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Droghe d’abuso in

Spettrometria di Massa

Nicole Marforio TAB3

Lavoro di Diploma 2012-2013

Responsabile Dr. Marco Cantù

Laboratorio d’Immunologia Cantonale/ ORBV

Nicole Marforio TAB3 – LD – 2012/2013 1

Indice Abbreviazioni 2

Abstract..........................................................................................................................................................3

1. Introduzione.........................................................................................................................................11.1. Ledroghed’abuso.......................................................................................................................................11.1.1. Epidemiologia.........................................................................................................................................................11.1.2. Concettigenerali...................................................................................................................................................11.1.3. Anfetamine..............................................................................................................................................................21.1.4. Cannabinoidi...........................................................................................................................................................31.1.5. Cocaina......................................................................................................................................................................41.1.6. Oppiacei....................................................................................................................................................................5

1.2. Tecniche.........................................................................................................................................................61.2.1. Metododiscreening............................................................................................................................................61.2.2. Metododiconferma.............................................................................................................................................8

2. Obiettivodellavoro.........................................................................................................................14

3. Materialiemetodi............................................................................................................................153.1. Reagenti,QCeCalibratori......................................................................................................................153.2. Preparazionecampioni..........................................................................................................................153.3. Strumentid’analisi...................................................................................................................................163.3.1. HPLC........................................................................................................................................................................163.3.2. SpettrometrodiMassa....................................................................................................................................173.3.3. Statistica................................................................................................................................................................17

4. Risultati...............................................................................................................................................194.1. Intraday........................................................................................................................................................194.2. Interday........................................................................................................................................................21

5. Discussione.........................................................................................................................................235.1. Intraday........................................................................................................................................................235.2. Interday........................................................................................................................................................23

6. Conclusioni.........................................................................................................................................24

7. Ringraziamenti.................................................................................................................................25

8. Bibliografia.........................................................................................................................................26

9. Allegati.................................................................................................................................................27


Abbreviazioni

OMS Organizzazione Mondiale della Sanità

THC 9 –Tetraidrocannabinolo

SNC Sistema nervoso centrale

EOLAB Dipartimento di medicina di laboratorio dell’ente ospedaliero cantonale

LC-MS/MS Cromatografia in fase liquida abbinata alla spettrometria di massa tandem

HPLC High performance liquid cromatography

MS Spettrometro di massa

SEC Size-exclusion chromatography

IEC Ion-exchange chromatography

RPC Reversed-phase chromatography

IP-RPC Ion-pair reversed-phase chromatography

AC Affinity chromatography

m/z Rapporto massa/carica

API Atmospheric Pressure Ionization

ESI Electrospray Ionization

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization

APPI Atmospheric Pressure Photoionization

AP-MALDI Atmospheric Pressure Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization

LD Lavoro di diploma

QC Controlli di qualità

IVD Dispositivi medico-diagnostici in vitro

water LC-MS Acqua ultra pura specifica per applicazioni in spettrometria di massa

BEG Benzoilecgonina

SI Standard Interno

QQQ Spettrometro di massa a triplo quadrupolo

CV% Coefficienze di variabilità percentuale

SD Deviazioni Standard

M Media


Abstract La droga è una qualsiasi sostanza capace di

modificare l’umore, la percezione della realtà o il

comportamento stesso della persona che assume

la sostanza. È possibile assumere le droghe per

diverse vie, orale, endovena e inalatoria ed è

possibile riscontrarne la presenza in diversi tessuti

o liquidi biologici. Per la determinazione

dell’assunzione di droghe d’abuso vengono

utilizzati dei test rapidi di screening con metodi

immunocromatografici, che si basano sul principio

antigene-anticorpo, questi test però non sono

abbastanza specifici e sensibili, sono in grado di

identificare solo la famiglia della droga, e hanno

dei cut-off elevati rispetto a tecniche come la

spettrometria di massa associata ad HPLC, che si

vuole introdurre come metodo di conferma. Il

nuovo metodo mostra diversi vantaggi come una

specificità maggiore, cut-off più bassi rispetto ai

test rapidi e la possibilità di dare risultati sia

quantitativi che qualitativi.

L’obiettivo è quello di validare un Kit diagnostico

per la quantificazione spettrometrica delle droghe

d’abuso, in questo lavoro di anfetamine, cocaina e

metadone.

I reagenti, controlli e calibratori vengono forniti

dalla ditta Eureka Italia, utilizzando un UHPLC

Agilent Technologies e uno Spettrometro di

Massa a triplo quadrupolo Agilent Technologies,

associato a sorgente ESI.

Per motivi di tempo non è stato possibile ottenere

tutti i valori necessari alla validazione. Con i

risultati preliminari però possiamo già identificare

dei problemi di accuratezza, che fanno pensare

ad un problema di stabilità o di assemblaggio dei

QC per questo motivo l’obiettivo stabilito non è

stato raggiunto, di conseguenza verranno presi in

considerazioni degli altri Kit diagnostici oppure la

Ditta Eureka risolverà i problemi riscontrati nei

QC.

The drug is any substance capable of altering the

mood, perception of reality or the conduct of the

person taking the substance. You can take drugs

by different routes, oral, intravenous and inhaled

and can foundet presence in different tissues or

biological fluids. For the determination of drug of

abuse are used for rapid screening test with

immunochromatographic methods, which are

based on the principle of antigen-antibody,

however, these tests are not sensitive and specific

enough, they are able to identify only the family of

drugs and have the cut-off levels than techniques

such as mass spectrometry combined with HPLC,

which is to be introduced as a confirmatory

method. The new method shows several

advantages such as higher specificity, cut-off

lower than the rapid tests and the ability to provide

both quantitative and qualitative results.

The aim is to validate a diagnostic kit for the

spectrometric quantification of drugs of abuse, in

this work of amphetamines, cocaine and

methadone.

The reagents, controls and calibrators are

supplied by the company Eureka Italy, using a

UHPLC Agilent Technologies, and a triple

quadrupole mass spectrometer Agilent

Technologies, associated with ESI source.

Due to time constraints it was not possible to

obtain all the necessary values to the validation.

With the preliminary results, however, we can

already identify the problems of accuracy, which

suggest a problem of stability or assembly of QC,

for this reason, the objective set was not reached,

a result of other considerations will be taken into

diagnostic kits or company Eureka solve the

problems encountered in the QC.


1. Introduzione

1.1. Le droghe d’abuso

1.1.1. Epidemiologia

Le droghe d’abuso sono tutt’oggi uno dei principali problemi della società, nel 2010

l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) riporta che dai 135 ai 300 milioni di persone nel

mondo hanno fatto uso di sostanze illecite nell’anno precedente, nell’età compresa tra i 15 ed i

64 anni (3.4-6.6% di popolazione mondiale in quel gruppo di età), con un tasso di mortalità di

circa 0.5-1.3%.

In Europa, con il 5.2% della popolazione, i cannabinoidi sono la droga più consumata, seguita

dalla cocaina con l’1.3%, seguita dalle anfetamine ed infine dagli oppiacei.

