Diffrazione

Schema generale della camera di flusso di un citometro ottico

PLT

RBC

Sistemi ad Impedenzae Globuli Rossi

Sistemi ad Impedenzae Globuli Rossi

Emocromo: Terminologia • WBC. White Blood Cells, Globuli Bianchi (GB). Indica il numero

di GB per mL o L di sangue.

• RBC. Red Blood Cells o Globuli Rossi (GR). È il numero di GR per mL o L di sangue.

• Hb. Hemoglobin o emoglobina Esprime la quantità (espressa in grammi) di Hb presente in un L o dL di sangue.  

• Ht. Hematocrit (ematocrito). • Reticolociti. G.R. neoformati

Emocromo: Terminologia INDICI

• MCV, Mean Corpuscular Volume, (Volume Corpuscolare Medio). Indica il volume medio dei globuli rossi. I GR normali sono, per quanto riguarda il volume, normocitici. Se il volume diminuisce, come nelle talassemie o nell'anemia da carenza di ferro, i GR sono definiti microcitici; se aumenta (p.e. nelle anemie da carenza di vitamina B12) si avrà una macrocitosi delle emazie.  

• MCH, Mean Corpuscolar Hemoglobin. Indica la quantità media di emoglobina in ogni globulo rosso. 

• MCHC, Mean corpuscolar Hemoglobin Concentration o Concentrazione Emoglobinica Corpuscolare Media. Indica la concentrazione media di emoglobina all'interno del singolo globulo rosso. 

• MPV, Mean platelet Volume o Volume Piastrinico Medio. Indica il volume medio delle piastrine. 

Emocromo: Terminologia

• Anisocitosi. notevole variazione nelle dimensioni dei globuli rossi o delle piastrine. Se di entità importante sono segnalate con una scala numerica (1+, 2+ ecc.) Se le dimensioni dei GR diminuiscono o aumentano avremo una microcitosi o una macrocitosi delle emazie, Lo stesso per le piastrine. 

• Poichilocitosi. Variazione della forma del contorno dei G.R. Forma a falce: drepanociti (anemia falciforme); di cellula a bersaglio o codocita (talassemie ed altre anemie); sferica o sferociti (sferocitosi ereditaria); di ellissi (ellissicitosi o ovalocitosi ereditaria); di frammenti globulari o schizociti

• Aggregati piastrinici. Indica la presenza di ammassi piastrine che appaiono riunite assieme, invece di essere separate, come di norma. In genere è un artefatto di laboratorio e non ha nessun significato clinico.

• •

Stabilità nel tempo dei Stabilità nel tempo dei parametri ematologiciparametri ematologici

U.O. Pat. Clinica

2002

Hb (mg/dl)

Hct (%)

MCV (fl)

PLT (103/l)

RET (#)

0 13.91.2 42.02.9 87.03.8 244.857.4 83.924.2

6h 13.91.0 41.72.6 86.13.8 245.751.2 83.717.9

9h 14.01.1 42.02.5 86.63.8 243.553.6 75.816.9

24h (T°a) 14.31.2 43.72.9 89.43.6 247.557.5 71.723.3

24h (T4°C) 14.51.1 43.43.1 86.63.8 248.857.3 85.423.8

CITOMETRIA A FLUSSOCITOMETRIA A FLUSSO

RBC

HGB

HTC

MCV

MCH

MCHC

RDW

120 fL120 fL60 fL60 fL

RDWRDW

MCVMCV

AnisocitosiFisiologica

CHCMCHCM

HDWHDW

28 g/dL 41 g/dL

AnisocromiaFisiologica

20050 100 200

RDW Normale< 15,5%

10050

RDW Elevato 18 %

50 100 200

RDW Molto Elevato35 %

RDW (Red Distribution Width)RDW (Red Distribution Width)

È un valore statistico corrispondente alla DS o al CV della distribuzione dei Globuli Rossi. Equivale all’ Indice di Anisocitosi

È un valore statistico corrispondente alla DS o al CV della distribuzione dei Globuli Rossi. Equivale all’ Indice di Anisocitosi

How Useful Are RBC and Reticulocyte Reports to Clinicians?

Am J Clin Pathol 118(5):787-793, 2002

PARAMETRI PIU’ FREQUENTEMENTE USATI

RBC HB HT MCV MCH

MCHC

reticolociti

Ematocrito o PCV (Packed Cells

Volume) o HCT (HematoCriT) • Valori ematici normali nell'uomo: 42% - 51% Valori ematici

normali nella donna: 37% - 47%   rappresenta il volume percentuale della frazione corpuscolata del sangue rispetto al volume totale del sangue.

