Domande

• Come avviene la replicazione del DNA?• Quali enzimi sono necessari?• Quali sono le differenze fra procarioti ed Eucarioti?

Tre modelli di replicazione del DNA

Meselson e Stahl1958

http://www.youtube.com/watch?v=Kybdh8VPiGk

Figura box 3.1

Centrifugazione in CsCl per la separazione di molecole di diversa densità

La replicazione del DNA è semiconservativa

Tre fasi nella replicazione del DNA

1. Inizio2. Allungamento della catena3. Fine

La girasi di E.coli è una topoisomerasi di tipo II che usa l’idrolisi di ATPper fornire l’energia necessaria all’ introduzione di superavvolgimenti inuna molecola circolare chiusa rilassata

Si lega al DNA e lo superavvolge processivamente e catalitic amenteContinua ad introdurre superavvolgimenti nella stessa mol ecola di DNAPuò introdurre circa 100 superavvolgimenti al minut o

La DNA girasi di E.coli

Mechanismo di Azione

I chinoloni sono farmaci battericidi.

Inibiscono la DNA girasi batterica detta anche topoisomerasi IV inibendocosì la replicazione e la trascrizione del DNA batterico.

I chinoloni entrano nel batterio attraverso dei canali detti porine e perciòvengono usati nel trattare infezioni batteriche di patogeni che si replicano

all’interno di cellule umane quali la legionella ed il micoplasma pneumonie.

Per molti batteri gram negativi la DNA girasi è il target di questi antibattericimentre per molti gram positivi il target è la DNA topoisomerasi IV

Le cellule eucariotiche non contengono ne DNA girasi e ne DNA topoisomerasi IV

Spettro di azione dei chinolonici

1° GenerazioneAcido nalidissico: Escherichia coli, Proteus, Shigella, Enterobacter, e Klebsiella.

2° GenerazioneCiprofloxacina: Come quelli della prima generazione ed nei confronti della salmonella typhy

3° GenerazioneGatifloxacina: Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae

4° GenerazioneGemifloxacina: Moraxella catarrhalis, Acinetobacter lwoffii, Klebsiella oxytoca, Legionella pneumophila, Proteus vulgaris. - Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae

Arthur Kornberg

Scoprì la polimerasi I ed il meccanismo della sintesi del DNA, lavorando con Escherichia coli

Sono necessari quattro componenti:

1. dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP(deossribonucleoside 5’-trifosfato)(zucchero-base + 3 fosfati)

2. DNA stampo

3. DNA polimerasi I (chiamata anche enzima di Kornberg)(DNA polimerasi II e III scoperte successivamente)

4. Mg 2+ (ottimizza l’attività della DNA polimerasi)

LA REPLICAZIONE DEL DNA

• La polimerizzazione del DNA avviene sempre in direzione 5’-3’• L’elicasi si muove in una sola direzione, srotolando progressivamente l’elica• I due filamenti antiparalleli non possono essere duplicati nello stesso modo• uno puo’ essere sintetizzato nella stessa direzione in cui si muove l’elicasi, in direzione 5’-3’ (filamento guida )• l’altro non possiede un gruppo ossidrile 3’ al punto di biforcazione, non puo’ essere sintetizzato in maniera continua, in direzione 3’-5’ (filamento in ritardo ), seguendo l’elicasi 5’

5’ 3’

3’

3’

5’

5’

3’

direzioneelicasi

?

LA REPLICAZIONE DEL DNA

• Il filamento in ritardo viene invece sintetizzato in direzione opposta a quella in cui si muove la forchetta di replicazione, mediante la sintesi progressiva di una serie di piccoli frammenti (frammenti di Okazaki ), ciascuno polimerizzato in direzione 5’-3’• le estremita’ dei frammenti di Okazaki vengono ricongiunte mediante formazione di legami covalenti ad opera dell’enzima DNA ligasi

5’ 3’

5’3’

3’

5’

5’

3’

direzioneelicasi

La sintesi di un filamentodi DNA richiede un innesco ad RNA ed avviene sempre in direzione 5’->3’

LA REPLICAZIONE DEL DNA

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5’3’

3’5’

Proteine alla forca replicazione in E. coli

Proteina Rep (elicasi)

proteine legantisingolo-filamento

(SSB)