Anche per quanto riguarda la Svizzera, i cannabinoidi sono la droga più consumata. È stato

dimostrato tramite un’inchiesta che fra i quindicenni il 34% dei ragazzi ed il 28% delle ragazze

hanno provato la canapa almeno una volta. Circa un quinto della popolazione di età compresa

fra 15 e 64 anni invece ammette di aver fumato hashish almeno una volta, e fra questi un

quarto circa ammette di continuare a farlo. Ad oggi, si stima che in Svizzera un numero di

persone tra i 500'000 ed i 600'000 faccia uso di cannabinoidi, mentre per quanto riguarda le

droghe pesanti (anfetamina, cocaina ed oppiacei), il numero di tossicodipendenti si aggira

intorno alle 30'000 persone. Il rapporto dell'organismo delle Nazioni Unite, International

Narcotics Control Board del marzo 2005, indica che la Svizzera è uno dei pochi paesi europei in

cui il consumo di cocaina ed anfetamine è in aumento. [16] [7]

1.1.2. Concetti generali

La parola “droga” viene utilizzata per identificare qualsiasi sostanza capace di modificare

l’umore, la percezione della realtà oppure il comportamento della persona che l’assume,

causando un effetto di tossicodipendenza molto variabile. Il termine “di abuso” viene utilizzato

per le droghe illegali, o per quelle che non vengono assunte per scopo terapeutico, per esempio

le benzodiazepine.

Le droghe d’abuso possono essere classificabili in tre differenti categorie dipendenti dalla loro

attività sul sistema nervoso centrale (SNC):

psicolettiche (deprimono l’attività mentale)

psicoanalettiche (eccitatori dell’attività mentale)

psicodislettiche (capacità di alterazione del comportamento e delle percezioni)


Le droghe sono delle sostanze di origine naturale o sintetica aventi principi psicoattivi, queste

sostanze possono essere assunte in vari modi, i più comuni sono:

endovenosa

inalazione

orale

A dipendenza della sostanza assunta gli effetti sull’organismo posso essere di diverso genere.

Queste sostanze sono tossiche per l’organismo umano, infatti un uso eccessivo sia in quantità

sia in durata possono portare a gravi disturbi, sia psichici sia fisici, fino a portare alla morte.

Quando la droga viene assunta, il corpo metabolizza questa sostanza tramite il fegato che le

trasforma in metaboliti adatti all’eliminazione. Il fegato, modificando le sostanze assunte, può

produrre metaboliti attivi aventi anch’essi effetti sull’organismo. Un esempio è l’eroina, un

oppiaceo, che dopo l’assunzione viene rapidamente trasformata in morfina.

Sia i metaboliti sia la sostanza assunta, dopo essere stati processati dal fegato per creare i

prodotti d’eliminazione, si accumulano in vari tessuti:

grasso

capelli

parenchima (tessuto caratteristico di un organo sia per la funzionalità che per la

struttura)

Tutte le sostanze che vengono prodotte dall’organismo per l’eliminazione, restano nei tessuti a

cui sono più affini, e vengono espulsi dall’organismo in tempistiche diverse per ogni tipo di

droga. Il tempo di rivelazione nei test di screening sono diversi, queste differenze sono date sia

dal metodo del test, sia dalla frequenza di assunzione della sostanza. Infatti se una sostanza

viene assunta regolarmente, questa può accumularsi maggiormente all’interno dei tessuti

aumentando di conseguenza il suo tempo di rivelazione. Ad esempio, per i cannabinoidi, il

tempo di rilevazione nelle urine va da 7 giorni (circa) per un fumatore occasionale, a 30-40

giorni per un forte fumatore.

Per l’analisi delle droghe è possibile utilizzare diversi fluidi biologici, ma il più utilizzato per

verificare l’assunzione di droghe è l’urina, questo perché può essere raccolta con metodi poco

invasivi. Le molecole possono anche essere ritrovate nel sangue, nella saliva, nel sudore e nei

capelli. [13]

Le principali classi di droghe d’abuso sono: anfetamine, cannabinoidi, cocaina ed oppiacei.

1.1.3. Anfetamine

Queste droghe sono di tipo sintetico, ottenute tramite delle reazioni chimiche prodotte in

laboratori clandestini. Viene assunta per via orale e la sua eliminazione nelle urine è fortemente

dipendente dal pH; dopo 20 minuti dall’assunzione è possibile riscontrarne la presenza nelle

urine, ed in 10-30 ore avviene l’intera escrezione. Le sostanze per questa classe di droghe

sono diverse, le più conosciute sono:


Ecstasy o MDMA

Metanfetamine

Efedrina

Ketamina

Per la famiglia delle anfetamine esistono differenti tipi di droghe che si basano sulla durata ed

effetti che producono:

allucinogeni (modificazioni della percezione, pensieri e sensazioni)

empatogeni (aumentano l’empatia della persona)

entactogeni (energizzanti, euforici)

sedativi

stimolanti

stati d’euforia

psichedelici (allargamento della coscienza e superamento della realtà)

anoressizzanti

L’azione più importante che producono le anfetamine, è quella di stimolare direttamente il

rilascio di dopamina nei neuroni a livello delle presinapsi, inoltre bloccano il feedback negativo

della dopamina bloccando la produzione di dopamina all’interno del neurone. Le anfetamine

agiscono anche sul rilascio di noradrenalina, adrenalina e serotonina. [1]

I differenti tipi di anfetamine causano tutte dei danni all’organismo; alcune possono portare alla

morte con una sola dose e, spesso, la causa della morte è l’associazione di altre sostanze

d’abuso, come per esempio i cannabinoidi e gli alcolici. [5] [13] [14]

1.1.4. Cannabinoidi

I cannabinoidi sono droghe di origine naturale derivati dalla pianta della canapa (Cannabis

sativa). Il principio psicoattivo per questo gruppo di droghe è il THC (9 –tetraidrocannabinolo).

La canapa da droga non è facilmente differenziabile da quella tessile, infatti il tessuto, la carta o

le corde sono realizzati utilizzando gli arbusti della pianta, mentre l’hashish e la marijuana sono

ottenuti grazie all’infiorescenza della pianta; per questo motivo a livello europeo si considera

canapa stupefacente la pianta con una concentrazione di THC superiore allo 0,5%.

Nel commercio si trovano diversi preparati contenenti THC:

la marijuana è ottenuta miscelando diverse parti della pianta contenenti da 0,5-1,5% di

THC; viene fumata da sola oppure con aggiunta di tabacco.

l’hashish è costituita dalla resina pura estratta dal fiore della pianta contenente il 3-7% di

THC.

l’olio di hashish è un concentrato di materiale vegetale con un THC dal 20-40% ed è

aggiunto alle canne per aumentarne il contenuto di principio psicoattivo.


Il THC viene assorbito sia dal tratto gastrointestinale, in modo lento ed irregolare, sia per via

inalatoria, con un assorbimento più rapido.

I principali effetti prodotti dai cannabinoidi sono:

diminuzione della forza muscolare e della fermezza delle mani

diminuzione dell'equilibrio e la stabilità della postura

apatia

tristezza

compromissione del giudizio

compromissione della concentrazione e della memoria

In svariate aree del cervello sono presenti dei recettori specifici per una molecola endogena

chiamata anandamide; essa, legandosi ai recettori del THC, genera gli stessi effetti del principio

psicoattivo. Si ha quindi un meccanismo dove questa molecola si lega in modo naturale al

recettore. L'anandamide è coinvolta nella regolazione dell'umore, della memoria, dell'appetito,

del dolore, della cognizione e dell’emozioni. Quando il principio attivo 9-tetraidrocannabinolo si

lega al recettore può interferire con tutte queste funzioni.

