Sorveglianza e caratterizzazione molecolare di Arbovirus ...€¦ · il virus per lunghi periodo di...

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TRIESTE

XXVIII CICLO DEL DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE DELLA RIPRODUZIONE E DELLO SVILUPPO

Indirizzo: Genetico Molecolare Settore scientifico-disciplinare: MED/42 Igiene Generale e Applicata

Sorveglianza

e caratterizzazione molecolare

di Arbovirus nel Friuli Venezia Giulia

DOTTORANDA

ILARIA CARACCIOLO

COORDINATORE

PROF.SSA GIULIANA DECORTI

SUPERVISORE DI TESI

PROF. PIERLANFRANCO D’AGARO

ANNO ACCADEMICO 2014/2015

SOMMARIO

PREMESSA ........................................................................................................................... 1

1. INTRODUZIONE ............................................................................................................. 3

1.1. ARBOVIRUS .............................................................................................................. 3

1.2. FAMIGLIA FLAVIVIRIDAE, GENERE FLAVIVIRUS ........................................... 7

1.2.1. GENOMA, CARATTERISTICHE STRUTTURALI E REPLICAZIONE ...... 11

1.3. TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS ................................................................ 14

1.3.1. CARATTERISTICHE E SOTTOTIPI DEL TBEV ........................................... 14

1.3.1. GENOMA E STRUTTURA .............................................................................. 16

1.3.2. PATOGENESI E MANIFESTAZIONI CLINICHE .......................................... 17

1.3.3. DIAGNOSI E TERAPIA ................................................................................... 18

1.3.4. EPIDEMIOLOGIA ............................................................................................ 20

1.4. WEST NILE VIRUS ................................................................................................. 34

1.4.1. CLASSIFICAZIONE E LINEAGE DEL WEST NILE VIRUS ....................... 34

1.4.2. REPLICAZIONE, PATOGENESI E MANIFESTAZIONI CLINICHE ........... 37


1.4.4. EPIDEMIOLOGIA DEL WEST NILE VIRUS ................................................. 42

1.5. DENGUE VIRUS ..................................................................................................... 50

1.5.1. CLASSIFICAZIONE E SIEROTIPI DEL DENGUE VIRUS .......................... 50

1.5.2. GENOMA .......................................................................................................... 50



1.5.5. EPIDEMIOLOGIA ............................................................................................ 56

1.6. FLAVIVIRUS EMERGENTI ................................................................................... 63

1.6.1. USUTU VIRUS ................................................................................................. 63

1.6.2. ZIKA VIRUS ..................................................................................................... 68

1.6.3. MARISMA VIRUS ............................................................................................ 72

1.7. FAMIGLIA TOGAVIRIDAE, GENERE ALPHAVIRUS ........................................ 74



1.8. CHIKUNGUNYA VIRUS ........................................................................................ 79

1.8.1. CLASSIFICAZIONE E SOTTOTIPI DEL CHIKUNGUNYA VIRUS ............ 79

1.8.2. GENOMA E REPLICAZIONE ......................................................................... 80

1.8.3. MANIFESTAZIONI CLINICHE ...................................................................... 81


1.8.5. EPIDEMIOLOGIA ............................................................................................ 83

1.8. FAMIGLIA BUNYAVIRIDAE, GENERE BUNYAVIRUS ..................................... 88



1.8.3. DIAGNOSI E PREVENZIONE ........................................................................ 91

1.8.4. PHLEBOVIRUS ................................................................................................ 92

1.8.5. TOSCANA VIRUS ............................................................................................ 93

2. SCOPO DELLA TESI ..................................................................................................... 97

3. MATERIALI E METODI ................................................................................................ 99

3.1. IDENTIFICAZIONE DEL TBEV NEI VETTORI .................................................. 99

3.1.1. RACCOLTA DELLE ZECCHE E CAMPIONAMENTO ................................. 99

3.1.2. SUDDIVISIONE IN POOL E OMOGENEIZZAZIONE ............................... 103

3.1.3. ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI .................................................... 103

3.1.4. CONTROLLO DI ESTRAZIONE .................................................................. 104

3.1.5. INDAGINI MOLECOLARI ............................................................................ 105

3.1.6. SEQUENZIAMENTO ED ANALISI FILOGENETICA ................................ 106

3.1.7. ANALISI FILOGENETICA ............................................................................ 111

3.1.8. COLTURE CELLULARI ................................................................................ 111

3.1.9. ANALISI STATISTICA ................................................................................... 112

3.2. IDENTIFICAZIONE DEL TBEV IN CAMPIONI UMANI.................................. 113

3.2.1. DIAGNOSI SIEROLOGICA .......................................................................... 113

3.2.2. DIAGNOSI MOLECOLARE .......................................................................... 114

3.2.3. GENOTIPIZZAZIONE DEI CAMPIONI POSITIVI ..................................... 114

3.2.4. ISOLAMENTO VIRALE ................................................................................ 115

3.2.5. TEST DI RIDUZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE DELLE PLACCHE ..... 115

3.2.6. CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITÀ ................................ 117

3.3. IDENTIFICAZIONE DEL WEST NILE VIRUS ................................................... 117




3.3.4. ISOLAMENTO VIRALE ................................................................................ 122

3.3.5. TEST DI RIDUZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE DELLE PLACCHE ..... 122

3.4. IDENTIFICAZIONE DEL DENGUE VIRUS ....................................................... 122




3.5. IDENTIFICAZIONE DEL CHIKUNGUNYA VIRUS .......................................... 124



3.6. REAL-TIME RT-PCR PER ZIKA VIRUS ............................................................. 126

3.7. REAL-TIME RT-PCR FLAVIVIRUS UNIVERSALI (Pan-Flavi) ........................ 126

4. RISULTATI .................................................................................................................... 128

4.1. IDENTIFICAZIONE DEL TBEV NEI VETTORI ................................................ 128

4.2. IDENTIFICAZIONE DEL TBEV IN CAMPIONI UMANI.................................. 147

4.3. IDENTIFICAZIONE DEL WNV ........................................................................... 153

4.4. IDENTIFICAZIONE DI CHIKUNGUNYA E DENGUE VIRUS ......................... 162

5. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI .............................................................................. 167

6. BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................... 177

PUBBLICAZIONI ............................................................................................................. 196

1

PREMESSA

Negli ultimi anni i cambiamenti climatici e la globalizzazione hanno aumentato il rischio

di introduzione e di diffusione di patologie trasmesse da vettori (vector-borne diseases -

VBDs) in molti paesi europei, Italia inclusa. In questo progetto di ricerca la nostra

attenzione si è focalizzata sulle infezioni causate da Arbovirus (acronimo di ARthropod-

BOrne virus).

In Italia è stata registrata la circolazione di Tick-borne encephalitis virus (TBEV), virus

trasmesso dalla zecca Ixodes ricinus, e di virus trasmessi da vettori di origine tropicale

come il West Nile virus (WNV), l’Usutu virus (USUV), il Chikungunya virus (CHIKV).

Negli ultimi anni si è verificato un incremento di casi importati di Dengue virus (DENV) e

CHIKV e per questo motivo si è attuato un sistema di sorveglianza ad ampio raggio al fine

di monitorare tali infezioni.

Grazie alle attività di sorveglianza da noi condotte sia sui casi umani che sui vettori (per

quanto riguarda il TBEV), è stato possibile confermare che anche nella regione Friuli

Venezia Giulia circolano virus come il TBEV ed il WNV e che vi sono casi importati sia di

WNV, DENV e CHIKV. Risulta quindi importante tenere rigorosamente monitorate queste

infezioni poiché sono stati documentati anche casi di donatori (di sangue e di organi e

tessuti) asintomatici infetti.

La sorveglianza di Arbovirus su campioni clinici è stata condotta sia con tecniche

molecolari che sierologiche. Poiché in fase acuta di infezione è possibile individuare

l’RNA virale mediante tecniche molecolari, i campioni di sangue intero in EDTA, liquor e

urine sono stati analizzati mediante RT-Real-Time PCR. Nel caso della ricerca di WNV si

utilizza oltre ad una Real Time home made, un kit commerciale in grado di rilevare e

quantificare l’RNA. In entrambi i casi si tratta di saggi molto sensibili e specifici che

consentono di riscontrare tutti i vari Lineage del WNV circolanti in Italia e nelle zone

limitrofe. La riproducibilità dei risultati ottenuti dalle due metodiche è stata verificata

testando i pannelli per proficiency test QCMD 2011-2013-2014-2015 West Nile Virus

(RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Regno Unito). Ogni 1-2 anni infatti vengono

inviati presso il nostro laboratorio controlli di qualità, denominati Quality Control for

Molecular Diagnostics (QCMD), per il miglioramento della qualità della diagnostica

2

molecolare. Nel 2015 sono stati eseguiti i QCMD per WNV, DENV e anche per CHIKV.

Nel siero e nel liquor di pazienti con sospetta encefalite da TBEV o WNV si sono cercati

anticorpi IgM e IgG specifici mediante test immuno-enzimatico (ELISA, enzyme-linked

immunosorbent assay). I campioni in cui si sono riscontrate le IgG sono stati poi sottoposti

al test di avidità, per poter stabilire se l’infezione era più o meno recente.

Per monitorare le infezioni da CHIKV e DENV, invece, si è utilizzato il test sierologico

dell’immunofluorescenza indiretta.

Per confermare le positività di WNV e TBEV si è utilizzata la metodica delle placche

messa a punto durante il secondo anno di dottorato. Il test di neutralizzazione di riduzione

delle placche PRNT (Plaque Reduction Neutralization Test) è utile per rilevare gli anticorpi

neutralizzanti ed incrementare la sensibilità e la specificità ovviando il problema della

cross reattività degli anticorpi tra i diversi Flavivirus. Precedentemente WNV e TBEV sono

stati titolati mediante test delle placche.

Infine, la ricerca del TBEV è stata eseguita anche nei vettori che lo trasmettono ovvero le

zecche I. ricinus. Le zecche, raccolte nel Friuli Venezia Giulia, sono state suddivise in pool

ed omogenate; successivamente la ricerca del virus è stata effettuata mediante real-time

RT-PCR. I campioni positivi sono stati sequenziati per poter costruire alberi filogenetici al

fine di identificare i ceppi circolanti nella nostra regione.

