Alimentazione e sicurezza alimentare. III Edizione.

Salerno, Camera di Commercio. 27 gennaio 2005.

Stress ossidativo ed alimentazione

Dr. Prof. Eugenio Luigi Iorio, MD, PhDDocente Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica

Seconda Università degli Studi di Napoli

Presidente del Comitato Scientifico dell’Osservatorio Internazionale dello Stress Ossidativo,

dei Radicali Liberi e dei Sistemi Antiossidanti (Parma)

Evoluzione degli organismi viventi e status redox

Cloroplasti di piante ed alghe verdi

Cloroplasti di alghe rosse Mitocondri

Batteri mobili E. coli Rhizobacteria

Solfo-batteri rossi

Solfo-batteri verdi

EUCARIOTIPROCARIOTI

Atmosfera ossidante

Atmosfera riducenteFotosintesi con H2O

Fotosintesi con H2S

Ciclo di fissazione del C

Cyanobacteria

Batteri rossi non zolfo-dipendenti

Batteri verdi filamentosi

Batteri blu-verdi

Perdita fotosintesi

Respirazione con O2 Respirazione con O2 Respirazione con O2

Batteri fermentanti ancestrali

Perdita fotosintesi

Fonti energetiche, metabolismo e status redox nel corso dell’evoluzione

OssidiFermentazionePrimi organismi viventiAnaerobiosi4 – 5 miliardi

di anni fa

OssidiFotosintesi, H2SBatteri mariniAnaerobiosi3 – 4 miliardi di anni fa

Precipitazione ossidi negli oceani con O2

Fotosintesi, H2OAlghe blu – verdiParziale anaerobiosi (1%)

1 – 2 miliardi di anni fa

Vita solo nel mareParziale anaerobiosi (17-21%)

1 miliardo di anni fa

O2 nelle acqueRespirazioneSelezione aerobia

Fotosintesi, fermenta-zione, respirazione

Metabol. aerobio, mitocondri simbiontiOzono

Apparati cardiova-scolari e respiratorio

Vantaggio energetico

Oggi

Schema generale del catabolismo cellulare

Dai processi ossidativi l’energia per la vita

NAD+

FAD

Nutrienti

Ciclo di Krebbs

Lipidicomplessi

Glicerolo Acidi grassi

Glicidi complessi

Glucosio

Glicolisi

Piruvato

Acetil-CoA

Proteine

Amminoacidi

NH3, CO2, H2O

Prodotti semplici da substrati complessi

Estrazione diequivalenti riducenti

NADH + H+

FADH2

ATP ADP+P O2 H2O

PRODUZIONE DI ENERGIA

Confronto fra anaerobiosi ed aerobiosi

In aerobiosi si produce molto più ATP che in anaerobiosi (36 vs 2, rispettivamente)

Citoplasma

GLUCOSIO

Rendimento netto

2 ATPGlicolisi

2 piruvato

2 ATP

32 ATP

Mitocondrio

Catena respiratoriaFosforilazione ossidativa

O2

6 CO2

Rendimento netto

+

H2O

Ciclo di Krebbs

2 NADH

2 NADH

6 NADH

2 FADH2

Il doppio volto dell’ossigeno

L’ossigeno, indispensabile per la vita, può diventare, in particolari condizioni, un pericolo killer

Prime evidenze sperimentali in animali da laboratorio sul possibile ruolo tossico dell’iperossia1940-1950

Disturbi respiratori fino a comparsa di lesioni alveolari dopo prolungata esposizione ad O2 puro

1954-1955 La fibroplasia retrolenticolare è provocata dall’esposizione dei neonati ad elevata pO2

1960

Molte lesioni in vivo sono provocate dalle specie reattive dell’ossigeno

Alcune specie reattive sono utili (fagocitosi)

L’invecchiamento e almeno 50 malattie sono correlate con lo STRESS OSSIDATIVO

“The free radical man”

Malattia di Alzheimer

Stroke

Aterosclerosi

Pancreatite

Infarto del miocardio

Obesità

Malattia di Parkinson

Cataratta

Artrite reumatoide

Malattia di Chron

Diabete mellito

CancroINVECCHIAMENTO

Lo STRESS OSSIDATIVO

La rottura di un equilibrio

Lo stress ossidativo è un tipo particolare di stress chimico indotto dalla presenza, in un organismo vivente, di un eccesso di specie chimiche reattive, generalmente centrate sull’ossigeno (reactive oxygen species, ROS), secondario ad un’aumentata produzionedelle stesse e/o a una ridotta efficienza dei fisiologici sistemi di difesa antiossidanti.

Radicali liberiAntiossidantiProtezione dalle malattie

Danno cellulare(invecchiamento

e malattie)Radicali liberiAntiossidanti Radicali liberiAntiossidantiProtezione

dalle malattieDanno cellulare

(invecchiamento e malattie)

Protezione dalle malattieProtezione

dalle malattieDanno cellulare

(invecchiamento e malattie)

Danno cellulare(invecchiamento

e malattie)

O3Ozono

H2O2Perossido di idrogeno

1O2*Ossigeno singoletto

Varietà non radicaliche

HO•Radicale idrossile

ROO•Radicale idroperossile

O2•Anione superossido

Varietà radicaliche

Specie reattive dell’ossigeno

Attività ossidante

Principali specie reattive dell’ossigeno di interesse biologico

Tutte le specie reattive dell’ossigeno, radicalichee non radicaliche, possiedono attività ossidante

Le specie chimiche reattive, radicaliche o meno, agiscono generalmente come ossidanti

L’ossidazione, ovvero il trasferimento di uno o piùelettroni, è la base chimica dello stress ossidativo

++Radicale

(ossidante)

A A

Nuova molecola (ridotta, stabile)

Molecola bersaglio(es. doppio legame C-C)

C C

Nuovo radicale(ossidante)