Il THC inizia questo processo legandosi ai recettori CB1 per l’anandamide. Questi recettori

modificano quindi l'attività di diversi enzimi intracellulari, riducendone l’attività. La ridotta attività

enzimatica colpisce il potassio ed i canali del calcio così da ridurre la quantità di

neurotrasmettitori rilasciati e quindi l'eccitabilità generale delle reti neurali del cervello.

Tuttavia nel circuito di feedback viene rilasciata più dopamina. Questo aumento si spiega con il

fatto che i neuroni dopaminici sono normalmente inibiti da neuroni GABAminici, Il THC elimina

l’inibizione dei neuroni GABAmininici attivando i neuroni dopaminici.

Nei consumatori cronici di cannabis, la perdita dei recettori CB1 nel arterie del cervello riduce il

flusso di sangue e quindi di glucosio ed ossigeno, al cervello. I risultati principali sono di

conseguenza deficit di attenzione, perdita di memoria, e ridotta capacità d’apprendimento.

L’eliminazione avviene sia attraverso le urine per 1/3 della dose assorbita, sia attraverso le feci

per 2/3. Si riscontra la presenza nelle urine di THC dopo 3 giorni dall’assunzione se è stata

assunta solo una volta, e da 30 a 80 giorni rispettivamente in caso di consumo occasionale

(una volta a settimana) o continuo. Questo tipo di tempistica è da attribuire alla cinetica del THC

che è molto affine ai tessuti adiposi. [13] [14] [9] [2]

1.1.5. Cocaina

La cocaina è una droga di origine naturale contenuta nelle foglie di Erithroxylon coca. Queste

vengono essiccate e lavorate fino ad ottenere una pasta dalla quale, dopo diversi passaggi, si

estrae il principio psicoattivo. La cocaina è ben assorbita in qualsiasi via di somministrazione.

I principali effetti prodotti dalla cocaina sono:

stimolanti del sistema nervoso centrale (SNC)

euforia

fiducia

benessere immediato


diminuita sensazione di stanchezza, fame e sete

maggiore socievolezza e facilità di relazione

instancabilità

aumento della libido

L’effetto più importante della cocaina è quello di bloccare il feedback negativo della dopamina

bloccando il recettore che inibisce la produzione di dopamina. Il blocco del feedback negativo

crea un conseguente aumento dei livelli di dopamina nelle sinapsi nel cervello. Oltre a bloccare

il feedback dopaminico, la cocaina blocca anche il feedback della noradrenalina e della

serotonina. Il ruolo delle azioni della cocaina sulla noradrenalina e sulla serotonina non è

ancora del tutto chiaro. [1]

L’eliminazione di questa droga avviene tramite le urine ed è molto influenzata dal pH, il tempo di

eliminazione varia a dipendenza del metabolismo da 30 minuti a circa 8 ore massimo. È

possibile invece ritrovare delle tracce di metaboliti della cocaina nelle urine fino, a 5 giorni dopo

l’assunzione. [13] [14] [12] [11]

1.1.6. Oppiacei

L’oppio è costituito da lattice essiccato del papavero bianco (papaverum somniferum), ottenuto

per incisione delle capsule seminifere ancora verdi. In questo lattice è presente circa il 10-20%

di sostanza stupefacente, costituita prevalentemente da morfina (8-14%). L’oppio grezzo si

ottiene essiccando il lattice e riducendolo in polvere, dopodiché si può aggiustare il contenuto di

morfina. L’eroina invece è prodotta tramite acetilazione della morfina.

Il metadone invece è una sostanza ottenuta per sintesi in laboratorio, chimicamente differente

dalla morfina; ciononostante viene classificato come oppioide sia per l’azione farmacologica

simile alla morfina, sia perché viene utilizzato come sostituto dell’ eroina in terapie di

disintossicazione.

I principali effetti prodotti dagli oppiacei sono:

antidolorifico

piacere intenso e immediato (flash)

pesantezza alle articolazioni

prurito

nausea

vomito

costipazione acuta

dolori intestinali e di stomaco

diminuzione della libido

Questi farmaci, quando somministrati nel corpo, imitano neurotrasmettitori peptidici oppioidi

(endorfine) endogeni. Le endorfine sono coinvolte in tre principali funzioni:

la modulazione del dolore e la percezione di risposta agli stimoli dolorosi;


la regolamentazione delle funzioni omeostatiche, come cibo, acqua;

la regolazione della temperatura.

I principali tipi di recettori oppioidi sono stati identificati nel cervello, sono chiamati “mu”, “delta”

e “kappa” e sono legati a recettori secondari all'interno della cellula. In generale, le endorfine,

hanno un effetto generalmente inibitorio su tutte le popolazioni di neuroni, producendo un

profondo senso di euforia e benessere accoppiati alla sedazione, il relax e l'aumento della

soglia del dolore. Gli studi sugli animali hanno dimostrato che gli oppiacei aumentano l'attività

dei neuroni dopaminici in determinate aree del cervello. I neuroni dopaminici vengono inibiti

normalmente da neuroni GABA. Poiché gli oppiacei inibiscono l’attività neurale, quando i

recettori mu sono attivati, i neuroni GABA vengono anch’essi inibiti e questo induce un aumento

di produzione di dopamina, prodotta dai neuroni dopaminici, i quali non subiscono l’effetto

inibitorio dei neuroni GABA. Questo aumento di dopamina produce sensazioni stimolanti e

gratificanti.

La morfina è assorbita facilmente dal tratto GI, dalla mucosa nasale, dai polmoni e per via

sottocutanea o intramuscolare. Si accumula facilmente e rapidamente nel parenchima degli

organi pieni. L’eliminazione è veloce ed avviene attraverso le urine e la bile con un tempo di

dimezzamento di circa 1-7 ore con la possibilità di identificarne la presenza dopo 48 ore.

Il metadone è differente dagli altri composti oppioidi perché è più stabile, viene assunto per via

orale e si concentra nei tessuti adiposi dove si accumula a concentrazioni elevate per diverso

tempo. L’eliminazione di questa droga infatti è molto lenta con tempo di dimezzamento da 15-

55 ore. Gli effetti prodotti sono simili a quelli dell’eroina. [14], [13] [6] [1]

1.2. Tecniche

1.2.1. Metodo di screening

I metodi analitici più utilizzati per identificare la presenza di droghe d’abuso sono immunochimici

o immunocromatografici. Tali metodi sono alla base dei test rapidi che si eseguono, in campo

diagnostico e/o legale. Il principio dei metodi sopraccitati è di tipo antigene-anticorpo.

1.2.1.1. Sistema Immunochimico

È un sistema a competizione ed utilizza degli anticorpi e degli antigeni marcati. L’antigene

marcato è una molecola uguale all’analita ricercato oppure è una molecola che reagisce nello

stesso modo con l’anticorpo presente nel test. Nelle membrane assorbenti sono contenuti gli

antigeni marcati (per esempio cocaina) con enzimi o molecole fluorescenti e gli anticorpi, che

sono immobilizzati alla membrana assorbente. Il campione viene assorbito dalla membrana e

per capillarità attraversa tutta la superficie, spostando l’antigene marcato. Se l’analita ricercato

è presente nel campione, esso si legherà sugli anticorpi immobilizzati alla membrana. Mentre

se l’analita non è presente si legheranno gli antigeni marcati, che grazie al legame antigene-

anticorpo produrranno la reazione chimica, visibile con una striscia colorata.