3

1. INTRODUZIONE

1.1. ARBOVIRUS

Una zoonosi è una malattia o infezione di origine virale, batterica e protozoica, che viene

trasmessa all’uomo da animali vertebrati, roditori e altri mammiferi, ma anche artropodi

(zanzare, zecche, flebotomi).

Gli Arbovirus, dall’inglese arthropod-borne viruses, sono altamente patogeni per l’uomo e

per gli animali poiché agenti eziologici di alcune zoonosi, chiamate arbovirosi. Gli

Arbovirus sono virus mantenuti in natura grazie ad un ciclo biologico che coinvolge un

vertebrato come ospite ed un artropode ematofago come vettore (Figura 1) [Go et al.,

2014].

Figura 1. Ciclo biologico degli Arbovirus.

Introduzione

4

La trasmissione delle arbovirosi può avvenire tramite diversi cicli (Figura 2):

1. Ciclo enzootico (sylvatic or jungle cycle): avviene tramite la naturale trasmissione tra

animali selvatici (ospiti vertebrati) e vettori; il virus si replica nei vettori e gli ospiti

vertebrati fungono da reservoir, cioè da serbatoi dell’infezione che possono ospitare

il virus per lunghi periodo di tempo pur non manifestando sintomatologia. Pertanto i

reservoir sono definiti come ospiti primari e possono essere infettati più volte nel

corso della loro vita.

2. Ciclo epizootico (rural cycle): il virus viene trasmesso tra animali non selvatici o

domestici e i vettori. Possono originare focolai epidemici di infezione in popolazioni

di animali domestici dove il virus si replica (amplifying host) e spesso in questo ciclo

viene coinvolto anche l’uomo (per esempio Japanese encephalitis virus, Venezuelan

equine encephalitis virus).

3. Ciclo epidemico o urbano (urban cycle): l’uomo, sviluppando elevati livelli di

viremia, è il principale serbatoi di infezione; uno dei vettori principalmente coinvolti

in questa modalità di trasmissione è la zanzara Aedes aegypti (Dengue virus, Yellow

fever virus, St. Louis encephalitis virus, Chikungunya virus, Rift Valley fever virus).

4. Ospiti accidentali, occasionali o a fondo cieco: l’uomo è talvolta un ospite a fondo

cieco ovvero non sviluppando una viremia sufficiente e non essendo fonte di

amplificazione virale non può trasmettere a sua volta l’infezione ai vettori (Eastern

equine encephalitis virus, Western equine encephalitis virus, West Nile virus, Sindbis

virus).

Introduzione

5

Figura 2. Cicli di trasmissione degli Arbovirus; A. ciclo enzootico, B. ciclo epizootico, C. ciclo epidemico, D. ospiti a fondo cieco o accidentali;

a) ospiti in cui avviene l’amplificazione del virus e i vettori possono quindi infettarsi quando si nutrono da essi; b) ospiti a fondo cieco o occasionali sono ospiti intermedi che generalmente non sviluppano una viremia

elevata da consentire ad un vettore di infettarsi; c) vettori ponte, cioè artropodi che acquisiscono il virus da animali selvatici infetti e successivamente trasmettono il patogeno all’uomo a ad un ospite secondario

[Go et al., 2014].

Gli Arbovirus sono virus ad RNA la cui classificazione si basa sia su caratteristiche

strutturali sia su criteri ecologici. Le famiglie virali maggiormente rappresentate sono

quelle dei Bunyaviridae, dei Flaviviridae e dei Togaviridae [Hernandez et al., 2014]. Tra le

arbovirosi più importanti di interesse medico vi sono l’encefalite trasmessa dalla zecca del

genere Ixodes ricinus e la malattia da West Nile Virus che è una zoonosi veicolata dalla

zanzara comune del genere Culex. Altre Arbovirosi tra cui Dengue e Chikungunya hanno

l’uomo come ospite principale e sono trasmesse da zanzare del genere Aedes. In Italia il

vettore potenzialmente più efficace è Aedes albopictus, meglio conosciuta come zanzara

tigre, introdotta nel 1990 in relazione al commercio di pneumatici usati, e attualmente

diffusa in tutta la penisola.

Nell’elenco sottostante vengono indicati le principali arbovirosi di interesse medico

suddivise per famiglie:

Introduzione

6

Famiglia FLAVIVIRIDAE (Genere Flavivirus)

∗ St. Louis encephalitis

∗ Japanese encephalitis

∗ Yellow fever

∗ Dengue 1, 2, 3, 4

∗ West Nile

∗ Marisma

∗ Rocio

∗ Usutu

∗ Zika

∗ Tick-borne encephalitis

∗ Louping ill

∗ M. foresta Kyasanu

∗ Febbre emorragica di Omsk

∗ Powassan

Famiglia TOGAVIRIDAE (Genere Alphavirus)

∗ Eastern Equine encephalitis

∗ Western Equine encephalitis

∗ Venezuelan equine encephalitis

∗ Chikungunya

∗ Barmah forest

∗ Mucambo

∗ Ross River

Famiglia BUNYAVIRIDAE

∗ Bunyavirus

∗ Phlebovirus

- Febbre della Valle del Rift

- Sand fly Fever - tipo Napoli

- Sand fly Fever - tipo Sicilia

- Toscana

∗ Nairovirus

- Febbre emorragica di Crimea e Congo

Introduzione

7

Quasi tutti questi virus originariamente circolavno in regioni tropicali di Africa e Sud

America o in vari paesi asiatici; tuttavia oggi molti Arbovirus si trovano diffusi in tutto il

mondo. Negli ultimi anni la globalizzazione, i cambiamenti climatici, l’aumento

dell’urbanizzazione e della popolazione nelle regioni tropicali, l’aumento di viaggi e la

rapidità dei trasporti e del commercio hanno contribuito alla diffusione anche in nuove aree

dei vettori e quindi delle infezioni da loro trasmesse [Go et al., 2014].

La maggior parte di queste arbovirosi sono inapparenti; le forme sintomatiche si possono

suddividere nei seguenti raggruppamenti:

• febbre con sintomi simil influenzali, con o senza rash maculopapulare

• encefalite e/o meningite

• mialgie e artralgie

• febbre emorragica

Spesso possono dar luogo ad una sintomatologia che comprende più di una di queste

categorie [Hernandez et al., 2014].

1.2. FAMIGLIA FLAVIVIRIDAE, GENERE FLAVIVIRUS

I Flavivirus appartengono alla famiglia Flaviviridae, che sulle basi della filogenesi

molecolare, si distingue in tre generi: il genere Flavivirus, che include ad esempio il West

Nile virus (WNV), il Dengue virus (DENV) e Yellow fever virus (YFV); il genere

Pestivirus (dal latino pestis, peste); il genere Hepacivirus (dal greco hepár, fegato), a cui

appartiene il virus dell’epatite C (HCV). I virus membri di questa famiglia condividono

morfologia del virione, organizzazione genomica e strategia di replicazione, ma presentano

diverse proprietà biologiche [Kuno et al., 1998].

Il nome Flavivirus deriva dal termine latino flavus, giallo, ricordando l’ittero causato da

Yellow fever Virus (YFV). Il genere Flavivirus è costituito da più di 70 specie divise in 3

gruppi, chiamati cluster, e 14 sierogruppi, denominati clade (Figura 3) [Kuno et al., 1998].

In base al tipo di vettore coinvolto si distinguono i cluster mosquito-borne flavivirus

(MBF), tick-borne flavivirus (TBF) e virus no-known-vector per i quali non è ancora stato

identificato un vettore (NKV).

Introduzione

8

Figura 3. Classificazione dei Flavivirus [Mukhopadhyay et al., 2005].

Mosquito-borne flavivirus

La distribuzione geografica dei mosquito-borne flavivirus (dal clade VI al clade XIV) è

molto ampia e dipende dalla localizzazione dei vettori; questi virus si dividono in due

distinti gruppi epidemiologici:

1. sierogruppo dei virus neurotropi: causa encefaliti nell'uomo e negli animali ed è

rappresentato dal Japanese encephalitis sierocomplex che comprende West Nile

virus (WNV) e Japanese encephalitis virus (JEV); questi virus sono spesso correlati

alle zanzare del genere Culex e hanno come reservoir i volatili;

2. sierogruppo dei virus non neurotropi: causa principalmente febbri emorragiche e

include Dengue virus (DENV) e Yellow fever virus (YFV); questi virus sono

spesso associati alle zanzare del genere Aedes [Gaunt et al., 2001; Colpitts et al.,

2012].

Nello specifico, tra i Flavivirus trasmessi da zanzare troviamo:

� il sierogruppo del Calbertado virus;

� il virus del sierogruppo Aroa con l’Aroa virus (AROAV);

� il sierogruppo del virus Dengue che comprende i quattro sottotipi del Dengue virus

(DENV1, 2, 3 e 4);

Introduzione

9

� il sierogruppo del Kedougou virus (KEDV);

� i virus del sierogruppo dell’encefalite giapponese a cui prendono parte Cacipacore

virus (CPCV), Koutango virus (KOUV), Japanese encefalite virus (JEV), Murray

Valley encefalite virus (MVEV), Virus dell’encefalite di Saint Louis (SLEV), Usutu

virus (USUV), West Nile virus (WNV) e Yaounde virus (YAOV);

� i virus del sierogruppo Kokobera che include il Kokobera virus (KOKV);

� i virus del gruppo Ntaya includono Bagaza virus (BAGV), Ilheus virus (ILHV),

Israel turkey meningoencephalomyelitis virus (ITV), Ntaya virus (NTAV),

Tembusus virus (TMUV);

� i virus del gruppo Spondweni che comprende lo Zika virus (ZIKV);

� il sierogruppo Yellow fever in cui troviamo Banzi virus (BANV), Bouboni virus

(BOUV), Edge Hill virus (EHV), Jugra virus (JUGV), Saboya virus (SABV), Sepik

virus (SEPV), Uganda S virus (UGSV), Wesselsbron virus (WESSV) e Yellow

fever virus (YFV).

