I-PARTE GENERALE - izsum.itDownload\91\9181\tesi_Di_Girolamo.pdf · 3 1. I CHINOLONI 1.1....

UNIVERSIT DEGLI STUDI DI PERUGIA

FACOLT DI FARMACIA

Corso di Laurea Specialistica in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

Dipartimento di Chimica e Tecnologia del Farmaco e

Istituto Zooprofilattico Sperimentale dellUmbria e delle Marche

TESI DI LAUREA SPERIMENTALE

MESSA A PUNTO E VALIDAZIONE DI UN METODO DI SCREENING IMMUNOENZIMATICO PER LA

DETERMINAZIONE DI RESIDUI DI CHINOLONICI IN TESSUTI ANIMALI

OPTIMIZATION AND VALIDATION OF AN

IMMUNOENZYMATIC SCREENING METHOD FOR THE RESIDUES DETERMINATION OF QUINOLONES IN

ANIMAL TISSUES

Laureanda: Relatori: Valeria Di Girolamo Prof.ssa Luana Perioli Dott.ssa Roberta G alarini

Anno Accademico 2007-2008

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I-PARTE GENERALE

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1. I CHINOLONI

1.1. Introduzione

I chinoloni sono una classe di farmaci antimicrobici di origine sintetica nati in

seguito alla scoperta casuale di un prodotto secondario della sintesi della

clorochina (antimalarico) che possedeva una modesta attivit nei confronti dei

batteri Gram negativi. Il primo ad essere sintetizzato fu lacido nalidissico che

nel 1963 fu introdotto in terapia come chemioterapico delle vie urinarie. Il suo

uso, tuttavia, andato via via declinando a causa del limitato spettro dazione e

dei problemi di resistenza batterica [I].

Lacido nalidissico, oggi, non pi utilizzato in terapia ma alcune sue modifiche

strutturali hanno determinato la sintesi di composti che presentano un notevole

incremento dellattivit antimicrobica, un ampliamento dello spettro di azione e

una riduzione dei fenomeni di resistenza acquisita, parallelamente ai minori

effetti collaterali indesiderati. Si quindi assistito alla sintesi di ben tre

generazioni di chinoloni [II].

Dal punto di vista chimico, la struttura base dei chinoloni quella di un

eterociclico aromatico con anelli condensati e un gruppo chetonico in posizione

4. La maggior parte dei chinoloni presenta un solo atomo di azoto in posizione 1

(chinoline), ma alcuni possiedono due atomi di azoto in posizione 1 e 8

(naftiridine) o, ancora, tre atomi di azoto in posizione 1, 3 e 8 (piridopirimidine),

come riportato in Figura 1. Inoltre va sottolineato che in posizione 3 sempre

presente il gruppo carbossilico che ha un ruolo fondamentale per le propriet

farmacologiche dei chinoloni [I, II].

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Figura 1- Nomenclatura dei chinoloni

(da Corelli F. e Pasquini S. Antibatterici chinolonici http://www.farm.unisi.it/~corelli/Antibatterici _chinolonici.pdf)

Tutti i chinoloni hanno in comune un identico meccanismo dazione,

caratterizzato dallinibizione della subunit A della DNA-girasi batterica, nonch

una resistenza batterica esclusivamente di tipo cromosomico e alcuni effetti

indesiderati simili (fototossicit, neuro tossicit e tossicit cartilaginea) [I].

Siccome alcuni di questi farmaci sono impiegati nel settore zootecnico [I], la

presenza di loro residui negli alimenti di origine animale stata regolamentata a

livello comunitario e sono stati fissati dei limiti massimi di residui (LMR) nel

Regolamento 2377/90(1). Per questo motivo, infatti, la loro ricerca nei tessuti di

alcune specie animali, nelle uova e nel latte contemplata nei Piani di

monitoraggio dei residui effettuati in conformit alle normative dellUnione

Europea (UE) [III].

1 Regolamento 2377/90 del 26 giugno 1990 che definisce una procedura comunitaria per la definizione dei limiti massimi di residui di medicinali veterinari negli alimenti di origine animale (GUCE L 224/1 del 18.08.1990).

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1.1.1. Chinoloni di prima generazione

Nella maggior parte dei casi i chinoloni presentano una struttura biciclica, a

eccezione della flumechina, dellacido ossolinico e della cinossacina con

struttura triciclica. Lacido nalidissico ha una struttura 1,8-naftiridinica, mentre gli

altri sono derivati di naftiridine, pirido-pirimidine o cinoline (cinossacina). Oltre

alla funzione chetonica in posizione 4, sempre presente un gruppo

carbossilico in 3. Sullatomo di azoto N1 si ha molto spesso una sostituzione

etilica. Sullatomo di carbonio in posizione 7 le sostituzioni sono molteplici

(metile, piperidina etc.). In Figura 2 sono riportate le strutture dei principali

chinoloni appartenenti alla prima generazione. Dal punto di vista chimico, il

passaggio strutturale che porta alla sintesi dei chinoloni di seconda

generazione, si nota nella flumequina (sostituzione di un atomo di fluoro in

posizione C6) e nellacido pipemidico (sostituzione di un nucleo piperazinico in

posizione 7) [II].

Figura 2- Chinoloni di prima generazione


6

1.1.2. Chinoloni di seconda generazione

Lintroduzione in posizione 6 di un atomo di fluoro e in posizione 7 di un anello

piperazinico ha comportato le modifiche pi significative per i chinoloni di

seconda generazione, aumentandone lattivit antimicrobica, nonch lo spettro

dazione rispetto alle caratteristiche della molecola precursore, ovvero lacido

nalidissico. I principali composti appartenenti a questo gruppo sono riportati in

Figura 3. Si pu affermare che la norflossacina stato il primo fluorochinolone

propriamente detto, in quanto presenta non solo il fluoro in posizione 6, ma

anche laltro elemento strutturale fondamentale che la piperazina in posizione

7. Le modifiche strutturali, inoltre, hanno contribuito a migliorare le

caratteristiche farmacocinetiche, in particolare la biodisponibilit che permette,

in molti casi, la somministrazione per via orale dei chinoloni di seconda

generazione, nonch un aumento della capacit di diffusione tissutale

complessiva. Il fluoro, infatti, potenzia lattivit contro i Gram positivi patogeni

(Clostridium, Staphilococcus, Streptococcus), mentre lanello piperazinico

aumenta lefficenza contro gli organismi Gram negativi (Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis) [I, II].

7

Figura 3- Chinoloni di seconda generazione


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1.1.3. Chinoloni di terza generazione

I nuovi composti di terza generazione, presentati in Figura 4, sono caratterizzati

da unaumentata complessit strutturale, che ha introdotto interessanti

propriet, quali lattivit contro i cocchi Gram positivi (in particolare S.

pneumoniae) e, per alcuni, contro anaerobi e patogeni atipici. In alcuni casi la

maggior potenza di azione e lampiezza dello spettro si coniugano con propriet

farmacocinetiche migliorate che permettono di somministrare questi farmaci

una sola volta al giorno. Va sottolineato che non c comune accordo sulla

classificazione dei chinoloni e alcuni autori suddividono le molecole in quattro

generazioni [II].

Figura 4- Chinoloni di terza generazione


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1.2. Propriet acido-base

Il gruppo carbossilico in posizione 3 conferisce ai chinoloni caratteristiche acide.

I 7-piperazinilchinoloni possiedono gruppi amminici basici e quindi, in soluzione

acquosa, questi mostrano tre differenti forme: cationica, zwitterionica e

anionica. In Figura 5 riportato lo schema di protonazione/deprotonazione della

ciproflossacina, che si trova nella sua forma protonata in ambiente acido e in

quella deprotonata in ambiente basico, mentre a pH neutro in equilibrio con la

sua forma zwitterionica dalla quale dipende la sua scarsa solubilit in acqua a

pH fisiologico [II].

Figura 5- Schema di protonazione/deprotonazione del la ciproflossacina


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Diversamente, chinoloni come lacido ossolinico, la flumechina e lacido

nalidissico possono avere solo due forme: neutra e anionica. Questi ultimi sono

detti chinoloni acidi, mentre i chinoloni come la ciproflossacina, che possiedono

lanello piperazinico, sono detti anfoteri. I valori di pKa per i chinoloni acidi sono

compresi nel range 6.0-6.9 mentre gli anfoteri hanno valori di pKa1 5.5-6.6 e di

pKa2 7.2-8.9 [II].

1.3. Relazione struttura-attivit

Lo studio delle relazioni tra struttura e attivit farmacologica ha permesso di

mettere in evidenza che la caratteristica indispensabile dei chinoloni, affinch si

manifesti lattivit antibatterica, la presenza del gruppo 1,4-diidro-4-piridon-3-

carbossilico, comune a tutti i chinoloni e, solo eccezionalmente, pu essere

sostituito da quello isosterico 1,4-diidro-4-piridazinon-3-carbossilico

(sostituzione del CH= con N=) [I].

Le propriet antibatteriche dei chinoloni dipendono strettamente dalla funzione

carbossilica libera in posizione 3, tanto che la sua sostituzione con un gruppo

estereo, ammidico o con gruppi affini (CN, COCH3, SO2CH3) ne annulla

lattivit. La presenza del gruppo chetonico in posizione 4, allo stesso modo,

indispensabile per linibizione della DNA-girasi.

Tutti i fluorochinoloni sono caratterizzati dalla presenza di un atomo di fluoro in

posizione 6 che ha portato ai miglioramenti di cui sopra.

Anche i gruppi in posizione 7 influenzano significativamente linibizione della

DNA-girasi e lattivit antibatterica. Piccoli radicali lineari, come -CH3, -Cl, -NH2,

-NHCH3, hanno permesso di ottenere composti con spettro dattivit ristretto,

bench pi ampio di quello dellacido nalidissico. Le sostituzioni con gruppi di

maggiori dimensioni, come ad esempio gruppi piperazinici, 3-amino-pirrolidinici

e 3-metilaminometil-pirrolidinici, hanno portato a composti caratterizzati da una

minore potenza in vitro, ma con il vantaggio di garantire livelli plasmatici pi

elevati dopo somministrazione orale [I].

Il radicale piperazinico migliora, tra laltro, lattivit anti-Pseudomonas dei

fluorochinoloni. Infine laggiunta di atomi di Cl o F in posizione 8 non influenza

negativamente linibizione della DNA-girasi, ma migliora la capacit del farmaco

di penetrare nella cellula ed il suo assorbimento gastrointestinale [I].