1.2.1.2. Sistema immunocromatografico

Questo metodo utilizza il principio antigene-anticorpo a competizione esattamente come per i

test immunochimici. La differenza consiste nella marcatura dell’antigene, che avviene tramite

l’aggiunta di una molecola colorata.

In EOLAB si utilizza lo screening droghe della ditta MD Doctors Direct, Instant - View® metodo a

goccia che utilizza i campioni di urina fresca. Questo test identifica 12 classi di droghe con i

rispettivi Cut-Off, cioè la quantità minima definita per legge che indica un’assunzione volontaria

a scopo illecito:

Classe Droga Cut-Off (ng/ml)

Metadone (MTD) 300

Benzodiazepine (BZD) 300

Cocaina (COC) 300

Anfetamine (AMP) 1000

Metamfetamine (MET) 1000

Morfina/Oppiacei (MOR) 300

Barbiturici (BAR) 300

Tetraidrocannabinolo (THC) 50

Antidepressivi triciclici (TCA) 1000

MDMA/XTC/Ecstasy (MSMA/XTC) 500

Fenciclidina (PCP) 25

Propossifene (PPX) 300

Tabella 1: Cut-Off Istant-Vew metodo a goccia

Per entrambi i metodi descritti i risultati che si riscontrano sono di tipo qualitativo cioè “positivo”

o “negativo”.

I vantaggi di questi test sono:

la rapidità di visualizzazione del risultato

i costi

la capacità degli anticorpi di riconoscere tutte le molecole che appartengono alla stessa

famiglia della droga assunta

La capacità degli anticorpi di legarsi ai metaboliti della medesima famiglia è perfetto per l’utilizzo

di questi anticorpi in test di screening. Con un test di screening si vuole solamente evidenziare

una positività o una negatività nel risultato, non è importante conoscere esattamente la

sostanza assunta dal paziente.


Gli svantaggi sono:

La bassa specificità degli anticorpi, la capacità di riconoscere molte molecole simili, porta a una

bassa specificità; è quindi possibile che i risultati riscontrati con i test di screening siano dei

“falsi positivi” o “falsi negativi”. Gli anticorpi utilizzati in questi test rapidi, possono fare delle

reazioni crociate con sostanze analoghe all’analita ricercato, queste sostanze analoghe sono

presenti nel campione del paziente. Le sostanze che possono creare delle reazioni crociate

sono frequentemente dei farmaci, oppure delle sostanze di origine naturale assunte con la

dieta.

Gli anticorpi utilizzati nel test che offre EOLAB mostrano in una tabella le sostanze, che con un

cut-off maggiore a 100 μg/ml possono dare interferenze, e produrre dei risultati “falsi positivi” o

“falsi negativi”. [10] [15]

Per questo motivo si vuole introdurre un metodo di conferma che non utilizzi un principio di tipo

antigene-anticorpo.

1.2.2. Metodo di conferma

Per confermare la presenza d’abuso di droga è necessario utilizzare un metodo più specifico e

più sensibile, rispetto al sistema di screening in uso. Utilizzando un altro metodo si può avere la

possibilità di quantificare esattamente la sostanza presente nel campione.

Il metodo in questione è la cromatografia in fase liquida abbinata alla spettrometria di massa

tandem(LC-MS/MS). Questa tecnica è suddivisa in due blocchi:

High Performance Liquid Cromatography (HPLC)

spettrometria di massa (MS)

I vantaggi che presenta questa tecnica sono:

maggiore sensibilità perché ha un cut-off molto più basso rispetto ai metodi

immunochimici e immunocromatografici.

maggiore specificità confrontandolo con i test rapidi perché è in grado di selezionare la

sostanza in analisi e di validarla misurando i frammenti specifici della stessa, senza

problemi di reazioni crociate.

capacità di fornire contemporaneamente risultati di tipo qualitativo e quantitativo per tutte

le sostanze analizzate.

1.2.2.1. High Performance Liquid Cromatography

(HPLC)

L’HPLC è un sistema di separazione del campione che grazie a colonne cromatografiche

contenenti una fase stazionaria, rallentano le molecole contenute nel campione in base alle loro

caratteristiche chimiche o fisiche. È molto importante quindi sapere esattamente la struttura

della molecola d’interesse, poiché esistono differenti tipologie di colonne che utilizzano fasi

stazionarie:


Size-exclusion chromatography, SEC, separazione basata sulla grandezza

Ion-exchange chromatography, IEC, interazione elettrostatica

Reversed-phase chromatography, RPC, interazione idrofobica

Ion-pair reversed-phase chromatography, IP-RPC, interazione elettrostatica e idrofobica

Affinity chromatography, AC, interazione biospecifica

Il primo tipo di colonna cromatografica utilizza esclusivamente le caratteristiche fisiche (la

grandezza) della molecola, mentre le altre quattro colonne elencate, utilizzano sistemi

d’interazione con la molecola per esempio di tipo elettrostatico dove la fase stazionaria è

costituita da una resina a scambio ionico, cioè un supporto organico al quale sono legati dei

gruppi ionici o ionizzabili. I gruppi ionici della resina trattengono per mezzo di interazioni

elettrostatiche, ioni di carica opposta. Il meccanismo di separazione è basato perciò sulla

diversa affinità dei soluti nei confronti dei gruppi attivi della resina. L’interazione idrofobica

utilizza una colonna con una fase stazionaria idrofoba, e permette di rallentare le molecole in

base al loro grado di idrofobicità. L’interazione biospecifica è in grado di separare le molecole

sulla base di un'interazione reversibile tra una proteina (o gruppo di proteine) e un ligando

specifico fissato alla colonna. Permette la purificazione di una biomolecola sulla base della sua

funzione biologica o struttura chimica individuale.

Nell’analisi delle droghe d’abuso si utilizzano delle colonne cromatografiche di tipo Reversed-

Phase Chromatography (RPC). Le colonne contengono una fase stazionaria idrofobica,

composta da silicio con catene alifatiche. Il campione viene immesso in una fase mobile

polarizzata idrofila (esempio acqua), con aggiunta di acidi polari per aumentare l’efficienza di

ionizzazione, la ritenzione avviene tra gli analiti idrofobici e la fase stazionaria idrofobica. Dopo

la ritenzione degli analiti si aggiunge un solvente organico per effettuare l’eluizione delle

molecole trattenute dalla fase stazionaria. [4]

Figura 1: RPC-HPLC

http://www.thefullwiki.org/Proteomics/Protein_Separations_-_Chromatography/Reversed_Phase


1.2.2.2. Spettrometria di Massa (MS)

Nello spettrometro di massa il campione, che può essere solido, liquido o gassoso, viene

immesso in una camera dove viene ionizzato tramite una sorgente. Gli ioni prodotti dalla

sorgente si troveranno in fase gassosa e verranno separati in base al loro rapporto

massa/carica (m/z). Dopo questa separazione gli ioni selezionati saranno raccolti da un

rivelatore che darà un segnale elettrico proporzionale al numero di ioni presenti. Il segnale verrà

quindi convertito in uno spettro di massa.

