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Dispersione dei raggi X

• Nello studio delle proprieta strutturali di macromolecole, le tecniche

piu potenti sono quelle basate sulla dispersione dei raggi X.

Attraverso la cristallografia dei raggi X si puo determinare la strut-

tura terziaria di proteine o di acidi nucleici con una risoluzione minore

di 3 A.

Per sistemi meno ordinati, come fibre o aggregati lipidici, la diffrazione

dei raggi X fornisce utili informazioni strutturali.

Per macromolecole biologiche in soluzione, la diffusione (scattering)

dei raggi X permettere di ottenere informazioni sulla forma e le di-

mensioni delle particelle.

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I raggi X

• Da un punto di vista classico, sono onde elettromagnetiche con

lunghezza d’onda λ compresa tra 0.1 e 100 A. Da un punto di vista

quantistico, sono fotoni con energia E = hν = hc/λ compresa tra

0.1 e 100 KeV (1 KeV = 1.6 · 10−16 J).

Normalmente vengono generati bombardando una targhetta di met-

allo (es. Cu o Mo) con elettroni di energia circa 10 KeV. Questi

elettroni riescono a strappare gli elettroni degli orbitali piu interni

(guscio K) degli atomi. La vacanza viene rapidamente riempita at-

traverso la transizione di un elettrone atomico proveniente dai gusci

piu esterni (M e L).

λKα =hc

EL − EKλKβ =

hc

EM − EK

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Espulsione

M

L

K

elettrone espulso elettrone deviato

elettrone accelerato

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Transizione

M

L

K

hν

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Numeri complessi

z = a + ib a e b numeri reali

i =√−1 unita immaginaria

a parte reale

b parte immaginaria

|z| =√

a2 + b2 modulo

z∗ = a− ib complesso coniugato

z z∗ = |z|2z = |z|(cos α + i sin α)

cos α = a|z|

sin α = b|z|

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Relazione di Eulero

eiα = cos α + i sin α Relazione di Eulero

z = |z|eiα Notazione esponenziale

eiα e nota come fase del numero complesso

• Pertanto una funzione periodica seno o coseno puo essere espressa

con un esponenziale complesso.

Combinare gli esponenziali e piu semplice che combinare le funzioni

trigonometriche

ei(x+y) = eixeiy

cos(x + y) = cos x cos y − sin x sin y

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Campo elettromagnetico

E(r, t) = E0 cos[2π

(k·rλ − νt + δ

)]Notazione reale

E(r, t) = E0e2πi(k·r/λ−νt+δ) Notazione esponenziale

t tempo

E0 ampiezza massima

k vettore unitario nella direzione di propagazione

λ lunghezza d’onda

ν frequenza

δ fase

t > 0t = 0

origine

rk

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Differenza di fase

Consideriamo due onde che differiscono solo nella fase e che si som-

mano

E1(r, t) = E0e2πi(k·r/λ−νt+δ1)

E2(r, t) = E0e2πi(k·r/λ−νt+δ2)

= E1(r, t)e2πiδ δ = δ2 − δ1, spostamento di fase

E1(r, t) + E2(r, t) = E1(r, t)(1 + e2πiδ)

• Se δ = 1/2 (mezzo ciclo) 1 + e2πiδ = 0

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Esempio

E1(1 + e2πiδ), δ = 0

E2

E1

E1(1 + e2πiδ), δ = 1

4

E2

E1

E1(1 + e2πiδ), δ = 1

2

E2

E1

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Processo elementare di scattering

2θ

rivelatore

sorgentes

s0

• Un elettrone e posto al centro del sistema di riferimento. Un fascio

collimato di raggi X lo colpisce.

• Nel caso di scattering elastico (scattering Thompson), l’elettrone e

in grado di deviare il fascio in tutte le direzioni.

s0 vettore unitario nella direzione del fascio incidente

s vettore unitario nella direzione del fascio deviato

2θ angolo di scattering

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Scattering da due elettroni

r

s

s0

s

s0

La distanza r e molto piu piccola della distanza tra gli elettroni e la

sorgente e della distanza tra il rivelatore e gli elettroni

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Differenza di fase

differenza di cammino = r · s − r · s0

r · s0

r · s

r

s

s0

• Si puo calcolare la differenza di fase tra i due fasci deviati

δ =1

λr · (s− s0)

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Vettore di scattering

Q

2θ

s

s0

Conviene definire un nuovo vettore

Q ≡ 2π

λ(s− s0) corrisponde alla quantita di moto trasferita

2πδ = Q · r

Q =4π

λsin θ modulo di Q

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Fattore di struttura di un elettrone

Ampiezza delle due onde deviate dai due elettroni

Elettrone all’origine (scattering Thomson) E(Q) ≡ −r0sin Ψ

R E0

Elettrone in r E(Q)eiQ·r

r0 raggio classico dell’elettrone, R distanza tra elettrone e rivelatore,

Ψ angolo tra r e la direzione di polarizzazione.