CC

Elettrone spaiatoOSSIDAZIONE

H2O2 + HCl → H2O + HClO-1

-1

-2

+1

RIDUZIONE

OSSIDAZIONE

OSSIDANTE

RIDUCENTE

Acquisizione elettroni

Cessione elettroni

I radicali liberi possono innescare reazioni a catena

Inizio

Propagazione

Termine

Interazione con metalli di transizione

AO : OB

AO• + OB-Fe3+

Fe2+

Scissione di perossidiRO : OR

RO• + •OR

+hν

CH2 =CH–

R–CH2 –CH* –

AddizioneR•

= C = C =

Frammentazione

R •

R:C – C*=

A : B+hν

Fotolisi/pirolisi

A• + •B

Scissione di azocompostiRN : : NR

R• + •R

– N2

R : H

A : H

A•Trasferimento

R•

Ri-arrangiamentoR:C – C*=

=C* – C:R

Combinazione

A : B

A• + •BDisproporzione

+

– C –

– C • –

– C –

– C • –+

– C =

– C =

– C –

– C –

Nei viventi, agenti fisici, chimici e biologici sono la causa dell’innesco di reazioni radicaliche a catena

L’esempio della fotolisi dell’acqua

Produzione di ROS

rUV, rX, radiazioni ionizzanti

Virus (HIV), Batteri

Inquinanti, idrocarburi aromatici, pesticidi, farmaci

Agenti fisici

Agenti biologici

Agenti chimici

+

Acqua

O HH

Radicale idrogeno

H

Radicale idrossile

OHUV +

Acqua

O HH

Acqua

O HH O HH

Radicale idrogeno

H

Radicale idrogeno

HH

Radicale idrossile

OH

Radicale idrossile

OH OHUVUV

Numerose attività metaboliche sono in grado di generare ROS

I ROS sono quasi insostituibili “compagni di viaggio” della vita cellulare

Citocromo P450Citocromo b5

NADH deidrogenasiCitocromo ossidasi

NADPH ossidasiLipoossigenasi

Xantina ossidasi Aldeide ossidasi

Produzione di ROS nella plasmamembrana: l’esempio dei leucociti polimorfonucleati

NADPH ossidasiNADPH + O2 → NADP. + H+ + O2

.

NADP. + O2 → NADP+ + O2.

Superossido-dismutasi (SOD)2 O2

. + 2 H+ → H2 O2 + O2

Catalasi (CAT)2 H2O2 → 2H2O + O2

Mieloperossidasi (MPx)HCl + H2O2 → H2O + HClO

Glutatione perossidasi (GPx)2 GSH + H2O2 → 2H2O + GSSG

Batteri, endotosine, anticorpi

Generazione di NADPH + H+

Ossidazione diretta del glucosio

Attivazione NADPH ossidasi

↑ Captazione ossigeno

↑ Disponibilitàossigeno

O2.

H2O2

H2O

SOD

CAT, GPx

HClOMPx

Ruolo del processo flogistico nella patogenesi del danno tissutale da radicali liberi

L’attivazione dei leucociti polimorfonucleati

PLA2

PL AA PG

Proteases

O2O2

.

NADPH-Ox

H2O2

HClO OH.

SOD

MPxCl-

Fe/CuFenton/HW

ROOH

R-NHClR-NH2

Batteri, LPS, Ig Fe/Cu RO•/ROO •

Produzione di ROS nei mitocondri

La catena respiratoria normalmente produce piccole quantità di ROS

O2.O2 H2O2 HO. H2O

1e- 1e-

2 H+

1e- 1e-

1H+

Riduzione tetravalente (“la regola”)

Riduzione bivalenteRiduzione univalente

Riduzione bivalente

Riduzione univalente

Riduzioni uni- e bi-valente (“le eccezioni”)

O2.O2 H2O2 HO. H2O

1e- 1e-

2 H+

1e- 1e-

1H+

Riduzione tetravalente (“la regola”)

Riduzione bivalenteRiduzione univalente

Riduzione bivalente

Riduzione univalente

Riduzioni uni- e bi-valente (“le eccezioni”)

O2.O2 H2O2 HO. H2O

1e- 1e-

2 H+

1e- 1e-

1H+

Riduzione tetravalente (“la regola”)

Riduzione bivalenteRiduzione univalente

Riduzione bivalente

Riduzione univalente

Riduzioni uni- e bi-valente (“le eccezioni”)

Produzione di ROS nei microsomi

Processi ossidativi microsomiali sono all’origine della produzione di radicali liberi lesivi

Radicali liberi lesivi generati da alcune sostanze chimiche mediante processi ossidativi microsomiali Agente chimico Funzione Radicale generato Organo bersaglio/patologia

Tetracloruro di C Lavasecco •CCl3 Fegato Paraquat Erbicida R+•, O2

• Polmoni (fibrosi polmonare) FeSO4 Contaminante alimentare HO• Sovraccarico marziale O2 Ossigenoterapia HO•, O2

• Lesioni oculari (prematuri) Alotano Anestetico •CHClCF3 - Daunomicina Chemioterapico antineoplastico Q•, O2

• Cuore Adriamicina Chemioterapico antineoplastico Q•, O2

• Cuore Mitomicina C Chemioterapico antineoplastico Q•, O2

• Cuore Nitrofurantoina Antibatterico RNO2

•, O2• Polmoni (edema polmonare)

Nitrofurazone Antibatterico RNO2•, O2

• Polmoni (edema polmonare) Metronidazolo Anti-infettivo RNO2

•, O2• Polmoni (edema polmonare)

Il ruolo chiave della xantina deidrogenasi

La xantina ossidasi catalizza la formazione di anione superossido e perossido di idrogeno nel citosol

← Xantina ossidasi →

XantinaIpoxantina

H2O2H2O + O2

Acido uricoXantina

O2•O2

Xantina deidrogenasi

Le specie reattive sono direttamente coinvolte nella patogenesi del danno da ischemia-riperfusione

Disponibilità ossigeno ↓

Stato ridotto mitocondri ↑

Fosforilazione ossidativa↓

Ipoxantina Xantina Acido urico

H2O2↑ O2. ↑

Creatina-P↓

Creatina ↑ Osmolarità ↑Glicolisi anaerobica ↑

Lattato ↑

Inosina ↑

Sintesi ATP ↓

ADP ↑

AMP ↑

IMP ↑

Danno membrana

Deficit pompe

Calcio ↑citosolico

Deficit pompe

Alterazioni omeostasi ionica

Attivazione proteasi

Xantina deidrogenasi

Xantina Ossidasi

DecompartimentalizzazioneDisorganizzazione citoscheletro

Macroischemia

Infarto, bypass, trapianti

Sedentarietà

MicroischemiapO2 ↓

Acidosi

Rilascio Fe2+/3+

dalle proteine

ROO• RO•Amplificazione del danno

ROOH

Vaso sanguigno

Cellula

ROOH↑

Attacco substrati organici

Antiossidanti preventivi

Gli antiossidanti preventivi prevengono la formazione dei radicali liberi

Classe Esempi Meccanismo d’azioneTransferrina, lattoferrina, ferritina Sequestro di ferro Aptoglobina Sequestro di emoglobina Emopessina Stabilizzazione dell’eme