Il funzionamento dello spettrometro di massa può essere suddiviso in tre passaggi:

1. produzione di ioni (ionizzazione)

2. frammentazione e separazione (scelta degli ioni in base alla m/z)

3. rivelazione

1.2.2.2.1. Ionizzazione

La produzione di ioni avviene attraverso delle apposite sorgenti. La sorgente utilizzata per le

droghe d’abuso è una API (Atmospheric Pressure Ionization). Il campione viene dissolto in un

solvente appropriato ed introdotto nella sorgente ionica. Esistono differenti tipi di sorgenti API:

Electrospray Ionization (ESI)

Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

Atmospheric Pressure Photoionization (APPI)

Atmospheric Pressure Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization (AP-MALDI)

La sorgente utilizzata per l’analisi delle droghe d’abuso è la ESI. Il campione in fase liquida

arriva all’interno della sorgente e passa attraverso un capillare, dove è applicato un potenziale

elettrico che ionizza il campione, all’uscita del capillare, il liquido viene investito da un flusso di

gas (solitamente azoto) necessario per la nebulizzazione e l’evaporazione del campione. A

questo punto, le molecole ionizzate ed in fase gassosa entrano nello spettrometro.


Figura 2: Sorgente ESI

http://www.ucl.ac.uk/ich/services/lab-services/mass_spectrometry/metabolomics/hplc

1.2.2.2.2. Separazione, selezione e frammentazione

Il processo di separazione e scelta degli ioni in base al loro rapporto m/z, avviene mediante

degli analizzatori all’interno dello spettrometro di massa. Esistono differenti analizzatori in

spettrometria di massa:

quadrupolo

settore magnetico

settore elettrico

tempo di volo

trappola ionica

risonanza ciclotronica

Il principio di tutti questi sistemi è quello di accelerare, separare e selezionare gli ioni

d’interesse.

L’analizzatore più utilizzato per le analisi quantitative, analizzatore utilizzato anche presso

EOLAB, è quello a triplo quadrupolo. Questo analizzatore consiste in tre camere ad alto vuoto

ognuna delle quali contenenti quattro cilindri chiamati elettrodi (quadrupoli). I quattro elettrodi

vengono suddivisi a coppie alle quali viene applicata una polarità opposta (positiva o negativa).

La prima camera viene utilizzata come filtro, infatti all’interno avviene una prima separazione

basata sul rapporto m/z. Alle coppie di elettrodi viene applicato un voltaggio ed una


radiofrequenza che consiste nella velocità in cui le due coppie di elettrodi invertono la loro

polarità, da negativo a positivo e viceversa.

La radiofrequenza (velocità di scambio delle polarità tra le coppie di elettrodi) produce un moto

oscillatorio degli ioni presenti nel quadrupolo, in modo da poterli spostare fino alla camera

successiva ed esercitare una prima filtrazione. Gli ioni presenti nel quadrupolo si spostano,

seguendo delle traiettorie ad onda, in base al rapporto m/z, alla polarità degli elettrodi ed alla

radiofrequenza. Per ogni rapporto m/z esiste una sola radiofrequenza in grado di stabilizzarne

la traiettoria, permettendone il passaggio alla camera successiva. Alla stessa radiofrequenza,

tutte le molecole con differenti rapporti m/z seguono traiettorie che li faranno collidere con gli

elettrodi o espellerli dal quadrupolo.

Figura3: Quadrupolo

http://cluin.org/characterization/technologies/windows/quadmass.htm?keepThis=true&TB_iframe=true&h

eight=350&width=510

Nella seconda camera, chiamata cella di collisione, è contenuto un gas inerte. Aumentando il

potenziale applicato agli elettrodi, gli ioni che entrano nella cella di collisione possono essere

accelerati. L’elevata energia cinetica, data dalla maggior velocità di movimento, unita agli urti

con le molecole di gas inerte, causa la frammentazione degli ioni presenti nella cella di

collisione. A seconda del potenziale applicato agli elettrodi, potrò conferire più o meno velocità

(e quindi energia cinetica) agli ioni, selezionando di fatto il livello di frammentazione desiderato.

Nell’ultima camera avviene una seconda filtrazione, basata sul principio della prima camera.

Tutto il sistema di filtrazione e frammentazione degli ioni è sotto alto sottovuoto. [3]

1.2.2.2.3. Rivelazione


Il rivelatore si posiziona alla fine delle tre camere e la rivelazione degli ioni avviene grazie ad un

tubo fotomoltiplicatore. In pratica, gli ioni collidono con una placca di metallo a cui viene

applicato un potenziale. La collisione degli ioni produce un’emissione di elettroni dalla placca

proporzionale alla quantità di ioni che collidono. Gli elettroni emessi vengono amplificati a

cascata fino alla generazione di un impulso elettrico proporzionale alla quantità di ioni che

entrano nel detector.[3]


2. Obiettivo del lavoro

L’analisi di screening di droghe d’abuso è un’analisi di routine in ambito ospedaliero e risulta

spesso necessario poter confermare i test positivi. Ad oggi tutti i test di conferma sono effettuati

in svizzera interna in quanto mancava in EOLAB sia la strumentazione sia il know-how

(competenze) per poter effettuare i test. Grazie all’acquisizione della spettrometria di massa per

le analisi farmacologiche già introdotte, EOLAB è ora in grado d’introdurre i test di conferma per

le droghe d’abuso.

Obiettivo di questo lavoro di diploma (LD) è la validazione di un kit diagnostico per la

quantificazione spettrometrica di droghe d’abuso, comprendente 3 protocolli di preparazione del

campione, basati sulla classe di appartenenza dell’analita.

Il presente LD si concentrerà sulla validazione del pannello di Amfetamine, cocaina e

metadone. Questo lavoro di diploma ha come scopo finale quello di avere un metodo più

accurato e preciso rispetto ai test rapidi attualmente in uso, utilizzabile come sistema di

conferma.


3. Materiali e metodi

3.1. Reagenti, QC e Calibratori

Per questo LD si sono utilizzati i calibratori ed i controlli di qualità (QC) della ditta Eureka srl-

LAB DIVISION Italia, Kit Sostanze d’Abuso urinarie in LC-MS – Cod. LC74010 Metodo di

conferma in LC-MS che rispetta la Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro

(IVD). Il kit permette di analizzare 27 molecole di 4 classi di droghe diverse.

I QC ed i calibratori vengono forniti in forma liofilizzate e sono conservati a -80°C. Al momento

dell’utilizzo vengono ricostituiti con un quantitativo di 5 mL di acqua ultra pura specifica per

applicazioni in spettrometria di massa (water LC-MS). Dopo l’aggiunta di acqua vengono

miscelati con appositi agitatori per 5-10 minuti. Il processo successivo è quello di preparare

delle aliquote di 500 μL che vengono poi conservate a -20°C.