Metodo di determinazione Manuale 

• Il sangue venoso reso incoagulabile (per aggiunta di una soluzione di ossalato di calcio ed ossalato di potassio in rapporto 3:2 e con concentrazione finale di 2 mg per ml di sangue) si centrifuga nella provetta ematocrito di Wintrobe a 1500 giri per 30 minuti. In condizioni normali la frazione corpuscolata occupa circa il 45% del volume totale di sangue.

How Useful Are RBC and Reticulocyte Reports to Clinicians?

Am J Clin Pathol 118(5):787-793, 2002

PARAMETRI PIU’ FREQUENTEMENTE USATI

RBC HB HT MCV MCH

MCHC

reticolociti

Variazioni dell’emoglobina

Increased Hemoglobin (Increased Red Blood Cell Count ) • Polycythemia Vera • Vigorous Exercise • High altitude • Tobacco Abuse • Renal cell carcinoma • Cardiovascular disease • Stress • Dehydration • Decreased Hemoglobin (decreased Red Blood Cell Count ) • Anemia

AnemiaClassificazione fisiopatologicaRidotta produzione di eritrociti Aplasia midollare Infiltrazione neoplastica del midollo osseo Carenza di vitamina B12 e/o di folati Sindromi mielodisplastiche Anemia da IRCSintesi emoglobinica anomala o ridotta Anemia sideropenica Anemia da disordini cronici(infiammazioni, infezioni, neoplasie) Sindromi talassemiche Emoglobine abnormi Anemia associata a endocrinopatieAumentata distruzione eritrocitaria Anemie emolitiche Da causa intracorpuscolare Alterazioni della membrana eritrocitaria Alterazioni della glicolisi anaerobia Deficit enzimatici dello shunt degli esosomonofosfati Alterazioni qualitative dell’emoglobina Da cause extracorpuscolare Cause meccaniche Malattie emolitiche isoimmuni e autoimmuni

AnemiaClassificazione di laboratorio

Anemia microcitica/ipocromica (MCV<79fl, MCHC<32%) Diagnosi differenziale fra anemia sideropenica e trait talassemico

Anemia normocitica/normocromica (80<MCV<94 fl, 32%<MCHC<36%) Una spiccata reticolocitosi esclude un difetto dell’emoglobinosintesi o dell’eritropoiesi, mentre suggerisce una anemia post emorragica acuta o una forma emolitica

Anemia macrocitica/normocromica o ipocromica (MCV >94 fl, 32%<MCHC<36%) Quando il valore di MCV supera i 110 fl l’anemia viene definita megaloblastica. Riduzione della reticolocitosi

High angle detector5°-15°

LUCE RIFRATTAConcentrazione Hb

High angle detector5°-15°

LUCE RIFRATTAConcentrazione Hb

Low angle detector2°-3°

SCATTER Volume RBC

Low angle detector2°-3°

SCATTER Volume RBC

sfericizzazionesfericizzazione

VVOOLLUUMMEE

Densità (concentrazione Hb)Densità (concentrazione Hb)

Densità (concentrazione Hb)Densità (concentrazione Hb)

VVOOLLUUMMEE

HC <28HC <28 HC 28-41HC 28-41 HC >41HC >41

V > 120 V > 120 946 (4.7%)946 (4.7%) 6256 (31.1%) 6256 (31.1%) 9 (0.0%) 9 (0.0%)

V 60-120V 60-120 3082 (15.3%)3082 (15.3%) 7553 (37.6%) 7553 (37.6%) 64 (0.3%) 64 (0.3%)

V < 60V < 60 981 (4.6%) 1221 (6.1%) 40 (0.2%)981 (4.6%) 1221 (6.1%) 40 (0.2%)

MacrociticheMacrociticheipocromicheipocromiche

MacrociticheMacrocitichenormocromichenormocromiche

MacrociticheMacrociticheipercomicheipercomiche

NormociticheNormociticheipercromicheipercromiche

MicrociticheMicrociticheipercrimcheipercrimche

MicrociticheMicrocitiche

normocromichenormocromiche

MicrociticheMicrociticheipocromicheipocromiche

NormociticheNormociticheipocromicheipocromiche

NormociticheNormocitichenormocromichenormocromiche

L’anemia non è un “innocent bystander”, ma impatta decisamente sulla mortalità e morbilità ed il suo trattamento ha effetti benefici evidenti.Nissenson et al. Arch Inter Med 2003; 163:1400-3

L’anemia è un fattore di rischio indipendente nello scompenso cardiaco cronico e per ogni 1% di HcT in meno vi è un aumento della mortalità del 1.6%.