Sequestratori di metalli

Ceruloplasmina, albumina Sequestro di rame Carotenoidi Quenching dell’ossigeno singoletto “Quencher”

di ROS Superossido dismutasi 2O2• + 2H+ → H2O2 + O2

Catalasi

2 H2O2 → 2 H2O + O2

Perossidasi H2O2 + AH2 → 2 H2O + A LOOH + AH2 → LOH + H2O + A

Glutatione perossidasi (plasmatica)

PLOOH+2GSH→PLOH+H2O+GSSG

Glutatione perossidasi (dei perossidi fosfolipidici)

H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GS–SG PLOOH+2GSH→PLOH+H2O+GSSG

Glutatione perossidasi (intracellulare)

H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GS–SG LOOH+2GSH → LOH+H2O+GS–SG

Inattivatori di perossidi

Glutatione–S–trasferasi Scissione dei perossidi lipidici

La barriera antiossidante plasmatica previene il danno ossidativo cellulare bloccando i ROS nel sangue

I gruppi tiolici (-SH) sono componenti qualitativamenteimportanti della barriera antiossidante plasmatica

-SH Altri gruppi chimiciROS

Il sistema antiossidante è regolarmente distribuito nella cellula

Gli antiossidanti lipofili presenti nelle membrane costituiscono la prima linea di difesa contro i ROS

Vitamina E, PUFA, β−carotene

Vitamina E, β−carotene

Glutatione, GPx, SOD, selenio, ascorbato,

Ubichinolo, selenio, vitamina E, SOD, GPx

Catalasi

Lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra processi proossidanti e processi antiossidanti

Le specie chimiche reattive possono essere sia la causa che l’effetto dello STRESS OSSIDATIVO

Specie reattive ↑ Difese antiossidanti ↓

Radiazioni,farmaci, metalli pesantiFumo di sigaretta, alcool, inquinamentoEsercizio fisico inadeguato, sedentarietà

Infezioni ed altre malattie

Ridotta assunzionee/o diminuita sintesi

e/o ridotta capacità di utilizzazione e/o aumentato consumo di antiossidanti

Danno cellulare

Malattie cardiovascolari

Invecchiamento precoce

Altre malattie

Demenza, M. di Parkinson

Infiammazioni,tumori

Il danno ossidativo è la conseguenza di un processo articolato in diverse fasi

ROS, ROMs e metalli di transizione sono responsabili di alterazioni strutturali e/o funzionali della cellula

2. Attacco di substrati organici (es. lipidi, amminoacidi, nucleotidi, etc.)

3. Formazione di idroperossidi R-OOH

5. Alterazioni funzionali/strutturali della cellula (apoptosi, necrosi)

Agenti esterni

Superamento sistemi antiossidanti

4. Generazione di radicali alcossilici R-O•/ idroperossilici R-OO•

O2

Fe/Cu

1. Generazione di ROS (O2 •, HO•, 1O2*, H2O2 )

Attività metabolica

Gli idroperossidi (ROOH) rappresentano non solo i marker ma anche gli amplicatori del danno cellulare

Gli idroperossidi presenti nel sangue costituiscono le specie chimiche rilevate dal d-ROMs test

Agenti esterniAttività metabolica

.OH

RH

H2O

R.

O2 ROO.

R1H ROOH

R1 .

Danno ossidativo

Respirazione

Cellula

Danno ossidativo

Nucleo

Citoplasma

Vaso sanguigno

ROOH

Cellula

R-O-O-H R-O.

Fe3+Fe2+

R-O-O. R-O-O-H

H+

OH-

pH ↓

Danno endoteliale

Ossidazione LDL

Matrice extracellulare

Gli effetti dello stress ossidativo sulla struttura e sulle funzioni cellulari

Bersaglio dell’attacco dei ROS sono non solo i lipidima qualsiasi biomolecola presente nella cellula

Cellula normale(senza lesioni)

Cellula dopo l’attacco dei ROS

Perossidazione di lipidi

Modificazioni enzimatiche

Lesioni del DNA

Rottura di proteine

Perossidazione ammi-noacidi e proteine

(Per)ossidazione di carboidrati

Alterazioni dell’omeostasi ionica

La matrice cellulare: uno dei principali target delle specie reattive dell’ossigeno

Il danno della matrice extracellulare gioca un ruolo determinante nella patogenesi dello stress ossidativo

EX

TRA

CE

LLULA

R M

ATR

IXa

b1

2

3

4

5

fibronectin6

7

8

Disfunzione endoteliale

Fattori di rischio

L’ossido nitrico. The molecule of the year 1992 (Science)

Le proprietà biologiche dell’ossido nitrico dipendono essenzialmente dalla sua natura radicalica

La biosintesi dell’ossido nitrico

La biosintesi dell’ossido nitrico è catalizzata dall’enzima ossido nitrico sintetasi (NOS)

NADPHO2

NO+

NH

NHH2N

H3N+ COO-

L-arginina

NADPHO2

NH

N–OHH2N

H3N+ COO-

NH

OH2N

H3N+ COO-

N-idrossiarginina L-citrullina

Meccanismo d’azione dell’ossido nitrico

Interazioni tra cellule endoteliali, piastrine e fibrocellule muscolari lisce

Ruolo dell’ossido nitrico nell’erezione

Interazioni tra neuroni e fibrocellule muscolari lisce

LumeLumevascolarevascolare

Muscolatura lisciaMuscolatura liscia

Neurone NANCNeurone NANCCorpus Corpus CavernosumCavernosum

Potenziale d’azione

L-arginina L-Citrullina +nNOS

Ca-CAM

Ca2+

NONO

LumeLumevascolarevascolare

Muscolatura lisciaMuscolatura liscia

Neurone NANCNeurone NANCCorpus Corpus CavernosumCavernosum

Potenziale d’azione

L-arginina L-Citrullina +nNOS

Ca-CAM

Ca2+

NONO

Ossido nitrico e disfunzione erettile

Meccanismi di trasduzione del segnale

ArgininaArginina NONO + + CitrullinaCitrullinanNOSnNOS

GTP cGMP + PPiGTP cGMP + PPiG. G. ciclasiciclasi

5’5’--GMPGMP

PDEPDE--55SildenafilSildenafil

RILASCIAMENTORILASCIAMENTO

ArgininaArginina NONO + + CitrullinaCitrullinanNOSnNOS

GTP cGMP + PPiGTP cGMP + PPiG. G. ciclasiciclasi

5’5’--GMPGMP

PDEPDE--55SildenafilSildenafil

RILASCIAMENTORILASCIAMENTO

Il professore Louis Ignarro, Premio Nobel per la Medicina/Fisiologia 1998

“Per le sue scoperte riguardanti l’ossido nitrico come molecola segnale nel sistema cardiovascolare”

