Diagnostica sierologica delle malattie infettivein età pediatrica

Bergamo 22 novembre 2014

G. Bargiggia

La diagnosi microbiologica è finalizzata alla ricerca

ed alla identificazione dell'agente eziologico

Adenomegalie virali

Interessamento linfonodale loco-regionale o generalizzato

Segni e sintomi vanno accuratamente valutati (anamnesi clinica ed esame obiettivo)

- Eruzione cutanea generalizzata (EBV, CMV, VZV, Morbillo, Rosolia, HIV)

localizzata (HSV 1 e 2, Adenovirus, Enterovirus, West Nile, Dengue)

- Febbre, esantema, astenia, cefalea, mialgie, faringodinia, ipertrofia tonsillare, splenomegalia, epatomegalia di grado lieve (EBV, CMV)

- Contatti a rischio, soggiorno in zone endemiche, punture d’insetto

Altri esami di laboratorio non virologici:

- linfocitosi, inversione della formula leucocitari, presenza di linfociti attivati,ipertransaminasemia, piastrinopenia

Epstein Barr Virus (EBV)

La trasmissione si manifesta già prima dei 3 anni, prevalentemente asintomatica.

Nei paesi sviluppati l’infezione primaria spesso si manifesta durante l’adolescenza presentandosi come infezione mononucleosica (MI)

A 10 anni la sieroprevalenza è del 50% e negli adulti del 95%

Qual è la differenza fra l’EBV e l’amore?

EBV è eterno!

L’IM si presenta con quadri clinici diversi, da malattia mite a grave

- Linfadenopatia (presente nel 94% dei casi)

Prime due settimaneLinfocitosi atipica (↑↑CD8)

> 20% “cellule atipiche” attivate Prevalentemente cervicale

Febbre (80%)

Esantema (5%)

Ittero (9%) 80-90% ↑ enzimi epatici

- Malessere generale(anche per settimane/mesi)e faringite (84%)

- Risoluzione spontanea(2-3 settimane)

EBV

- Anemia emolitica autoimmune(~2%) - moderata trombocitopenia

- Sintomi neurologici (< 1%) forma acuta a guarigione spontanea

- Ampicillina e Amoxicillina prurito ed esantema maculopapulare (95%)

- Rottura della milza (infrequente ma a rischio di vita) → astensione attività sportive per 3-4 settimane

- Immunodeficienza malattia linfoproliferativa o linfoma (linfoma endemico di Burkitt - 100%)

(linfoma Hodgkin e carcinoma nasofaringei - 25%)

EBV

Diagnosi di Laboratorio

Anticorpi Eterofili

Compaiono precocemente nel siero

- Prove di Paul-BunnellTitolazione del siero per diluizione a raddoppio con globuli rossi di pecora (↑ sensibilità

con globuli rossi di cavallo)

- adsorbimento con rene di cavia (↑ specificità eliminando anticorpo di Forssman)

- adsorbimento con stromi di cellule bovine(↑↑ specificità)

- MonospotParticelle di lattice (agglutinazione su vetrino)

Sensibilità 84 - 100% Specificità 89 - 100%Risultati falsi negativi in < 14 anni

- Immunocromatografia

Possono rimanere positivi per molti mesi dopo la risoluzione dei sintomi e nelle infezioni asintomatiche

EBV

Anticorpi anti-Envelope

- IgG, IgM e IgA anti-VCA

Tipicamente presenti all'insorgenza dei sintomi

All’esordio le IgG raggiungono spesso titoli elevati

Durante la convalescenza (entro 3-6 mesi dall’esordio)le IgA e le IgM diminuiscono a livelli non rilevabili

EBV

- IgM con immunofluorescenza indiretta (IFA)

Elevata sensibilità(complessi IgG anti EBV e le IgM del fattore reumatoide possono determinare falsi risultati positivi → pretrattamento)

Fluorescenza aspecifica anti-cellule

- IgM (ELISA - CLIA - ELFA)

Affidabili e più usateFalsi positivi in corso d’infezione primaria da CMV

EBV

Anticorpi anti EBNA-1

IgG anti-EBNA 1 (ELISA - CLIA - ELFA)

Non sono di solito rilevabili prima del periodo della convalescenzaSe presenti escludono una MI recente o in atto

EBV DNA

PCR quantitativaMonitoraggio pazienti immunocompromessi a rischio di EBV associato a malattia linfoproliferativa ed in corso di MI complicata

Mancanza di standard internazionali

EBV

Citomegalovirus(CMV)

Infezione a diffusione ubiquitaria e di solito asintomatica.