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1.4. Meccanismo dazione

Allinterno della cellula batterica si trova una grande quantit di DNA (circa 1

metro) contenuta in uno spazio ridotto (circa 1-2 micron). Per permettere che

lintero DNA sia compreso in una cellula di pochi micron di lunghezza,

necessario che il doppio filamento di DNA batterico subisca una forte

compattazione, che pu avvenire grazie ad un superavvolgimento del DNA.

La formazione di un DNA tridimensionale superavvolto avviene grazie a

numerose transizioni momentanee nella sua struttura, che lo portano a

comprimersi e a ricostituirsi nella giusta configurazione. Sia le cellule procariote

che eucariote sono dotate di due enzimi, la topoisomerasi I e la topoisomerasi

II, in grado di promuovere le interruzioni nei filamenti di DNA e di cooperare,

quindi, nel processo di superavvolgimento. La topoisomerasi I altera

transitoriamente la topologia del DNA provocando interruzioni ed unioni su di un

singolo filamento di DNA, mentre la topoisomerasi II determina interruzioni ed

unioni su entrambi i filamenti della struttura a doppia elica del DNA.

I batteri sono dotati di un particolare tipo di topoisomerasi II, la DNA-girasi, che

introduce un superavvolgimento negativo nella molecola a doppio filamento del

DNA batterico. Questo spiega la selettiva tossicit dei chinoloni nei confronti dei

batteri, piuttosto che nei confronti dei mammiferi, che non possiedono questo

particolare enzima.

La DNA-girasi costituita da due subunit, la A e la B, che devono agire

contemporaneamente perch si realizzi il superavvolgimento. La subunit A

contiene il sito di legame del DNA e sovrintende alla capacit di ricongiungere

le interruzioni della doppia catena del DNA, mentre la subunit B sovrintende

alla trasformazione di energia necessaria ed alla idrolisi dellATP tanto da

essere ritenuta la reale responsabile dellintroduzione del superavvolgimento

negativo nel doppio filamento di DNA.

I chinoloni, e in particolare i fluorochinoloni, esercitano, quindi, la loro azione

tramite il meccanismo di inibizione selettiva della DNA-giarasi, soprattutto a

livello delle sue subunit. Si ritiene infatti che linibizione della DNA-girasi

batterica sia il fondamentale meccanismo con il quale questi farmaci esercitano

i loro effetti battericidi. I meccanismi molecolari che bloccano la replicazione del

DNA del microrganismo non sono per ancora completamente noti.

Linterruzione della sintesi di proteine batteriche e di RNA sembra essere il

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fenomeno intracellulare indispensabile per il definitivo espletamento dellattivit

battericida [I].

1.5. Spettro antimicrobico

I fluorochinoloni sono farmaci molto attivi a concentrazioni estremamente

basse, rispetto ai pi tradizionali antibatterici come le penicilline, le

cefalosporine, le tetracicline, i macrolidi e gli inibitori dellacido folico. La

suscettibilit di un certo microrganismo ai singoli composti del gruppo pu

tuttavia variare in misura considerevole, pur essendo questi strutturalmente e

chimicamente simili. In linea generale, i fluorochinoloni sono attivi nei confronti

di bacilli e cocchi Gram negativi intestinali (E. Coli , Kelbsiella spp., Shigella

spp., ecc.) e di altri Gram negativi come Salmonella spp.,Yersinia spp.,

Aeromonas spp., Proteus spp. e Pseudomonas aeruginosa. Sono attivi per

anche nei confronti di Gram positivi come Staphilococcus aureus e

Staphilococcus epidermidis, Haemophilus spp., Neisseria spp. e Campylobacter

spp. e rivelano attivit variabile nei confronti della maggior parte dei ceppi di

streptococco, tra cui Streptococcus pyogenes, streptococchi emolitici dei gruppi

B, C, F e G, Streptococcus pneumonite ed Enterococcus faecalis. Molti cocchi

anaerobi, come Clostridia e Bacteroides, sono invece insensibili a questo tipo di

farmaci. Nei confronti di alcuni batteri si riscontrato anche un prolungato

effetto post-antibiotico, come nel caso della norflossacina nei confronti dello

Staphilococcus aureus, E. Coli, ecc [I].

1.6. Usi terapeutici in medicina veterinaria

In medicina umana i chinoloni sono impiegati principalmente per curare

numerose infezioni microbiche a carico delle vie genito-urinarie e respiratorie e,

grazie alle loro interessanti propriet, il loro uso stato largamente esteso

anche alla medicina veterinaria. Trattandosi, infatti, di composti notevolmente

meno tossici, ma con spettro antimicrobico simile, degli aminoglicosidi, i

chinoloni stanno assumendo il ruolo di farmaci di elezione per il trattamento

delle infezioni gravi da Gram negativi negli animali da allevamento, domestici e

in acquacoltura. In particolare alcuni di loro come norflossacina, enroflossacina

e ciproflossacina, vengono utilizzati per curare infezioni (complicate e non) delle

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vie urinarie nel cane e nel gatto. Inoltre, i fluorochinoloni (in particolare

lenroflossacina) sembrano raggiungere anche nel tessuto prostatico

concentrazioni sufficienti a curare le prostatiti batteriche [I].

Le principali applicazioni dei fluorochinoloni riguardano comunque il trattamento

delle infezioni delle vie respiratorie e del tratto gastrointestinale, principalmente

in animali dallevamento. Questi infatti, in particolare la norflossacina,

raggiungono, nel tessuto polmonare di molti animali, concentrazioni superiori a

quelle sieriche, tali da risultare superiori alle MIC (concentrazione inibente

minima) per molti patogeni. Daltra parte, la decolonizzazione selettiva

dellapparato gastrointestinale, che si verifica dopo somministrazione di

chinoloni, risulta vantaggiosa per trattare le infezioni da microrganismi sensibili

che qui si instaurano.

Lenroflossacina il fluorochinolone pi usato nellUE per il trattamento delle

infezioni, soprattutto nellallevamento avicolo e suinicolo [IV].

La flumechina , sembra essere il fluorochinolone principalmente utilizzato,

sottoforma di pellets commestibili, nella produzione di alimenti medicati ad uso

zootecnico per lacquacoltura e per il pollame, grazie alla sua efficacia sia nella

terapia che nella prevenzione di molte infezioni batteriche [IV]. Studi effettuati

somministrando flumechina a galline ovaiole in una dose pari a 200 mg/L

dacqua per 5 giorni consecutivi, mostrano la presenza di residui nelle uova a

partire dal secondo giorno di trattamento fino allundicesimo giorno dopo il

termine dello stesso. I residui si distribuiscono principalmente nellalbume [I].

Lacido ossolinico stato autorizzato per il trattamento delle infezioni in pesci,

bovini, suini e pollame per via orale [IV]. Pu essere somministrato tramite

alimenti, acqua o come compressa. Esso velocemente assorbito in seguito a

somministrazione orale, ma tale assorbimento variabile e pu dipendere dalla

specie animale, dalla formulazione del farmaco, dalla dieta dellanimale e dallo

stadio della malattia. Quando ai polli viene somministrato acido ossolinico per

un certo periodo di tempo, alla fine del trattamento possibile evidenziare

residui di tale farmaco nel fegato, nei reni e nel muscolo. Per questo motivo le

uova, insieme al tessuto muscolare e ai mangimi, sono alcune delle matrici

previste per la ricerca di residui di chinolonici nei piani di monitoraggio degli

alimenti di origine animale [I].

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1.7. Resistenza e tossicit

Lunico meccanismo noto tramite il quale i batteri possono manifestare

resistenza nei confronti dei chinoloni quello di una modificazione

cromosomiale, la quale pu comportare alterazioni dellenzima bersaglio (DNA-

girasi), principalmente a carico della subunit A, o provocare ridotta capacit

del farmaco di penetrare allinterno della cellula microbica [I]. I chinoloni

penetrano nelle cellule microbiche per diffusione attraverso il doppio strato

fosfolipidico e tramite le porosit dello strato pi esterno dei batteri Gram

negativi. Un aumento della lipofilia della membrana cellulare e della porosit

pu ridurre la capacit del farmaco a penetrare nella cellula e pertanto rendere

la cellula stessa resistente ad esso [I].

I principali effetti tossici si manifestano quando i farmaci vengono somministrati

a dosi terapeutiche in animali ancora immaturi. Tutti gli appartenenti al gruppo

dei chinoloni sono in grado di provocare lesioni articolari nei giovani animali con

evidenti zoppie e forti dolori dovuti alle alterazioni a carico delle cartilagini di

accrescimento. Pertanto questi farmaci non possono essere somministrati a

giovani animali ancora in fase di sviluppo osseo, ossia nella maggior parte dei

cani sotto gli otto mesi di et, nei cavalli giovani e negli animali gravidi in genere

[I].

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2. IL CONTROLLO DEI RESIDUI NEGLI ALIMENTI DI ORIGI NE

ANIMALE

2.1. Il Piano Nazionale Residui

I prodotti di origine animale, come carne, latte, uova costituiscono la parte

preponderante dellalimentazione nei paesi industrializzati e la sempre

crescente domanda di alimenti proteici ha stimolato e condizionato lo sviluppo

della zootecnia sia attraverso la selezione genetica ed il miglioramento delle

tecniche di produzione, trasformazione e conservazione di mangimi e foraggi,

sia attraverso il ricorso alla somministrazione di sostanze diverse da quelle

alimentari, quali farmaci, additivi, ormoni, ecc. Tra queste molecole, quelle

maggiormente utilizzate per incrementare il rendimento delle produzioni

zootecniche, sono state e sono i prodotti ad azione ormonale ed antiormonale,

gli antibiotici, i -agonisti, il cui impiego, purtroppo, non esente da rischi

igienico-sanitari, sia sugli alimenti che sulla salute del consumatore. Una vasta

serie di molecole autorizzate (antibiotici, antielmintici, anticoccidici, etc.) sono,

inoltre, impiegate in allevamento come medicinali veterinari nella prevenzione

e nella cura delle malattie [V].

Il problema del controllo dei residui nelle derrate alimentari di origine animale

si cos intensificato con il passare del tempo, anche per lattenzione e

linteresse sempre maggiori che il consumatore ha rivolto a questa tematica.