Ossido nitrico e disfunzione erettile

… per ridere un po’

Lo spettro d’azione dell’ossido nitrico

Un mediatore importante coinvolto in numerose funzioni di vitale importanza

NONO

CardioVascularCardioVascular

AntiAnti--InflammatoryInflammatory

Host DefenseHost Defense

CNSCNS

PulmonaryPulmonary

GastroGastro--intestinalintestinal

GenitoGenito--urinaryurinary

ManyManyOthersOthers

NONO

CardioVascularCardioVascular

AntiAnti--InflammatoryInflammatory

Host DefenseHost Defense

CNSCNS

PulmonaryPulmonary

GastroGastro--intestinalintestinal

GenitoGenito--urinaryurinary

ManyManyOthersOthers

Ossido nitrico, stress ossidativo e malattie

Lo stress ossidativo riduce la “biodisponibilità” di NO e aumenta il livello di perossinitrito (ONOO-) “tossico”

FUNZIONI NORMALI

⇔O2•

NO•

NOSL-arg

FUNZIONI ALTERATE

⇑O2•

NO•

NOSL-arg

ONOO-

Ossido nitrico, stress ossidativo ed omocisteina

L’iperomocisteinemia è un importante fattore di rischio cardiovascolare

Il processo aterogenetico

Un processo ad esordio pre-natale

Basi biochimiche del processo aterogenetico (1)

Ruolo dello stress ossidativo e della dislipidemia

Basi biochimiche del processo aterogenetico (2)

Il ruolo del diabete

Basi biochimiche del processo aterogenetico (3)

Il ruolo dei fattori genetici

Dalla disfunzione endoteliale alla lesione ateromatosa

Riequilibrare un bilancio alterato

Aspirina,anticoagulanti,ACE-I, Ca-Ant

Nitrati, Ca-Ant, Statine, ACE-I, ARBs,

β-bloccanti

Formazione di trombi Vasocostrizione

Ipolipidemizzanti,ACE-inibitori, ARBs,Ca-Antagonisti, β-bl

Modifichestrutturali

Antiossidanti?NO-modulatori?

Danno ossidativo

Lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra processi proossidanti e processi antiossidanti

Le specie chimiche reattive possono essere sia la causa che l’effetto dello STRESS OSSIDATIVO

Specie reattive ↑ Difese antiossidanti ↓

Radiazioni,farmaci, metalli pesantiFumo di sigaretta, alcool, inquinamentoEsercizio fisico inadeguato, sedentarietà

Infezioni ed altre malattie

Ridotta assunzionee/o diminuita sintesi

e/o ridotta capacità di utilizzazione e/o aumentato consumo di antiossidanti

Danno cellulare

Malattie cardiovascolari

Invecchiamento precoce

Altre malattie

Demenza, M. di Parkinson

Infiammazioni,tumori

Cause di aumentata produzione di specie reattive

Diversi fattori fisiologici e patologici sono coinvolti nella generazione dei ROS

Farmacoterapia, radioterapia, raggi XFattori iatrogeni

Traumi, infiammazioni, infezioni, patologieda ischemia-riperfusione, neoplasie

Malattia

Stress psico-emotivo (?)Fattori psicologici

Alimentazione, alcool, fumo di sigaretta, esercizio fisico incongruoStile di vita

GravidanzaStati fisiologici

Inquinamento, radiazioniAmbiente

Cause di riduzione delle difese antiossidanti

Fattori genetici e ambientali possono contribuire alle alterazioni del sistema antiossidante

Sovraccarico del sistema microsomialeAssunzione di farmaci

Eccessiva produzione di specie reattive Eccessivo consumo di antiossidanti

Fattori genetici o iatrogeniInsufficienza dei sistemi enzimatici antiossidanti

Deficit dei meccanismi di captazione o di trasporto

Ridotta capacità di utilizzazione di antiossidanti

Sindromi da malassorbimento, malattia celiaca

Ridotto assorbimento di antiossidanti

Ipovitaminosi, diete monotoneRidotta assunzione di antiossidanti

Le differenti fonti cellulari di ROS sono responsabili dei differenti meccanismi dello stress ossidativo

Quattro fonti cellulari di ROS per almenoquattro meccanismi basilari di stress ossidativo

Stress ossidativoda modificazioni reattivedella superficie cellulare

Stress ossidativo da induzione

farmacometabolica

Stress ossidativo da variazioni

intracellulari della pO2

Stress ossidativoda ridotta efficienza del-la respirazione cellulare

Citocromo P450Citocromo b5

Xantina ossidasi Aldeide ossidasi

NADPH ossidasiLipoossigenasi

NADH deidrogenasiCitotocromo ossidasi

Assessing to monitor and to prevent oxidative stress

Tokyo, June 2004

Assessing to monitor and to prevent oxidative stress

Tokyo, June 2004

In the field of oxidative stress the basic research is in a very advanced phase, while the clinical practice “marks time”. Therefore, the definitive “entry” of the whole oxidative stress background into the “arsenal” of healthy professionals, including clinicians, pharmacists and other therapists must be encouraged.

In particular, any clinician should examine any subject at risk or suffering from oxidative stress with specific analyses able to identify and circumstantially define the true status of the systemic/local oxidative balance (production/elimination ratio of chemically reactive species).

This new behavior of healthy professionals is the right premise not only for any antioxidant therapy prescription, when indicated, but also for a correct monitoring of either specific or antioxidant systemic/topical treatments, for a better patient’s quality of life.