Tick-borne flavivirus

I tick-borne flavivirus (clade IV e V) vengono veicolati da zecche e vedono coinvolti

spesso i roditori come ospiti reservoir; possono essere a loro volta suddivisi in due gruppi:

1. Mammalian group, che infettano i mammiferi;

2. Seabird group, che infettano gli uccelli marini.

Il Tick-borne encephalitis virus (TBEV) appartiene al primo gruppo (clade IV), assieme a

Louping ill (LIV) virus, Langat virus (LGTV), Central European encephalitis virus

(CEEV), Russian spring-summer encephalitis virus (RSSEV), Omsk hemorrhagic fever

virus (OHFV), Alkhurma hemorrhagic fever virus (ALKV), Kyasanur Forest disease virus

(KFDV), Kadam virus (KADV), Powassan virus (POWV), Royal Farm virus (RFV),

Karshi virus (KSIV), Gadgets Gully virus (GGYV). Tra questi, TBEV, CEEV, RSSEV,

POWV e LIV causano encefalite nell’uomo e in altri mammiferi, OHFV, KFDV e AHFV

sono responsabili di disturbi emorragici, LGTV è conosciuto come Virus non patogeno,

mentre non sono stati riportati disturbi nell’uomo causati da KSIV, RFV o GGYV (Figura

4) [Gritsun et al., 2003; Turell, 2015].

Introduzione

10

Figura 4. Sottotipi e relazioni filogenetiche dei tick-borne flavivirus.

No-known-vector-borne flavivirus

Gli NKV Flavivirus formano tre gruppi distinti:

1. primo gruppo: correlato con i mosquito-borne virus, associato ai pipistrelli;

2. secondo gruppo: associato ai pipistrelli come ospiti reservoir ma geneticamente

distante dal primo;

3. terzo gruppo: associato ai roditori, probabilmente correlato filogeneticamente ai

TBF [Gaunt et al., 2001].

Studi recenti hanno suddiviso la terza categoria di Flavivirus (NKV) in Un-known

arthropod vector (UNKV), isolati dai mammiferi, ed Insect Flavivirus o Insect-specific

Flavivirus. Il primo virus all’interno del gruppo degli Insect flavivirus è il Cell fusing agent

virus (CFAV), isolato da cellule di Aedes aegypti. Il CFAV replica nelle zanzare e nelle

colture cellulari di Ae. Albopictus, ma non in cellule di mammifero. Per la prima volta il

CFAV è stato isolato a Porto Rico e in Thailandia, successivamente sono stati descritti

diversi virus appartenenti a questo gruppo. Nel 2003 il Kamiti River virus (KRV) è stato

isolato dalla specie Aedes macintoshi in Kenya; inoltre il Culex flavivirus (CXFV) è stato

isolato e caratterizzato dalle zanzare Culex sp. in Giappone, Indonesia, Guatemala,

Introduzione

11

Trinidad, USA, Mexico e Uganda. Altri nuovi membri degli insect flavivirus sono il Quang

Binh Virus (QBV) isolato da Cx. tritaeniorhynchus in Vietnam, Nakiwogo Virus (NAKV)

isolato dalla specie Mansonia africana nigerrima in Uganda e il Calbertado virus

identificato principalmente nelle zanzare Cx. tarsalis nel nord America. L’Aedes flavivirus

(AEFV) è stato isolato da Aedes albopictus e Aedes flavopictus in Giappone ed è correlato

al CFAV e al KRV. In Europa sono stati riportati diversi Insect flavivirus in zanzare

Ochlerotatus sp., Culex sp. e Aedes sp. raccolte in Italia, Spagna, Portogallo, Regno Unito

e Repubblica Ceca [Roiz et al., 2012].

1.2.1. GENOMA, CARATTERISTICHE STRUTTURALI E REPLIC AZIONE

Il genoma dei Flavivirus è costituito da un singolo filamento lineare di RNA a polarità

positiva di circa 11.000 nucleotidi (Figura 5). Nel genoma si distingue un lungo segmento

ORF (Open Reading Frame) incluso tra due regioni non codificanti (non coding regions,

NCR) e altamente conservate, una all’estremità 5’ (5’ NCR) e una all’estremità 3’ (3’

NCR). Le regioni NCR, denominate anche NTR (not translated regions) o UTR

(untranslated regions), constano rispettivamente di 130 e 400-700 nucleotidi. La regione 5’

NCR funge da innesco di traduzione.

Figura 5. Organizzazione del genoma dei Flavivirus.

La singola ORF codifica per un’unica poliproteina che viene scissa in 10 proteine da

proteasi virali e della cellula ospite: 3 proteine strutturali, denominate proteina E (envelope

o mantello), proteina C (nucleocapside) e proteina prM (precursore di membrana) e 7

proteine non strutturali NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Le sequenze

codificanti più vicine all’estremità 5’ (N-terminale) codificano per le proteine strutturali

Introduzione

12

mentre le proteine non strutturali (proteasi, elicasi e polimerasi) sono codificate da

sequenze più vicine all’estremità 3’ [Mukhopadhyay et al., 2005; Lindquist et al., 2008;

Hernandez et al., 2014].

I Flavivirus vengono rapidamente inattivati dall’esposizione al calore: in dieci minuti a

50°C perdono già il 50% della loro infettività. Sono inoltre sensibili a disinfettanti, solventi

dei lipidi e detergenti mentre risultano stabili a pH 8, in condizioni di laboratorio.

La struttura dei virioni dei Flavivirus, rivelata grazie alle tecniche di microscopia

elettronica (cryoEM), varia durante gli stadi maturativi del virus [Mukhopadhyay et al.,

2005]. I virioni immaturi (Figura 6) appaiono come particelle sferiche o pleomorfe di circa

40-60 nm e contengono un capside o core denso di elettroni (circa 30 nm) a simmetria

icosaedrica circondato da un envelope (o pericapside o mantello). Il capside è composto da

una singola proteina denominata proteina C di 100 amminoacidi. Sulla superficie del

virione vi sono due glicoproteine ancorate, tramite il C-terminale, al doppio strato lipidico

che circonda il core; queste sono la proteina E dell’envelope e la proteina prM, proteina

precursore di membrana. Le proteine E e prM neosintetizzate vengono incorporate nel

virione immaturo ed interagiscono tra loro per garantire il suo trasporto dal reticolo

endoplasmatico (RE) verso l’esterno della cellula proteggendolo dall’ambiente acido degli

endosomi [Allison et al., 1995; Guirakhoo et al., 1991]. Grazie al taglio di prM da parte

della furin proteasi cellulare, il virione viene convertito nella forma attiva matura e

rilasciato dalla cellula [Allison et al., 1999; Stadler et al., 1997]. Il virione maturo

(diametro di circa 50 nm) è composto da un capside icosaedrico avvolto da un envelope

con le due proteine associate alla membrana, M ed E [Kuhn et al., 2002].

Figura 6. Rappresentazione del virione dei Flavivirus.

Introduzione

13

La glicoproteina E (50-60 kDa) è la componente principale della superficie virale, consente

il legame dell’ospite al recettore e media la fusione del virione maturo con la membrana

endosomiale. Il rilascio del genoma virale nel citoplasma si verifica dopo il cambio

conformazionale indotto dal pH acido presente nell’endosoma. Inoltre questa proteina è

responsabile della formazione di anticorpi neutralizzanti che determinano un’efficace

immunità protettiva nell’ospite [Allison et al., 2001].

La proteina di membrana M è invece una proteina non glicosilata, associata all’envelope,

ed è responsabile dei legami fra nucleocapside ed envelope e stimola anch’essa la

produzione di anticorpi neutralizzanti.

La proteina del capside C (11 kDa), rispetto alle altre due proteine strutturali, presenta una

minore omologia tra i vari Flavivirus.

Vi sono poi le proteine non strutturali (NS), che intervengono, in vario modo, nella

replicazione virale (espressione delle proteine, assemblaggio e rilascio delle particelle

virali) e nell’elusione del sistema immunitario dell’ospite. Queste sono:

∗ NS1: proteina implicata nella replicazione dell'RNA virale; mutazioni nei siti di

glicosilazione possono portare a difetti in questo processo e nella produzione del

virus [Lindenbach et al., 2007]. Sembra inoltre contribuire alla regolazione della

risposta immunitaria innata ed è in grado di impedire l’attivazione del TLR3

[Wilson et al, 2008].

∗ NS2A: proteina coinvolta nei processi di assemblaggio del capside, inibizione della

trascrizione ed espressione dell'INF-beta [Liu et al, 2004].

∗ NS2B: proteina cofattore per la sintesi della serina proteinasi NS3.

∗ NS3: proteina che partecipa alla replicazione virale e mostra attività NTPasica in

associazione con NS5.

∗ NS4A e NS4B: piccole proteine che agiscono durante la replicazione virale,

inducendo riarrangiamenti della membrana del reticolo endoplasmatica dell’ospite

per la formazione di vescicole contenenti dsRNA e polimerasi. NS4A sembra

regolare l’attività ATPasi della NS3 elicasi, NS4B previene invece l’azione

antivirale cellulare, mediante il blocco della produzione di interferone (INF) alfa e

beta [Munoz-Jordan et al., 2005].

∗ NS5: proteina multifunzionale di 130 kDa, maggiormente conservata tra i

flavivirus; contiene all’N-terminale una metiltransferasi (MTase) e al C-terminale

una RNA polimerasi-RNA dipendente (RdRp). L’attività di metiltransferasi consiste

Introduzione

14

nell’addizionare gruppi metilici nella parte terminale degli RNA virali nascenti per

proteggerli dalla degradazione e per consentire ai ribosomi cellulari di riconoscerli

per la traduzione. Studi di mutagenesi hanno dimostrato che NS5 è essenziale

durante la replicazione e contribuisce a prevenire l’azione antivirale da parte

dell’INF; si pensa quindi che potrebbe essere un importante target antivirale per

farmaci in grado di bloccare questo processo [Geiss et al., 2009; Laurent-Rolle et

al, 2010].