• Il fattore di struttura di un elettrone in r e definito dal rapporto tra

l’ampiezza dell’onda diffusa dallo stesso elettrone e quella diffusa

dall’elettrone posto all’origine. Si ha pertanto

f (Q) ≡ eiQ·r

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Fattore di struttura di un atomo

• Per un atomo il fattore di struttura sara dato dal contributo di tutti

gli elettroni

f (Q) =

∫d3rρ(r)eiQ·r

ρ(r), densita elettronica

Quest’ultima equazione e una trasformata di Fourier. Il fattore di

struttura di un’atomo e quindi la trasformata di Fourier della sua

densita elettronica.

• Trasformata di Fourier inversa

ρ(r) =1

(2π)3

∫d3Qf (Q)e−iQ·r

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Proprieta del fattore di struttura

f (0) =

∫d3rρ(r) ≡ Z Numero atomico

E’ un numero complesso, costituito pertanto da una parte reale ed

una immaginaria, oppure da un modulo e una fase.

• Il rilevatore e in grado di misurare non l’ampiezza, ma l’intensita

della radiazione diffusa. Avendo adottato la notazione complessa,

l’intensita dipende dal quadrato del numero complesso, e quindi

soltanto dal modulo di f (Q)

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Sezione d’urto differenziale

• Per un fascio di raggi X non polarizzato si definisce la sezione d’urto

differenziale dσdΩ(Q) come il rapporto tra l’energia diffusa per unita

di tempo e l’energia incidente per unita di tempo e di area,

dσ

dΩ(Q) = r2

0

(1 + cos2(2θ)

2

)f (Q) f ∗(Q)

= r20

(1 + cos2(2θ)

2

)|f (Q)|2

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Rappresentazione di Fourierdella δ(Q) di Dirac

Estensione a tre dimensioni della δ(x)

δ(Q) =

0 Q 6= 0

∞ Q = 0

• Rappresentazione di Fourier

δ(Q) =1

(2π)3

∫d3r eiQ·r

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Fattori di struttura atomici

Con buona approssimazione, la densita elettronica di un atomo ha

una simmetria sferica, ρ(r) ≡ ρ(r), dove r ≡ (r, θ, φ)

• I fattori di struttura diventano funzioni reali che dipendono soltanto

dal modulo Q

f (Q) =

∫ ∞

0

r2dr

∫ π

0

sin θdθ

∫ 2π

0

dφ ρ(r) eiQ·r

= 4π

∫ ∞

0

r2drρ(r)sin(Qr)

Qr≡ f (Q)

trasformata di Fourier isotropa

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Esempio

K

Cl

S

P

Na

O

N

C

H

Q (A−1

)

f(Q)

109876543210

20

18

16

14

12

10

8

6

4

2

0

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Fattore di struttura di una molecola

In generale, dovremo prendere in rassegna tutti gli elettroni. Si

ottiene

F (Q) =

∫d3rρ(r)eiQ·r

ρ(r), densita elettronica molecolare

• D’altra parte gli elettroni sono concentrati negli atomi. Sia N il

numero totale di atomi. L’atomo n-esimo si trovera nella posizione

rn. Il suo fattore di struttura dovra essere moltiplicato per la fase

corrispondente eiQ·rn. Si ha dunque

F (Q) =

N∑n=1

fn(Q)eiQ·rn

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Scattering di due atomi

Gli atomi sono identici, il loro fattore di struttura e f (Q). Il primo

e nell’origine, l’altro in a

F (Q) = f (Q) (1 + eiQ·a)

• Calcoliamo la sezione d’urto differenziale

dσ

dΩ(Q) = r2

0

(1 + cos2(2θ)

2

)F (Q) F ∗(Q)

= r20

(1 + cos2(2θ)

2

)f 2(Q)(1 + eiQ·a)(1 + e−iQ·a)