Geni, stress ossidativo ed aterosclerosi (1)

Le nuove tecnologie

Geni, stress ossidativo ed aterosclerosi (2)

L’analisi genica

Napoli C, Lerman A, Sica V, & de Nigris F.MICROARRAY ANALYSIS: A NOVEL RESEARCH TOOL

FOR CARDIOVASCULAR SCIENTISTS AND PHYSICIANS. HEART 2003; 89:597-604.

CAMPIONI (laser capturing)

Tessutosano

Lesioni Ateroscl.

MICROARRAYCHIP GENE ANALYSIS

STRESS OSSIDATIVO: la rottura di un equilibrio

Gli idroperossidi sono marker ed amplificatoridelle lesioni da STRESS OSSIDATIVO

Aumentata produzione di ROS (O2

., HO., H2O2,…)Compromissione della barriera antiossidante (vit. C, vit. E,…)

Perossidazione di biomolecole con produzione di idroperossidi

R-OOH(una classe di ROM)

IDROPEROSSIDI (MARKER ED AMPLIFICATORI DEL DANNO)NEI LIQUIDI EXTRACELLULARI

INVECCHIAMENTO E PATOLOGIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO (ictus, infarto, diabete, demenza, m. di Parkinson, cancro, …)

I test

STRESS OSSIDATIVO:valutare per riequilibrare

VALUTAZIONE GLOBALE DELLO STRESS OSSIDATIVO

Valutare l’ “attacco” Valutare la “difesa”

PREVENZIONE E MONITORAGGIODELLE MALATTIE CORRELATE CON LO STRESS OSSIDATIVO

d-ROMs test, MDA, LPO, F2-isoprostani plasmatici,…

OXY-Adsorbent test, FRAP, BAP test, TAS, -SHp test…

La valutazione globale dello stress ossidativo nella sindrome di Down

Aumentati livelli di ROM e ridotto spessore della barriera antiossidante nei soggetti Down

Car

rate

lliM

( , P

orca

ro L

, R

usci

caM

) , D

e S

imon

e E) ,

Ber

telli

Aae

, Cor

si M

mIn

tJ C

lin P

harm

Res

. Xxi

(2) 7

9-84

(200

1)

Status antiossidanteStatus proossidante

d-ROMs test

Controlli (n=20)

Down (n=40)

500

0

100

200

300

400

U C

ARR

800

600

700

p<0,05500

0

100

200

300

400

µmol

i/L

800

600

700

OXY-ADS test

Controlli (n=20)

Down (n=40)

500

0

100

200

300

400µm

oli H

ClO

/mL

800

600

700

p<0,05

-SHp test

Controlli (n=20)

Down (n=40)

p<0,05

Test comunementi impiegati per valutare lo stress ossidativo attraverso la perossidazione lipidica

Acido arachidonico radicale

1114

13

1215

16

R18

R2

1114

13

1215

16

R1

Acido arachidonico radicale

8

R2

HO*H2O

Electron transfer

O2

RHR*

Radicale perossilico

1114

13

12

15

16

OOR1

8

R2

Perossido ciclico

1114

13

12

15

16

OOR1

8

R2

IDROPEROSSIDO

1114

13

12

15

16

OHOR1

8

R2

Acido arachidonico

1114

13

1215

16

R18

R2

O2

O2

d–ROMs test

PENTANOCHOCHO

MDA

TBAR test

Misurazione diretta UV

11

14

13

12

15

16

R1

Diene coniugato

8

R2

Misurazione diretta MS

Endoperossido ciclico

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12

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14

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Il principio del d-ROMs test

Know-how e sviluppo tutto italiano

1A) R–OOH + Fe2+ → R–O• + Fe3+ + OH-

1B) R–O• + A–NH2 → R–O- + [A–NH2•]+

2A) R–OOH + Fe3+ → R–OO• + Fe2+ + H+

2B) R – OO• + A – NH2 → R-OO- + [A–NH2•]+

• R–OOH è un generico idroperossido( es. da lipidi, amminoacidi…)• R-O • è il radicale alcossilico di un generico idroperossido• R-OO* è il radicale perossilico di un generico idroperossido• A-NH2 è la N, N-dietil-parafenilendiammina (cromogeno, DEPPD) • [A-NH2

•]+ è il radicale catione, colorato, della DEPPD

La procedura di esecuzione del d-ROMs test (I)

Fasi 1-3

21 3

Procedura: Un campione di sangue intero è raccolto, per digito-puntura, in un capillare (1), il quale è immerso in una provetta contenente una soluzione acida tamponata (2). Dopo aver tappato accuratamente la provetta, si procede ad una delicata agitazione (3).Spiegazione: le proteine del siero e, in particolare, la trasferrina liberano, in ambiente acido, ioni ferro, i quali catalizzano la trasformazione degli idroperossidi inizialmente presenti nel campione in radicali alcossilici e perossilici, secondo le reazioni:A) R-O-O-H (idroperossido) + Fe2+→ R-O• (radicale alcossilico) + Fe3+ + OH-

e/o B) R-O-O-H (idroperossido) + Fe3+→ R-O-O• (radicale perossilico) + Fe2+ + H+

La procedura di esecuzione del d-ROMs test (II)

Fasi 4-6

54 6

Procedura: la soluzione tamponata di sangue intero è versata, senza il capillare, in una cuvetta (4), alla quale si aggiunge una goccia di cromogeno (5). La cuvetta è tappata e delicatamente agitata (6).Spiegazione: il cromogeno, la N,N-dietil-parafenilendiammina, che è inizialmente incolore, a contattocon i radicali alcossilici e perossilici precedentemente generati nel campione di sangue, si ossida a spesedi questi ultimi, cedendo elettroni, e, quindi, si trasforma nel corrispondente radicale catione (colorato), secondo le reazioni:

C) R-O + A-NH2 → R-O• + [A-NH2 •]+ e/o D) R-O-O + A-NH2 → R-O-O• + [A-NH2

•]+dove:

• A-NH2 è il substrato cromogeno (la N,N-dietil-parafenilendiammina), e • [A-NH2

•]+ è il radicale catione (colorato in rosso) del substrato cromogeno.