Daltra parte, la preoccupazione giustificata dal fatto che un numero

crescente di farmaci viene impiegato nelle produzioni animali e ci,

potenzialmente, espone il consumatore allassunzione di residui di xenobiotici,

se pur in piccole quantit, per la durata di tutta una vita. Di conseguenza negli

ultimi decenni il legislatore, sia in ambito comunitario che nazionale, si

fortemente impegnato a emanare una serie di normative atte a migliorare gli

aspetti inerenti alla sicurezza alimentare.

Il tema delligiene e della sicurezza degli alimenti di origine animale, infatti,

una fase complessa ed articolata che fa parte di un processo che inizia in

allevamento con la lotta alle malattie infettive trasmissibili tra animali, e di cui

fanno parte la lotta alle zoonosi, il controllo degli alimenti destinati agli animali,

la vigilanza sullinquinamento ambientale di derivazione animale, la

sorveglianza sul benessere e sulla sanit animale.

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Se certe sostanze possono essere assunte dagli animali in modo del tutto

involontario o accidentale (contaminanti ambientali), esistono invece, come

sopra accennato, molecole che vengono loro somministrate volontariamente.

Si tratta sia di farmaci veterinari autorizzati utilizzati a scopi terapeutici, sia di

promotori di crescita (sostanze ad azione ormonale) somministrati in modo del

tutto illecito per aumentare le rese delle produzioni di carne. Il legislatore, da

oltre quarantanni, sta richiamando lattenzione degli operatori sanitari su

queste problematiche legate sostanzialmente alla presenza di residui, i cui

effetti biologici sono strettamente correlati alle caratteristiche tossicologiche

del farmaco progenitore, alla sua metabolizzazione nellorganismo animale, ai

legami che i diversi metaboliti formano con le molecole biologiche e che ne

condizionano la biodisponibilit, oltre che la loro degradazione.

Nella Comunit Europea (CE) il problema dei residui delle sostanze ad azione

anabolizzante utilizzate in zootecnica venne alla ribalta nel 1981 con la

Direttiva 81/602/CEE (2,3).

A causa del problema dei residui di anabolizzanti nelle carni, con questa

Direttiva gli Stati membri decidevano di vietare la somministrazione agli

animali in allevamento di sostanze ad azione tireostatica, estrogena,

androgena e gestagena e limmissione sul mercato di animali ai quali fossero

state somministrate dette sostanze. A seguito di questo provvedimento, la CE,

con la Direttiva 86/469/CEE(4), decise di istituire dei piani annuali di controllo

degli animali e delle carni fresche per la presenza di residui di medicinali

veterinari e di altri contaminanti, ritenuti un rischio per la salute del

consumatore, oltre che un danno per la qualit delle carni.

Fino ad allora, infatti, le modalit di controllo, la frequenza dei campionamenti e

le concentrazioni massime consentite di residui di farmaci e contaminanti

ambientali erano disciplinate in maniera profondamente eterogenea nei vari Stati

2 Per dare attuazione alle politiche in materia di sicurezza e qualit degli alimenti, la Comunit ha adottato principalmente due tipi di strumenti normativi: i Regolamenti e le Direttive. I primi non necessitano di normative particolari di recepimento da parte degli Stati membri, mentre le Direttive possono contenere solo principi generali della disciplina delle materie che vanno a regolare e sono rivolte ai singoli Stati membri, che devono attuarle con proprie leggi ordinarie. 3 Direttiva 81/602/CEE del Consiglio, del 31 luglio 1981, concernente il divieto di talune sostanze ad azione ormonica e delle sostanze ad azione tireostatica. Recepita in Italia con il Decreto: Decreto Ministeriale 3 novembre 1981: " Divieto di vendita di medicinali (specialit di medicinali o galenici) per uso veterinario contenenti stilbenici o tireostatici". 4 Direttiva 86/469/CEE del 16 settembre 1986 concernente il controllo degli animali e delle carni fresche per la presenza di residui.

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membri. Ci comportava, fra laltro, notevoli ostacoli agli scambi intracomunitari

ed una distorsione delle condizioni di concorrenza tra produzioni.

Pertanto, fu necessario trovare una soluzione globale e uniforme per

leffettuazione dei controlli allinterno della Comunit per la ricerca di residui negli

animali di allevamento, nelle carni e nei prodotti a base di carne, sia che questi

prodotti fossero destinati al mercato nazionale degli Stati membri oppure agli

scambi intracomunitari. Venne, quindi, stabilito che gli Stati membri avrebbero

dovuto elaborare un piano annuale di controllo tenendo conto della propria

specifica situazione: tale piano effettuato ancora oggi e va sotto il nome di

Piano Nazionale Residui (PNR) [VI].

La Direttiva 86/469/CEE sanciva che i campionamenti fossero eseguiti in modo

ufficiale secondo criteri comuni per le diverse categorie di sostanze interessate e

che i campioni venissero analizzati in laboratori ufficialmente autorizzati. Ed

infine, qualora una determinazione analitica avesse rilevato la presenza di

residui di sostanze non consentite o di sostanze consentite in concentrazione

superiore al limite ammesso (campione non conforme), si imponeva ladozione

di misure comuni intese ad accertare la causa della non conformit, a eliminare

il problema ed atte ad assicurare che i prodotti coinvolti fossero effettivamente

esclusi dal consumo.

Ciascun Paese Membro doveva quindi provvedere affinch la ricerca dei residui

negli animali, nei loro escrementi e liquidi biologici, nonch nei tessuti e nelle

carni fresche venisse eseguita conformemente alle prescrizioni dettate dalla

Direttiva 86/469/CEE. Inoltre, i singoli paesi della CE affidavano a un servizio o

organismo centrale il compito di coordinare lesecuzione dei controlli previsti

dalla Direttiva. Tale organismo doveva coordinare le attivit dei servizi regionali

effettivamente incaricati di effettuare i controlli, raccogliere i risultati e le

informazioni da trasmettere alla Commissione e infine, di primaria importanza,

elaborare annualmente i piani stessi. Per quanto riguarda lesecuzione delle

analisi, nel nostro paese furono affidate alla rete dei Laboratori degli Istituti

Zooprofilattici Sperimentali.

Lelenco completo e la classificazione delle sostanze da ricercare era riportato

nellAllegato I della stessa Direttiva e prevedeva categorie comuni a tutti gli stati

membri (A) e categorie specifiche (B).

Lapprovazione dei singoli piani nazionali veniva decisa dalla Commissione

Europea previa verifica della loro conformit ai requisisti della Direttiva CEE

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86/469; in caso di mancata approvazione lo Stato Membro avrebbe dovuto

modificare e/o completare il piano proposto.

A partire dal 1988, quindi, lItalia attua il proprio PNR che ha subito nel tempo

molte modifiche derivanti dalla necessit di adeguamento alle nuove

problematiche, nellambito dei residui, che via via si presentavano. Nel tempo

lenorme progresso delle tecniche analitiche e i vari allarmi a livello mondiale,

nellambito della sicurezza alimentare, hanno portato, ad esempio,

allintroduzione della ricerca di diossine, di metaboliti di nitrofuranici o di alcuni

gestageni [V]. Inoltre, nuovi settori produttivi sono stati via via coinvolti nei

campionamenti programmati tanto che i controlli che, inizialmente, riguardavano

prevalentemente il settore bovino (1988), attualmente prevedono il

campionamento nei settori bovino, suino, ovi-caprino, equino, avicolo, cuniculo,

selvaggina allevata ed acquacoltura. Inoltre sono effettuati anche prelievi di

latte, miele e uova.

Nel 1997 lItalia dovette tener conto di due fondamentali Direttive promulgate

proprio dal Consiglio dEuropa durante il 1996(5). Le due Direttive furono recepite

nellordinamento nazionale solo qualche anno pi tardi con il Decreto Legislativo

n. 336 del 4 agosto 1999(6) e sono alla base del PNR attuale.

Tra le novit, la Direttiva 96/23/CE comportava una riclassificazione delle

sostanze da ricercare come riportato in Tabella 1. Come si pu osservare, nella

Categoria A sono incluse le sostanze considerate fonte di gravi rischi per la

salute pubblica e per le quali non , quindi, possibile fissare un LMR, mentre

nella Categoria B si collocano i farmaci veterinari con LMR (ad esempio i

chinoloni che appartengono, nello specifico, alla categoria B1) ed i contaminanti

ambientali (metalli pesanti, micotossine, pesticidi etc.).

5 Direttiva 96/22/CE del 29 aprile 1996: "concernente il divieto di utilizzazione di talune sostanze ad azione ormonica, tireostatica e delle sostanze beta-agoniste nelle produzioni animali e che abroga le direttive 81/602/CEE, 88/146/CEE e 88/299/CEE". Direttiva 96/23/CE del 29 aprile 1996: "concernente le misure di controllo su talune sostanze e sui loro residui negli animali vivi e nei loro prodotti". 6 Decreto Legislativo n. 336 del 4 agosto 1999: "Attuazione delle direttive 96/22/CE e 96/23/CE concernenti il divieto di utilizzazione di talune sostanze ad azione ormonica, tireostatica e delle sostanze -agoniste nelle produzioni di animali e le misure di controllo su talune sostanze e sui loro residui negli animali vivi e nei loro prodotti"

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Tabella 1- Classificazione delle sostanze da ricerc are come indicato nellAllegato I della Direttiva 96/23/CEE [VI]

Categoria A - Sostanze ad effetto anabolizzante e s ostanze non autorizzate categoria A, 1

stibeni, loro derivati e loro sali ed esteri

categoria A, 2

agenti antitiroidei

categoria A, 3

steroidi

categoria A, 4

lattoni dell'acido resorcilico (compreso lo zeranolo)

categoria A, 5

beta-agonisti

categoria A, 6

sostanze incluse nell'allegato VI del regolamento (CEE) n. 2377/90 del Consiglio, del 26 giugno 1990

Categoria B - Farmaci veterinari ((((7)))) e contaminanti ambientali

categoria B, 1 sostanze antibatteriche, compresi sulfamidici e chinoloni

altri prodotti medicinali veterinari: B, 2a antielmintici

B, 2b coccidiostatici, compresi i nitroimidazoli

B, 2c carbammati e piretroidi

B, 2d tranquillanti

B, 2e antinfiammatori non steroidei (AINS)

categoria B, 2

B, 2f altre sostanze esercitanti un'attivit farmacologia

altre sostanze e agenti contaminanti per l'ambiente: B, 3a composti organoclorurati, compresi i PCB

