici, che sono disposti su 4 cromosomi con funzioni simili a quelli della Drosophila:

- sono direzionati in senso cranio-caudale. Infatti lo sviluppo della maggior parte dei mammiferi ha un indice cefalico.

- Se messi in fila i 4 string del DNA che possiedono i morfogeni, questi ⇀ iniziano al 3’ con i morfogeni cefalici⇀ Proseguono con quelli toracici⇀ Al 5’ vi sono quelli caudali.


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Il differenziamento nell’uomo e il mantenimento dello stato differenziato

Durante lo sviluppo dell’individuo umano si esprime nel giusto ordine una cascata di fattori di trascrizione a gradiente, che sono espressione dei morfogeni.

Il differenziamento è un processo che si attua per la maggiore durante lo sviluppo embrionale, ma prosegue nell’adulto attraverso il mantenimento dello stato differenziato:

- cellule permanenti: alcuni tessuti non si rinnovano mai più, hanno cellule eterne (nervoso, muscolare, cellule del cristallino…)

- tessuti che si rinnovano per duplicazione semplice: epatociti, cellule endoteliali. Possiedono già nel loro citoplasma le cellule differenziate.

- Tessuti rinnovati da cellule staminali: epiteli, midollo osseo, ecc… Devono subire determinati segnali che gli impongono una specializzazione e un differenziamento.

Negli adulti il mantenimento dello stato differenziato è ancora regolato dall’espressione di geni che codificano per fattori di differenziamento:

- attivati da fattori di crescita e ormoni- la cellula ha specifici recettori che, in presenza di questi

segnali, inducono la trascrizione dei geni caratteristici del tessuto.

-

Mantenimento dello stadio differenziatoIl mantenimento dello stadio differenziato ad opera di ormoni o altri stimoli può seguire diverse modalità:

- endocrina: gli stimoli giungono attraverso il flusso sanguigno, con ormoni che si legano a specifici recettori sulle cellule

- paracrina: il mantenimento della specializzazione può essere indotto dalle cellule vicine attraverso vari meccanismi

- autocrina: la cellula stessa produce segnali che auto impongono il mantenimento dello stato differenziato.

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