Prevalenza negli adulti è di circa il 40% e aumenta ovunque dell’1% l’anno (variazioni 40 -100% in funzione dell’etnia, della classe sociale e dei fattori di rischio sessuali)

Infezione congenita(0.5% dei nati vivi)

Trasmissione perinatale(alla nascita o con l’allattamento al seno)

Infezione nei primi anni d’infanzia(trasmissione negli asili nido - rilascio virale per molti mesi con le secrezioni respiratorie e con le urine)

Trasmissione a soggetti sieronegativi con l’inizio dell’attività sessuale o con emoderivati

L’età media dei pazienti con mononucleosi da CMV è maggiore di quella da MI sostenuta da EBV

Clinicamente difficile da differenziare da quella da EBV

- Ingrossamento dei linfonodi e della milza(non frequente)

- Tonsillite e faringite (rare)

- Epatite grave o ittero(infrequenti sebbene compaia spesso innalzamento degli enzimi epatici)

- Malessere(67%), febbre (46%), sudorazione(46%)

Risoluzione spontanea nei soggetti immunocompetenti

CMV

Paziente immunocompromesso

- polmonite- retinite- epatite - malattia gastrointestinale

Elevata morbilità e mortalità in assenza di terapia

Malattia congenita grave> frequenza in caso di infezione materna primaria

L'infezione nell’adulto immunocompetente può determinare la sindrome di Guillain-Barré

L’infezione attiva nella donna in età fertile dovrebbe consigliare l'immmediato accertamento per confermare o escludere la condizione di gravidanza

CMV

Diagnosi di Laboratorio

- ELISA IgM

Metodo più diffusamente utilizzatoFrequenti reazioni crociate in corso di infezione primaria (44% dei pazienti inizialmente reattvi anche per EBV IgM)

- Avidity IgG

Conferma di infezione recente

- PCR (sangue e urine)

Riservata come monitoraggio, diagnosi e gestione dei pazienti immonocompromessi, in gravidanza e per l’infezione congenita

CMV può essere confermato con la PCR in circa il 60% dei pazienti perché i soggetti immunocompetenti possono essere viremici solo nei primi giorni della malattia

CMV

CMV

Rosolia (Rub)

L’epidemiologia della rosolia è cambiata in modo consistente dopo l’adozione nel 1988 della vaccinazione con MMR (Measles, Mumps, Rubella)

Dalla metà degli anni ’90, la diminuzione della vaccinazione dei bambini in tenera etàa seguito di segnalazioni di possibili complicanze dovute all’utilizzo del vaccino MMR ha condizionato la possibilità di epidemie da rosolia che sono ancora una volta possibili

La popolazione che arriva da paesi in via di sviluppo, privi di programmi di vaccinazione, può essere

suscettibile al rischio d’infezione

Rub

Malattia lieve, moderatamente febbrile, con eritema fugace e linfoadenopatia retroauricolare, sub-occipitale e alle ghiandole cervicali posteriori

Occasionalmente negli adulti si manifestano artralgie e artrite

Spesso i bambini presentano moderata sintomatologia che si risolve spontaneamente

Diagnosi differenziale con infezioni da CMV e Parvovirus B19

RubRub

Rosolia congenita (da infezione primaria in gravidanza)

Gravi danni del feto se si manifesta nelle prime 16 settimane

La reinfezione è di solito a carattere sub-clinico e l’indice di rischio per il feto èridotto, ma comunque presente se insorge nelle prime 16 settimane di gestazione

Rub

Diagnosi di Laboratorio

- HAI (emoagglutinazione)

- LA (agglutinazione al lattice)

- ELISA IgM

IgM specifiche rilevabili nei primi 4 giorni dalla comparsa dell’esantema e nelle 4 - 8 settimane successiveElevata sensibilità ma (causa bassa prevalenza)ridotto indice predittivo

- IgG avidity

Per confermare la rosolia acuta è importante prelevare campioni multipli per definire l’aumento del titolo delle IgG (> 4 volte dopo 10-15 gg)o la loro bassa avidità

- PCR (a trascrizione inversa)

Rub

Sospensione cellulare/antigene

Diluizioni scalari

del siero

Pozzetti di reazione

Lettura

HIV

Retrovirus (virus a RNA) - inserisce il suo genoma (grazie all’enzima trascrittasi inversa)nel DNA (provirus)della cellula ospite

T CD4 principale bersaglio (deplezione alla base dell’immunodeficienza progressiva)

- Infezione primaria (poche settimane)

Asintomatica (spesso)

Malattia acuta simil-influenzale (linfoadenopatia, eruzione cutanea, febbre, artralgie,

mialgie, malessere)