= r20

(1 + cos2(2θ)

2

)2f 2(Q)[1 + cos(Q · a)]

• Ci sono due termini, uno deriva dai singoli atomi, l’altro tiene conto

della loro distanza

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Scattering di un reticolomonodimensionale di atomi

a

0

Sia a il vettore traslazione e sia N il numero totale di atomi, tutti

identici. Si ha

F (Q) = f (Q)

N∑n=1

ei(n−1)Q·a

= ei(N−1)Q·a2 f (Q)sin

(N Q·a

2

)sin

(Q·a2

)

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Sezione d’urto differenziale

dσ

dΩ(Q) = r2

0

(1 + cos2(2θ)

2

)F (Q) F ∗(Q)

= r20

(1 + cos2(2θ)

2

)f 2(Q)S(Q)

S(Q) =

sin(N Q·a

2

)sin

(Q·a2

)2

funzione d’interferenza

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N = 1

S(Q)[f (Q)]2S(Q)

N 2[f (Q)]2

Q·a2π

3210-1-2-3

12

10

8

6

4

2

0

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N = 2

S(Q)[f (Q)]2S(Q)

N 2[f (Q)]2

Q·a2π

3210-1-2-3

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0

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N = 4

S(Q)[f (Q)]2S(Q)

N 2[f (Q)]2

Q·a2π

3210-1-2-3

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

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N = 15

S(Q)[f (Q)]2S(Q)

N 2[f (Q)]2

Q·a2π

3210-1-2-3

3000

2500

2000

1500

1000

500

0

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Condizione di van Laue

Si nota che se Q·a2π e un numero intero, S(Q) = N 2. Quando N e

molto grande, i picchi diventano molto alti e stretti.

• In sostanza, solo certe orientazioni tra il cristallo monodimensionale

e Q danno luogo a un segnale diverso da zero. Questa condizione e

nota come la condizione di van Laue

Q · a2π

= h h = 0,±1,±2, . . .

(s− s0) · aλ

= h h = 0,±1,±2, . . .

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Piani paralleli

Q·a2π = h h = 2

2π

a

h = −2

2π

a

h = −1

2π

a

h = 1

2π

a

a

h = 0

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Sfera di Ewald

Q

2π

λ

s

s0

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Caso a e s0 paralleli

Q

s

s0

h = −5

2π

a

h = −4

2π

a

h = −3

2π

a

h = −2

2π

a

h = −1

2π

a

h = 0

a2π

λ

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Caso a e s0 perpendicolari

Qs

s0

h = 2

2π

a

h = 1

2π

a

h = 0

2π

a

h = −1

2π

a

h = −2

2π

a

a

2π

λ

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Reticolo bidimensionale

R = naa + nbb na,b = 0,±1,±2, . . .

R

b

a

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Reticolo tridimensionale

I 14 reticoli di Bravais, R = naa+nbb+ncc, con na,b,c = 0,±1,±2, . . .

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Scattering di un reticolotridimensionale di atomi

E’ un’estensione del caso monodimensionale. Siano a, b e c i tre

vettori traslazione del reticolo. Il fattore di struttura risulta

F (Q) = f (Q)∑na

∑nb

∑nc

eiQ·(naa+nbb+ncc)

• Condizioni di van Laue: F (Q) e diverso da zero solo quando

Q · a = 2πh h = 0,±1,±2, . . .

Q · b = 2πk k = 0,±1,±2, . . .

Q · c = 2πl l = 0,±1,±2, . . .

⇒ eiQ·R = 1

h, k, l sono gli indici di Miller

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Definizione di Fh,k,l

Quando le tre condizioni sono rispettate, risulta allora

F (Qh,k,l) = f (Qh,k,l)∑na

∑nb

∑nc

1

• Si scrive allora

F (Qh,k,l) ≡ Fh,k,l = Nf(Qh,k,l)

dove N e il numero totale di atomi nel reticolo. Il fattore di struttura

atomico viene “campionato” soltanto per determinati valori di Q,

quelli che obbediscono alle condizioni di von Laue.

