AntibiogrammaAntibiogrammaAntibiogrammaDott. Semih ESIN

Antibiogramma:Antibiogramma:Indagine di laboratorio per saggiareIndagine di laboratorio per saggiarela suscettibilità di un microrganismola suscettibilità di un microrganismo

ai farmaci antibattericiai farmaci antibatterici

A causa della ormai vasta diffusione delfenomeno della farmaco-resistenza, il test disensibilità agli antibiotici è essenziale per lamaggior parte dei microrganismi isolati daipazienti per la scelta dell’antibiotico migliore peril trattamento.

Il microbiologo clinico, impiegando leinformazioni relative alla sensibilità ai farmaci,costruisce gli antibiogrammi, che indicano lasensibilità dei microrganismi isolati in clinica neiconfronti degli antibiotici attualmente in uso.

L’uso inappropiato ed esagerato di farmaci antimicrobici staportando a un rapido sviluppo, nei microrganismi patogeni,di resistenze specifiche a tali sostanze. La scoperta el’impiego in clinica di molti antibiotici è andata di pari passocon la comparsa di batteri resistenti alla loro azione.

Resistenza ai farmaciResistenza ai farmaci

Campione clinico prelevato prima dell’iniziodella terapia antimicrobica

Isolamento ed identificazionedell’agente patogeno

Antibiogramma

Scelta dell’antibiotico orivalutazione della terapia

Antibiogramma: diagramma diAntibiogramma: diagramma diflussoflusso

MICMIC (MMinimum IInhibiting CConcentration; minimaconcentrazione inibente) La concentrazione più bassadel composto in esame necessaria per inibire lacrescita di un dato organismo.

MBCMBC (MMinimum BBactericidal CConcentration; minimaconcentrazione battericida) La concentrazione piùbassa del composto in esame necessaria per provocarela morte di più del 99.9% di un dato organismo.

Metodi per determinare la suscettibilitàMetodi per determinare la suscettibilitàdei microrganismi ai farmacidei microrganismi ai farmaci

Metodi basati sulla diffusionein agar (terreno solido)

Kirby-Bauer

Metodi basati sulla diluizionedell’antibiotico (terreno liquido)

Determinazione della minimaconcentrazione inibente (MIC)

Procedura di Kirby-Bauer per determinare laProcedura di Kirby-Bauer per determinare lasensibilità di un microrganismo agli antibioticisensibilità di un microrganismo agli antibiotici

2. La colonia viene inoculataall’interno di un tubo contenenteterreno di coltura liquido e lasciatacrescere sino al raggiungimento diuna densità specifica.

3. Un tampone viene introdottonella coltura liquida e poistrisciato su tutta la superficie diuna piastra di agar sterile in mododa ottenere una crescita battericaconsistente ed uniforme.

1. Una colonia isolata vieneprelevata da una piastra di agar.

Procedura di Kirby-Bauer per determinare laProcedura di Kirby-Bauer per determinare lasensibilità di un microrganismo agli antibioticisensibilità di un microrganismo agli antibiotici

5. Incubazione di 18 ore in 35°C perconsentire la crescita batterica.

6. Viene valutata la presenza e vengono misurate le dimensioni(diametro in mm) degli eventuali aloni di inibizione della crescitaattorno ai dischetti dei differenti agenti ed i valori ottenuti vengonoparagonati a quelli standard, in modo da stabilire se l’isolato èsensibile o meno ad un dato antibiotico.

4. Filtri di carta a forma didisco (carta bibula–assorbente–) contenenticoncentrazioni note di diversiagenti antimicrobici vengonoposti sulla piastra.

Quantità note dell’agente antimicrobico sono assorbite sudischetti di carta da filtro che vengono poi depositati sullasuperficie del terreno agarizzato.

L’agente antimicrobico diffonde dal dischetto nell’agarcreando un gradiente di concentrazionegradiente di concentrazione: quanto più ci siallontana dal dischetto, tanto minore sarà la suaconcentrazione, fino al punto in qui si raggiungerà laconcentrazione criticaconcentrazione critica (MIC aprossimata). Al di là diquesto punto si avrà crescita confluente, mentre nella zonapiù vicina al dischetto la crescita sarà assente. La zona incui non si è avuta crescita viene chiamata alone dialone diinibizione.inibizione.

Il metodo di Kirby-Bauer:Il metodo di Kirby-Bauer:interpretazione dei risultatiinterpretazione dei risultati

Il diametro degli aloni diinibizione osservati sulla piastraviene misurato (in mm) ed i valoriottenuti paragonati a quellistandard per il ceppo batterico, inmodo da stabilire se l’isolato èsensibile o meno ad un datoantibiotico (SSensibileensibile, IIntermediontermedio,RResistenteesistente).