I reagenti presenti nel kit sono 6:

Reagente A, soluzione per idrolisi 9-THC-COOH 1x2 mL

Reagente B, enzima di idrolisi Droghe 2x1 mL

Reagente C, soluzione tampone per idrolisi 1x20 mL

Reagente D, soluzione diluente 1x150 mL

Reagente E, standard interno 3 flaconi

Reagente M1, fase mobile M1 1x500 mL

Reagente M2, fase mobile M2 1x500 mL

Reagenti da ricostituire al momento dell’uso:

Reagente B aggiunta di 9.0 mL di reagente C

Reagente E aggiunta di 50 mL di reagente D

Tutti i reagenti vengono conservati a 2-8°C e sono stabili per 3 anni. Eccezione per il reagente

E non ricostituito la cui conservazione è a -20°C, mentre quando viene ricostituito la

conservazione è 2-8°C ed è stabile un anno. [8]

3.2. Preparazione campioni

Per effettuare l’analisi su i QC ed i calibratori aliquotati si sono seguite le istruzioni rilasciate

dalla ditta Eureka. I protocolli previsti sono tre e vengono utilizzati in base alla molecola che si

vuole analizzare. I protocolli sono stati identificati in sequenza 1, 2 e 3. Il protocollo 1 viene

utilizzato per tutte le analisi del presente LD:

3.4-MDE


3.4-MDMA

3.4-MDA

anfetamina

metanfetamina

efedrina

pseudoefedrina

norpseudoefedrina

ketamina

cocaina

benzoilecgonina (BEG)

cocaetilene

metadone

EDDP

Il protocollo 1 consiste in:

scongelamento dei campioni, QC e Calibratori

miscelazione e centrifugazione dei campioni

pipettare una porzione del campione all’interno delle vial (provette apposite per HPLC)

aggiungere dello Standard Interno (SI)

miscela il campione per 10 secondi

Il campione così preparato è pronto per essere immesso nell’HPLC-MS. [8]

3.3. Strumenti d’analisi

3.3.1. HPLC

UHPLC 1290 Agilent Technologies

Colonna utilizzata: Zorbax Eclipse Plus C18, Rapid Resolution HD, 2.1x50mm, 1.8μm

T (min.) M1

A%

M2

B%

0.00 95 5

0.5 95 5

1.5 5 95

3.5 5 95

3.51 95 5

5 95 5

Tabella 2: Protocollo di estrazione HPLC


Nella tabella 2 vengono descritte le percentuali delle fasi mobili all’interno della colonna per

effettuare l’analisi delle molecole d’interesse. In 5 min. la colonna ha analizzato completamente

il campione ed ha effettuato il ricondizionamento quindi è pronta per un nuovo campione.

3.3.2. Spettrometro di Massa

Spettrometro di massa a triplo quadrupolo (QQQ) modello 6460 Agilent Technologies,

associato a sorgente ESI

Sorgente ESI

GAS Temp. 290°C

GAS Flow 6 L/min.

Capillare 3500 Volt (+)

Tabella 3: Informazione Sorgente ESI

Nella tabella 3 sono presenti i parametri utilizzati per effettuare la ionizzazione del campione

con la sorgente ESI.

3.3.3. Statistica

Per la parte statistica sono state calcolate le seguenti formule:

Coefficiente di variazione percentuale (CV%) intraday e interday

Deviazione Standard (SD)

Media (M)

Accuratezza

CV% formula:

SD formula

M formula:

Accuratezza formula:


Il CV% intraday significa un insieme di campionature nella stessa serie di analisi con la stessa

curva di calibrazione, mentre il CV% interday è l’insieme di campionatura di serie indipendenti

di analisi in giorni diversi e con curve di calibrazione differenti.

I valori che si sono ottenuti servono per la determinazione di riproducibilità, efficacia e

precisione del metodo.


4. Risultati

4.1. Intraday

I risultati Intraday sono stati ottenuti analizzando nello stesso giorno 10 aliquote di ogni singolo

campione. Il dettaglio di tutti i risultati è visionabile negli allegati.

Anfetamine Norpseudoefedrina

CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml

Valore bersaglio 157.0 706.7 155.6 694.3

Media 194.6 781.7 196.5 910.0

DS 8.2 47.3 8.3 64.0

CV% 4.2 6.1 4.2 7.0

Accuratezza% 124.0 110.6 126.3 131.1

Efedrina Pseudoefedrina


Valore Bersaglio 156.5 689.3 143.6 705.2

Media 119.2 579.3 119.1 572.7

DS 3.0 35.1 2.9 34.6

CV% 2.5 6.1 2.3 6.0

Accuratezza% 76.2 84.0 83.0 81.2

Metanfetamina 3,4-MDE

3.4-MDA 3,4-MDMA



Media 151.4 656.5 205.1 888.4

DS 7.1 42.4 6.4 46.9

CV% 4.7 6.5 3.1 5.3

Accuratezza% 98.8 91.7 129.3 120.5




Media 109.7 477.7 141.4 566.1

DS 2.1 30.4 2.5 36.3

CV% 1.9 6.4 1.8 6.4

Accuratezza% 73.8 68.5 91.9 81.4

EDDP Metadone



Media 165.9 618.8 168.1 607.4

DS 4.0 67.3 8.2 43.0

CV% 2.4 10.9 4.9 7.1

Accuratezza% 76.7 87.6 106.6 97.4

BEG Cocaetilene


Valore Bersaglio 75 307.2 79.5 309.4

Media 33.1 119.5 77.0 297.9

DS 1.6 8.7 2.5 16.5

CV% 4.7 7.3 3.3 5.5

Accuratezza% 44.1 38.9 96.8 96.3

Ketamina Cocaina


Valore bersaglio 154.0 709.3 84.7 326.3

Media 152.6 671.6 97.6 394.6

DS 4.1 36.2 6.8 49.4

CV% 2.7 5.4 6.9 12.5

Accuratezza% 99.1 94.7 115.3 121.0


4.2. Interday

I risultati presenti nelle tabelle dell’Interday sono stati ottenuti con 7 misurazioni in 7 giorni

differenti. Il dettaglio dei valori ottenuti nelle singole sessioni di analisi è visionabile negli

allegati.

Efedrina Pseudoefedrina



Media 125.1 613.5 124.8 606.4

DS 4.5 25.4 3.9 25.0

CV% 3.6 4.1 3.1 4.1

Accuratezza% 80.0 89.0 86.9 86.0

Norpseudoefedrina 3,4 MDMA



Media 210.5 951.5 211.6 934.4

DS 14.0 50.6 4.4 23.4

CV% 6.6 5.3 2.1 2.5

Accuratezza% 135.3 137.0 133.4 126.7

Metanfetamina Anfetamina



Media 113.5 505.0 200.3 806.6

DS 3.8 15.5 18.0 26.5

CV% 3.4 3.1 9.0 3.3

Accuratezza% 76.4 72.4 127.6 114.1

3,4 MDA 3,4 MDE




Media 156.2 710.4 147.5 606.9

DS 14.2 26.2 7.4 24.9

CV% 9.1 3.7 5 4.1

Accuratezza% 102 99.3 95.9 87.3

Ketamina Cocaina



Media 162.0 716.9 101.1 398.3

DS 9.1 18.2 10.8 23.4

CV% 5.6 2.5 10.7 5.9

Accuratezza% 105.2 101.1 119.4 122.1

Metadone EDDP



Media 168.7 658.2 165.4 588.8

DS 22.5 82.6 40.1 223.6

CV% 13.4 12.6 8.9 6.9

Accuratezza% 107.0 105.5 82.7 95.0

BEG Cocaetilene



Media 36.6 136.8 86.0 330.2

DS 1.8 7.3 5.3 20.1

CV% 4.9 5.3 6.2 6.1

Accuratezza% 48.8 44.5 108.2 106.7


5. Discussione

5.1. Intraday

I risultati riscontrati nei calcoli dell’Intraday mostrano che, per entrambi i livelli di controllo

analizzati, i CV% di tutte le 14 molecole analizzate in questo studio sono inferiori al 12.5%.