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Cristallo

Un cristallo molecolare e un reticolo di Bravais in cui nelle posizioni

reticolari sono presenti una o piu molecole

Reticolo + Base = Cristallo

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Esempio 1

R

b

a

+ =

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Esempio 2

R

b

a

+ =

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Scattering da un cristallo molecolare

Applicando il teorema della convoluzione, si dimostra che il fattore

di struttura risulta

F (Q) = Fm(Q)∑na

∑nb

∑nc

e2πi(nah+nbk+ncl) = Fh,k,l = NFm(Qh,k,l)

dove Fm(Q) e il fattore di struttura molecolare della cella unitaria

Fm(Q) =∑

j

fj(Q)eiQ·rj

rj vettore del j-esimo atomo nella cella unitaria

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Fh,k,l di un cristallo molecolare

Possiamo esprimere il vettore rj in termini dei vettori di cella

rj = xja + yjb + zjc

• Si ha pertanto

Fm(Q) =∑

j

fj(Q)eiQ·(xja+yjb+zjc)

• Applicando le condizioni di van Laue si ottine infine

Fh,k,l =∑

j

fj(Q)e2πi(hxj+kyj+lzj)

• Rappresenta lo scattering della cella unitaria campionato nei punti

reticolari h, k, l.

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Il reticolo reciproco

Nello spazio reale, il reticolo rappresenta l’insieme delle posizioni che

si ripetono a distanze regolari. Si puo dimostrare che nello spazio

reciproco, lo spazio del vettore di scattering Q, i punti che rispettano

le tre condizioni di von Laue costituiscono, a loro volta, un reticolo,

il reticolo reciproco.

• I tre vettori del reticolo reciproco risultano

a∗ = 2πb× c

Vb∗ = 2π

c× a

Vc∗ = 2π

a× b

V

dove V = a · b × c e il volume della cella unitaria. Il simbolo ×rappresenta il prodotto vettoriale e il simbolo · il prodotto scalare.

• I valori di Q che appartegono al reticolo reciproco si calcolano dalla

relazione

Qh,k,l = ha∗ + kb∗ + lc∗

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Esempio

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Scattering di un reticolo 3D

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Esempio: Lisozima

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Densita elettronica

La densita elettronica all’interno della cella unitaria si calcola at-

traverso l’antitrasformata di Fourier del fattore di struttura. Tenendo

conto delle condizioni di van Laue, si ottiene

ρ(r) =1

NV

∞∑h=−∞

∞∑k=−∞

∞∑l=−∞

Fh,k,l e−2πi(hx+ky+lz)

dove r = (x, y, z) e il vettore nello spazio diretto.

• Tuttavia dagli esperimenti si possono calcolare soltanto i moduli

|Fh,k,l| ma non le fasi eiφ. Il problema delle fasi e uno dei piu grandi

ostacoli della cristallografia.

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Centro di simmetria

Se la densita elettronica possiede un centro di simmetria,

ρ(r) = ρ(−r)

• Si dimostra che Fh,k,l e un numero reale, per cui

eiφ = ±1

ovvero c’e solo incertezza sul segno. Per n fattori di struttura, 2n

possibili scelte

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Metodo delle sostituzioniisomorfe multiple

1. Si preparano differenti cristalli della macromolecola biologica con sostituzioni isomorfe dialcuni atomi con atomi pesanti.

2. Si tenta di trovare la locazione degli atomi pesanti nel cristallo (metodo di Patterson)

3. Si calcola il fattore di struttura degli atomi pesanti

F(H)h,k,l =

∑j=atomi pesanti

fj(Q)e2πi(hxj+kyj+lzj) = |F (H)h,k,l|e

iφh,k,l

4. Si assegnano le fasi degli atomi pesanti φh,k,l alle fasi dei fattori di struttura totali con glistessi h, k, l.

5. Si calcola quindi la densita elettronica totale e da questa una nuova posizione degli atomipesanti. Si torna quindi allo step 2.

6. Dalla struttura ricavata si calcolano gli Fh,k,l di tutti cristalli isomorfi e da queste le densitaelettroniche.

7. Si torna quindi allo step 2 e si ripete la procedura per tutti i cristalli isomorfi disponibili.

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Dal cristallo alle polveri 1

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Dal cristallo alle polveri 2

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Coni di diffrazione

• Il campione e costituito da grani policristallini con orientazione ca-

suale

• I fasci diffratti si dispongono in coni

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Diffrazione da polveri

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Confronto intensita diffratte

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La legge di Bragg

E’ una formulazione equivalente alle condizioni di van Laue. Si

puo dimostare che ad ogni vettore Qh,k,l del reticolo reciproco cor-

risponde una famiglia di piani nel reticolo diretto che contengono i

punti reticolari e che si trovano a distanza

dh,k,l =2π

Qh,k,l

• La legge di Bragg mette in relazione il valore di dh,k,l con l’angolo

di scattering 2θ e la lunghezza d’onda

2dh,k,l sin θ = nλ n = ±1,±2, . . . ordine di diffrazione

Questa formulazione e piu utile per descrivere la diffrazione.