In un’ampia coorte di pazienti in istituti di ricovero con insufficienza cardiaca, l’anemia è un fattore prognostico indipendente di mortalità

Justin A. Ezekowitz et al. Circulation. 2003;107:223

L’anemia è associata con sintomi più gravi, maggior insufficianza funzionale e un significativo aumento della mortalità in pazienti con insufficienza cardiaca avanzata

Horwich, T. B et al. JACC 39: 1780-1786

Blood transfusion is associated with a lower short-term mortality rate among elderly patients with acute myocardial infarction if the hematocrit on admission is 30.0 percent or lower and may be effective in patients with a hematocrit as high as 33.0 percent on admission. Wu W-C et al.NEJM 345:1230-1236, 2001

In older women with disabilities, a haemoglobin (Hb) concentration of 14,0 g/dL was associated with a lower risk of all cause mortality than concentrations of 11,0 g/dL and 12,0 g/dL after adjustment for chronic disease burden. Mortality risk decreased with increasing Hb concentrations up to a threshold of 13,9 g/dL. Chaves PH et al Evidence-Based Medicine 2005; 10:90-97

L’anemia (HcT < 35%) è un fattore indipendente di morte in interventi di chirurgia generale

Nei dializzati un HcT fra 33 e 39 abbatte del 16% la possibilità di ospedalizzazione ed è associato ad un basso rischio di morte

Definizione di Anemia della WHO

Hemoglobin < 13g/dL for men and < 12 g/dL for women

Source Men g/dL Women g/dL

WHO 13,0 12,0

Jandl 14,2 12,2

Beutler 14,0 12,3

Lee 13,2 11,6

Rapaport 14,0 12,0

Goyette 13,2 11,7

Tietz 13,2 11,7

Hoffman 13,5 12,0

… e nei neonati e nei bambini ?

… e nelle gravide?

… e negli anziani?

Emoglobina I. Normal Values per age (-2 to +2 S.D) II. Birth: 13.5 to 24.0 g/dl (mean 16.5 g/dl) III. Age <1 month: 10.0 to 20.0 g/dl (mean 13.9 g/dl) IV. Age 1-2 months: 10.0 to 18.0 g/dl (mean 11.2 g/dl) V. Age 2-6 months: 9.5 to 14.0 g/dl (mean 12.6 g/dl) VI. Age 0.5 to 2 years: 10.5 to 13.5 g/dl (mean 12.0 g/dl) VII. Age 2 to 6 years: 11.5 to 13.5 g/dl (mean 12.5 g/dl) VIII. Age 6-12 years: 11.5 to 15.5 g/dl (mean 13.5) IX. Female A. Age 12-18 years: 12.0 to 16.0 g/dl (mean 14.0 g/dl) B. Age >18 years: 12.1 to 15.1 g/dl (mean 14.0 g/dl) C. Male D. Age 12-18 years: 13.0 to 16.0 g/dl (mean 14.5 g/dl) E. Age >18 years: 13.6 to 17.7 g/dl (mean 15.5 g/dl)

Variazioni dell’emoglobina

Anemia Cut-offs

Men

1. Age 12-14 years: <12.5 g/dl (CDC)

2. Age 15-17 years: <13.3 g/dl (CDC)

3. Age >17 years: <13 g/dl (WHO) or <13.5 g/dl (CDC)

Women (Non-pregnant, non-lactating)

• Age 12-14 years: <11.8 g/dl • Age 15-17 years: <12.0 g/dl • Age >17 years: <12 g/dl

(WHO and CDC)

Women in Pregnancy (CDC Guidelines <5th percentile)

1. First Trimester: <11.0 g/dl

2. Second Trimester: <10.5 g/dl

3. Third Trimester: <11.0 g/dl

Children (CDC Guidelines <5th percentile)

• Age 1-2 years: <11.0 g/dl • Age 2-5 years: <11.1 g/dl • Age 5-8 years: <11.5 g/dl • Age 8-11 years: <11.9 g/dl

1.

… e nelle persone di colore?