L’entrata del virus nelle cellule ospiti avviene tramite endocitosi mediata da recettori; la

proteina E virale lega lectine e glicosaminoglicani, in particolare l’eparan solfato, presenti

sulla superficie cellulare [Lindquist et al., 2008; Mansfield et al., 2009]. L’endocitosi è di

tipo clatrina-dipendente: dopo che il recettore si è legato al dominio DIII della proteina E,

si forma una depressione sulla superficie cellulare che attira la clatrina e porta alla

formazione delle cosiddette fossette rivestite. Queste si ripiegano ulteriormente fino a

richiudersi per formare una vescicola che si fonderà poi con l’endosoma primario nel

citoplasma; a questo punto avviene la fusione, durante la quale il rivestimento si rompe

(scapsidamento) e la clatrina ritorna nella membrana plasmatica per formare una nuova

fossetta rivestita. Una volta penetrato nella cellula, il virus perde il capside e il genoma va

incontro a replicazione. Questo processo consiste nella sintesi del filamento negativo di

RNA, che funge da stampo per l’amplificazione di quello positivo. La reazione enzimatica

è catalizzata dall’attività di NS5 in associazione con la proteasi virale NS3. Il virione

assemblato subisce un processo di maturazione mediante la proteolisi di prM, per essere

poi rilasciato sulla superficie cellulare per esocitosi [Villordo et al., 2009; Selisko et al.,

2014].

1.3. TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS

1.3.1. CARATTERISTICHE E SOTTOTIPI DEL TBEV

Il Tick-borne encephalitis virus (TBEV) appartiene al gruppo degli Arbovirus, alla famiglia

Flaviviridae e al genere Flavivirus [Kuno et al., 1998].

Le analisi genetiche delle sequenze del gene E dei ceppi isolati, in differenti regioni

geografiche, hanno permesso di distinguere tre sottotipi di TBEV denominati a seconda

dell’area di maggiore circolazione: European o Western European o europeo, Siberiano o

Introduzione

15

siberiano e Far Eastern o asiatico (Figura 7).

Il sottotipo European è largamente distribuito in Europa occidentale e adopera come

vettore Ixodes ricinus; il Far Eastern ed il Siberian vengono trasmessi da I. persulcatus e si

riscontrano nell’Europa dell’Est (Russia, Estonia, Lettonia e Siberia) ed in Asia (Cina e

Giappone) [Dumpis et al, 1999; Charrel et al., 2004; Ecker et al., 1999]. Vi sono tuttavia

delle aree in cui si osserva una co-circolazione dei diversi sottotipi e dei due vettori, come

ad esempio nei Paesi Baltici o in Finlandia [Mavtchoutko et al., 2000; Lindquist et al.,

2008; Amicizia et al., 2013].

Figura 7. Distribuzione geografica dei sottotipi del TBEV e dei rispettivi vettori [Lindquist et al., 2008].

La variabilità intra-sottotipo è del 2.2%, mentre quella tra sottotipi è del 2-5.2% [Ecker et

al., 1999]. I tre sottotipi sono correlati sia antigenicamente che filogeneticamente, ma

mostrano patogenicità e decorso di malattia differenti [Bogovic et al., 2010; Gaumann et

al., 2010]. È importante ricordare che il sottotipo European include i ceppi Neudoerfl,

isolato in Austria nel 1971 da una zecca [Heinz et al., 1981], Hypr, isolato da sangue

umano in Cecoslovacchia nel 1953, e altri ceppi isolati in Svizzera, Francia, Germania,

Ungheria, Slovenia, Croazia, Finlandia. Al sottotipo Far Eastern appartengono i ceppi

N132 (isolato nel 1997 a Wladiwostok), Absettarov, N256, Sofjin e altri ceppi provenienti

dall’Europa dell’Est (Russia, Ucraina, Lituania), dalla Cina e dal Giappone. Il sottotipo

Siberian, più vicino filogeneticamente al Far Eastern, include principalmente i ceppi Aina e

Vasilchenko (Figura 8) [Ecker et al., 1999].

Introduzione

16

Figura 8. Albero filogenetico dei ceppi isolati di TBEV [Ecker et al., 1999].

1.3.1. GENOMA E STRUTTURA

Dal punto di vista strutturale il TBEV ha un diametro di 50 nm, simmetria icosaedrica e

comprende il capside che è costituito dal genoma ad RNA e dai dimeri della proteina C ed

è circondato dall’envelope a cui sono ancorate due proteine E e prM. Quest’ultima subisce

un taglio proteolitico che rende il virione maturo e quindi capace di liberarsi dalla cellula

ed infettarne altre.

Il genoma, come per tutti i Flavivirus, è costituito da un singolo filamento lineare di RNA a

polarità positiva di circa 11 kb. Si distingue un unico segmento ORF incluso tra due

regioni non codificanti e altamente conservate alle due estremità. La ORF codifica per una

poliproteina che viene scissa in 10 proteine da proteasi virali e dell’ospite. Le proteine più

importanti dal punto di vista patogenetico e diagnostico sono la proteina strutturale E e la

proteina non strutturale NS5. La prima consente il legame al recettore dell’ospite e

costituisce il principale determinante antigenico, mentre la seconda è la proteina

Introduzione

17

maggiormente conservata tra i Flavivirus ed ha attività metiltransferasica e polimerasica

[Lindquist et al., 2008].

1.3.2. PATOGENESI E MANIFESTAZIONI CLINICHE

Il TBE virus è trasmesso all’uomo attraverso due vie:

∗ mediante morso di zecca infetta

∗ per via alimentare (più raro), tramite ingestione di latte o formaggio non

pastorizzato [Cisak et al., 2010].

L’infezione da TBEV può causare un ampio spettro di manifestazioni cliniche che vanno

dall’infezione asintomatica alla meningoencefalite grave con o senza paralisi dipendenti

dal sottotipo virale. Nel 70% dei casi l’infezione rimane silente dal punto di vista clinico,

anche se possono essere dimostrati la viremia e la formazione di anticorpi. Solo il 10-30%

degli infettati ha manifestazioni cliniche dopo un periodo di incubazione di 7-14 giorni o di

3-4 giorni nel caso in cui l’infezione sia avvenuta per via alimentare. Infatti l’attività del

virus può essere osservata nel succo gastrico entro due ore dall’ingestione di tali alimenti

[Bogovic et al., 2010].

La malattia causata dai due sottotipi orientali ha un andamento monofasico con

coinvolgimento del sistema nervoso centrale e solo una piccola percentuale di casi presenta

stati febbrili con mal di testa [Bogovic et al., 2010; Gaumann et al., 2010]; il sottotipo

europeo mostra invece un andamento bifasico [Kaiser, 1999; Gritsun et al., 2003].

Dopo il morso della zecca, il virus del sottotipo europeo, si replica localmente a livello

delle cellule epiteliali, migra ai linfonodi regionali da cui accede al torrente circolatorio

determinando viremia (Figura 9). In seguito il virus raggiunge ed infetta diversi organi e

tessuti e a questo corrisponde la prima fase clinica della malattia con sintomi simil-

influenzali della durata di 2-7 giorni; segue un periodo di remissione con guarigione.

In una parte di pazienti dopo 2-4 settimane di benessere il virus può superare la barriera

emato-encefalica, replicarsi nell’endotelio dei capillari cerebrali coinvolgendo il sistema

nervoso centrale determinando l’insorgenza di meningite (50% dei casi), encefalite (40%)

e meningo-encefalomielite (10%). La gravità della malattia aumenta con l’età: nei bambini

e negli adolescenti la forma che predomina è la meningite. Nel 40-50% dei casi si possono

avere sequele neurologiche per lungo tempo (mesi, anche anni), che si manifestano con

paralisi, atassia e altri disturbi neurologici.

Introduzione

18

Le encefaliti causate dal sottotipo di TBEV centro-europeo sono fatali nell’1-2% dei casi,

mentre quelle causate del sottotipo orientale nel 20-60%. Il terzo sottotipo invece è meno

letale (1-3%), ma ha una tendenza maggiore a sviluppare forme di infiammazione cronica a

causa di mutazioni nel gene NS1 [Bogovic et al., 2010; Gaumann et al., 2010; Kaiser,

2012].

Figura 9. Diffusione del TBE Virus nell’organismo.

1.3.3. DIAGNOSI E TERAPIA

Un caso di TBE è definito dalla presenza di segni/sintomi clinici di meningite o meningo-

encefalite e da una conferma microbiologica dell’infezione (dimostrazione di anticorpi

specifici). I valori della Proteina C Reattiva e la sedimentazione eritrocitaria risultano

leggermente aumentati; l’analisi del liquido cerebrospinale mostra un aumento dei leucociti

(pleocitosi), accompagnato da normali livelli di glucosio e lattato [Bogovic et al., 2010].

La clinica unitamente al dato anamnestico della puntura di zecca pone il sospetto, ma la

diagnosi di certezza è solo laboratoristica. La diagnosi dell’infezione da TBEV può essere

talvolta complicata poiché:

� dal punto di vista clinico molti pazienti non mostrano sintomatologia fino ad un

tardo decorso della malattia quando sono ormai evidenti i segni neurologici;

� si può riscontrare reattività crociata con anticorpi nei confronti di altri Flavivirus,

che rende le analisi difficilmente interpretabili.

La diagnosi sierologica si basa sulla ricerca di anticorpi (IgM e IgG) diretti contro la

proteina E utilizzando tecniche immunoenzimatiche ELISA o RIA (fissazione del

Introduzione

19

complemento, neutralizzazione anticorpale, inibizione dell’emoagglutinazione). Queste

analisi vengono eseguite sul siero e sul liquido cerebrospinale e presentano una specificità

e sensibilità maggiori del 99% [Bogovic et al., 2010]. I test sierologici sono molto sensibili

ma purtroppo danno luogo a reazioni di reattività crociata tra i vari membri del genere

Flavivirus poiché sono simili tra loro antigenicamente.

Nella fase acuta di infezione si dispone di tecniche di biologia molecolare per poter

identificare il genoma virale mediante real-time RT-PCR su sangue intero, liquido

cerebrospinale e urine, nelle quali recentemente si è scoperta la presenza del virus [Veje et

al., 2014; Caracciolo et al., 2015]. Si può inoltre isolare il virus su colture cellulari in

Laboratorio di Biosicurezza di livello 3 (Figura 10).