La procedura di esecuzione del d-ROMs test (III)

Fasi 7-9

Procedura:la cuvetta viene centrifugata (7) e, quindi, sottoposta a lettura fotometrica (8). I risultati del test sono visualizzati sul display e, quindi, stampati (9).Spiegazione: la centrifugazione del campione è resa indispensabile perchè a causa dellatorbidità della soluzione e dell’intenso colore rosso del sangue, non è possibile apprezzare il colore rosso del substrato cromogeno ossidato. Il fotometro, opportunamente tarato, trasformerà l’intensità del colore rilevato in termini di variazione di assorbanza a 505 nm. Tale variazione, proporzionale alla quantità di radicali generati in vitro e, in definitiva, alla concentrazione di idroperossidi inizialmente presenti nel campione di sangue, saràespressa in unità CARR.

87 9

Acropolis Fitness Center – Salerno, 31 gennaio ore 21

Un appuntamento da non perdere

Dimagrire allenandosicon il fitness anti-stress

I resultati del d-ROMs test, che indicano i livelli ematici degli idroperossidii quali, a loro volta, correlano direttamente con i livelli di radicali liberi,

sono espressi in termini di unità convenzionali di concentrazione (U CARR)

Valori di riferimento nella popolazione normale:

250-300 U CARRcioè 20.08-24.00 mg/dL di H2O2

Un aumento progressivo delle U CARR indica una gravità progressivamente crescente di stress ossidativo

d-ROMs test: interpretazione dei risultati

1 U CARR = 0.08 mg/dL H2O2

La valutazione globale dello stress ossidativoin medicina veterinaria

Valutazione globale dello stress ossidativo nelle mucche da latte nel peri-partum

-30 -15 0 +15 +30 +45 Parto Giorni

GPx (UI/mL)ROMs (U CARR)TAS (mmol/L) SOD (UI/mL)

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997.

P 2

03-4.

Stato dell’arte e prospettive future in tema di nutrizione ed integrazione antiossidante

Potenziale utilità dei test per la valutazione dello stress ossidativo

Attività anti-ossidanteStato pro-ossidante

Campioni biologici

Valutazione su

Prima dell’uso

Valutazione su

Se idoneo

Oli, eccipienti… Ortaggi, bevande…

Stato ossidativo ↓ Potenziale antioss. ↑

“Olea prima omnium arborum est” [Columella, De Rustica, 100 A. C.]

“Fra tutti gli alberi il più importante è l’ulivo”

L’olio di oliva: produzione e indici di qualità

L’olio extravergine di oliva è un’importante fonte diantiossidanti, quali tocoferoli e polifenoli

Numero di perossidi

Distribuzione del titolo di perossidi in un campionedi 20 oli extravergine di oliva testati in supermarket

Il titolo dei perossidi è uno dei più importanti indici della qualità nutrizionale di un’olio d’oliva

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Suggerimenti per la commercializzazionedi un buon olio di oliva

Conservare sempre l’olio in presenza di basse con-centrazioni di ossigeno e lontano dalla luce solare

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9.

Potere filtrante della luce (%)

Nei sacchetti destinati alla nutrizione parenterale si verificano rapidi fenomeni di perossidazione

Utilità del dosaggio dei lipoperossidi nella nutrizione parenterale

Piro

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2003

. 19:

784

–78

8.

L’assunzione di perossidi con l’alimentazione: Un possibile fattore di rischio per l’aterosclerosi

Wolff SP, et Al. Atherosclerosis. 1996. 119: 261-263

Valutazione dell’attività antiossidante totale dialcuni ortaggi e frutti mediante OXY-Adsorbent test

Più elevata attività antiossidante in alcuni ortaggi rispetto ad alcuni comuni frutti

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Mean values (n=10 determinations)

PEPPER TOMATO LEEK SAVOY

The normal level of antioxidant plasma barrier

I pomodori San Marzano: bentornato RE POMODORO

I pomodori sono una preziosa fonte di antiossidanti, quali caroteni e licopene

I pomodori San Marzano: bentornato RE POMODORO

I pomodori sono una preziosa fonte di antiossidanti, quali caroteni e licopene

Vegetables (tomato) vs. fruits (lemon): the different significance of OXY-adsorbent test vs. BAP test

Most vegetable show compared to fruits higher OXY-Adsorbent test and lower BAP test

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Mean values ±SD (n=10 determinations)

Attività antiossidante del “Morellino di Scansano”vs. comune bianco da tavola

Una delle possibili spiegazione del “paradosso francese”

Carr

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Mean values (n=10 determinations)

Red wineWhite wine0

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Relationships between oxidative stress and rearing conditions of selected animals for human nutrition

Usefulness of oxidative status assessment in veterinary medicine and food quality/safety

1. Low peroxidation level and good taste and nutrional quality of meat fromchichens reared according to the organic system (BIO). Castellini C, et al. Ital Anim Sci. 2002. 1: 291-300.

2. Dietary linolenic acid and vitamin E affect the fatty acid composition, storage stability and sensory traits of rabbit meat. Dal Bosco A et al. Meat Science. 2004. 66: 407-413.

3. Vitamin E supplementation reduces oxidative stress in growing pigs. Brambilla G, et al. J Vet Med A. 2001. 48: 33-38.

4. Low levels of oxidative stress in Cinta Senese Pigs, a historical breed free-range reared in Siena countryside. Ballerini A, et al. Journal of Veterinary Medicine A. 2003. 50 (3): 113.

5. Oxidative stress is a bio-marker of estrogen exposure in healthy veal calves.Brambilla G, et al. Analytica Chimica Acta. 2003. 483: 281–288.

Stato dell’arte e prospettive future in tema di nutrizione ed integrazione antiossidante

Potenziale utilità dei test per la valutazione dello stress ossidativo

Attività anti-ossidanteStato pro-ossidante

Campioni biologici

Valutazione su

Prima dell’uso

Valutazione su

Se idoneo

Oli, eccipienti… Ortaggi, bevande…

Stato ossidativo ↓ Potenziale antioss. ↑

Le differenti fonti cellulari di ROS sono responsabili dei differenti meccanismi dello stress ossidativo

Quattro fonti cellulari di ROS per almenoquattro meccanismi basilari di stress ossidativo

Stress ossidativoda modificazioni reattivedella superficie cellulare

Stress ossidativo da induzione

farmacometabolica

Stress ossidativo da variazioni

intracellulari della pO2

Stress ossidativoda ridotta efficienza del-la respirazione cellulare

Citocromo P450Citocromo b5

Xantina ossidasi Aldeide ossidasi

NADPH ossidasiLipoossigenasi

NADH deidrogenasiCitotocromo ossidasi

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1.