Il metodo di Kirby-Bauer:Il metodo di Kirby-Bauer:interpretazione dei risultatiinterpretazione dei risultati

Il metodo di Kirby-Bauer:Il metodo di Kirby-Bauer:interpretazione dei risultatiinterpretazione dei risultati

c

c

ba

ab

9 mm 14 mm

30 mm

CF GM

CB

CFCFGMGM

CBCB

RR II

SS

Tecnica delle diluizioni scalariTecnica delle diluizioni scalari1. Ad una serie di provette contenenti il terreno di coltura(brodo di Mueller-Hinton) vengono aggiunte diluizioni scalari(in ragione di 2) dell’antibiotico da saggiare.

2. Ogni provetta viene inoculata con una quantità standard(105 -108 CFU/ml) del microrganismo in esame.

3. Dopo 18 ore di incubazione, le provette vengono controllateper la presenza di una crescita batterica visibile (torbidità):l’assenza di torbidità visibile del terreno di coltura denotaun’inibizione completa della crescita microbica.

La sensibilità del microrganismo nei confrontidell’antibiotico è espressa come la più alta diluizione(cioè la più bassa concentrazione) di antibiotico capacedi inibire completamente la crescita del microrganismostesso (minima concentrazione inibente=MIC)(minima concentrazione inibente=MIC).

MICMIC

incubazione (18 ore)

Tecnica delle diluizioni scalariTecnica delle diluizioni scalari((macrodiluizionemacrodiluizione))

MICMIC (MMinimum IInhibitingCConcentration; minimaconcentrazione inibente) Laconcentrazione più bassa delcomposto in esame necessariaper inibire la crescita di undato organismo.

Con 0.2 0.4 0.81.6 3.2 6.4 12.8 25.6 51.2

MICMIC

Saggio di MIC e MBCSaggio di MIC e MBC

MBCMBC

MICMIC

MBCMBC (MMinimum BBactericidal CConcentration;minima concentrazione battericida) Laconcentrazione più bassa del composto in esamenecessaria per provocare la morte di più del99.9% di un dato organismo.

Concentrazione minima battericida (MBC)

2 3

4 5

32 4 5

n°3=17 c.f.u.; n°4=66 c.f.u.; n°5=2000 c.f.u.

(inoculo=0.5x105 c.f.u.)

Sensibilità agli antibiotici determinataSensibilità agli antibiotici determinataattraverso il metodo delle microdiluizioniattraverso il metodo delle microdiluizioni

Ciascuna fila (orizzontale) di pozzetticontiene un diverso antibiotico. L’usodi una piastra per microtitolazioneconsente di automatizzare questo tipodi test.

La MIC corrisponde al pozzettocontenente la più bassaconcentrazione di antibiotico allaquale non c’è evidenza di crescitabatterica.

La più alta concentrazione diantibiotico è presente nel pozzetto asinistra; le diluizioni serialiprocedono nei pozzetti a destra.

Per esempio, nelle file 1 e 2, il titolo ènel terzo pozzetto. Nella fila 3l’antibiotico è inefficace alleconcentrazioni testate, per cui c’ècrescita batterica in tutti i pozzetti.

Nella fila 4, la MIC è nel primopozzetto.

Sistemi Commerciali: E-Test (AB Biodisk)Sistemi Commerciali: E-Test (AB Biodisk)

L’E-test impiega strisce impregnate di antibiotico postesulla superficie dell’agar. Il principio del test è analogo aquello del metodo per diffusione. La striscia contieneconcentrazioni crescenti di antibiotico che sono indicatesulla striscia stessa. Dopo incubazione il valore di MICcorrisponde alla concentrazione di antibiotico a cui l’alonedi inibizione interseca la striscia.

MICMIC

E-TestE-Test (Applicazione & Interpretazione)(Applicazione & Interpretazione)

CI: ciprofloxacina; IP: imipenem

Pseudomonas aeruginosa

SS

RR

E-TestE-Test (Interpretazione)(Interpretazione)

Sistemi commerciali automatizzatiSistemi commerciali automatizzatiSistemi semi-automatici:Sistemi semi-automatici: Basati sulla determinazione dellaMIC in terreno liquido, utilizzano un sistema di analisicomputerizzata della crescita batterica in gallerie diplastica, contenenti l’antibiotico in forma liofilizzata, percalcolare la MIC. Vitek (BioMérieux) Phoenix (BD Diagnostics)

RefertoReferto

Sono possibili tre categorie di suscettibilità ad unantibiotico:sensibile (S); intermedia (I); resistente (R)

comporta che il microrganismo risponde alle dosistandard di antibiotico somministrato secondo una viaopportuna, incluso la via orale.

comporta che il microrganismo possa essere inibitoda concentrazioni di antibiotico che sono raggiunte inseguito a inoculazione parenterale della massima dose diantibiotico possibile; l’antibiotico può essere selezionato ascopo terapeutico, ma è opportuno considerare altriantibiotici che potrebbero risultare più efficaci.

Indica che il microrganismo non è inibito daconcentrazioni raggiungibili del farmaco e, pertanto, nondeve essere selezionato per la terapia.

R

S

I

RefertoReferto