BCG Primosoma

pol I

pol III

pol III

DNA ligasi

DNA girasi – questa è una topoisomerase II, cherompe e risalda il DNA per introdurre

superavvolgimenti negativi a monte della forca

primasi

DNAcDNAb

elicasi

Componenti dell’apparato di replicazionednaA lega all’origine la sequenza di DNAPrimosoma

dnaB elicasi (svolge il DNA all’ origine)dnaC lega dnaBdnaG primasi (sintetizza RNA primer)

DNA gyrase introduce superavvolgimenti negativi in testaalla forca di replicazione

Rep protein elicasi (svolge il DNA alla forca)SSB si lega al singolo-filamento di DNADNA pol III principale polimerasi replicanteDNA pol I rimuove i primer e riempe gli intervalliDNA ligasi risalda gli intervalli formando legami

3’, 5’-fosfodiesterei

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La “correzione di bozze”

I superavvolgimenti sono un problema per la replicazione di cromosomi circolari

100 superavvolgimenti

Azione della topoisomerasi

Schema dei passaggi enzimatici nella replicazione di E. coli

1. La topoisomerasi fa rilassare il filamento2. La proteina iniziatrice si lega a ori-C3. Due elicasi (una per ciascuna forca replicativa) denaturano e

svolgono un tratto della doppia elica4. Le single-strand binding proteins stabilizzano il DNA ad elica

singola, senza coprire le basi5. La RNA polimerasi (primasi) si lega all’elicasi e sintetizza un

innesco di circa 30 paia di basi6. La DNA P III lo estende da 5’ a 3’7. Ad ogni passaggio la DNA P III rimuove gli appaiamenti

sbagliati (proof-reading)8. La DNA P I degrada l’innesco ed estende il frammento

adiacente, procedendo da 5’ a 3’9. La ligasi salda i filamenti adiacenti, senza aggiungere alcun

nucleotide

Il replicone è un segmento di DNA chepossiede un inizio di replicazione e sireplica una volta ad ogni divisionecellulare

I repliconi dei genomi di vari organismi

Durante la replicazione, la stessa elica è, in tratti diversi, leading e lagging

La “bolla replicativa”

Figura 3.5

Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A

In sintesi:

Figura 3.9

Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A

Filamento leading e filamento lagging occupano entrambe le eliche, in posizioni diverse

Figura 3.7

Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A

Fine della replicazione: la ligasi

Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A

Figura 3.6

Fine della replicazione

Figura 3.10

Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A

Replicazione di cromosomi circolari

Nella foto: SV40

Ciclo cellulare in Eucarioti e procarioti (ore)

Organismo M G1 S G2 Totale

E. coli 1Lievito 20’ 25’ 40’ 35’ 2Piante 1 8 12 8 29Uomo 1 8 10 5 24

Velocità di replicazione:E. coli: 50000 basi al minutoDrosophila: 2600 basi al minutoTopo: 2200 basi al minuto

Il genoma umano è circa 1000 volte più grande di quello di E. coli

Negli eucarioti superiori

DNA P α: sintesi del primerDNA P β: riparazione del DNA nucleareDNA P γ: replicazione, solo nei mitocondri DNA P δ: sintesi dell’elica laggingDNA P ε: sintesi dell’elica leading*

* Finora dimostrato solo nel lievito

SPECIE Dimens. genoma N repliconi velocità replicazione/min

E. coli: 4,2 Mb 1 50000

Drosophila: 140 Mb 3500 2600

Topo: 3200 Mb 25000 2200

E alla fine?

Figura 3.15

Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A

LA REPLICAZIONE DEL DNAOltre la parte piu’ estrema di un filamento di DNA non c’e’ piu’ spazio per la sintesi di un innesco!• Quindi la replicazione del DNA rimane incompleta, ovvero un frammento terminale di un cromosoma resta a singola elica• a questo ovvia la replicazione dei telomeri ad opera dell’enzimatelomerasi , che utilizza come stampo un RNA parte dell’enzima stesso

I telomeri sono delle strutture formate da DNA e

proteine presenti alle estremità dei cromosomi lineari

costituiti da ripetizioni in tandem della sequenza

TTAGGG

La replicazione dei La replicazione dei La replicazione dei La replicazione dei

telomeritelomeritelomeritelomeri

Premio Nobel per la Medicina 2009

Jack W.