Group Hemoglobin, g/dL  

White men, y

20-59   13.7

60+ 13.2

White women, y

20-49 12.2

50+ 12.2

Black men, y

20-59 12.9

 60+ 12.7

Black women, y

20-49 11.5

 50+ 11.5  

Anemia sideropenica

• MCV < 80 fl (fase clinica)• Hb correla con MCV e RBC• Ipocromia e

anisopoichilocitosi• Ferritina ↓, transferrina ↑

sideremia ↓• Recettori solubili per la

transferrina ↑• Reticociti ↓• Ridotta Hb reticolocitaria• RDW ↑

STADI DI CARENZA MARZIALESTADI DI CARENZA MARZIALE

Fe depositoFe deposito

Fe trasportoFe trasporto

NO

RM

AL

EN

OR

MA

LE

DE

PL

EZ

ION

E

DE

PL

EZ

ION

E

DE

PO

SIT

ID

EP

OS

ITI

ER

ITR

OP

OIE

SI

ER

ITR

OP

OIE

SI

CA

RE

NT

EC

AR

EN

TE

Ipocro.Microc.NNNNNNEritrociti

<10<10<15<15>20>20>20>20Saturazione Transferrina (%)

NNNNTransferrina (mg/dl)

NNNNSideremia (ng/ml)

NNFerritina (ng/ml)

Fe Fe eritrocitarioeritrocitario

ANEMIA ANEMIA

Emoglobinopatie e Talassemie

Anomalie del tetramero dell’emoglobina

• Anomalie strutturali delle catene dell’emoglobine (EMOGLOBINOPATIE)

• Riduzione o completa mancanza della sintesi di una o più catene polipeptidiche della molecola dell’emoglobina (TALASSEMIE)

N.B. 250 milioni di persone (4.5% della pop.mondiale) sono eterozigoti per un gene globinico difettivo ed annualmente nascono almeno 300 mila omozigoti affetti!!!

Beta talassemia

•Anemia mediterranea: (la beta-talassemia tipica dell'area mediterranea)

trait talassemico un solo gene difettoso (condizione asintomatica)

talassemia maior ambedue i geni difettosi (malattia grave)

talassemia intermedia ambedue i geni difettosi (da lieve a grave)

Parametri nella Talassemia

• MCV

• RDW normale o

• Reticolociti normali o

• Ferritina normale o • Transferrina normale

• Sideremia normale o

• Recettori solubili normali

Trait Talassemico

• MCV < 80 fl (eccetto aa/a- e b+)

• Hb non correla con MCV and RBC

• punteggiatura basofila delle cellule target

• studio delle catene globiniche HbA2

• RDW normaleScreening per talassemia e emoglobinopatieScreening per talassemia e emoglobinopatie

Diagnosi differenziale tra Anemia sideropenica

e Trait Talassemico

• RBC

Anemia in corso di malattia cronica

• MCV ridotto o normale• MCH ↓• Sideremia, T.I.B.C. ↓• Ferritina normale o aumentata• Recettori solubili per la

transferrina normali• Transferrina ↓• Anemia normo/microcitica

Anemia macrociticaAnemia macrocitica

RDW aumentato in presenza di un valore

MCV ai limiti superiori della norma, permette

di individuare precocemente la presenza di:

• alcoolismo

• epatopatie

• carenza subclinica di B12/folati

• esposizione industriale a solventi organici

• mielodisplasia primitiva o chemioindotta

• assunzione terapeutica di AZT and HU

VVOOLLUUMMEE

Densità (concentrazione Hb)

Deficitaria Sintesi del DNA

Persistenza della Sintesi di RNA e delle Proteine

Bambina di 2 anni. Deficit di accrescimento

Paziente di 70 anniP.S. Astenia

Paziente di 77 anniP.S. Shock

Bambina di 2 anni. Deficit di accrescimento, irritabilitàAnemia Megaloblastica

Ret 0,8%MCVr 146

RBC 2.680.000HgB 9.5MCV 106.9MCHC 33.1PLT 63.000

RBC 3.090.000HgB 9.4MCV 95.5MCHC 31.7PLT 157.000

RBC 3.680.000HgB 9.7MCV 84.1MCHC 31.7PLT 167.000

EFFETTO DELLA NORMALIZZAZIONE DEI LIVELLI DI VITAMINA B12

Sindromi MielodisplasticheSindromi Mielodisplastiche

Altre cause di macrocitosi, non megaloblastica

Target cells

Difetti di membrana

Reticolocitosi

Rouleaux

Agglutinati daCrioagglutinine

Altre cause di macrocitosi, non megaloblastica

Paziente del P.S. anni 77Shock

Falsa macrocitosi e ipocromia da IPERGLICEMIA(da prelievo eseguito con glucosata in corso)