- Fase di latenza(mesi/anni)Assenza di segni clinici ma attiva replicazione virale ↓↓ CD4

- Fase clinica manifesta (AIDS)

Infezioni opportunistiche, neoplasie

HIV

Trasmissione

- Sessuale

- Ematica (scambio di siringhe, lesioni cutanee o delle mucose…)

- Verticale (gravidanza, parto, allattamento)

Diagnosi di Laboratorio

HIVTest sierologici di screening e di conferma

- EIA/CLIAab anti HIV-1 e HIV-2 eAg p24 (quarta generazione)

- Western Blot / Immuno Blotdistinzione tra HIV-1 e HIV-2

Combinazione dei due test → valore predditivo positivo prossimo al 100%

- HIV RNA quantitativo

- test fenotipici e genotipici

Neonato

Gli anticorpi rilevati potrebbero essere dovuti a trasmissione passiva materna (persistenza anche oltre i 18 mesi)

- HIV DNA provirale

- isolamento virale nei linfo-monociti del sangue periferico (PBMC)

- ricerca specifica di p24 serica

HIV

West Nile Virus

Arbovirus diffuso in Africa, Asia occidentale, Europa, Australia e America

Serbatoi naturali- uccelli selvatici e zanzare (Culex)

↓> equini < cani, gatti, conigli ecc.

No trasmissione da persona a persona per contatto con soggetto infetto

Raramente per trapianto d’organo, trasfusione, da madre a feto in gravidanza

WNV

Infezione asintomatica nella maggior parte dei soggetti infetti

~ 20% lievemente sintomatica(febbre, mal di testa, nausea, vomito,

linfonodi ingrossati, sfoghi cutanei)

< 1% sintomi più gravi (febbre alta, forti mal di testa, disorientamento, tremori, disturbi della vista, torpore, convulsioni, fino alla paralisi ed al coma - 1/1000 encefalite letale)

WNV

Diagnosi di Laboratorio

IgM/IgGELISA - IFA

siero, urine, liquor

PCR (WNV RNA < 8 giorni)

Coltura virale

Linfoadenopatie batteriche e parassitarie

Generalmente di natura benigna a decorso autolimitante

Bartonellaspp.

Maggior rappresentante di febbre di origine sconosciuta

B. henselae(malattia da graffio di gatto)- pulci

B. bacilliformis(malattia di Carrion)- pappataci- Endemica in Sud AmericaB. quintana(febbre delle trincee)- pidocchi

Replicazione intraeritrocitaria

Mancata risoluzione dell’infezione nell’immunodepresso

Cat scratch disease

Diagnosi di Laboratorio

- IgG & IgM immunofluorescenza

- Western Blot

- PCR

Torino 112 casi sospetti → 14 PCR +

Chlamydia trachomatis

Infezione batterica, sessualmente trasmessa, più diffusa

Prevalenza C. trachomatis3,2% (8% < 25 anni)

(~ 76.000 campioni età media 35 anni) Trichomonas vaginalis0,7%Neisseria

gonorroheae0,2%

Trend di positività in aumento (stretta correlazione con infezione da HIV)

Infertilità 20% maschio 75% femmina

1^ causa di malattia infiammatoria pelvica (25-70% dolore pelvico)

> 70% asintomatica o non riconosciuta → cronicizzazione

Gravidanza 25-60% trasmissione verticale↓

- congiuntivite (spesso a risoluzione spontanea)

- polmonite interstiziale (tosse secca simil pertosse)Titolo

IgA ≥ 1:320 diagnostico(escludere RSV)

Diagnosi di Laboratorio

C. trachomatis- IgG, IgA, (IgM) immunoperossidasiBassa sensibilità e

specificitàUtilità: PID, pneumopatie

neonatali, LGV (dal 2000 in

significativo aumento nei maschi omosex HIV +),epidemiologia

- NAT (test di amplificazione genica)Sensibilità > 90%Specificità > 99%

maschi: 1° getto di urina

femmine: prel.vo vaginale* o 1° getto di urina

Treponema pallidum(Sifilide)

Il numero di casi di sifilide primaria, secondaria e latente precoce diagnosticati è in significativa crescita

Europa ~ 20.000 casi (stima CDC 2011)Italia ~ 20% degli stranieri

Gli omosessuali esprimono il 73% dei casi di sifilide infettiva e la co-infezione con HIV è frequente nei pazienti con diagnosi di sifilide (27%)

L'aumento del numero di casi di sifilide nelle donne in età riproduttiva ha portato a un aumento dei casi d’infezione congenita