B, 3b composti organofosforati

B, 3c elementi chimici

B, 3d micotossine

B, 3e coloranti

categoria B, 3

B, 3f altri

7 Comprese le sostanze non registrate utilizzabili a fini veterinari.

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2.2. I controlli analitici

Parallelamente allistituzione dei Piani Nazionali, un nodo fondamentale era

quello di avere un sistema di controlli efficace. Infatti garantire laffidabilit dei

dati non era un problema banale, data la numerosit e la disomogeneit dei

laboratori coinvolti nei vari paesi membri e la difficolt intrinseca del settore

analitico che si occupa di determinare tracce di sostanze in matrici complesse,

quali gli alimenti di origine animale. LUE si apprest quindi a unintensa

attivit legislativa riguardante i criteri di qualit che dovevano adottare i

laboratori incaricati dello svolgimento delle analisi dei residui a livello

comunitario. Attraverso la Direttiva 89/397/CEE(8) si introdussero importanti

disposizioni riguardo alla necessit di un controllo pubblico dei prodotti

alimentari. La Direttiva prevedeva:

ampliamento del campo di azione dei controlli a tutte le fasi della

produzione, della fabbricazione, del magazzinaggio, del trasporto, della

distribuzione, dell'importazione e del commercio;

controllo sui prodotti alimentari anche allesame dei sistemi di verifica

della qualit eventualmente installati dall'impresa e dei relativi risultati;

pubblicazione di un elenco delle autorit competenti nel settore del

controllo dei prodotti alimentari di ciascuno stato membro, in cui siano

indicati i territori di rispettiva competenza ed i laboratori abilitati ad

effetuare le analisi;

nomina, da parte delle suddette autorit competenti, di laboratori ufficiali

incaricati di effettuare le analisi.

Per garantire la qualit del dato analitico era necessario introdurre un sistema

di norme per i laboratori ufficiali dei vari Stati membri. Tale sistema doveva

essere basato su norme approvate e standardizzate, ed i laboratori incaricati

dovevano lavorare secondo metodi di analisi convalidati. Perci venne

8 Direttiva 89/397/CEE del Consiglio, del 14 giugno 1989, relativa al controllo ufficiale dei prodotti alimentari. Recepita con il D.Lgs. 03/03/1993 n. 123. Attuazione della Direttiva 89/397/CEE relativa al controllo ufficiale dei prodotti alimentari.

21

successivamente emanata la Direttiva 93/99/CE(9) con la quale si

completavano in sostanza le disposizioni gi riportate nella 89/397/CEE. Nelle

sue premesse essa ribadisce, quale preoccupazione prioritaria del Consiglio,

la necessit di introdurre un sistema di norme di qualit per i laboratori

incaricati dagli Stati membri di effettuare il controllo ufficiale delle derrate

alimentari; tale sistema doveva essere basato su norme generalmente

approvate e standardizzate. Inoltre i laboratori erano tenuti, ove possibile, a

impiegare metodi analitici convalidati. In particolare nella Direttiva si fissavano:

il personale delle strutture cui compete il controllo ufficiale;

i requisiti necessari per il funzionamento dei laboratori(10);

gli organismi responsabili della verifica dei laboratori;

i requisiti e le modalit dei sistemi di verifica dei laboratori;

le procedure relative al sistema di mutua assistenza amministrativa e di

scambio di informazioni nonch alle ispezioni congiunte con gli agenti

dell'UE.

Ogni Stato membro, dal 1 novembre 1998, era in sos tanza obbligato a

prendere i provvedimenti necessari affinch:

i laboratori fossero conformi ai criteri generali stabiliti dalla norma

europea UNI CEI EN 45001, ovvero fossero accreditati;

fossero designati gli organismi responsabili della valutazione e del

riconoscimento dei laboratori preposti al controllo ufficiale. Tali

organismi dovevano soddisfare i criteri generali stabiliti dalla norma

europea UNI CEI EN 45003;

9 Direttiva 93/99/CE del Consiglio, del 29 ottobre 1993, riguardante misure supplementari in merito al controllo ufficiale dei prodotti alimentari. Recepita con il D.Lgs.26/05/1997, n.156. Attuazione della Direttiva 93/99/CE concernente misure supplementari in merito al controllo ufficiale dei prodotti alimentari. Sia la Direttiva 89/397/CEE che la 93/99/CE sono state abrogate con effetto dal 1 gennaio 2006 dallarticolo 61 del Regolamento (CE) n. 882/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 29 aprile 2004, relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformit alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali (GU L 165 del 30.4.2004). 10 I laboratori adibiti al controllo ufficiale sono quelli precisati allarticolo 7 della 89/397/CEE.

22

la valutazione dei laboratori di prova doveva avvenire applicando i

requisiti stabiliti dalla norma UNI CEI EN 45002.

In Italia, nel novembre 1998, solo alcune strutture operavano in conformit alla

norma EN 45001 o erano in attesa di ricevere gli audit (verifiche ispettive) da

parte dellunico organismo operante sul territorio nazionale in conformit alla

UNI CEI EN 45003: il SINAL (Sistema Nazionale per lAccreditamento dei

Laboratori di prova).

Nel frattempo la Direttiva 96/23/CE cerc di migliorare l'efficacia dei piani di

sorveglianza messi in opera ogni anno degli Stati membri, assicurare la

comparabilit dei risultati ottenuti ed armonizzare le modalit di applicazione

per il campionamento.

A tal fine, venne emanata la Decisione 98/179/CE(11) la quale, allarticolo 1,

stabiliva che le analisi dei campioni dovevano essere effettuate

esclusivamente presso laboratori per il controllo ufficiale dei residui riconosciuti

dall'autorit competente, ribadendo la necessit di assicurare la qualit e la

comparabilit dei risultati analitici. I laboratori autorizzati erano, quindi, tenuti a

partecipare a un programma esterno, riconosciuto sul piano internazionale, di

valutazione qualitativa e di accreditamento. Tale obiettivo doveva essere

conseguito attraverso laccreditamento (da ottenersi prima del 1 gennaio

2002) e la partecipazione degli stessi a circuiti interlaboratorio (proficiency

testing schemes), organizzati dai Laboratori Nazionali di Riferimento (LNR) o

dai Laboratori Comunitari di Riferimento (LCR) [VII].

Con la Decisione 98/179/CE si richiedeva dunque che, a partire dal 2002, i

laboratori per il controllo ufficiale dovessero essere accreditati secondo la UNI

CEI EN ISO/IEC 17025 [VIII] che, dal 2000, ha sostituito la EN 45001.

Parallelamente allo svilupparsi dei Sistemi di Qualit, la UE emanava

provvedimenti pi specifici atti a garantire il rispetto di alcuni requisiti minimi.

Infatti, la norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025 di tipo orizzontale e, quindi

piuttosto generica, non essendo indirizzata ad un settore analitico in

particolare. Da questa considerazione, si sviluppa dunque un punto

fondamentale della strategia dellUE, che richiede ai propri laboratori ufficiali

11 98/179/CE: Decisione della Commissione del 23 febbraio 1998 recante modalit d'applicazione per il prelievo ufficiale di campioni al fine della sorveglianza su talune sostanze e sui loro residui negli animali vivi e nei prodotti di origine animale.

23

ulteriori requisiti di qualit, considerando lambito analitico nei quali questi

operano, ovvero la ricerca di sostanze in tracce (residui).

Prima del 1993, i criteri analitici da applicare ai metodi di riferimento erano

riportati nella Decisione 89/610/CEE(12).

Dal 1993 entrarono poi in vigore la Decisione 93/256/CE(13) e la Decisione

93/257/CE(13).

Nelle previsioni, queste due Decisioni avrebbero dovuto essere riviste entro il

1996. Quindi, nel 1995, la Commissione Europea, in collaborazione con i

quattro laboratori di riferimento comunitari, dava inizio a un lavoro di revisione

tecnico-legislativo delle Decisioni 93/256/CE e 93/257/CE, proprio con il

compito di superare i limiti evidenziati dalla normativa vigente, soprattutto alla

luce dei progressi pi recenti della chimica analitica. A causa della natura

complessa dellopera di revisione e delle istanze di partecipazione dei

laboratori nazionali di riferimento, nel 1998 la Commissione designava un

gruppo di lavoro ad hoc con il compito di delineare e revisionare i criteri relativi

alla validazione dei metodi e allinterpretazione dei risultati. Questa attivit

port finalmente alla pubblicazione nel 2002 della Decisione 2002/657/CE(14).

La 2002/657/CE abroga sia la Decisione 93/256/CEE che la 93/257/CEE e,

allarticolo 5, ribadisce che: Gli Stati membri garantiscono la qualit dei

risultati delle analisi dei campioni prelevati a norma della Direttiva 96/23/CE, in

particolare attraverso la sorveglianza delle analisi e/o la calibrazione dei

risultati in ossequio al capitolo 5.9 della ISO 17025 [VIII].

La 2002/657/CE [VI,IX] si configura come un provvedimento completo e

complesso, che ha dato adito ad alcune critiche e a diverse interpretazioni, ma

che, comunque, rappresenta ormai un punto di riferimento sia per i laboratori

ufficiali che non, allinterno dellUE e anche al di fuori dei suoi confini. Infatti,

12 89/610/CEE: Decisione della Commissione, del 14 novembre 1989, che stabilisce i metodi di riferimento e la lista dei laboratori nazionali da impiegare per la ricerca dei residui. 13 93/256/CE: Decisione della Commissione, del 14 aprile 1993, che stabilisce i metodi da impiegare per la ricerca dei residui di sostanze ad azione ormonica e di sostanze ad azione tireostatica. 93/257/CE: Decisione della Commissione, del 15 aprile 1993, che stabilisce i metodi di riferimento e l'elenco dei laboratori di riferimento nazionali per la ricerca dei residui. 14 2002/657/CE: Decisione della Commissione, del 12 agosto 2002, che attua la Direttiva 96/23/CE del Consiglio relativa al rendimento dei metodi analitici e all'interpretazione dei risultati (GUCE L221/8 del 17.08.2002). Precedentemente, con il nome di SANCO/1085/2000, era stata diffusa una bozza di revisione della Decisione 93/256/CE.

24

oltre a indicare i parametri di prestazione che devono essere determinati e i

loro limiti di accettabilit, essa descrive anche il piano sperimentale per

ottenerli. Indica, inoltre, i criteri da seguire nellinterpretazione dei risultati,

modulando le prescrizioni anche in funzione della categoria delle sostanze

analizzate (sostanze vietate appartenenti alla categoria A o permesse della

categoria B).