Szostak Elizabeth H. BlackburnCarol W. Greider

TelomerasiLa telomerasi, la trascrittasi inversa che aggiunge ripetizioni TTAGGG alle sequenze telomeriche, è ilmaggior regolatore della lunghezza telomerica nelle cellule di mammifero (collins & mitchell 2002).

Consiste di due componenti principali:

Il 90% dei tumori presentano attivazione della telo merasi

Nell’uomo l’attività telomerasica è stata riscontrata nelle cellule della linea germinale ed in cellule embrionali ma non nella maggior parte dei tessuti adulti

TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) - una subunità con attività di trascrittasi inversa conosciuta come trascrittasi inversa telomerasica

TERC (Telomerase RNA component) - una molecola di RNA conosciuta come il componente ad RNA della telomerasi che serve da copia per la sintesi di nuove

ripetizioni telomeriche.

LA TELOMERASI

La telomerasi permette di risolvere il problemadella replicazione delle estremità cromosomicheaggiungendo ripetizioni telomeriche ad ogni ciclo disintesi del DNA

TelomerasiLe regioni terminali dei cromosomi (telomeri) contengono sequenzeripetute:Ciliati (Tetrahymena): n(TTGGGG)Flagellati (Trypanosoma), uomo: n(TTAGGG)

L’enzima telomerasi contiene un tratto di RNA complementare allasequenza ripetuta e lo usa come primer per replicare l’estremitàtelomerica 5’: è unaDNA P – RNA dipendente

Carol Greider

Come funziona la telomerasi

Senescenza e neoplasia

Trends in Genetics 15:93-94, 1999

Figure 12.6 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)

Deaminazione

Depurinazione

Ossidazione

Dimeri di pirimidine

Formazione diaddotti del DNA

MAP: Myh-associated polyposis

Figure 12.23b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)

Xeroderma pigmentosumaltissima incidenza di maligni della pelle espostaa raggi UV.

Figure 12.8c The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)

Mismatch repair

Figure 12.8a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)

Mismatch repair

Hereditary non-polyposiscolon cancer (HNPCC).

Difetti del mismatch repairnel 15% dei tumori sporadicidel colon, dello stomaco,dell'ovaio e dell'endometrio.

Figure 12.32 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)

Homology-directed repair

Difetti di BRCA1 o BRCA2prevengono la riparazione guidatadall'omologia.

Carcinomi della mammella edell'ovaio.

Figure 12.33 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)

Non-homologous end joining (NHEJ)

Difetto della proteina NBS(nibrina).

Linfomi.

Sistemi di correzione e riparo del DNA

Correzione di bozze (“proofreading”) – durante la replicazione la DNA polimerasi può eliminare una base incorretta attraverso l’attività 3’-5’ fosfodiesterasica

Riparo dei misappaiamenti – le coppie di basi non corrette sul filamento nuovo vengono riparate da un complesso proteico che segue la polimerasi in duplicazione. La metilazione del DNA consente di distinguere il filamento vecchio dal nuovo.

Riparo per escissione – le basi modificate da agenti chimici successivamente alla replicazione del DNA vengono riconosciute e riparate.

Meccanismi di correzione e riparo nel DNA

CH3

Causa delle mutazioni

• Errori di replicazione• Danni chimici. Il DNA è una molecola

fragile: perdita o alterazioni di basi, rottura dello scheletro

• Inserimento di trasposoni .

Riparazione del mismatch

Mismatch repair è parte della replicazione.

In E. coli il DNA viene analizzato per distorsioni da Mut S (un dimero), lo distorce ulteriormente

Recluta MutL , che recluta MutH che taglia il filamento vicino al mismatch

Poi intervengono: elicasi, esonucleasi, DNA Pol (III) e ligasi.

Mismatch repair in E. coli

Come fa a identificare il filamento nuovo su cui operare il taglio ed escissione?

Dalla metilazione della A nella sequenza CTAG ad opera della Dam metilasi

MutS si lega al filamento non metilato

Mismatch repair in Eucarioti

• Gli eucarioti hanno omologhi di Mut(s) con più alta specificità (per mismatch, indels etc)

• Non hanno Dam Metilasi, riconoscono il filamento stampo dalle incisioni dei frammenti di Okazaki. Sono associate al sliding clamp

• Mutazioni dei geni predispongono ai tumori