Vecchie infezioni: titolo RPR cala molto lentamente

Infezioni recenti: in corso di terapia il titolo RPR si negativizza entro i sei mesi

Sifilide secondaria

- esantema, linfadenopatiameno frequentemente febbre,

persistenza di ulcera primaria, condilomi, piastre mucose e alopecia

- epatite, meningite, neuropatia periferica, sorditàpercettiva, splenomegalia, peritonite, artrite, iridociclite

Nessuna di queste manifestazioni è presente in più del 2% dei pazienti

T. pallidum

Diagnosi di Laboratorio

Test reaginici

- VDRL*

- RPR

* unico test validato per il liquor

Test treponemici

- TPHA/TPPA

- ELISA/CLIA

- FTA IgM (IFA)

- Western Blot

- PCR

T. pallidum

T. pallidum

Sifilide - Microscopia in campo scuro

Sifilide - Immunofluorescenza (FTA-IgM)

Madre con sierologia positiva per sifilide e trattamento penicillinico documentato →sottoporre neonato a procedure di screening clinico e sierologico alla nascita (a maggior ragione per follow up neonati da madri sieropositive non trattate)

- Neonato certamente infettoPresenza di IgM o identificazione di T. pallidum nelle

lesioni

- Neonato ad alta probabilità di infezioneSegni/sintomi clinici compatibili e sierologia positiva o titolo anticorpale ≥ 4 volte quello materno alla nascita

- Neonato a bassa probabilità di infezioneAsintomatico con titolo sierologico non superiore a

quello materno

- Raccomandato lo studio del LCR nel neonato certamente infetto o ad elevataprobabilità di infezione

Le alterazioni del liquor sono molto frequenti nei neonati con sifilide congenita anche in assenza di segni di coinvolgimento neurologico (VDRL positiva, leucocitosi, proteine elevate)

- Raccomandata ripetizione della puntura lombare ogni sei mesi sino allanormalizzazione di tutti i parametri

- Valutazione attenta della crescita e dello sviluppo intellettivo, vista e udito sino ai tre anni di età

L’esclusione definitiva della sifilide congenita si basa sulla negativizzazione della sierologia (test treponemici)nel bambino

Tubercolosi

Italia < 10 casi/100.000 abitanti (Romania 100/100.000 - India >)

~ 40% forme extrapolmonari

Spesso paucisintomatica (tranne HIV+); spesso interessamento laterocervicale

Micobacterium tuberculosis

Diagnosi di Laboratorio

- Microscopia

- Coltura

- PCR

- Test cutaneo(tubercolina)

- Test IGRA

Borrelia spp.* viene trasmessa all'uomo con il morso di zecche del genere Ixodes

* B. burgdorferi“sensu stricto” (Stati Uniti e, in < misura, Europa e Asia), B..afzeliie B. guarinii (Europa e Asia)

Il serbatoio in natura è rappresentato dall'animale con spirochetemia

Borrelia spp.

Incubazione: 3-14 gg (talvolta ≥ 1 mese)

- 1^ fase: precoce

a) localizzata - 1° stadio (eritema cronico migrante)

Papula eritematosa in corrispondenza del morso che si

estende ad anellob) sistemica - 2° stadio (infezione disseminata)

Diffusione delle borrelie al cuore, SNC*, muscolo

scheletrico e nuovamente alla cute

* Nei bambini interessamento del nervo ottico

- 2^ fase: tardiva (infezione persistente)

- 3° stadioArtriti recidivanti

o croniche (60% dei soggetti non trattati)

Borrelia spp.

Diagnosi di Laboratorio

Borrelia spp.

- ELISA

- IFA

- Western Blot*

- PCR*

*siero e liquor

Rickettsia spp.

Genere di microorganismi (gram-negativi) parassiti intracellulari obbligati trasmessi da artropodi (> zecche, < pulci e pidocchi)

2 Biotipi

- Febbre maculosa (Spotted Fever Group)

Febbre bottonosa (R. conorii)Febbre maculosa delle

Montagne Rocciose (R. rickettsii)

Tifo da zecche (R. australis, R. sibirica)

Rickettsiosi vescicolare (R. akari)

Febbre bottonosa orientale (R. japonica) -acari del topo

- Dermotifo (Typhus Fever)

Tifo murino o endemico (R. typhi) - pulci del ratto e animali domestici

Tifo epidemico (R. prowazekii) -

Rickettsia

Rickettsia conorii sub.Conorii (Mediterranean spotted fever - Febbre bottonosa)

- febbre (> 39° C)- sintomatologia simil-influenzale- escara scura (tache noire)