La Decisione supera, inoltre, la precedente distinzione tra i metodi di routine e

di riferimento, distinzione riportata nella stessa Direttiva 96/23/CE (art. 15),

lasciando solo la differenziazione tra metodi di screening e di conferma [X].

In particolare, i metodi di screening sono usati per determinare la presenza di

un analita o di una classe di analiti al di sopra o al di sotto del livello di

interesse (LMR, presenza, etc..). Sono caratterizzati dalla capacit di

analizzare un gran numero di campioni allo scopo di individuare quelli sospetti

da processare, successivamente, con un metodo di conferma. Sono, quindi,

sostanzialmente concepiti per evitare campioni falsi negativi (falsi conformi).

I metodi di conferma , invece, devono fornire informazioni definitive per

lidentificazione, e, se necessario, per il dosaggio dellanalita al livello

dinteresse. Proprio per garantire questo, al contrario dello screening per cui

non esistono prescrizioni particolari, la Decisione stabilisce che, per un esame

di conferma, possano essere utilizzate solo tecniche strumentali con requisiti

ben precisi.

Con il provvedimento di cui sopra, lobiettivo della Commissione stato quello

di garantire ladozione di procedure analitiche con performances prestabilite.

La filosofia perseguita dallUE si configura, quindi, come molto flessibile dal

punto di vista delle scelte di ciascun laboratorio, ma estremamente rigida sui

criteri minimi di qualit da rispettare affinch un metodo di prova sia da

considerarsi adeguato allo scopo. Tutto ci si reso necessario poich, daltra

parte, lutilizzo di metodi standardizzati ufficialmente riconosciuti (di

riferimento), che costituirebbe gi di per s una garanzia di confrontabilit del

dato analitico, si era dimostrata una strada inadatta proprio in virt del

continuo progresso tecnico-scientifico di questo particolare settore della

chimica analitica. Inoltre questa strategia permette una maggiore flessibilit

rispetto alle varie allerte, che via via possono presentarsi anche su

analiti/matrici inusuali. Anche se molta strada rimane ancora da percorrere,

25

anche nellarmonizzazione e semplificazione delle norme che fissano requisiti

tecnici riguardanti gli obblighi dei laboratori, limpegnativa strategia comunitaria

ha comunque fatto registrare imponenti miglioramenti. A dimostrazione di ci,

un esempio per tutti rappresentato dallabbassamento dei livelli medi di

controllo per le sostanze vietate di oltre un ordine di grandezza dallistituzione

dei piani nazionali dal 1988 a oggi.

3. I METODI ANALITICI DI SCREENING

3.1. Introduzione

La normativa europea vigente, riguardo alle performances dei metodi analitici

per la ricerca di residui negli animali vivi e nei loro prodotti (Decisione

2002/657/CE), prevede espressamente lutilizzo di metodi di screening. Tale

eventualit non obbligatoria, ma riguarda una scelta del laboratorio.

Tecnicamente i metodi di conferma, generalmente pi sofisticati e costosi,

possono essere utilizzati anche come primo approccio analitico e, nel caso in

cui non siano disponibili adeguati metodi di screening, questo avviene

sistematicamente. Tuttavia, quando possibile, per il laboratorio e anche per il

cliente, estremamente conveniente avere a disposizione screening che

permettano di ottenere una maggiore produttivit, costi pi contenuti e, non

ultimo, tempi di risposta brevi.

Sostanzialmente il flusso dei campioni pu essere riassunto come in Figura 6,

dove per conventional analytical process si intende il metodo di conferma

attuato prevalentemente con tecniche cromatografiche (HPLC o GC). Il ruolo

del metodo di screening quindi quello di selezionare, tra la massa dei

campioni in arrivo, quelli sospetti, che poi verranno rianalizzati con una idonea

procedura di conferma.

26

Figura 6- Flusso dei campioni in laboratorio: metod i di screening e di conferma

Per i metodi di conferma, la Decisione 657 prevede lutilizzo solo di certe

tecniche analitiche strumentali elencate nella Tabella 1 della stessa Decisione:

tali tecniche sono in grado di fornire adeguate garanzie di riconoscimento

strutturale delle molecole da determinare. Per lo screening, invece, non

prevista alcuna restrizione da questo punto di vista, ma sono altres richieste

determinate performances metodologiche che, come ovvio, per lo screening

sono meno severe che per la conferma, come si evince dalla Tabella 2

seguente (Tabella 9 della Decisione 2002/657/CE) [VI, IX].

Tabella 2- Classificazione di metodi analitici in b ase alle caratteristiche di rendimento che devono essere determinate

Limite di

rilevazione CC

Limite di decisione

CC

Esattezza/ Recupero

Preci- sione

Selettivit/ Specificit

Applicabilit/ Robustezza/

Stabilit

S + + +

Metodi

qualitativi C + + + +

S + + + +

Metodi

quantitativi C + + + + + +

S = metodi di screening; C = metodi di conferma; + = la determinazione obbligatoria

27

Infatti generalmente lo screening un test a risposta binaria (negativo/sospetto)

che, quindi, non presenta le problematiche legate ad un esito quantitativo, quale

quello ottenuto con i metodi di conferma.

Riguardo ai parametri riportati in Tabella 2, essi devono essere determinati

durante lo studio di validazione. La validazione di un metodo la conferma

attraverso lesame e lapporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per

lutilizzazione prevista siano soddisfatti. Le definizioni dei parametri di

performances importanti per un metodo di screening qualitativo sono riportati di

seguito [VI].

.

Limite di decisione (CC = Critical Concentration ): il limite al quale

e oltre il quale possibile concludere con una probabilit di errore pari

ad che un campione non conforme. Lerrore rappresenta la

probabilit che il campione sottoposto ad analisi sia conforme, sebbene

sia stata ottenuta una misura non conforme (decisione di falsa non

conformit o falsa positiva).

Capacit di rilevazione (CC = Critical Concentration ): il CC il

contenuto pi piccolo della sostanza che possibile rilevare, identificare

e/o quantificare in un campione con la probabilit di un errore . Lerrore

rappresenta la probabilit che il campione sottoposto ad analisi sia

effettivamente non conforme, sebbene sia stata ottenuta una misura

conforme (decisione di falsa conformit o falsa negativa). Questo

parametro fondamentale per i metodi di screening in quanto, se una

decisione falsa positiva comporta unanalisi inutile di un campione con

metodo di conferma, diversamente una decisione falsa negativa ha come

ripercussione la commercializzazione di prodotti contaminati. La

massima percentuale di errore beta che viene ammessa dalla Decisione

2002/657/CE il 5%. Per metodi qualitativi, la verifica di tale percentuale

pu essere effettuata sulla base dei risultati ottenuti dallanalisi di almeno

venti bianchi-campione fortificati ad un livello pari o superiore al limite di

decisione.

Robustezza : la capacit posseduta da un metodo di non essere

influenzato significativamente, in termini di risultati finali, da variazioni

deliberate introdotte nelle sue fasi di effettuazione. Questo parametro

28

serve a qualificare laffidabilit di una procedura durante il suo utilizzo

routinario o la possibilit di riprodurre il metodo analitico in differenti

laboratori e in tempi diversi, senza una differenza significativa nei

risultati. Sperimentalmente la valutazione della robustezza pu essere

ottimizzata mediante lutilizzo di tecniche di disegno sperimentale, come

suggerito dalla stessa Decisione 2002/657/CE (schema di Youden).

Specificit : labilit di un metodo di rilevare solo quello che intende

rilevare, ovvero la sua capacit di non risentire della presenza di

interferenti o di altri componenti diversi dagli analiti in esame. Per lo

screening importante nel determinare la percentuale di campioni falsi

positivi, che, se presenti in misura elevata, vanificano lutilit dello

screening stesso, costringendo a rianalizzare i campioni sospetti con il

metodo di conferma.

E importante sottolineare che, rispetto ai tradizionali parametri limite di

rilevazione (LOD) e limite di quantificazione (LOQ), la Decisione 657

introduce il CC e il CC, limiti definiti in funzione, rispettivamente, della

probabilit di decisione falsa positiva e negativa. Ci comporta che, allorquando

si trattino sostanze con un LMR fissato, tali concentrazioni sono determinate a

partire dal LMR e non sulla presenza/assenza dellanalita e quindi non hanno

niente a che vedere con la sensibilit del metodo.

Tra le tecniche di screening pi utilizzate, soprattutto nel settore della ricerca di

sostanze ad azione anabolizzante (estrogeni, androgeni, beta-agonisti etc..) ci

sono i metodi immunoenzimatici e, in particolare, lELISA.

Scopo di questo lavoro di tesi stato lo sviluppo della procedura di

preparazione del campione e la validazione, secondo i criteri prescritti dalla

2002/657/CE, di un metodo di screening ELISA per la determinazione di residui

di chinolonici nel tessuto muscolare. Fino ad oggi la ricerca di questa

importante classe di antibiotici prevista dal PNR stata prevalentemente

effettuata mediante lutilizzo diretto dello stesso metodo di conferma in HPLC

con rilevazione in fluorescenza. La disponibilit di una procedura di screening

adatta allo scopo offre, quindi, interessanti prospettive nella riduzione dei tempi

di risposta e dei costi analitici.

29

3.2. I test immunoenzimatici ELISA

ELISA lacronimo dellespressione Enzyme Linked Immunosorbent Assay, un

metodo di analisi immunologica usato per rilevare leventuale presenza di un

dato antigene in un campione, oppure per misurare la concentrazione di

anticorpi nel plasma sanguigno, come ad esempio nei test per lAIDS. Il termine

ELISA sta a significare che il dosaggio unisce la specificit della reazione

antigene-anticorpo (reazione immunologica) con la sensibilit di un semplice

dosaggio spettrofotometrico di un enzima. Nellambito dei vari metodi

immunoenzimatici, la denominazione ELISA si riferisce esclusivamente ai

sistemi in fase eterogenea, sistemi in cui anticorpi o antigeni sono adsorbiti o

legati ad un substrato solido [XI].

LAntigene una molecola che pu legarsi ad una specifica immunoglobulina,

grazie ad una struttura specifica detta epitopo . Una singola molecola di

antigene pu contenere diversi epitopi riconosciuti da anticorpi differenti.