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Analisi di un picco di diffrazione

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Informazioni ottenibili• Posizione dei picchi:

Distanze interplanari

Cella cristallografica

Determinazione di fase

Analisi qualitativa

• Intensita dei picchi:

Intensita di una fase

Analisi strutturale

Intensita di piu fasi

Analisi quantitativa

• Larghezza dei picchi

Dimensione dei cristalliti

Deformazione dei cristalliti

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Diffrazione di sistemi lipidi/acqua

I sistemi lipidi/acqua sono in grado di generare numerose fasi, in

funzione della concentrazione, della temperatura o della pressione.

La caratteristica fondamentale di tali sistemi e la tendenza a segre-

gare la parte polare e quella apolare delle molecole in regioni distinte

• Come diretta conseguenza, in fase acquosa si formano stutture or-

dinate a lungo raggio, in una due o tre dimensioni.

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Fasi lipidiche

Lamellari Esagonali Cubiche

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Diffrazione di fasi lipidiche

Le fasi lipidiche sono strutturalmente analoghe a sistemi policristallini

di reticoli in una, due o tre dimensioni.

• Da uno spettro di diffrazione dei raggi X e dunque possibile risalire

alla identificazione delle fasi presente e alla determinazione della loro

struttura (parametri di cella)

La simmetria del reticolo si riflette infatti in una serie di riflessioni

di Bragg che nello spazio reciproco hanno un caratteristico rapporto

di posizioni.

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Valori di Q permessi per fasi lipidiche

Fase Q Rapporti di spaziatura

Lamellare Qh = 2πd h 1 : 2 : 3 : 4 . . .

Esagonale Qhk = 4π√3a

√h2 + k2 − hk 1 :

√3 :√

4 :√

7 :√

12 . . .

Cubica Qhkl = 2πa

√h2 + k2 − l2 Ia3d (Q230)√

6 :√

8 :√

14 :√

16 :√

20 :√

22 :√

24 . . .Pn3m (Q224)√

2 :√

3 :√

4 :√

6 :√

8 :√

9 :√

10 . . .Im3m (Q229)√

2 :√

4 :√

6 :√

8 :√

10 :√

12 :√

14 . . .Pm3n (Q223)√

2 :√

4 :√

5 :√

6 :√

8 :√

10 :√

12 . . .Fd3m (Q227)√

3 :√

8 :√

11 :√

12 :√

16 :√

19 :√

24 . . .P4332 (Q212)√

2 :√

3 :√

5 :√

6 :√

8 :√

9 :√

10 . . .

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Analisi delle intensita

Assegnata la fase, ad ogni picco di diffrazione e possibile assegnare

gli indici h, k, l (indicizzazione).

Per effetto della simmetria, alcune terne h, k, l possono portare allo

stesso Qh,k,l, percio si definisce la molteplicita della riflessione mh,k,l

• La maggior parte delle fasi lipidice sono centrosimmetriche, ovvero

ρ(r) ≡ ρ(−r). Si ha pertanto

Fh,k,l = ±

√Ih,k,l

mh,k,l

• Problema delle “fasi”

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Soluzione con metodi indiretti1. Da informazioni sulla

molecola di lipide e da con-

siderazioni di simmetria si

costruisce un modello di den-

sita elettronica

2. Dalla densita elettronica mod-

ello si calcolano i fattori di

struttura e quindi le intensita

3. Si confrontano le intensita

teoriche con quelle sperimen-

tali

4. Si modifica il modello di den-

sita elettronica e si ritorna allo

step numero 1 finche l’accordo

tra intensita teorica e speri-

mentale (step 3) e considerato

accettabile

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Esempio fase lamellare

d

z

ρ(z

)

100806040200

Fh ≡ F (Qh) =

∫ρ(z) cos(Qhz) dz

Qh =2π

dh h = 1, 2, 3, . . .

Metodo dello swelling. Si ipo-

tizza che, diluendo il lipide, ρ(z)

non cambi, ma cambi soltanto d:

il fattore di struttura viene “cam-

pionato” in diversi valori di Q