UTILIZZO di PIANTE TRANSGENICHE

Piante RESISTENTI agli INSETTI e INSETTICIDIPiante RESISTENTI a VIRUSPiante RESISTENTI agli ERBICIDIPiante RESISTENTI a FUNGHI e BATTERI

Piante per MODIFICARE SAPORE-COLORE-MATURAZIONE-FERTILITA’

PIANTE resistenti a INSETTI

1)Piante transgeniche che esprimono PROTOSSINA INSETTICIDA di Bt

2) Piante transgeniche che producono INIBITORI di amilasi e proteasi

Piante che esprimono PROTOSSINA INSETTICIDA di Bt

DIFFUSIONE DELLA PROTOSSINA SULLE COLTURE: La protossina di B. thuringiensis non permane nell’ambiente e non è pericolosa per gli animali quindi può essere utilizzata per irrorare le piante. (1938)

PRODUZIONE DI PIANTE CON PROTOSSINA: Contro quegli insetti che attaccano i tessuti interni delle piante, si possono generare piante che esprimono i geni delle tossine di B. thuringiensis. Finora sono state prodotte diverse piante che esprimono il gene della prototossina di B. thuringiensis (pomodoro, tabacco, patata, riso, mais, melo,melanzana, pioppo, noce, abete, mirtillo e cotone) (1996)

CHI E’ IL BACILLO THURINGIENSIS?? (BT)

 

Identificato nel 1902 nella larva del baco da seta da Ishiwata

Produce una tossina che danneggia l’apparato digerente delle larve di

Ditteri (zanzare) o causa nei bruchi di molti Lepidotteri una malattia

paralitica.

protossina

Bt ha 2 classi di TOSSINE:

1)(Cyt) CITOLISINE tossiche per Coleotteri (scarafaggi) e Ditteri (zanzare-mosche)

2) (Cry) DELTA-ENDOTOSSINE tossiche per Lepidotteri (farfalle e falene) legano recettori specifici di membrana delle cellule dell’intestino dell’insetto uccidendole

MECCANISMO di AZIONE di Bacillus T.

Colpisce solo le LARVE

PRODUZIONE di PIANTE Bt

METODO VETTORECOINTEGRATO

Promotore FORTEVirus del mosaico del cavolfiore

Nopalina-sintasi

PRODUZIONE di PIANTE Bt

PER AUMENTARE ESPRESSIONE DELLA TOSSINA:

1)Delezione della regione C-term. Clonaggio della regiona N-term (regione CATALITICA)

2)Mutazione sito specifica di seq. note per inibire trascrizione/traduzione (96,5%)

3)Mutazione ampie regioni: codoni procariotici-strutture II Mrna

4)Espressione solo nel Cloroplasto – proteina di fusione (tossina+prot trasportatrice)

- solo tossina (bombardamento + seq omologhe)

In questo caso non è necessario mutare la seq con codoni “procariotici” poiché il Cloroplasto è di origine procariotica.

RISULTATI

Pianta BtPianta WT

RISCHIO: selezione di insetti RESISTENTI alla TOSSINA Bt!!

Soluzione: espressione inducibile di Bt nel tempo. Utilizzo del promotore PR-1APromotore di un gene del tabacco indotto da patogeni e sostanze chimiche (acido salicilico)

In questo modo è possibile esprimere la Tossina solamente in determinati periodi dell’anno riducendo ilrischio di SELEZIONE di insetti resistenti

Piante transgeniche che producono INIBITORI di amilasi e proteasi

Per causare la morte degli insetti dannosi per la pianta, sono state prodotte piantetransgeniche capaci di esprimere sostanze che non permettono la digestione delvegetale negli insetti. Queste sostanze interferiscono con l’idrolisi delle proteine vegetali (PROTEASI) o dell’amido (AMILASI)Questo causa la morte degli insetti per fame.