Gli obesi (BMI>30) livelli significativamente piùelevati di ROM rispetto ai controlli (BMI<23)

Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stile di vita e prevenire le conseguenze dell’obesità

BMI>30(n=12)

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Riduzione significativa del livello di ROS con riposo e antiossidanti dopo un gara ciclistica di gran fondo *

Il d-ROMs test è utilissimo per monitorare lo stress ossidativo e la terapia antiossidante negli atleti

*150 kmDopo 10 giorni di terapia (n=6)

p ≤ 0.001 vs riposo iniziale0

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Subito dopo lacorsa (n=12)

2 giorni dopo la corsa (n=6)

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Livelli significativamente più elevati di ROM nei forti bevitori rispetto ai non bevitori

Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stile di vita e prevenire le conseguenze dell’alcool

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Forti bevitori(n=45)

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3-18

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Le donne che assumono contraccettivi orali hanno livelli significativamente elevati di ROM nel siero

Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stile di vita e per prevenire le coseguenze legate alla pillola

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Integrazione antiossidante: una reale necessità?

Con il “padre” degli antiossidanti, l’americano Lester Packer, a Milano e con l’inventore del d-ROMs test, Mauro Carratelli,

in un supermarket di San Francisco (CA, USA)

Assessment of food supplementation bioavailability using the d-ROMs test as a marker of oxidative stress

Cornelli U, et Al. J Nutr. 2001. 131: 3208-3211

La composizione di un comune integratore

Una miscela efficace di antiossidanti

1 mgVitamin B6

48 µgSelenium5 mgZinc10 mgL-cysteine30 mgFlavonoids (from citrus)20 mgCoenzyme Q10

30 mgVitamin C0.05 mgβ-carotene0.4 mgVitamin A5 mgVitamin E

DoseIngredienti

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7-13

0La terapia antiossidante riduce significativamente lo stress ossidativo nelle vasculopatie periferiche

Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stress ossidativo nel corso della terapia antiossidante

Controlli (n=12)Pazienti (n=15)

Dopo la terapiaPrima della terapia0

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Ruolo protettivo di classici NO-donatori e della ni-troaspirina sulla generazione di ROS da riperfusione

Il d-ROMs test è utile per monitorare trattamentispecifici nello stress ossidativo da isch-riperfusione

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Dopo 30’ IS. Dopo 5’ RIP. Dopo 15’ RIP. Dopo 30’ RIP.

Fisiol. NO-ASA DETA-NO *p < 0.05 fisiol vs. basale°p < 0.05 NO-ASA e DETA-NO vs. fisiol.

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La terapia antiossidante riduce significativamente il livello di stress ossidativo nella demenza senile

Utilità del d-ROMs test nel monitoraggio dello stress ossidativo in pazienti con malattia di Alzheimer

p<0.01 (pz vs contr)p<0.05 (prima vs dopo)

Controlli (n=11)Pazienti (n=11)

Dopo la terapiaPrima della terapia0

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p<0,01p<0,01

Alla ricerca dell’elisir di lunga vita

Il ruolo delle medicine alternative e complementari

Riduzione significativa (30-40%) del livello di ROM dopo terapia antiossidante nel photo-aging

Utilità della valutazione dei ROM nel monitoraggio dello stress ossidativo nel photo-aging

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Settimana 2 Settimana 4 Settimana 6P<0,005 per ambedue i gruppis vs. basale

Settimana 8

Terapia L+S (n=10) Terapia S (n=10) NO antiossidanti (n=10)

L: acido α-lipoico (0.5 mg) + melatonina/emblica (15 mg), gel nano-colloidale S: ascorbato (45 mg) + tocoferolo (5 mg) + luteina (3 mg) + α-lip. (2.5 mg) caps.

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465.

La terapia idropinica, specie se associata a fango-balneoterapia, riduce il livello di stress ossidativo

Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stress ossidativo nel corso di trattamenti termali

SOLO TI (n=19)TI + FBT (n=16)

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Nel diabete, un regolare regime dietetico riducesignificativamente il livello di stress ossidativo

Il d-ROMs test è utile per monitorare lo stress ossidativo e le sue conseguenze nei diabetici

Controlli (n=12)Diabetici (n=15)

Dopo la dietaPrima della dieta0

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Il Parco Nazionale del Cilento (provincia di Salerno)

L’area che rivendica i natali della Dieta Mediterranea

Assessment of oxidative stress in school children of 3 cities of Southern Italy (10 to 13 years, n=180)

A screening for d-ROMs test showed a trend to high levels of oxidative stress may be due to lifestyle

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Substantial changes in the distribution of nutrients and caloric intake after 44 years of study

A possibile cause of increased oxidative stress

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Substantial changes in the Body Mass Index (BMI) during 44 years of study

A possibile cause of increased oxidative stress

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Significantly increased levels of ROMs in obese children

The epidemic of obesity (WHO)

Atabek ME, Vatansev H, Erkul I. Oxidative stress in childhood obesity. J Pediatr Endocrinol Metab. 2004. 17(8): 1063-8.

OBJECTIVE: To measure products of free radical damage in childhood obesity. METHODS: Plasma free radicals were assayed in 24 children with exogenous obesity and 24 non-obese healthy controls. A new colorimetric method was used that measures the generation of peroxy radicals (D-ROMs test), first products of the reaction between free radicals and oxygen. RESULTS: D-ROMs levels were higher in the obese children than in the non-obese group (33.3±10.1 mg% of H2O2 vs. 22.8±2.8 mg% of H2O2; p<0.001). Moreover, D-ROMs levels were higher in children with hyperlipidemia than in children with normolipidemia (49.6±3.1 mg% of H2O2 vs. 27.8±3.2 mg% of H2O2; p<0.001). D-ROMs level was positively correlated with waist-hip ratio, serum total cholesterol, serum triglycerides, serum low-density lipoprotein-cholesterol, systolic blood pressure, diastolic blood pressure and fasting blood glucose in obese children. In a multivariate regression model for obese children, the independent correlates for D-ROMs level were systolic blood pressure (p <0.001) and serum total cholesterol (p <0.001), with the total variance explained being 82%. CONCLUSION: Our study demonstrates for the first time that there was increased D-ROMs levels in obese children and adolescents and suggests that increased systolic blood pressure associated with hyperlipidemia may independently contribute to increased oxidative stress in childhood obesity.