La dimostrazione della presenta del TBE virus nelle urine rappresenta un importante

miglioramento dal punto di vista diagnostico perché questo tipo di campione è ottenibile in

maniera non invasiva e in quantità cospicua. Tuttavia sono necessari ulteriori studi per

capire se la presenza del virus nelle urine sia confinata a casi particolari, come ad esempio

in soggetti immunodepressi, oppure possa essere ricercata nella diagnosi di routine.

Figura 10. Tecniche diagnostiche e fasi cliniche del TBEV.

Diagnosi differenziale

La diagnosi differenziale è piuttosto estesa e complessa poiché include un’ampia varietà di

Introduzione

20

infezioni a carico del sistema nervoso e patologie che non vedono coinvolti agenti infettivi.

Nella fase iniziale della TBE, ovvero la fase viremica, la diagnosi differenziale comprende

diverse sindromi virali a causa dei sintomi aspecifici; se sono presenti nausea, vomito e

diarrea, la gastroenterite potrebbe essere una possibile spiegazione. Quando iniziano a

svilupparsi sintomi neurologici, la TBE ha bisogno di essere distinta da encefaliti o

meningiti asettiche causate da altri virus, come ad esempio il West Nile virus. La diagnosi

differenziale racchiude anche altre patologie causate da morso di zecca come la borelliosi

di Lyme, babesiosi, anaplasmosi, rickettsiosi e tularemia. In molte regioni endemiche,

inoltre, il TBEV si sovrappone geograficamente alla presenza di agenti batterici come

Anaplasma phagocytophilum e Borrelia burgdorferi. Queste patologie sono entrambe

trattabili con antibiotici perciò è utile poterle distinguere dalla TBE [Bogovic et al., 2015].

Terapia

Attualmente non esiste terapia eziologica ma solo sintomatica. Nella gestione dei casi

clinici è indispensabile il mantenimento dell’equilibrio idrico e degli elettroliti, la

somministrazione di antipiretici ed analgesici e, se necessario, di anticonvulsivi. Nei casi di

meningite e/o encefalite è richiesto il ricovero ospedaliero e la fisioterapia degli arti

paralizzati per prevenire l’atrofia muscolare [Kaiser, 2008].

1.3.4. EPIDEMIOLOGIA

Nel corso degli ultimi 20 anni si è osservato un aumento della prevalenza di zecche infette

e parallelamente di incidenza della malattia nell’uomo con un ampliamento delle aree

endemiche. Questo fenomeno dipende da una complessa interazione tra fattori climatici,

umani, sociali ed economici. L’aumento della temperatura e delle precipitazioni influisce

sul ciclo di sviluppo del vettore. L’abbandono delle aree coltivate ed il rimboschimento

hanno creato un habitat adatto per la sopravvivenza e la diffusione dei vettori. Inoltre,

l’incremento di viaggi ed attività lavorative/ricreative in aree endemiche favorisce

l’esposizione al TBEV [Randolph et al., 2000; Randolph, 2008; Bogovic et al., 2015].

L’infezione da TBEV si trova solamente in piccole aree dove esistono le condizioni ideali

per il suo mantenimento. Un’area endemica per TBEV è definita come una zona con

comprovata circolazione di TBEV tra zecche e ospiti vertebrati o in cui vi è la conferma di

almeno 20 anni di infezioni autoctone in animali o nell’uomo. Lo sviluppo di una foce

naturale dipende da una varietà di fattori, tra cui la dinamica di popolazione dei vettori e

Introduzione

21

dei loro ospiti e la presenza di ospiti suscettibili al virus [Süss, 2011].

Cenni storici e distribuzione

Il TBEV è stato identificato per la prima volta nell’Unione Sovietica nel 1937 [Gritsun et

al., 2003]. La trasmissione Ixodidi-mammiferi venne invece rivelata due anni dopo

[Lindsquit et al., 2008] e il primo isolamento è avvenuto in Russia nel 1949 [Amicizia et

al., 2013]. Data la stagionalità dell’attività delle zecche, da aprile a luglio, inizialmente la

malattia venne chiamata meningo-encefalite primaverile-estiva (in tedesco Frühsommer-

Meningoenzephalitis, da cui la sigla FSME), ma assume ormai più comunemente il nome

di encefalite da zecche (in inglese Tick-Borne Encephalitis, da cui l’abbreviazione TBE).

La TBE è frequente in molti paesi dell’Europa (Figura 11) e del centro Asia. L’incidenza

stimata è tra i 10 mila e i 15 mila casi all’anno, ma si tratta sicuramente di cifre

sottostimate poiché la malattia non viene sempre notificata. Attualmente in molti Paesi

europei, come nei Paesi Baltici, in Repubblica Ceca, in Russia ed in Slovenia, la TBE

costituisce un importante problema di sanità pubblica poiché è in costante aumento

[Amicizia et al., 2013; Bogovic et al., 2015]. In Austria, dove è stata realizzata un’intensa

campagna vaccinale, morbosità e mortalità sono state drasticamente ridotte: prima

dell’introduzione della vaccinazione nel 1981, l’incidenza della TBE era di circa 700 casi

all’anno mentre oggi grazie alla intensiva copertura vaccinale si è ridotta del 90% [Donoso

Mantke et al., 2011]. Questo può essere facilmente appreso da uno studio condotto tra il

1972 ed il 2011, e pubblicato di recente da Heinz e colleghi nel 2015. L’Austria rimane

comunque un Paese ad alto rischio di contrarre la TBE per i turisti. Anche in Svizzera la

vaccinazione di massa e la caratterizzazione di aree di rischio hanno diminuito

notevolmente il tasso di incidenza [Gaumann et al., 2010]. La Germania è sicuramente uno

degli stati dell’Europa occidentale più colpiti da TBE. In Francia il primo caso è stato

diagnosticato nel 1968 e l’incidenza sembra essere di 5-10 casi all’anno, mentre sono stati

documentati anche casi associati al consumo di latte crudo nella zona alpina. Negli Stati

Baltici, soprattutto in Lettonia, l’incidenza è molto alta e, come già descritto, circolano tutti

e tre i sottotipi virali. In Finlandia vengono registrati 20-40 casi all’anno ed in Norvegia

circa 50, mentre in Svezia e Danimarca la TBE è meno diffusa ma è comunque presente. In

Slovenia invece la TBE è considerata endemica a causa dell’alta incidenza e della bassa

copertura vaccinale, soprattutto nella zona settentrionale (regioni Carinzia e Alta Carniola).

Recentemente l’infezione si è diffusa nella costiera adriatica arrivando a colpire anche la

Introduzione

22

Croazia, la Serbia e la Bosnia-Herzegovina, dove sono stati documentati anche casi legati

alla via alimentare. Anche in Albania e in Romania la TBE è endemica in particolare nella

parte nord-est; alcuni studi hanno dimostrato una sieroprevalenza dello 0.6% nella

popolazione romena. Nel nord della Grecia pare circolare un Flavivirus del sierogruppo del

TBEV che a Salonicco ha generato casi clinici sporadici. Nell’Europa dell’Est, come

Repubblica Ceca e Slovacchia, l’incidenza è piuttosto elevata fin dal 1997-98, mentre in

Ungheria vi sono delle zone considerate endemiche e negli ultimi anni alcuni casi sono

stati collegati all’assunzione di latte crudo. In Polonia sembrano essere più colpite le aree a

nord-est e sud-ovest, in Ucraina sono state identificate tre aree endemiche, mentre in

Bielorussia il virus circola sull’intero territorio. La Russia è considerato lo stato europeo a

più alta incidenza: la TBE è endemica in almeno 44 degli 83 soggetti federali. Infine, fino

ad oggi, in Belgio, Regno Unito, Irlanda, Lussemburgo, Paesi Bassi, Spagna, Portogallo e

Malta non sono stati mai registrati casi autoctoni [Amicizia et al., 2013].

Figura 11. Incidenza di TBE per 100 mila abitanti nell’Unione Europea [Fonte ECDC].

In Italia la presenza di TBE è nota fin dagli anni ‘70 anche se ha un’importanza secondaria

per la salute pubblica rispetto alla borreliosi di Lyme, infezione batterica causata dallo

stesso vettore. Come per il resto dell’Europa i cambiamenti climatico-ambientali e

l’abbondanza di ungulati hanno portato ad un aumento della popolazione delle zecche e

secondariamente dell’incidenza dell’infezione [Rizzoli et al., 2009].

Introduzione

23

Il primo caso clinico di TBE è stato documentato in Toscana nel 1975; da allora casi

sporadici sono stati riportati in Trentino-Alto Adige e Veneto. Tra il 1995-2001 il numero

di casi è aumentato arrivando a 102 casi registrati e tra il 2003 ed il 2005 si sono

confermati 17 casi. Il primo caso autoctono in FVG è stato segnalato nel 2003, in provincia

di Udine, in una donna di 36 anni. Come in altri Paesi è stata attuata una campagna di

prevenzione regionale grazie alla quale nella popolazione residente si è verificato un calo

dell’infezione, mentre risulta aumentata l’incidenza nei turisti [Beltrame et al., 2005;

Beltrame et al., 2006].

Recentemente è stato condotto un interessante studio retrospettivo nelle tre regioni in cui

l’infezione è presente (Friuli Venezia Giulia, Trentino-Alto Adige e Veneto) per poter

stabilire l’incidenza di TBE dal 2000 al 2013. Nell’area di studio sono stati segnalati 367

casi (0.38/100000 abitanti); per la maggior parte di questi i sintomi si sono presentati tra

aprile e ottobre (con due picchi in giugno e luglio) e l’età è risultata compresa tra 30 e 70

anni per circa il 70%. L’encefalite si è dimostrata la manifestazione clinica più frequente,

mentre in 60 soggetti si sono manifestate sequele neurologiche come paralisi, tremori,

disturbi di memoria e di concentrazione. Solo in due casi l’esito è risultato fatale. Quasi

tutti i soggetti non erano vaccinati ed alcuni ricordavano di essere stati morsi da una zecca.