Lanticorpo (o immunoglobulina ) una glicoproteina del siero con una

peculiare struttura quaternaria che le conferisce una forma a Y. Sono costituiti

da una regione costante, comune a tutte le immunoglobuline appartenenti allo

stesso isotipo e una regione variabile che contiene invece il sito di

combinazione con lantigene e che quindi variabile a seconda della specificit

dellanticorpo per un dato antigene. Nellambito del sistema immunitario gli

anticorpi hanno la funzione di neutralizzare corpi estranei come virus e batteri,

riconoscendo ogni antigene legato al corpo come un estraneo [XII].

LELISA ha una elevata selettivit nei confronti degli analiti da determinare.

Lanticorpo, infatti, in grado di riconoscere specificamente lantigene che ha

portato alla sua formazione. La costante di affinit per la formazione dei

complessi antigene-anticorpo estremamente elevata e, bench la reazione sia

di tipo reversibile, lequilibrio di gran lunga spostato verso la formazione dei

complessi antigene-anticorpo. La tecnica si basa sul fatto che, con adatti

procedimenti, possibile coniugare gli anticorpi di un siero con alcuni enzimi

(perossidasi, fosfatasi alcalina, beta-galattosidasi) senza alterarne la capacit di

combinazione con gli antigeni corrispondenti. Gli enzimi utilizzati sono in grado

di catalizzare una reazione su un idoneo substrato (ad esempio la

tetrametilbenzidina) con la formazione di un prodotto terminale colorato che

permette cos di evidenziare la quantit di antigene presente.

30

Nei formati commerciali le reazioni vengono, di norma, eseguite allinterno di

pozzetti di polivinile o polistirene (micropiastre da 12 strip da 8 pozzetti

ciascuna per un totale di 96 pozzetti) su cui sono adesi, a seconda dei casi, gli

anticorpi specifici per lantigene di interesse o lantigene stesso. Allinterno dei

pozzetti vengono incubati i campioni da analizzare (plasma, siero, omogenati

tissutali, latte etc.) e gli opportuni reagenti intervallati da lavaggi atti a rimuovere

i reagenti in eccesso. Per ultimo si aggiunge il substrato che d origine al

prodotto colorato. La positivit valutata analizzando la comparsa o meno del

colore, in seguito alla reazione catalizzata dallenzima sul substrato. La tecnica

immunoenzimatica pu essere impiegata per la ricerca sia di antigeni che

anticorpi e si presta a numerose variazioni per altrettante applicazioni diverse. I

test ELISA possono essere, infatti, di tipo competitivo o non competitivo

(sandwich) (Figura 7).

31

Figura 7- Rappresentazione schematica di un saggio ELISA tipo sandwich (non competitivo) e competitivo diretto

I saggi tipo sandwich sono generalmente utilizzati per la ricerca di molecole ad

alto peso molecolare, come ad esempio, le proteine. Quando invece gli antigeni

sono molecole a basso peso molecolare, come nel caso della ricerca di residui

di farmaci o ormoni, i saggi sono sempre di tipo competitivo e possono essere a

loro volta ulteriormente classificati in diretti e indiretti. Per i test competitivi,

maggiore la concentrazione di antigene, minore sar il numero di

immunocomplessi rilevabili per cui, contrariamente a quanto avviene

generalmente in chimica analitica, esiste una proporzionalit inversa tra il

segnale registrato (assorbanza) e concentrazione.

ELISA competitivo di tipo diretto [XI]

Lanticorpo specifico per lanalita adsorbito sulla superficie dei pozzetti della

micropiastra. Il campione in esame, nel quale si deve determinare la presenza

dellanalita (antigene libero), e una quantit prefissata di coniugato (antigene

legato allenzima) vengono depositati nei vari pozzetti. Durante la fase di

incubazione, lantigene coniugato compete con lantigene libero,

eventualmente presente nel campione, per i siti di legame degli anticorpi adesi

nei pozzetti. Quindi, il materiale non reagito viene rimosso grazie ad opportuni

lavaggi e la quantit di analita coniugato, legata dagli anticorpi immobilizzati,

quantificata mediante laggiunta di un substrato che forma un prodotto

colorato. La reazione viene arrestata mediante laggiunta di una soluzione

acida (stop solution) e la lettura spettrofotometrica effettuata a 450 nm

(giallo).

ELISA competitivo di tipo indiretto [XX]

In questo caso lanalita (antigene, X), generalmente legato ad una proteina

carrier come lalbumina di siero bovino, ad essere adsorbito sulla superficie dei

pozzetti. Il campione viene addizionato nei pozzetti e successivamente si

aggiunge una quantit prefissata di anticorpo specifico per lanalita. Durante la

fase di incubazione, gli anticorpi in soluzione si ripartiscono tra lanalita libero

(X), eventualmente presente nel campione in analisi, e lanalita immobilizzato

sulla superficie solida del pozzetto. Tutto ci che non ha reagito durante

lincubazione viene successivamente rimosso mediante lavaggi e la quantit di

anticorpo legato allanalita specifico nel pozzetto viene quantificata mediante

aggiunta di un secondo anticorpo enzima-coniugato che si lega al primo. In

32

seguito ad una seconda fase di incubazione e ai lavaggi, si aggiunge il

substrato, si arresta la reazione e si procede alla lettura. Anche in questo caso,

la quantit di colore sviluppatosi risulter inversamente proporzionale alla

quantit di analita libero nel campione.

Sempre nei saggi competitivi di tipo indiretto, in alcuni casi, nella superficie dei

pozzetti sono adesi, invece che gli antigeni, degli anticorpi in grado di legare

anticorpi anti-antigene (X). Durante lesecuzione del test, si aggiunge la

soluzione contenente gli anticorpi anti-antigene che si legano agli anticorpi

adesi. Con laggiunta simultanea del coniugato e del campione (in cui pu

essere eventualmente presente lanalita libero (X) si origina la reazione di

competizione per i siti anticorpali gi vista sopra. Lo schema di questo tipo di

saggio riportato in Figura 8. Si procede infine ai lavaggi e allaggiunta del

substrato. La reazione viene arrestata mediante una soluzione acida (stop

solution), che muta il colore da blu a giallo e la lettura spettrofotometrica

effettuata a 450 nm.

Figura 9- Schema di un saggio competitivo indiretto

33

4. BIBLIOGRAFIA

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(Germany), 1998.

35

II - PARTE SPERIMENTALE

36

1. Introduzione

Durante le prove di validazione del metodo si sono effettuati esperimenti

utilizzando due differenti procedure di trattamento del campione, di seguito

denominate con A e B. Quindi, nella prima parte dello studio di

ottimizzazione/validazione, sono state eseguite prove ripetute in parallelo su

bianchi-campione e fortificati appartenenti a varie specie animali per verificare

le performances ottenute con i due diversi protocolli. Il metodo A pi semplice

e veloce ed , tranne per alcune piccole modifiche, sostanzialmente quello

suggerito dal produttore dei test ELISA adottati [I, II], mentre il metodo B pi

lungo e complesso, ma ha il vantaggio di portare a estratti pi concentrati e con

meno interferenti [III, IV]. Questo primo gruppo di esperimenti stato pianificato

per decidere quale fosse il trattamento pi adeguato da adottare.

Nella seconda parte dello studio di validazione, si invece utilizzato il solo

protocollo B ritenuto, in base allanalisi dei dati ottenuti nella prima parte, pi

efficace; quindi, si completata lindagine sulle caratteristiche di performances

del metodo, utilizzando la procedura pi complessa. Tale procedura prevede

unestrazione, una successiva purificazione in fase liquida (sgrassaggio) e una

in fase solida. Le due parti dello studio di validazione sono schematizzate in

Figura 1 della pagina seguente.

Gli esperimenti sono stati effettuati presso il Laboratorio Residui dellIstituto

Zooprofilattico Sperimentale dellUmbria e delle Marche, ad eccezione delle

prove eseguite con la procedura di preparazione del campione A, effettuate

presso il Laboratorio di Chimica dellIstituto Zooprofilattico Sperimentale

dellAbruzzo e del Molise.

37

I PARTE(SPECIFICITA'/ERRORE BETA)

FLUOROCHINOLONI (EIA)(Generic test)

50 L in doppio

FLUMECHINA (EIA)

50 L in doppio

TEST ELISA

ESTRATTO PURIFICATOCON

METODO A

-BIANCHI-CAMPIONE-FORTIFICATI

(acido ossolinico/flumechina)


50 L in doppio

FLUMECHINA (EIA)

50 L in doppio

TEST ELISA


METODO B

-BIANCHI-CAMPIONE-FORTIFICATI

(acido ossolinico/flumechina)

STUDIO DI VALIDAZIONE/OTTIMIZZAZIONE


METODO B

II PARTE


50 L in doppio

FLUMECHINA (EIA)

50 L in doppio

TEST ELISA

-FORTIFICATI(farmaci non chinoloni)

SPECIFICITA'


50 L in doppio

TEST ELISA

-FORTIFICATI(diflossacina-saraflossacina)

ERRORE BETA


50 L in doppio

FLUMECHINA (EIA)

50 L in doppio

TEST ELISA

FORTIFICATI(acido ossolinico/flumechina)

ROBUSTEZZA

STUDIO DI VALIDAZIONE

Figura 1- Schema del piano di validazione/ottimizza zione

Di seguito sono riportrati entrambi i metodi di trattamento del campione, nonch

le istruzioni per lesecuzione dei due saggi ELISA.

38

2. Metodo A: preparazione del campione secondo le indicazioni riportate dal produttore dei kit ELISA con piccole modifiche

2.1. Reagenti :

Acqua ultrapura per HPLC

Metanolo per HPLC

Normal esano

Sample dilution buffer: Pesare 0.97 g di Na2HPO4 H2O, 0.18 g di KH2PO4,

8.94 g di NaCl in un matraccio da 1 L e portare a volume con H2O

ultrapura per HPLC. Portare a pH=7.4 (7.3-7.5)

2.2. Materiali di riferimento ( standard analitici)

Standard di acido ossolinico (OXO): Sigma-Aldrich, cod. 00877

Standard di flumechina (FLU): Sigma-Aldrich, cod. 45735

Standard di diflossacina (DIF): Sigma-Aldrich, cod. 33984

Standard di marboflossacina (MAR): Sigma-Aldrich, cod. 34039

2.2.1. Soluzioni Madre dei Materiali di Riferimento

Le soluzioni madre sono conservate a +4C per tre m esi

Soluzione Madre di acido ossolinico 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio

idrossido

Soluzione Madre di flumechina 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio idrossido

Soluzione Madre di diflossacina 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio idrossido

Soluzione Madre di marboflossacina 0.1 mg/mL in 0.01 M di acido nitrico

Per ciascuna soluzione pesare circa 10 mg di standard in un matraccio tarato

da 100 mL e portare a volume.