- rash maculopapulare diffuso

- manifestazioni neurologiche - interessamento multiorgano

In Francia < 10 > 50 anni tasso di mortalità∼ 2,5%fattori di rischio età avanzata, immunocompromissione,

alcolismo, deficienza di G6PD, trattamento inadeguato o ritardato

Diagnosi di Laboratorio

Rickettsia- Weil-Felix

P. vulgaris OX2, P. vulgaris OX 19, P. mirabilis OXK

- MIF (microimmunofluorescenza)

- IgM / IgG ELISA

- Western Blot

- Isolamento (inoculazione in animale)

- Immunologico (ab monoclonali coattati su biglie magnetiche)

- PCR

Toxoplasma gondii

Zoonosi a diffusione ubiquitaria (varia incidenza nei diversi paesi)

Interessa numerose specie di mammiferi

I gatti sono importanti vettori di trasmissione

L’infezione si manifesta di solito dopo ingestione di oocisti presenti nella carne cruda o parzialmente cotta e sulle verdure contaminate con escrementi animali

Solo il 10 - 20% delle infezioni dell'adulto sono sintomatiche

Manifestazioni cliniche non patognomoniche

Se presenti:- linfoadenopatia cervicale(ingrossamento di alcuni o tutti i linfonodi)

- febbre, malessere, mialgie, faringodinia, esantema maculopapulare ed epatosplenomegalia

T. gondii è causa del 3 - 7% di tutte le linfoadenopatie clinicamente significative e dell'1% delle sindromi mononucleosiche

Infezione solitamente ad andamento benigno ed autolimitante

Sintomatologia (se presente)in risoluzione in pochi mesi (raramente persistono per più di12)

Toxoplasma gondii

Paziente immunocompromesso

Malattia di solito grave(conseguente alla riattivazione dell’infezione latente)

- encefalite- polmonite- corioretinite

In gravidanza l’infezione primaria può causare infezione congenita con possibile danneggiamento grave del feto quando acquisita, in particolare, nel primo trimestre di gestazione

Toxoplasma gondii

- Ig totali

- IgG, IgM, IgA

- IgG avidity

- Western Blot

- PCR

- IGRA

Diagnosi di LaboratorioToxoplasma gondii

La toxoplasmosi acuta nei soggetti immunocompetenti può essere effettivamente esclusa con la negatività dei test di screening

L’utilizzo di saggi a elevata sensibilità e specificità quali ISAGA, ELFA e avidità delle IgG è raccomandato per confermare l’infezione acuta (specialmente in gravidanza)

Toxoplasma gondii

Tripanosoma cruzi

A poeira de Curvelo não az mal para ninguém não Do pulmão lá ninguém morre O que mata é o coração

(From the poem “ O galo cantou na serra”by Luiz Claudio and Guimarães Rosa)

“La polvere di Curvelo non fa male a nessuno Nessuno muore lì di malattia polmonare.Quello che uccide è il cuore”

La tripanosomiasi americana (malattia di Chagas) è una zoonosi diffusa in ambienti rurali dell’America Latina (stima 16 -18 milioni di persone, ~ 20% della popolazione boliviana, 1,3 - 4% in Brasile)

45.000 - 50.000 morti all’anno (morte cardiaca improvvisa per fibrillazione ventricolare nel 60% dei

casi)tra pazienti affetti principalmente dalla forma cardiaca cronica

Tripanosoma cruzi

- Forma acuta classicaSpesso inapparente o paucisintomatica(specie nei bambini) - Segno di Romaňa

- Cardiopatia chagasica acutaMiocardite (< 5% dei casi, spesso pediatricinelle aree endemiche)

- Forme congeniteInfezione intrauterina: aborto spontaneoo prematuroNeonato: basso peso, epato-splenomegalia, ittero, anemia, febbre, meningoencefalite con convulsioni - coinvolgimento cardiaco raro

- Forma indeterminatafase asintomatica (dopo 3 - 8 w di fase acuta)- nel 50 - 70% dei casi dura tutta la

vita ogni anno ~ 3% di essi sviluppano patologia chagasica

- Cardiopatia chagasica cronica30% degli individui infetti (> maschi) con progressivo deterioramento del

tessuto miocardico → insufficienza di pompa → aritmia fatale

Tripanosoma cruzi

Diagnosi di Laboratorio

Tripanosoma cruzi

- Xenodiagnosi

- Emoagglutinazione

- Agglutinazione al lattice

- ELISA/CLIA

- IFA

- Western Blot

- PCR (sensibilità 96 - 100%)