Significant low values of d-ROMs test but not significant reduced barrier thickness in obeses

d-ROMs test and OXY-Adsorbent test are useful methods to monitor oxidative stress in obesity

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BMI<23: n=12; 54±6 yrBMI>31: n=12; 55±7 yr

Antioxidant status (OXY-A)

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Prooxidant status (d-ROMs)

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001.

The Second International ConferenceOxidative Stress & Aging

Maui, Hawaii, April 2-5 2001:the first presentation of d-ROMs test in US

Il sogno della baia delle balene di Mauii…

… e la realtà dell’epidemia mondiale dell’obesità.

The genuine napolitan hand-made pizza: the “Queen of the Mediterranean diet”

Pizza is an hand made and wood oven baked product to be eaten as “espresso” food

From the raw materials…

… to the end product.

Festa della Pizza (Salerno, Southern Italy): the biggest Pizza Festival of the World…

… which born to defend the identity of Italian genuine pizza worldwide.

The first certified “napolitan genuine hand-made pizza” of the world

A very important step in the process of qualifying of Italian products (science manager Dr. Iorio)

The original recipe of the “napolitan genuine hand-made pizza”

The triumph of Mediterranean diet

Leavening time: 6-8 hoursWood oven temperature: 400-450°C

Baking time: 60-90 sec

Disk:Wheat floor 1700 gWater 1 L (<20°F, pH 6.7)Natural yeast 2.5-5 gMarine salt 50 gGuarnishing:Extra-virgin olive oil 5 gTomato 30 gBuffalo Mozzarella chease 50 gPecorino/Parmigiano chaese 4 gBasilSalt

Assessing to monitor and to prevent oxidative stress

Tokyo, June 2004 – Larissa, October 2004Thessaloniki, November 2004 -

– Elea, december 2004 – SALERNO 2005

The clinician should examine any subject at risk or suffering from oxidative stress with specific tests able to identify and circumstantially define the true status of the systemic/local oxidative balance (production/elimination ratio of chemically reactive species). This new behavior of healthy professionals is the right premise not only for any antioxidant therapy prescription, when indicated, but also for a correct monitoring of either specific or antioxidant systemic/topical treatments, for a better patient’s quality of life.

Scheda per la valutazione dello stress ossidativo (Iorio, 2002)

Per un migliore inquadramento del paziente

AnnotazioniInterventi terapeutici consigliatiRisultati BAP-test 1Risultati d-ROMs test 1Anamnesi patologica prossimaAnamnesi patologica remotaVerdure (porzioni/giorno)Attività fisica (ore/settimana)Frutta (porzioni/giorno)FarmaciForte bevitoreAssunzione di alcoliciFumo di sigarettaArea di residenzaAltezzaPesoTelefonoIndirizzoProfessioneStato civileData di nascitaLuogo di nascitaCognomeNome

d-ROMs test: le linee-guida per la prevenzione ed il monitoraggio dello stress ossidativo

Uno strumento preziosissimo per la pratica clinica

Linee guida per monitorare lo

STRESS OSSIDATIVO

301 – 320 U CARR 250 – 300

U CARR 321 – 400 U

CARR < 250

U CARR > 400

U CARR

La condizione border-line

Come orientarsi

301 – 320 U CARR (condizione border line)

Anamnesi ed esame obiettivo

Dieta sbilanciata

Esercizio fisico inadeguato

Riequilibrare la dieta

Monitorare l’allenamento

Malattia in atto

Suggerimenti per migliorare stile di vita

Trattamento specifico + suggerimenti

Ripetere il test dopo 3 mesi (in media)

Ripetere il test dopo 3 mesi

Nessuna evidenza di malattia in atto

Ulteriori indagini diagnostiche

Possibile malattia in atto

BAP TEST

Terapia antiossidante (se positivo BAP TEST)

The d-ROMs test is a useful test to predict the first atherothrombotic event

Ridke et al. Circulation, 2004

Livelli normali di colesterolo totale possono essere associati con elevati livelli di ROM

Lo STRESS OSSIDATIVO potrebbe essere un fattore di rischio indipendente D

e P

risco

R, A

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e 20

01.

<200 mg/dL(n=21)

11%

13%

26%

28%

22%

>200 mg/dL(n=46)

52%

29%

14%

5%

Nel 48% dei casi, soggetti normocolesterolemici possono

avere livelli anche elevati di ROM

<300 U CARR (normale)

301-320 U CARR (borderline)

361-400 U CARR (SO medio)

321-360 U CARR (SO medio-basso)

>400 U CARR (SO elevato-elevat.mo)

Livelli di stress ossidativo (SO) sulla base del d-ROMs test

L’approccio integrato della “rivoluzione antiossidante”

Come orientarsi

Controllare periodicamente il proprio livello di stress ossidativo con test semplici, affidabili e precisi.

Ridurre l’esposizione del proprio organismo a fattori ambientali che inducono il rilascio di radicali liberi, curando l’igiene dell’ambiente di vita e di lavoro: limitare il contatto con l’aria inquinata, evitare o ridurre l’esposizione al fumo passivo, alle radiazioni ed ai campi elettromagnetici, ecc.

Migliorare il proprio stile di vita: ridurre/abolire il fumo di sigaretta, ridurre il consumo di bevande alcoliche e superalcoliche, praticare attività fisica con esercizi a bassa intensità (30’ di camminata veloce senza interruzione, tre volte alla settimana, secondo Cooper)

Cucinare e mangiare in maniera antiossidante, privilegiando il modello alimentare “mediterraneo”; in particolare consumare pane e pasta integrali e crucifere (broccoli e cavoli), favorire alcuni matrimoni alimentari ad azione sinergica (es. pomodoro ed olio extravergine di oliva), assumere molta frutta colorata di stagione e… bagnare eventualmente il pranzo con un bicchiere di buon vino rosso!

Integrare, quando necessario, l’alimentazione con antiossidanti, sotto il diretto controllo del medico, e dopo aver effettuato un’accurata valutazione di laboratorio.

Amici e collaboratori

Grazie per l’attenzione!