La distribuzione geografica dei casi è risultata piuttosto eterogenea e le province

maggiormente colpite dall’infezione sono risultate Pordenone (Tramonti di Sopra), Belluno

(Limana), Udine (Resiutta) e Trento (Tres) [Rezza et a., 2015]. Questi dati dimostrano

l’utilità degli studi entomologici in quanto dimostrano la circolazione del virus. Il TBEV è

stato trovato nel 2.1% delle zecche raccolte tra Veneto e Friuli Venezia Giulia (Vicenza,

Verona, Treviso, Pordenone e Udine) tra aprile e giugno 2006-2008, come sottolineato da

Capelli et al., in uno studio pubblicato nel 2012; in un lavoro pubblicato nel 2009 da

D’Agaro e collaboratori la prevalenza è risultata dello 0.21% nelle zecche raccolte tra il

2005 ed il 2006 nell’area alpina dell’estremo nord-est della regione FVG [D’Agaro et al.,

2009; Capelli et al., 2012; Rezza et a., 2015].

Tuttavia, l’incidenza di TBE in Italia è piuttosto bassa se si paragona agli altri stati europei

ed è limitata ad alcune zone del nord-est Italia; i casi clinici sono infatti circoscritti a livello

regionale: le principali foci segnalate sono la provincia di Trento, la provincia di Belluno e

la zona nord-est del Friuli Venezia Giulia. L’episodio toscano viene considerato isolato, in

quanto il virus, nonostante fosse stato trovato anche nei vettori, non è più ricomparso. Sono

stati segnalati inoltre alcuni casi sporadici in Lombardia, regione che confina con la

Svizzera, altro paese europeo con alta incidenza del virus. Appare evidente che

Introduzione

24

l’epidemiologia del TBEV è strettamente correlata con l’ecologia e la biologia delle zecche

I. ricinus sia per quanto riguarda la loro distribuzione sia per la loro attività stagionale.

Bisogna inoltre ricordare che il Triveneto confina con Austria e Slovenia, paesi in cui il

virus è endemico [Beltrame et al., 2005, Beltrame et al., 2006, Cruciatti et al., 2006,

Caracciolo et al., 2015, Rezza et al., 2015]. Nelle altre regioni italiane non c’è evidenza

della patologia, ma non ci sono nemmeno dati per poterla escludere.

Vettore del TBEV: morfologia, ciclo biologico e ospiti della zecca Ixodes ricinus

Le zecche sono artropodi ectoparassiti ematofagi obbligati, appartenenti alla famiglia degli

Ixodidae, zecche dure, così definite per la presenza di uno scudo dorsale chitinoso. Come

accennato, i principali vettori del TBEV sono Ixodes ricinus per il sottotipo europeo ed

Ixodes persulcatus per i due sottotipi orientali. Il primo è diffuso in Europa, arrivando fino

in Turchia, nelle zone settentrionali dell’Iran e del sud-est del Caucaso, mentre l’altro

circola nell’Europa dell’Est, in Siberia e in Asia (Cina e Giappone). In alcune aree della

Siberia e della Cina, dove I. persulcatus non è la specie predominante, sono state associate

altre famiglie di zecche come le Dermacentor e le Haemaphysalis [Süss, 2011]. Ci sono poi

delle zone di overlap dei due vettori tra gli Stati Baltici e gli Urali e di conseguenza si ha la

circolazione di tutti e tre i sottotipi (Figura 12).

Figura 12. Distribuzione della Zecca I. ricinus in Europa [Fonte ECDC].

Introduzione

25

I. ricinus è una zecca ad esoscheletro chitinoso ben differenziata sessualmente: la femmina

è di dimensioni maggiori (3-4.5 mm) e presenta uno scudo che ricopre parzialmente il

dorso, mentre il maschio (2-3.5 mm) possiede un esoscheletro duro che lo ricopre

completamente (Figura 13).

Figura 13. I. ricinus femmina e maschio visti dal dorso.

L’apparato boccale, chiamato rostro o capitulum, è di tipo pungente-succhiatore e mobile

rispetto al corpo. Le ghiandole salivari, annesse all’apparato digerente, secernono sostanze

anestetiche per ridurre il dolore al momento del morso, anticoagulanti che favoriscono il

prelievo di sangue, antiinfiammatorie e immunosoppressive che contrastano la risposta

dell’ospite (Figura 14).

La zecca, diversamente dalla zanzara, minimizza il costo energetico mentre succhia il

sangue perché sfrutta l’attività cardiocircolatoria dell’animale parassitato; dopo aver

succhiato, trattiene la parte corpuscolata e rigurgita la frazione liquida per poter mantenere

il suo equilibrio idrostatico [Süss, 2003].

Figura 14. Apparato boccale di I. ricinus.

Introduzione

26

Il ciclo biologico degli Ixodidae presenta quattro stadi di sviluppo: uovo, larva, ninfa e

adulto (Figura 15). Per passare da uno stadio al successivo, la zecca necessita di un pasto di

sangue, che può compiere su uno stesso ospite (parassiti monoxeni) o, più frequentemente,

su due o più ospiti (dixeni ed eteroxeni).

Figura 15. Stadi di sviluppo di I. ricinus.

Ad ogni pasto la zecca si stacca, effettua la muta nell’ambiente ed in seguito cerca un altro

ospite su cui nutrirsi. La nutrizione nelle larve e nelle ninfe avviene generalmente senza

interruzioni, mentre nelle femmine adulte avviene in due fasi. In ogni stadio della crescita,

la zecca compie un unico pasto ematico di diversa durata: qualche ora nella fase larvale, 12

ore circa nella fase ninfale e 24-48 ore quando l’acaro è adulto.

La riproduzione è sessuata e può avvenire sia sull’ospite parassitato che nell’ambiente

esterno, quindi prima dell’aggressione. Il ciclo vitale (Figura 16) si compie mediamente in

uno-tre anni, a seconda della temperatura e della reperibilità degli ospiti [Moshkin et al.,

2009; Süss, 2003].

La metamorfosi da larve a ninfe, dopo il pasto, può avvenire entro un periodo compreso tra

2 settimane e 5 mesi. Le ninfe, che presentano otto zampe, come gli adulti, restano attive

tutta l’estate parassitando caprioli, cervi, topi, ed eventualmente l’uomo. Una volta trovato

l’ospite adatto su cui nutrirsi, si trasformano in adulti dopo un tempo variabile da 2

settimane a 7 mesi di tempo. Gli stadi immaturi si nutrono su piccoli mammiferi e

insettivori (uccelli e lucertole), mentre gli adulti utilizzano come ospiti i mammiferi più

grandi (caprioli, daini e cervi), compreso l’uomo [Gray et al., 2009].

I principali ospiti e serbatoi in natura sono rappresentati da piccoli roditori. È possibile

identificare tre tipi di ospiti (Figura 16):

- ospiti serbatoio (reservoir): sono animali infetti che pur essendo asintomatici trasmettono

Introduzione

27

l’infezione poiché agiscono da serbatoi. Vengono classificati in questo gruppo roditori,

insetti e carnivori;

- ospiti indicatori: animali infetti che non possono trasmettere il virus ad altri vettori a

causa della bassa carica virale. Tra questi si trovano ungulati selvatici (caprioli, daini e

cervi), ovini, carnivori (volpe), pipistrelli ed uccelli. In particolare il capriolo (Capreolus

capreolus), l’ungulato maggiormente diffuso in Europa, sembra essere fondamentale nel

mantenimento della popolazione delle zecche [Labuda et al., 1997; Rizzoli et al., 2009].

Gli uccelli, molto probabilmente, contribuiscono a trasportare passivamente zecche infette

anche a notevole distanza durante le loro migrazioni [Mansfield et al., 2009];

- ospiti accidentali o occasionali: possono essere infettati sviluppando viremia ma non

contribuiscono alla circolazione del virus; in questa categoria è incluso l’uomo [Süss,

2003].

Figura 16. Ciclo biologico ed ospiti di I. ricinus.

Introduzione

28

La TBE mostra un tipico andamento stagionale di tipo bimodale, con picchi di incidenza

nel periodo primaverile-estivo (maggio/giugno) e primo autunnale (settembre/ottobre),

corrispondenti ai periodi di massima attività delle zecche. La loro presenza è condizionata

dai seguenti fattori climatico-ambientali:

� fattori abiotici come la temperatura (6-25°C), l’umidità relativa (>85%) e l’uso del

suolo;

� fattori biotici, quali la disponibilità di ospiti vertebrati da parassitare e la

vegetazione.

I. ricinus è una specie dotata di elevata plasticità ecologica; l’habitat preferito è

rappresentato da luoghi ricchi di vegetazione erbosa ed arbustiva, con microclima

preferibilmente fresco ed umido, ma è frequente anche nella fascia ecotonale bosco-

prato/pascolo [Moshkin et al., 2009]. Le zecche amano appunto gli ambienti ombreggiati

con vegetazione bassa ed un letto di foglie secche, meglio se boschivi e con erba incolta,

come pure le zone di confine tra prato e bosco soprattutto se con presenza d’acqua.

Le mutate condizioni ambientali, che hanno favorito il proliferare delle popolazioni di

ospiti naturali, l’elevata capacità riproduttiva (una femmina adulta depone fino a diverse

migliaia di uova), la scarsità di antagonisti naturali e la resistenza ai pesticidi ed alle

condizioni ambientali sfavorevoli spiegano la crescente diffusione delle zecche osservata

da alcuni anni in molti paesi.

La specie Ixodes è nota per la trasmissione simultanea di diversi patogeni durante il pasto

di sangue. L’animale ospite può quindi sviluppare contemporaneamente i quadri clinici

delle patologie da essi provocate (Tabella 1). I microrganismi di solito non interferiscono

tra loro nella stessa zecca poiché occupano diversi organi, tessuti o strutture cellulari che

fungono così da nicchie ecologiche [Süss, 2011].