Questo dato evidenza l’elevata precisione dell’analisi valutata sui 10 replicati.

Nonostante l’elevata precisione, il calcolo dell’accuratezza evidenzia che il 40% dei QC risulta

essere più del 20% superiore o inferiore al valore bersaglio definito dal kit indicando una scarsa

accuratezza per 12 parametri su 28.

5.2. Interday

Le campionature per la determinazione dei parametri sulla riproducibilità interday non sono

complete; infatti i risultati ottenuti sono basati su una campionatura di 7 sedute sperimentali,

sulle 10 necessarie per la completa valutazione statistica.

I primi esperimenti interday, da novembre fino a dicembre, hanno mostrato delle problematiche

di accuratezza con il kit fornito, per questo motivo abbiamo contattato la ditta Eureka per

evidenziare i problemi riscontrati, richiedendo un nuovo kit con lotto differente.

Contemporaneamente, nel mese di novembre, è stata introdotta in routine l’analisi per gli

immunosoppressori (tacrolimus, ciclosporina, sirolimus ed everolimus). Nel mese di febbraio in

aggiunta agli immunosoppressori sono stati introdotti i dosaggi di micofenolato e 22

medicamenti antiepilettici. L’elevata rilevanza clinica di queste nuove analisi, ed il tempo

richiesto per la loro effettuazione sullo spettrometro di massa, hanno ridotto drasticamente il

tempo disponibile per la validazione delle droghe d’abuso. Per questo motivo le campionature

per il lavoro di diploma sono state riprese solamente ad aprile, con conseguente inpossibilità a

completare le campionature necessarie nel tempo stabilito per eseguire lo studio.

I dati preliminari fino ad ora ottenuti possono comunque evidenziare un CV% inferiore al 13.4%,

che denota elevata precisione del kit.

I dati preliminari di accuratezza mostrano invece che, il 40% (10 su 28) dei risultati ottenuti da

entrambi i livelli per tutti e 14 analiti, hanno un’accuratezza superiore o inferiore al 20%.

Si può notare inoltre che le molecole aventi problematiche d’accuratezza, sono le stesse sia per

i risultati d’intraday che per i valori d’interday con la stessa tendenza di errore verso l’alto o

verso il basso.


6. Conclusioni

Il lavoro per verificare la validità del kit continuerà fino ad ottenere tutte le campionature

necessarie per avere i risultati completi.

I valori intraday e interday mostrano una buona precisione perché abbiamo ottenuto dei valori

inferiori al 13.4%, mentre per quanto riguarda l’accuratezza i risultati preliminari evidenziano

numerosi parametri inadeguati per un kit diagnostico.

I risultati preliminari da noi ottenuti, uniti alle valutazioni di altri utilizzatori del medesimo kit (i

quali, sugli stessi lotti non notano accuratezze anormali) ed alle indicazioni della ditta

produttrice, ci fanno ipotizzare una possibile problematica nella stabilità di alcune molecole; In

particolare anfetamina, norpseudoefedrina, cocaina, 3-4MDMA, metanfetamina, EDDP e BEG.

Il problema sembra essere dovuto alla degradazione degli analiti nella fase di giacenza durante

lo sdoganamento; questa operazione può infatti richiedere diverse ore o giorni, con un sistema

di conservazione probabilmente inadeguato. Per questo motivo al termine delle campionature e

dopo la valutazione finale di tutti i risultati, si vorrà chiarire il motivo di quest’accuratezza al di

fuori dei parametri attesi.

In conclusione l’obiettivo posto all’inizio del lavoro, cioè la validazione del kit diagnostico per le

droghe d’abuso, in particolare anfetamine, cocaine e metadone non è stato al momento

raggiunto. Gli esperimenti condotti durante il presente LD, hanno comunque permesso

l’individuazione del possibile problema, e posto le basi per la ricerca di una possibile soluzione.


7. Ringraziamenti

Ringrazio Dr. Franco Keller Capo Dipartimento di EOLAB per aver dato la possibilità di

effettuare questo lavoro di diploma, Dr. Marco Cantù per la sua disponibilità e Cinzia Benagli

per aver svolto il lavoro pratico.


8. Bibliografia

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4. Delmotte, N. (2007). Development of multidimensional liquid chromatographic methods

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9. Allegati

A. Risultati e tabelle Intraday

B. Risultati e tabelle Interday

Date Cocaina BEG Cocaetilene Metadone CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml

09.04.13 104.2 414.8 37 145.6 92.2 357.9 203.1 798.4 11.04.13 115.1 430.6 39.9 147.7 94.2 360 196.6 732.1 17.04.13 95.3 378.8 35.5 127.7 80.4 313.2 155.1 666.3 18.04.13 89.2 385.9 37.7 134.3 83.7 321.4 154.1 588 23.04.13 91.4 366.6 34.4 132.9 86.5 316.6 157.1 596.4 30.04.13 115.6 418.1 36 136.4 81 326.2 169.7 640 03.05.13 97.2 393 35.8 132.8 84.1 316.3 145.2 620

Valore bersaglio 84.7 326.3 75 307.2 79.5 309.4 157.7 623.9 Media 101.1428571 398.2571429 36.61428571 136.7714286 86.01428571 330.2285714 168.7 663.0285714 DS 10.80429809 23.36149661 1.793905025 7.264918969 5.34148187 20.06628302 22.53774612 76.982048 CV% 10.68221562 5.86593286 4.899467489 5.311722663 6.20999387 6.076483005 13.35965982 11.61066828 Accuratezza 119.4130545 122.0524495 48.81904762 44.5219494 108.1940701 106.7319235 106.9752695 106.2716095 Date Ketamina EDDP CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml

09.04.13 158.1 705.1 190.6 677.2 11.04.13 162.7 728.5 201.4 766.7 17.04.13 154.1 705.9 176.6 668.9 18.04.13 163.4 715.1 156.9 644.9 23.04.13 181.3 753 182.5 668 30.04.13 157.2 709.6 160.4 617.6 03.05.13 156.9 701.3 184.3 654.4

Valore bersaglio 154 709.3 216.4 706.3 Media 161.9571429 716.9285714 178.9571429 671.1 DS 9.14327752 18.24780483 15.89956573 46.58075425 CV% 5.645491986 2.545275157 8.884566147 6.940955782 Accuratezza 105.1669759 101.075507 82.69738579 95.01628203

2

Allegato B2

Metanfetamina Anfetamina 3,4 MDA 3,4 MDE Date CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml

09.04.13 115.7 493.6 184.3 781.1 171 698 143.2 591.8 11.04.13 115.5 530.7 206.5 839.7 135.2 714.9 152.3 646.2 17.04.13 111.2 498.6 186 811.5 144.1 724.2 139.6 606.5 18.04.13 111.5 488.5 187.3 775.6 155.4 676.4 150.2 582.6 23.04.13 119.9 521.7 235.6 831.1 174.4 757.6 160.8 637 30.04.13 108.2 497.7 204.3 824.3 162.5 710.4 141.9 594.8 03.05.13 112.2 504.4 198.3 782.7 150.9 691 144.3 589.2