39

2.2.2. Soluzione Intermedia dei Materiali di Riferi mento

Soluzione intermedia dei Materiali di Riferimento ( analiti) a 10 g/mL

La soluzione intermedia conservata a +4C per una settimana

Introdurre, mediante pipetta in vetro in un matraccio tarato da 10 mL 1 mL di

ciascuna soluzione madre a 100 g/mL e portare a volume con Metanolo per

HPLC.

2.2.3. Soluzione di Lavoro dei Materiali di Riferim ento

Soluzione di Lavoro dei Materiali di Riferimento a 1 g/mL

Con una pipetta da 2 mL prelevare 1 mL della soluzione intermedia a 10 g/mL

(2.2.2.) degli analiti (flumechina e acido ossolinico) e portare a volume con

Metanolo per HPLC in matraccio tarato da 10 mL.

NB: Le soluzioni di lavoro preparata di fresco al momento delluso.

2.3. Materiali

Cilindri in vetro

Imbuti di vetro

Matracci in vetro

Pipette tarate in vetro

Provette in plastica da centrifuga tipo Falcon da 15 e 50 mL

Puntali per micropipette

Siringhe tipo Hamilton

Kit immunoenzimatico: Fluoroquinolones EIA (Euro-Diagnostica cod. ED

21) e Flumequine EIA (Euro-Diagnostica cod. ED 22)

2.4. Apparecchiatura

Agitatore meccanico: (IKA, KS 501 digital)

Bilancia analitica 0.00001 g: (Mettler Toledo, XS 105 DU)

40

Bilancia tecnica, sensibilit 0.01 g: (Ohaus Corporation, Ohaus Explorer)

Centrifuga: (Hettich Rotina, 46 R)

Evaporatore a flusso dazoto: (BUCHI, 461 Buchi)

Frigorifero (4C 2C): (Angelantoni Industrie Spa, FCL 400/2 TS)

Lettore di micropiastre ELISA: (Bio-Rad, 550)

Ultraturrax: (Janke & Kunkel IKA-LABORTECHNIK, T 25)

Vortex: (Barloworld Scientific, Vortex Stuart SAS)

2.5. Estrazione

Pesare circa 1 g ( 0.1 g) di tessuto muscolare precedentemente

omogenato con ultraturrax in falcon di plastica da 50 mL

Aggiungere 3 mL di soluzione di estrazione (MeOH/Sample dilution buffer

80/20 v/v)

Vortexare per alcuni secondi

Porre su agitatore meccanico per 15 minuti

Centrifugare per 10 minuti a 4000 rpm

Prelevare 2 mL di surnatante

Portare a secco sotto flusso dazoto a 50C

Riprendere il residuo con 1 mL di MeOH/sample dilution buffer 8/92 v/v

Sgrassare con 1 mL di normal esano

Centrifugare brevemente e scartare lo strato superiore

Prelevare 50 L e diluire con 250 L di MeOH/sample dilution buffer 8/92

v/v e dispensare sul kit della Flumechina (par. 4. Reazione

immunoenzimatica (analisi ELISA)

Prelevare altri 50 L e diluire con 450 L di MeOH/sample dilution buffer

8/92 v/v e dispensare sul kit dei Fluorochinoloni (par. 4. Reazione

immunoenzimatica (analisi ELISA)

41

3. Metodo B: preparazione del campione con estrazi one e purificazione SPE

3.1. Reagenti

Acido fosforico 0.025 M a pH=3: Prelevare con pipetta di vetro da 2 mL 1.7

mL di acido ortofosforico 85%, porlo in un matraccio tarato da 1 L, portare

a volume con acqua per HPLC. Miscelare accuratamente e portare a pH 3

con NaOH 10 M.

Acqua ultrapura per HPLC

Ammoniaca concentrata al 30%

Normal esano

Idrossido di sodio 0.01 M

Metanolo per HPLC

Miscela di estrazione: Pesare 1 g di di acido metafosforico e introdurlo in

matraccio tarato da 100 mL. Solubilizzare e quindi portare a volume con

acqua. Prelevare 60 mL della precedente soluzione di MPA 1% (p/v) e

portare a volume con metanolo in matraccio tarato da 100 mL

Sample dilution buffer: Pesare 0.97 g di Na2HPO4 H2O, 0.18 g di KH2PO4,

8.94 g di NaCl in un matraccio da 1 L e portare a volume con H2O

ultrapura per HPLC. Portare a pH=7.4 (7.3-7.5).

3.2. Materiali di riferimento ( standard analitici)

Standard di acido ossolinico (OXO): Sigma-Aldrich, cod. 00877

Standard di flumechina (FLU): Sigma-Aldrich, cod. 45735

Standard di diflossacina (DIF): Sigma-Aldrich, cod. 33984

Standard di marboflossacina (MAR): Sigma-Aldrich, cod. 34039

Standard di saraflossacina (SAR): Sigma-Aldrich, cod. 33497

3.2.1. Soluzioni Madre dei Materiali di Riferimento

Le soluzioni madre sono conservate a +4C per tre m esi

42

Soluzione Madre di acido ossolinico 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio

idrossido

Soluzione Madre di flumechina 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio idrossido

Soluzione Madre di diflossacina 0.1 mg/mL in 0.01 M di sodio idrossido

Soluzione Madre di marboflossacina 0.1 mg/mL in 0.01 M di acido nitrico

Soluzione Madre di saraflossacina 0.1 mg/mL in 0.01 M di acido nitrico

Per ciascuna soluzione pesare circa 10 mg di standard in un matraccio tarato

da 100 mL e portare a volume.

3.2.2. Soluzione Intermedia dei Materiali di Riferi mento

Soluzione intermedia dei Materiali di Riferimento ( analiti) a 10 g/mL

La soluzione intermedia conservata a +4C per una settimana

Introdurre, mediante pipetta in vetro in un matraccio tarato da 10mL 1 mL di

ciascuna soluzione madre a 100 g/mL e portare a volume con Metanolo per

HPLC.

3.2.3. Soluzione di Lavoro dei Materiali di Riferim ento

Soluzione di Lavoro dei Materiali di Riferimento a 0.1 g/mL

Con una siringa tipo Hamilton prelevare 100 L della soluzione intermedia a 10

g/mL (3.2.2.) degli analiti (flumechina e acido ossolinico) e portare a volume

con Metanolo per HPLC in matraccio tarato da 10 mL.

NB: Le soluzioni di lavoro preparata di fresco al momento delluso.

3.3. Materiali

Colonnine SPE OASIS HLB Waters (30 mg/1 mL)

Cilindri in vetro

Filtri idrofili per siringa da 17 mm 0.45 m

Imbuti di vetro

43

Matracci in vetro

Pipette tarate in vetro

Provette in plastica da centrifuga tipo Falcon da 15 e 50 mL

Puntali per micropipette

Reservoir, adattatore e rubinetti per SPE

Siringhe tipo Hamilton

Kit immunoenzimatico: Fluoroquinolones EIA (Euro-Diagnostica cod. ED

21) e Flumequine EIA (Euro-Diagnostica cod. ED 22)

3.4. Apparecchiatura

Agitatore meccanico: (IKA, KS 501 digital)

Bagnomaria termostatato: (Heto, HMT 200)

Bilancia analitica 0.00001 g: (Mettler Toledo, XS 105 DU)

Bilancia tecnica, sensibilit 0.01 g: (Ohaus Corporation, Ohaus Explorer)

Centrifuga: (Hettich Rotina, 46 R)

Evaporatore a flusso dazoto: (BUCHI, 461 Buchi)

Frigorifero (4C 2C): (Angelantoni Industrie Spa, FCL 400/2 TS)

Lettore di micropiastre ELISA: (Bio-Rad, 550)

Ultraturrax: (Janke & Kunkel IKA-LABORTECHNIK, T 25)

Vortex: (Barloworld Scientific, Vortex Stuart SAS)

3.5. Estrazione

Pesare circa 1 g ( 0.1 g) di tessuto muscolare precedentemente

omogenato con ultraturrax in falcon di plastica da 50 mL

Aggiungere 4 mL di soluzione di estrazione (soluzione di MPA allo 0.6% in

MeOH/acqua 40/60)

Vortexare per circa 30 secondi

Porre su agitatore meccanico per 10 minuti

Immergere le provette in bagnomaria per 30 minuti a 45-50C per favorire

la precipitazione proteica

Lasciare raffreddare e centrifugare per 10 minuti a 4000 rpm

Filtrare il surnatante mediante filtri per siringa da 17 mm 0.45 m

44

Ripetere lestrazione, come sopra, con ulteriori 4 mL di soluzione di

estrazione (soluzione di MPA allo 0.6% in MeOH/acqua 40/60)

Unire gli estratti

Vortexare per rimescolare gli estratti

Prelevare la met dellestratto complessivo (circa 4 mL)

Ridurre sotto flusso dazoto a 40-50C il volume de llestratto fino a circa 2

mL per garantire la completa eliminazione del metanolo. La fase di

evaporazione del metanolo critica, poich la sua incompleta eliminazione

porta ad una perdita degli analiti durante la purificazione SPE

Alla fine del processo di evaporazione diluire gli estratti con 4 mL di

soluzione acquosa di MPA all1%

E possibile lasciare i campioni in frigo a +4C pe r una notte prima di

procedere allo sgrassaggio

Sgrassare con 3 mL di normal esano

Vortexare per qualche secondo, centrifugare brevemente, prelevare e

buttare lo strato superiore

E possibile lasciare i campioni in frigo a +4C pe r una notte prima di

procedere alla purificazione.