Piante transgeniche che producono INIBITORI di proteasi

Produzione di Tabacco transgenico resistente agli insetti

+METODO VETTORE

BINARIO

Gene inibitore della TRIPSINA (proteasi) di Vigna sinensis

L’espressione dell’inibitore

potrebbe essere circoscritta

alle foglie/radici (enhancer-trap)

Piante transgeniche che producono INIBITORI di proteasi

Produzione di Riso transgenico resistente agli insetti (Sesamia inferens)80% delle piante transgeniche risulta resistente

METODO BOMBARDAMENTO

Gene inibitore II della proteinasi (proteasi) di Patata

Conferisce resistenzanei confronti dell’erbicida

“basta” (glufosinato di ammonio)

PIANTE resistenti a VIRUS

I virus delle piante causano spesso danni considerevoli alle coltivazioni.I trattamenti chimici spesso sono inefficaci: produzione di piante transgeniche

capaci di esprimere il gene per la RESISTENZA al VIRUS (esistenti in natura in altre piante)

Ma spesso piante resistenti cosi’ prodotte diventano nuovamente sensibili

Sono state prodotto piante transgeniche esprimenti1)PROTEINE DI RIVESTIMENTO DEL CAPSIDE VIRALE

Queste piante transgeniche (meccanismo sconosciuto)sono piu’ resistenti a successive infezioni virali (IMMUNIZZAZIONE)

2)ANTISENSO dell’RNA per le PROTEINE DEL CAPSIDE VIRALEDurante infezione, RNA antisenso si appaia all’RNA virale

non permettendone la traduzione (RNA ANTISENSO)

RNA4=proteina CAPSIDEdel virus del mosaico del cetriolo

IMMUNIZZAZIONE RNA antisenso

VETTORI BINARI

IMMUNIZZAZIONE RNA antisenso

EFFICACE ad ALTE DOSI di VIRUS

EFFICACE solo a BASSE DOSI di VIRUS

RNA4

VIRUS

PIANTE resistenti a VIRUS multipli

VETTORI BINARI

Confine DESTRO/SINISTRO Virus mosaico cetriolo

Virus 2 mosaico anguria

Virus mosaico giallo zucchine

PIANTE resistenti a ERBICIDI

Resistenza agli erbicidiPuò essere acquisita in vari modi:

1) Conferire alla pianta la capacità di inattivare metabolicamente l’erbicida

2) Sovraprodurre la proteina bersaglio sensibile all’erbicida, così da farne rimanere abbastanza per le funzioni cellulari, nonostante l’erbicida

Conferire alla pianta la capacità di inattivare metabolicamente l’erbicida

1) Il bromossinile è un erbicida che agisce inibendo la fotosintesi.La nitrilasi è un enzima isolato da Klebsiella ozaenae (batterio) che inattiva ilbromossinile, è stato clonato nelle piante che diventano così resistenti all’azione dell’erbicida.

2) Il glifosato è un erbicida che agisce inibendo la biosintesi degli amminoacidi aromatici delle piante. E’ stato isolato un ceppo di E.coli resistente al glifosato. Il gene che conferisce la resistenza (EPSPS) è stato clonato e posto sotto un Pr e Term Vegetale. Sono state cosi’ prodotte piante (pomodoro, tabacco cotone) resistenti al glifosato.

TRANSGENI (PIANTE) piu’ utilizzati nel MONDO

Resistenza alla PIRALIDE (Lepidottero)

Mais Bt

Mais Starlink

Resistenza a ERBICIDI

PIANTE resistenti a FUNGHI e BATTERI

FUNGHI: Le piante infettate dai funghi sintetizzano un gruppo di proteine correlate con la patogenesi (PR). Sono state modificate piante come il riso ed il tabacco in modo da produrre costitutivamente alcune di queste proteine, quali ad es. la chitinasi capace di degradare la parete dei funghi

BATTERI: Per rendere le pianti resistenti all'infezione batterica è stato introdotto nelle piante il gene per il lisozima del batteriofago T4, capace di lisare batteri sia gram-positivi che gram-negativi. Tali piante hanno dimostrato resistenza verso elevate concentrazione di batteri patogeni.

BOMBARDAMENTO di PROTOPLASTI

di RISO

Modificazione del COLORE del fiore

Tecniche di incrocio naturale hanno permessodi produrre nuove varietà e di variare la

pigmentazione dei fiori.

L’incrocio tradizionale è pero’ una proceduralenta e faticosa e circoscritta al patrimonio

genetico di quella particolare specie.