Valore bersaglio 148.6 697.3 157 706.7 153.2 715.7 153.8 695.2 Media 113.4571429 505.0285714 200.3285714 806.5714286 156.2142857 710.3571429 147.4714286 606.8714286 DS 3.848314411 15.47144836 17.95371032 26.50664786 14.17808503 26.21906794 7.412987316 24.92941464 CV% 3.39186614 3.063479817 8.962131658 3.286336079 9.076048947 3.690969846 5.026727813 4.107857689 Accuratezza 76.35070179 72.42629735 127.5978162 114.1320827 101.9675494 99.25347811 95.88519413 87.29450929

Efedrina Pseudoefedrina Norpseudoefedrina 3,4 MDMA Date CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml

09.04.13 124.2 579 124.2 572.3 209.7 887.9 213.1 898.2 11.04.13 127.1 644.2 126.9 635.7 219.2 990.1 213.1 964.6 17.04.13 121.2 619.1 121.1 611.9 185.6 900.5 205.6 943.5 18.04.13 122.7 620.8 121.2 615 205.1 935.5 209.6 921.7 23.04.13 132.6 641.7 132.3 634.1 231.5 1010.6 219.7 960.6 30.04.13 123.7 604.1 123.5 597.2 213 1006.3 210.4 924.6 03.05.13 124.5 585.7 124.5 578.6 209.5 929.4 209.9 927.5

Valore bersaglio 156.5 689.3 143.6 705.2 155.6 694.3 158.7 737.5 Media 125.1428571 613.5142857 124.8142857 606.4 210.5142857 951.4714286 211.6285714 934.3857143 DS 4.499222155 25.40940958 3.861100263 25.00093332 13.98659222 50.62307492 4.367193716 23.44023809 CV% 3.595268845 4.141616613 3.093476232 4.122845204 6.644010962 5.320503948 2.063612529 2.508625478 Accuratezza 79.96348699 89.00540921 86.91802626 85.98979013 135.2919574 137.0403901 133.3513368 126.696368

1

Allegato B

Data EDDP Metadone BEG Cocaetilene 30.04.13 CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml 1° 160.4 617.6 169.7 640 36 136.4 81.6 326.2 2° 168.4 674.6 165.2 568 34.8 112.4 79.7 280.1 3° 160.1 553.8 170.8 634.9 33.8 122 76 299.4 4° 171.9 572.4 167.3 625.3 32.1 125.6 74.1 303.5 5° 167.9 610.2 174.5 538 32.6 115.1 78.7 287.9 6° 168.9 572.6 163.6 579.6 32.7 119.3 75.7 293.1 7° 168.1 648.9 156.1 665.4 34.3 114.4 75.9 301.2 8° 167.1 771.2 157.6 624 31.3 115.7 73.5 296.8 9° 163.7 548.9 184.2 641.9 32.1 127.6 78.1 319.2 10° 162.7 618.1 171.6 557.2 31.3 106.4 76.6 271.1 Valore Bersaglio 216.4 706.3 157.7 623.9 75 307.2 79.5 309.4 Media 165.92 618.83 168.06 607.43 33.1 119.49 76.99 297.85 DS 3.95103362 67.26374374 8.204361983 42.98684683 1.567730136 8.670185183 2.522542809 16.52736788 CV% 2.381288344 10.86950273 4.881805298 7.076839607 4.73634482 7.255992287 3.276455135 5.548889668 Accuratezza 76.6728281 87.61574402 106.5694356 97.36015387 44.13333333 38.89648438 96.8427673 96.26696833

Data 3,4-MDA Cocaina 30.04.13 CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml 1° 162.5 710.4 115.6 418.1 2° 149.8 627.9 96.6 437.6 3° 148.8 670 96 367.5 4° 143.1 676.4 99.3 352.1 5° 142 587.5 93.8 353.4 6° 161 646 97 350.1 7° 153 679.8 97.5 416.8 8° 145.2 672 96.9 499.7 9° 152.4 702.4 91.1 352 10° 156.5 592.6 92.6 398.5 Valore Bersaglio 153.2 715.7 84.7 326.3 Media 151.43 656.5 97.64 394.58 DS 7.070604249 42.35542731 6.774002592 49.42830498 CV% 4.669222908 6.45170256 6.937733093 12.52681458 Accuratezza 98.84464752 91.72837781 115.2774498 120.9255287

Allegato A2

2

Data 3,4-MDMA Metanfetamina 3,4-MDE Ketamina 30.04.13 CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml 1° 210.4 924.6 108.2 497.6 141.9 594.8 157.2 709.6 2° 191.1 812.6 107.8 423 142.2 515.8 155.3 628.7 3° 206.4 894.8 109 502.9 143 574.4 156.3 673.2 4° 203.4 899.8 106.3 486.3 137.8 572.7 149 688.8 5° 204.5 833.6 109 442 143.1 527.1 151.7 631.7 6° 211.5 887.1 112.6 472.7 144.3 558 156.7 657.7 7° 207 924 110.6 500.4 140.5 593.3 149.9 691.3 8° 200.7 916.2 109.9 496.2 136.7 593.2 145.5 701.3 9° 213.3 956.4 112.9 510.1 143.8 617.5 155.2 717.3 10° 203 834.6 110.2 445.9 140.7 514.5 148.7 616.3 Valore Bersaglio 158.7 737.5 148.6 697.3 153.8 695.2 154 709.3 Media 205.13 888.37 109.65 477.71 141.4 566.13 152.55 671.59 DS 6.364842671 46.89273931 2.058181506 30.39577639 2.513519003 36.25772102 4.114540612 36.18592268 CV% 3.102833652 5.278514505 1.877046517 6.362809317 1.777594769 6.404486782 2.697175098 5.388097303 Inaccuratezza 129.2564587 120.4569492 73.78869448 68.50853291 91.93758127 81.43411968 99.05844156 94.68349077

Data Anfetamine Norpseudoefedrina Efedrina Pseudoefedrina 30.04.13 CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml CQ1 ng/ml CQ2 ng/ml 1° 204.3 824.3 213 1006.3 123.7 604.1 123.5 597.2 2° 180.6 710.3 196.1 858.7 115.9 536.2 115.9 530.2 3° 198.1 782.1 201.5 917.7 120.8 584.7 120.7 578 4° 183.1 807.3 198.3 929.3 120 594.5 119.9 587.7 5° 204.5 793 200.7 824.2 121.5 539.5 121.4 533.5 6° 199 747.9 188.8 889.7 120.1 560 120 553.7 7° 198.3 819 193.6 947.5 116 599.2 116 592.3 8° 193.5 795 183.7 954.8 114.1 612.9 114.1 605.8 9° 188.6 837.5 200.4 964.1 121 630.2 120.9 622.8 10° 196.1 700.4 188.6 807.8 119.1 531.4 119 525.5 Valore Bersaglio 157 706.7 155.6 694.3 156.5 689.3 143.6 705.2 Media 194.61 781.68 196.47 910.01 119.22 579.27 119.14 572.67 DS 8.199654464 47.29326473 8.349590808 64.02762338 2.980231162 35.11815137 2.920121763 34.60064386 CV% 4.213377763 6.050207851 4.249804453 7.035925251 2.499774502 6.062484052 2.451000305 6.04198646 Accuratezza 123.955414 110.6098769 126.2660668 131.0687023 76.17891374 84.03742928 82.96657382 81.20674986

Allegato A

1

Droghe d’abuso in Spettrometria di Massa - sbt.ti.ch · test rapidi e la possibilità di dare...

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