glucosioglucosio

glucosioglucosio

glucosioglucosio

Situazioni di importante Iperglicemia

glucosioglucosio

glucosio

Diluente dell’analizzatore

Acqua

Acqua

Acqua

glucosio

glucosio

glucosio

AcquaAcqua

Acqua

Ore 21.00Ore 21.00Glicemia 1 grGlicemia 1 gr

Ore 12.00Ore 12.00Glicemia 146 mgGlicemia 146 mg

• Esame dirimente: Conta dei Reticolociti

La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive

La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive

EritroblastiOrtocromatici

EritroblastiOrtocromatici

ReticolocitiMidollari

Tempo diPermanenza 2-3 giorni

ReticolocitiMidollari

Tempo diPermanenza 2-3 giorni

BarrieraEMATO- MIDOLLARE

BarrieraEMATO- MIDOLLARE

Reticolociti nel Sangue Periferico

Tempo di permanenza

1-1.5 giorni

Reticolociti nel Sangue Periferico

Tempo di permanenza

1-1.5 giorni

• I reticolociti sono globuli rossi in cui la colorazione sopravitale a fresco con alcuni coloranti basici mette in evidenza la sostanza granulo-filamentosa, sotto forma di granuli isolati o riuniti tra loro da una rete più o meno fitta di materiale basofilo.

I RETICOLOCITI

Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)

Contengono RNA(colorazioni sopravitali con blu di metilene o blu di Cresile)

Sono più grandi dei globuli rossiMCVr > MCVgbr

Sono più grandi dei globuli rossiMCVr > MCVgbr

Possono avere un diverso contenuto di RNA (cioè un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione

Possono avere un diverso contenuto di RNA (cioè un diverso contenuto di granuli e filamenti) e un diverso volume in rapporto al loro grado di maturazione

D’Onofro e Zini “Morfologia del Sangue”

D’Onofro e Zini “Morfologia del Sangue”

• Riduzione delle dimensioni• Aumento della densità• Perdita dei ribosomi, mitocondri e frammenti di

membrana• Riduzione di: RNA , mRNA e attività enzimatica• Cambio della forma (plurilobata -› biconcava)• Perdita dei recettori di membrana per transferrina

(CD71) e fibronectina• Perdita di motilità e adesività• Aumento della deformabilità

Maturazione reticolocitaria

RMI = Reticulocyte Maturity Index

Nei diversi studi è stato usato come:

• intensità media di tutta la popolazione reticolocitaria

• reticolociti ad elevata Fluorescenza o Assorbimento

• reticolociti a media ed elevata fluorescenza o assorbimento, che alla fine sono stati definiti come

IRF = Immature Reticulocyte Fraction

RMI = Reticulocyte Maturity Index

Nei diversi studi è stato usato come:

• intensità media di tutta la popolazione reticolocitaria

• reticolociti ad elevata Fluorescenza o Assorbimento

• reticolociti a media ed elevata fluorescenza o assorbimento, che alla fine sono stati definiti come

IRF = Immature Reticulocyte Fraction

L M H

• Frazione dei reticolociti immaturi (IRF)• Contenuto emoglobinico reticolocitario• Volume reticolocitario

Nuovi parametri in citometria

• Monitoraggio della ripresa midollare dopo trapianto o chemioterapia

• Monitoraggio della terapia delle anemie• Monitoraggio della terapia con Epo• Monitoraggio dell’attecchimento del

trapianto renale • Rilevamento delle crisi aplastiche nelle

anemie emolitiche

IRF: applicazioni cliniche

Caratteristiche delle anemie emolitiche

• Anemie normocitiche-normocromiche

• Reticolociti ↑• Urobilinogeno ↑• Bilirubina indiretta ↑• Emoglobinemia ed Emoglobinuria• LDH eritrocitaria ↑

Caratteristiche delle anemie emolitiche

• Anemie emolitiche da cause intraglobulari

• Anemie emolitiche da cause extraglobulari

• Esame dirimente: Coomb’s test

Anemie Emolitiche

• Cause intraglobulari (difetti di membrana)

• Sferocitosi, ellissocitosi

• Cause intraglobulari (difetti enzimatici)• Deficit di G6PD o Favismo• Deficit di Piruvato K• Deficit di Glutatione reduttasi

• Cause intraglobulari (Emoglobinopatie)• Talassemie• Drepanocitosi

Anemie emolitiche da cause extraglobulare

• Anemie emolitiche da isoanticorpi

• Anemie emolitiche da autoanticorpi

• Anemie da farmaci e veleni

Elementi diagnostici delle anemie emolitiche da difetto intraeritrocitario

Comuni Specifici

Segni di emolisi Segni di iper-funzione midollare

 Dipendenti dalla causa

Bilirubinemia non coniugata

Reticolocitosi Morfologia Emazie

Urobilinogeno Iperplasia eritroblastica

Emosiderosi

LDH isoenzima 2 Turnover del Fe sideremia alla norma

- Aumentata fragilità osmo tica- Dosaggi enzimi eritrocitari (G6PD)- Elettroforesi Hb

Aptoglobinemia