L’eziologia di queste malattie comprende diversi microrganismi: batteri, protozoi e virus;

tra questi un cenno particolare meritano: Anaplasma phagocytophilum (Anaplasmosi),

Babesia divergens (Babesiosi), Borrelia burgdorferi (morbo di Lyme), Coxiella burnetii

(Febbre Q), Francisella tularensis (tularemia), Rickettsia helvetica (febbre bottonosa). Le

zecche inoltre possono essere dirette responsabili di paralisi negli animali, provocata da

una tossina neurotropa prodotta dalle ghiandole salivari. Si tratta di una paralisi motoria

ascendente che insorge alcuni giorni dopo il morso, anche dopo che la zecca è stata

rimossa e che in alcuni casi può risultare fatale o lasciare degli esiti permanenti.

Introduzione

29

Nel Friuli Venezia Giulia la patologia più nota e diffusa (> 20%) è la borreliosi di Lyme,

una malattia infiammatoria multisistemica che causa un’eruzione cutanea (rash)

denominato eritema cronico migrante, che può essere seguito dopo settimane o mesi da

alterazioni neurologiche, cardiache o articolari [Stinco et al., 2014].

Agente infettivo Agente eziologico Patologia Vettore

Batteri

Borrelia burgdorferi s.l. Malattia di Lyme Ixodes ricinus, I. scapularis Borrelia spp. Febbre ricorrente

Rickettsia conori Febbre bottonosa

mediterranea I. ricinus,

R. sanguineus

R. rickettsii Febbre purpurica delle

montagne rocciose

I. ricinus, D. andersoni, D. variabilis

Ehrlichia chaffeensis Ehrlichiosi monocitica I. ricinus, R. sanguineus, D. variabilis,

A. americanum Ehrlichia phagocytophila

Ehrlichiosi granulocitica

Francisiella tularensis Tularemia I. ricinus, D.variabilis,

D.andersonii

Coxiella burnetii Febbre Q

I. ricinus, R. sanguineus, D. variabilis, D. Andersonii

Virus TBEV Meningo-encefalite I. ricinus, I. persulcatus Protozoi Babesia divergens e B. microti Babesiosi I. ricinus, I. scapularis

Proteina Neurotossina Paralisi flaccida -

Tabella 1. Quadro riassuntivo delle patologie trasmesse dalla zecca Ixodes ricinus.

Trasmissione virale

L’epidemiologia del TBEV è strettamente correlata con l’ecologia e la biologia delle

zecche sia per quanto riguarda la lo loro distribuzione che per la loro attività stagionale

[Charrel et al., 2004]. Gli Ixodidae rappresentano degli amplificatori dell’infezione e

fungono da serbatoi in cui il virus sopravvive nei periodi in cui non è possibile la

trasmissione [Lasala et al., 2010]. Il TBEV presenta un ciclo di trasmissione che coinvolge

vertebrati come ospiti e gli artropodi come vettori biologici e serbatoi capaci di veicolare il

patogeno da un ospite all’altro.

Il mantenimento in natura del TBEV e la potenziale esposizione umana dipendono da

diversi fattori:

∗ densità e distribuzione di zecche (vettori);

Introduzione

30

∗ presenza di ospiti intermedi che forniscono alle zecche il pasto di sangue;

∗ ambiente;

∗ frequenza e permanenza dell’uomo negli habitat delle zecche;

∗ presenza di agenti patogeni trasmissibili con il morso di zecca [Lasala et al., 2010].

Si possono identificare diverse modalità di trasmissione del TBEV (Figura 17):

- trasmissione sistemica: le zecche possono infettarsi con l’agente patogeno durante un

pasto di sangue su un reservoir e trasmetterlo poi allo stesso modo ad un altro ospite; più a

lungo permangono negli ospiti, maggiore sarà la probabilità di infettarsi [Ostfeld et al.,

2000]. Il sangue viene succhiato attraverso la micro ferita prodotta dal rostro; segue una

fase di rigurgito della parte liquida in cui il potenziale trasferimento di microrganismi è

attivo e avviene in entrambi i sensi (ospite ⇔ zecca);

- trasmissione transovarica: le femmine adulte infette possono trasmettere l’infezione alle

successive generazioni quando depongono le uova;

- trasmissione transtadiale: il passaggio dell’infezione da uno stadio di sviluppo al

successivo provvede alla trasmissione orizzontale estendendone la distribuzione. Questo

fenomeno sembra essere più importante per il mantenimento naturale del virus tra le

zecche rispetto al precedente;

- trasmissione tramite co-feeding: il co-feeding consiste nella trasmissione del virus da una

zecca infetta ad una non infetta qualora si cibino simultaneamente sullo stesso ospite, in

assenza di una infezione sistemica. Tale fenomeno avviene poiché il punto di inoculo

rappresenta un sito di replicazione virale. Questa è la via di trasmissione principale per il

TBEV, anche in ospiti immuni, poiché questo virus non è in grado di produrre viremie

rilevanti nei micro mammiferi. Questi, se sopravvivono, sono fondamentali per la

persistenza del virus nel ciclo silvestre così come l’abbondanza di altri ospiti vertebrati

come gli ungulati selvatici che garantiscono la sopravvivenza ed il completamento del

ciclo biologico di Ixodes ricinus [Labuda et al., 1997; Randolph et al., 2000];

- trasmissione per via alimentare: è possibile tramite ingestione di latte non pastorizzato e/o

di formaggi di animali infetti (caprini, ovini, bovini), poiché il succo gastrico non è in

grado di inattivare rapidamente il virus. Questa via è documentata soprattutto nei Paesi

dell’Europa orientale; per esempio in Repubblica Ceca circa lo 0.9% dei casi è avvenuto

per via alimentare, mentre durante un’epidemia in Ungheria sono stati confermati 7 casi e

sospettati 4 collegati al consumo di latte non pastorizzato [Amicizia et al., 2013]. Questa

modalità è altamente improbabile nelle regioni dell’Europa centrale interessate da TBE

Introduzione

31

(Austria e Germania) e nel nostro Paese vista la presenza di rigorose norme di igiene,

anche se non è da escludere [Cisak et el., 2010; Caracciolo et al., 2015].

Inoltre è importante sottolineare che non può verificarsi una trasmissione interumana

dell’encefalite da zecche poiché gli ospiti non possono infettarsi tra loro [Nonaka et al.,

2010]. Sono stati trovati anticorpi specifici in donatori di sangue in Germania, Norvegia e

Turchia [Ergünay et al., 2011; Larsen et al., 2014]. Tuttavia, non sono stati documentati

casi di infezione mediante trasfusioni. In letteratura sono infine documentati alcuni casi di

infezione avvenuta in laboratorio [Amicizia et al., 2013; Bogovic et al., 2015].

Figura 17. Modalità di trasmissione del TBEV.

Prevenzione e sorveglianza

L’infezione da TBEV rappresenta un problema emergente di sanità pubblica poiché è in

costante aumento in diversi paesi europei. Vista la gravità della patologia e la sua

progressiva diffusione anche in nuove foci, è importante avvalersi di diversi strumenti di

profilassi e prevenzione quali:

Introduzione

32

� interventi sull’ambiente: mirano soprattutto a ridurre il numero delle zecche nelle

zone residenziali mediante disinfestazione su larga scala e per mezzo di

disboscamento selettivo di vegetazione incolta;

� misure individuali di carattere generale e comportamentale: sono fondate

sull’informazione e sull’educazione sanitaria della popolazione generale e delle

categorie professionali maggiormente esposte al rischio. Negli habitat dove vivono

le zecche (foreste e radure) ad esempio si suggerisce l’utilizzo di un abbigliamento

adeguato e di repellenti riducendo così l’esposizione al contagio. Inoltre è

opportuno divulgare le conoscenze atte a riconoscere precocemente i sintomi e

insegnare il giusto ricorso alle strutture sanitarie.

� somministrazione di profilassi immunitaria specifica (vaccinazione).

Il periodo ottimale per avviare la vaccinazione contro la TBE è quello invernale, in modo

che il soggetto sia già protetto nel periodo di massima attività delle zecche e di incidenza di

TBE [Kaiser, 2008]. Il ciclo vaccinale di base prevede la somministrazione di tre dosi per

via intramuscolare, seguite da una dose booster ogni tre anni. In caso di necessità è

possibile ravvicinare le tre dosi di base grazie alla schedula rapida. In entrambi i casi ogni

tre anni c’è la necessità di eseguire un richiamo per rafforzare l’immunità già acquisita,

mediante una dose dello stesso vaccino precedentemente eseguito (Figura 18).

Attualmente i vaccini in uso sono:

a) FSME-Immun ® (prodotto da Baxter, in Austria);

b) Encepur ® (prodotto da Novartis Vaccines, in Germania);

c) EnceVir ® (prodotto da Scientific Production Association Microgen, in Russia);

d) TBE vaccine Moscow ® (prodotto da Federal State Enterprise of Chumakov

Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides, Russian Academy of Medical

Sciences, in Russia).

Nell’Unione Europea i vaccini disponibili e approvati dalla European Medicines Agency

(EMA) sono FSME-Immun® ed Encepur®. In Italia il vaccino più utilizzato è FSME-

Immun®, denominato anche Ticovac, costituito da virus inattivato con formalina (ceppo

Neudoerfl, sottotipo europeo). L’Encepur® vaccine è prodotto a partire dal ceppo K23,

appartenente sempre al sottotipo europeo, e in commercio in Germania dal 1991. La

schedula vaccinale è simile a quella per il vaccino austriaco.

I vaccini russi sono invece basati su ceppi appartenenti al sottotipo orientale: ovvero ceppo

Introduzione

33

205 per EnceVir® e ceppo Sofjin per TBE vaccine Moscow®. Per entrambi la schedula

prevede una seconda dose dopo 5-7 mesi ed una terza dopo 6-12 mesi e le dosi booster

vengono effettuate ogni 3 anni [Amicizia et al., 2013].

Figura 18. Rappresentazione grafica delle schedule vaccinali di base (o tradizionale) e rapida.