3.6. Purificazione SPE

Posizionare la colonnina OASIS in stazione da vuoto

Attivare la colonnina con 1 mL di metanolo e seccare, con 1 mL di acqua e

seccare

Caricare quantitativamente lestratto diluito

Scartare leluato avendo cura di non far seccare la colonnina

Lavare la colonnina con 2 mL di acido fosforico 0.025 M (pH=3)/Metanolo

95:5 v/v

Lavare con 2 mL di acqua

Far asciugare la colonnina sotto flusso daria per circa 15 minuti

Eluire i chinolonici con 2 mL di Metanolo/NH3 95:5 v/v in provetta di

plastica da 15 mL

E possibile lasciare i campioni in frigo per una notte a +4C prima di

procedere allanalisi ELISA

45

Portare a secco sotto flusso di azoto a 50C

Riprendere il residuo con 2 mL di Sample diluition buffer diluito

Vortexare per alcuni minuti

Seminare 50 L dei campioni in doppio su ciascuno dei due kit (par. 4.

Reazione immunoenzimatica o analisi ELISA)

4. Reazione immunoenzimatica (analisi ELISA)

4.1. Operazioni preliminari

Estrarre i kit dal frigorifero almeno unora prima dellesecuzione dei saggi

e porli a temperatura ambiente

Allapertura dei kit effettuare le seguenti operazioni valide per entrambe i kit:

Ricostituire il coniugato liofilizzato (CAP-HRPO) con 4 mL di tampone di

ricostituzione (dilution buffer). Agitare bene e conservare al buio

Ricostituire lanticorpo liofilizzato (antibody) con 4 mL di tampone di

ricostituzione (dilution buffer). Agitare bene e conservare al buio

Diluire il tampone di lavaggio (rinsing buffer) con acqua secondo le

indicazioni riportate nel libretto di istruzioni allegato al kit in uso (2 mL di

rinsing buffer concentrato con 38 mL dacqua). Per ogni strip sono

necessari circa 40 mL di tampone di lavaggio diluito. Conservarlo in una

spruzzetta

Prelevare il numero di pozzetti necessari alla esecuzione del saggio

considerando una semina in doppio sia degli standard che dei campioni, e

riporre immediatamente la piastra in frigorifero.

4.2. Esecuzione del saggio

Seminare in doppio 100 L di standard di Flumechina o Norflossacina a 0

ng/mL (bianco)

Seminare in doppio 50 L di standard di Flumechina o Norflossacina a 0

ng/mL (segnale massimo B0)

46

Seminare in doppio 50 L di standard di Flumechina a 1 ng/mL o

Norflossacina a 1.25 ng/mL forniti dai kit (standard obbligatori)

Qualora si voglia controllare lintera curva di taratura, seminare in doppio

50 L anche degli altri standard di Flumechina o Norflossacina forniti dai

kit, rispettivamente nel range tra 0.1 e 50 ng/mL e nel range tra 0.313 e 10

ng/mL (standard facoltativi)

Seminare in doppio 50 L di ciascun campione

Aggiungere 25 L del coniugato (CAP-HPRO) a tutti i pozzetti, tranne a

quelli del bianco

Aggiungere 25 L dellanticorpo diluito (Anti-CAP), a tutti i pozzetti, tranne

quelli del bianco

Agitare leggermente la micropiastra con un movimento rotatorio per alcuni

secondi

Incubare per 1 ora a temperatura di refrigerazione (4 2C), al buio

Scaricare il contenuto dei pozzetti e lavare per 3 volte con il tampone di

lavaggio, eliminando ogni volta i residui capovolgendo energicamente la

piastra su carta assorbente e avendo cura di eliminare completamente il

tampone

Procedere immediatamente con laggiunta di 100 L di substrato, a tutti i

pozzetti e agitare

Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (25 2C)

Aggiungere 100 L di soluzione darresto (stop solution), a tutte le cuvette

Leggere immediatamente i valori di assorbanza (OD) a 450 nm.

5. Elaborazione dei dati

Alla media delle assorbanze (optical density, OD) registrate o per un campione

o per uno standard sottratta la media delle assorbanze del bianco: si ottiene

cos una quantit indicata con B. Analogamente, alla media delle assorbanze

registrate per il segnale massimo (standard zero) sottratta la media delle

assorbanze del bianco: si ottiene cos una quantit indicata con B0.

Quindi si procede ad effettuare il rapporto tra B e B0 moltiplicando per 100:

47

100

ODOD

ODOD%

BB

biancomassimosegnale

biancocampione/dardtans

0

=

6. Studio di validazione

Il piano sperimentale dello studio di validazione stato approntato in conformit

ai criteri della Decisione della Commissione 2002/657/CE per metodi di

screening qualitativi. Lo schema completo utilizzato durante lo studio riportato

in Tabella 1.

Tabella 1- Livelli di fortificazione utilizzati nel lo studio di validazione del muscolo in funzione dei parametri determinati

FLUMEQUINE

ELISA GENERIC

FLUOROQUINOLONES ELISA

Parametro N di

esperi-menti

Tratta-mento FLU

(g/kg) OXO

(g/kg) DIF

(g/kg) SARA (g/kg)

I PARTE

specificita 20 A 0 0 0 0

specificita 21 B 0 0 0 0

CC 20 A 200 50 0 0

CC 21 B 10 10 0 0

II PARTE

FLUMEQUINE ELISA

GENERIC FLUOROQUINOLONES ELISA

Parametro

N di esperi-menti

Tratta-mento FLU

(g/kg) OXO

(g/kg) DIF

(g/kg) SARA (g/kg)

specificitb 6 B 0 0 0 0

CC 20 B 10 0 25 0

robustezza 8 B 10 10 0 0

Errore c 10 B 0 0 0 10 aProve di specificit effettuate su bianchi-campione per la verifica dellinfluenza delle sostanze endogene; bProve di specificit effettuate fortificando sei bianchi-campione con sei farmaci veterinari diversi dai chinolonici (sulfadimetossina, ossitetraciclina, nicarbazina, robenidina, dimetridazolo e cloramfenicolo); cProve aggiuntive effettuate su un numero limitato di campioni inferiore a quello minimo richiesto (20).

48

6.1. Curve in tampone

Come ogni sistema di rilevazione strumentale, anche la tecnica ELISA prevede

lallestimento di curve di taratura. Preliminarmente sono quindi stati seminati,

per entrambi i kit, i sei standard forniti dal produttore, al fine di verificare le

performances dei due prodotti. Per quanto riguarda il kit Generic

fluoroquinolones, gli standard forniti sono di norflossacina alle concentrazioni

progressive di 0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5 e 10 ng/mL, mentre per il kit

Flumequine gli standard sono di flumechina alle concentrazioni 0.1, 0.5, 1.5, 10

e 50 ng/mL.

6.2. Prima parte dello studio di validazione

La prima parte dello studio di validazione/ottimizzazione, come

precedentemente accennato, stata condotta in parallelo testando entrambe le

procedure di preparazione del campione (A e B), al fine di valutare quale

trattamento del campione sia adatto allo scopo di utilizzo del metodo.

6.2.1. Specificit (bianchi-campione)

Sono stati analizzati almeno venti bianchi-campione di tessuto muscolare

rappresentativi delle specie prelevate durante il controllo ufficiale (polli, suini,

bovini, ovi-caprini, pesci). Lo scopo quello di valutare linfluenza di possibili

interferenze endogene naturalmente presenti in matrice (falsi positivi).

6.2.2. Verifica della percentuale di errore beta (a cido ossolinico e

flumechina)

Almeno venti bianchi-campione sono stati fortificati a livelli di concentrazione

appropriati simultaneamente con flumechina e acido ossolinico. La fortificazione

avvenuta in parallelo allesperimento di specificit (6.2.1.). Durante le prove

preliminari, per il kit Generic fluoroquinolones, la scelta della molecola di

chinolone da utilizzare per la verifica delle performances e il relativo livello di

fortificazione sono stati individuati considerando la cross-reattivit dellanticorpo

(Tabella 2), lLMR fissato a livello comunitario e, non ultima, la procedura di

49

preparazione del campione (A o B).

Tabella 2- Cross- reattivit Kit Generic fluoroquinolones (Eurodiagnostica)

Molecola Cross -reattivit

Acido ossolinico 57

Ciproflossacina 124

Danoflossacina 89

Diflossacina 1

Enroflossacina 92

Marboflossacina 16

Saraflossacina 4

Norflossacinab 100

Si cos deciso di additivare con acido ossolinico a 50 e 10 g/kg

rispettivamente per il trattamento A e B, tenendo conto del diverso grado di

concentrazione dei due protocolli. Quindi si considerato che tutte le molecole

con cross-reattivit superiore a quella dellacido ossolinico (57%), ovvero

enroflossacina, ciproflossacina, danoflossacina e norflossacina siano rilevabili a

livelli uguali o inferiori a quelli di additivazione dellacido ossolinico. Questa

assunzione stata poi verificata sperimentalmente nella seconda parte dello

studio di validazione.

In questo tipo di validazione non si determina il valore di concentrazione esatto

corrispondente alla capacit di rilevazione (CC), ovvero il livello a cui si

registra una percentuale di falsi negativi pari al 5%, ma pi semplicemente si

valuta se, alle concentrazioni di interesse, i requisiti della Decisione

2002/657/CE sulla percentuale di errore beta siano soddisfatti (5%). Ad ogni

seduta stato seminato un solo standard in tampone a concentrazione

intermedia tra quelli forniti dal produttore per controllare le performances del kit

commerciale.

Nel caso della procedura A, la fortificazione di flumechina a 200 ppb stata

effettuata aggiungendo a ciascun campione 20 L di una soluzione di lavoro a

10 g/mL, mentre per lacido ossolinico a 50 ppb, si sono aggiunti 50 L di una

soluzione di lavoro a 1 g/mL. Per la procedura B, invece, le due fortificazioni a

10 ppb sono state effettuate aggiungendo a ciascun campione 100 L di

50

ciascuna soluzione di lavoro dei singoli analiti, alla concentrazione di 0.1

g/mL. Dopo aver effettuato le aggiunte, si lascia equilibrare il campione per

almeno 30 minuti.

6.3. Seconda parte dello studio di validazione

La seconda parte dello studio di validazione stata condotta utilizzando la sola

procedura di preparazione del campione B.

6.3.1. Specificit (campioni fortificati con farmac i veterinari diversi dai chinoloni)

Secondo quanto indicato dalla Decisione 2002/657/CE, sono stati utilizzati due

approcci per verificare la specificit: uno per le sostanze endogene (prima parte

dello studio) e laltro per composti esogeni (farmaci veterinari non appartenenti

alla classe dei chinoloni).

Utilizzando il metodo di preparazione del campione B, stata eseguita lanalisi

di una serie di bianchi-campione additivati con farmaci veterinari (antibiotici e

coccidiostatici) utilizzati lega

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