Con PIANTE TRANSGENICHEsi puo’ manipolare il percorso biosintetico

delle ANTOCIANINE

ANTOCIANINE: classe di FLAVONOIDIresponsabili del COLORE del FIORE

Sono sintetizzate a partire da FENILALANINA

Le catene laterali del prodotto finaledeterminano il pigmento del fiore

Modulando l’espressione deglienzimi di questo percorso

(sovra-espressione/antisenso)è possibile ottenere pigmenti

differenti

Modificazione del SAPORE del frutto

Utilizzo della Monellina: molecola prodotta dalla pianta africana Dioscoreophyllum cumminsii

Monellina: proteina 100.000 piu’ dolce dello zucchero(minore impatto metabolico)

Ma….è un dimero formato da 2 catene (A e B) distinte.La separazione frequente delle due catene portaalla perdita della dolcezza in seguito a cottura

Quindi….PRODUZIONE DI PIANTE TRANSGENICHECon gene per la MONELLINA ingegnerizzato: UNICO PEPTIDE

Modificazione delle PROPRIETA’ NUTRITIVE del frutto

• riso transgenico nel quale viene inserito il gene per la produzione di beta-carotene. (golden rice)

• Il riso non contiene una vitamina fondamentale per la nutrizione umana: la vitamina A; circa due miliardi di persone nel mondo, soprattutto in alcune zone povere del pianeta, hanno un'alimentazione basata sul riso e soffrono di carenza di questa vitamina

• Il riso transgenico produce beta-carotene, che viene trasformato dal nostro organismo in vitamina A.

Vitamina E ( tocoferolo):composto lipofilico ad azione antiossidante..previene l’ossidazione degli acidi grassi e quindi incrementa la stabilità delle membrane cellulari (integrità cellulare).Esistono diversi tipi di Tocoferoli: α β γ δ (dipendono dalla presenza di gruppi metilici sull’anello).L’α-Tocoferolo: maggiore capacità antiossidante. Il γ –Tocoferolo: piu’ abbondanteSovraespressione dell’enzima γ – TMT: maggiore conversione γ-tocoferolo in α-Tocoferolo

AmminoacidiCereali: poca lisina, legumi: poca metionina.Modulando la via biosintetica degli amminoacidi è possibile variarne il contenuto.

Modificazione delle PROPRIETA’ NUTRITIVE del frutto

Modificazione dei TEMPI di MATURAZIONE del frutto

POMODORI TRANSGENICI con MATURAZIONE RITARDATASintetizzano l’RNA antisenso dell’enzima POLIGALACTURONASI:

controlla la degradazione progressiva dell’acido Poligalacturonico (componenete della parate cellulare del pericarpo della frutta)

L’eliminazione dell’enzima rallenta la maturazione del frutto

Modificazione della FERTILITA’’

dei semi

Ditte produttrici di SEMI TRANSGENICI (per es.Monsanto) sono interessanti alla produzione di SEMI STERILI per costringere il coltivatore

a comprare ogni anno le loro sementi

E’ stato introdotto nei semi transgenici il gene RIP: ribosome inactivating protein da Dianthus sinensis

GENE CITOTOSSICO CHE CAUSA STERILITA’ SE ESPRESSO

Modificazione della FERTILITA’ dei semi

PIANTE come BIOREATTORILE PIANTE possono essere utilizzate come BIOREATTORI: “macchine “biologiche capaci di produrre elevate quantità di sostanze. Crescono velocemente e possono generare una BIOMASSA considerevole.

1)La produzione di sostanze puo’ essere indirizzata in specifici compartimenti. Molte sostanze sono prodotte nei SEMI: accumulo e protezione nel tempo

2)Molti anticorpi (plantbodies) sono prodotti in piante: mantenimento di un corretto “ripiegamento”, aggiunta di eventuali modificazioni post-traduzionali (non possibili in E.coli), nessun rischio di contaminazione con patogeni umani.

SVANTAGGIO: DIFFICILE LA PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE RICOMBINANTI PRODOTTESOLUZIONE: PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI CON TAG MOLECOLARI (cromatografia)

UTILIZZO:

Produzione di 1) proteine farmacologiche, 2) anticorpi, 3) vaccini edibili

PIANTE come BIOREATTORI

Vaccini ricombinanti prodotti nelle piante

Proteine ricombinanti umane con valore terapeutico prodotte in piante

MELO

CRISANTEMO

VITE

AGLIO

LILIUM

TITOLO, AUTORI, NOME RIVISTA, DATA

BREVE INTRODUZIONE

SCOPO DEL LAVORO

PARTE SPERIMENTALE/RISULTATI

DISCUSSIONE

MASSIMO 15’ (cronometro)