I vaccini sono da considerarsi sicuri ed efficaci con una protezione del 98%; la prima dose

può dare esclusivamente un imprinting al sistema immunitario, mentre la seconda aumenta

notevolmente il numero di anticorpi presenti. Tuttavia, sono stati segnalati pochi casi di

infezione in cui si è verificato il fallimento del vaccino. In questi soggetti (soprattutto

anziani) si è osservata una risposta anticorpale anomala caratterizzata da assenza di IgM

ma presenza di IgG con fenomeni di mancata neutralizzazione degli anticorpi. Questa tipo

di risposta potrebbe essere falsamente interpretata come un’immunità post-vaccinazione

[Andersson et al., 2010]. Le motivazioni di questa mancanza di efficacia della

vaccinazione possono essere diverse: per prima cosa nessun vaccino garantisce una

copertura al 100%; può ad esempio verificarsi una non-responsività per l’antigene presente

Introduzione

34

nel vaccino (non-responders); oppure si può avere la perdita di antigenicità e/o infettività a

causa di uno stoccaggio inadeguato; o infine la risposta immunitaria potrebbe essere

insufficiente o inappropriata a causa di carenze di antigeni per inadeguata esecuzione del

vaccino [Stiasny et al., 2009].

La vaccinazione è consigliata a tutte la categorie di soggetti a rischio per motivi lavorativi

(esempio guardie forestali), turistico/ricreativi (scout) e di residenza in cui potenzialmente

si può essere esposti al vettore. In uno studio condotto in FVG ad esempio è emerso che la

sieroprevalenza nelle guardie forestali è dello 0.6% [Beltrame et al., 2006]. Alla luce di

quanto detto, in questa regione la vaccinazione è stata resa gratuita dal 2013.

L’aumento dei casi ha suscitato un notevole interesse ed è quindi emersa la necessità di

ampliare le conoscenze riguardo l’ecologia di I. ricinus e l’epidemiologia del TBE virus.

L’opera di prevenzione e controllo dell’infezione può essere condotta su più piani:

� attività di ricerca e raccolta dati per la definizione e il monitoraggio del problema;

l’indagine su casi clinici;

� monitoraggio dei vettori, presenza e determinazione della distribuzione geografica e

valutazione della densità vettoriale;

� monitoraggio del virus nelle popolazioni di zecche in aree a rischio e promozione

delle attività di sorveglianza su animali sentinella.

1.4. WEST NILE VIRUS

1.4.1. CLASSIFICAZIONE E LINEAGE DEL WEST NILE VIRU S

Il West Nile virus (WNV) appartiene alla famiglia Flaviviridae, genere Flavivirus. È

compreso nel siero-complex del virus dell’Encefalite Giapponese (JEV) insieme ai virus

dell’encefalite di Murray Valley (MVEV) e dell’encefalite di St. Louis (SLEV), Kunjin

virus (KUNV), Usutu virus (USUV), Rabensburg Virus (RABV), Koutango virus

(KOUV), Cacipacore virus (CPCV), Alfuy virus (ALFV) e Yaounde virus (YAOV) virus

[Kuno et al., 1998; Pauli et al., 2013]. Questi Flavivirus hanno un ciclo biologico che

comprende principalmente zanzare e uccelli ma anche l’uomo ed altri mammiferi possono

essere infettati (Tabella 2). Fatta eccezione per il West Nile, il Rabensburg e l’Usutu, i

virus di questo siero-complex non sono presenti né in Italia né in Europa.

Introduzione

35

Virus Distribuzione Patologia nell’uomo Animali infettati

Reservoir Vettori

Japanese encephalitis Virus

(JEV)

Asia sud orientale, India, Giappone, Korea, Filippine

febbre, encefalite, meningite

maiali, cavalli

maiali, uccelli zanzare

West Nile Virus (WNV)

Tutto il mondo febbre, encefalite, meningoencefalite

uccelli, mammiferi,

rettili uccelli

zanzare (zecche)

Murray Valley encephalitis Virus

(MVEV) Australia

febbre, encefalite, meningoencefalite

pecore, uccelli

Uccelli acquatici

zanzare

St. Louis encephalitis Virus

(SLEV)

USA, America centrale e

meridionale febbre, encefalite - uccelli zanzare

Usutu Virus (USUV)

Africa, Austria, Ungheria, Europa

meridionale, Germania

febbre, encefalite in immunocompromessi

uccelli roditori, uccelli zanzare

Rabensburg Virus (RABV)

Austria/Cepubblica Ceca

- - - zanzare

Koutanga Virus (KOUV)

Senegal, Somalia, Repubblica

Centrafricana - - (roditori)

Zanzare, zecche

Alfuy Virus (ALFV)

Australia febbre - uccelli zanzare

Yaounde Virus (YAOUV)

Cameroon, Senegal, Repubblica

Centrafricana, Congo - - (roditori) zanzare

Cacipacore Virus (CPCV)

Brasile (febbre) (cavalli) uccelli -

Tabella 2. Siero-complex del Japanese Encephalitis Virus, al quale appartiene il WNV [Pauli et al., 2013].

Il WNV dal punto di vista genetico è molto variabile; le analisi delle sequenze

nucleotidiche degli isolati hanno consentito di definirne le relazioni filogenetiche con

conseguente raggruppamento dei ceppi in diversi lineage (Figura 19):

• Lineage 1 � suddiviso in almeno 3 classi:

- Classe A: ceppi provenienti dall’Europa, Africa, Medio Oriente e America;

- Classe B: ceppi provenienti dall’Australia (Kunjin);

- Classe C: ceppi provenienti dall’India; per alcuni viene classificato come lineage 5.

• Lineage 2 � contiene il ceppo prototipo B 956 e altri ceppi isolati nell’Africa

Subsahariana e in Madagascar, ma ha causato sporadiche epidemie anche

nell’Africa settentrionale. Recentemente i ceppi di questo genotipo sono stati

Introduzione

36

associati a epidemie negli uccelli e nell’uomo in Europa meridionale e orientale;

dal 2004 è stato isolato anche in Indonesia;

• Lineage 3 � comprende il ceppo virale isolato nella Repubblica Ceca nel 1997, in

prossimità del confine con l’Austria (Rabensburg) da zanzare Culex pipiens, viene

appunto chiamato Rabensburg virus;

• Lineage 4 � circola in Russia dal 1988 e include un isolato da zecche del Caucaso

(specie Dermacentor marginatus) e alcuni ceppi ottenuti da zanzare e rettili.

Figura 19. Principali lineage del WNV [Chancey et al., 2015].

I lineage 1 e 2 sembrano coinvolgere maggiormente l’uomo e i cavalli, mentre i virus

appartenenti ai lineage 3 e 4 sembrano interessare meno l’uomo. I lineage 3 e 4,

caratterizzati da scarsa patogenicità, sono stati descritti recentemente e presentano notevoli

differenze genetiche con i ceppi dei lineage 1 e 2. Le analisi filogenetiche hanno

dimostrato che il lineage 1A ha avuto origine nell’Africa subsahariana o settentrionale;

questo clade è emerso all’inizio del Ventesimo secolo e si è poi diffuso tra gli anni

Introduzione

37

Settanta-Ottanta anche in Europa principalmente ad opera di uccelli migratori. Negli anni

Novanta un ceppo appartenente a questo genotipo è comparso in Marocco e nell’Europa

dell’Est, dove il virus è diventato endemico, causando piccoli focolai di infezione. Nel

1999 si è poi propagato, probabilmente dal Medioriente, fino in America del Nord, da dove

si è successivamente diffuso anche nell’America Latina, diventando così un problema di

sanità pubblica globale. Tra i ceppi del lineage 2 troviamo oltre a quelli africani, molti

ceppi europei isolati soprattutto negli ultimi anni: il virus isolato dagli uccelli trovati morti

in Ungheria nel 2004 appartiene a questo lineage, dimostrando la diffusione al di fuori

dell’Africa e la potenzialità di divenire virulento nei vertebrati. A partire da allora sono

stati isolati ceppi appartenenti al lineage 2 in diversi stati europei, Italia inclusa [Barzon et

al., 2013a; Donadieu et al. 2013; Sambri et al., 2013; Chancey et al., 2015]. Le analisi

filogenetiche effettuate utilizzando una sequenza nucleotidica del gene codificante per la

proteina E dei virus isolati in Italia nel 1998 e nel 2008 hanno permesso di rilevare un

elevato grado di omologia (98.8%) tra i due virus che, a loro volta, sono risultati simili a

quelli circolanti da circa un decennio nel bacino del Mediterraneo ed in alcuni paesi

africani ed entrambi ascrivibili al Lineage 1 [Savini et al., 2008].

1.4.2. REPLICAZIONE, PATOGENESI E MANIFESTAZIONI CL INICHE

Il virus entra nelle cellule tramite endocitosi mediata da recettore ( DC-SIGN, recettore del

mannosio, diversi glicosamminoglicani); a seguito di un cambio conformazionale della

proteina E, avviene la fusione tra le membrane del virus e dell’endosoma; il nucleocapside

virale viene poi rilasciato nel citoplasma. Il virus replica a livello del reticolo

endoplasmatico generando l’RNA a polarità negativa che funge da stampo per la sintesi del

filamento positivo definitivo. Il genoma viene quindi impacchettato all’interno della

progenie virale oppure utilizzato per la sintesi di proteine virali. Il virione immaturo viene

trasportato attraverso il network trans-Golgi; a seguito della trasformazione di prM in

proteina M avviene la maturazione del virione che assume quindi le capacità infettive e

viene rilasciato per esocitosi (Figura 20) [Samuel et al., 2006; Colpitts et al., 2012; De

Filette et al., 2012].

Introduzione

38

Figura 20. Ciclo vitale del WNV [De Filette et al., 2012].

Nell’uomo, dopo la puntura del vettore, il virus infetta i cheratinociti e le cellule di

Langerhans, migrando poi verso i linfonodi regionali dove inizia la replicazione. Il virus si

diffonde attraverso il torrente circolatorio arrivando a diversi organi, come rene e milza,

dove avviene una seconda replicazione. A seconda del genotipo e del livello e della durata

della viremia, il WNV può oltrepassare la barriera ematoencefalica causando meningo-

encefalite (Figura 21).

Introduzione

39

Figura 21. Patogenesi dell’infezione da WNV [Petersen et al., 2013].

Introduzione

40

Sembra che la glicoproteina E, in particolare il dominio III, che costituisce il sito di legame

del recettore, sia implicata nella neuroinvasività del virus. Alcuni studi dimostrano tre

distinte vie per il raggiungimento del sistema nervoso centrale:

1. attraversamento della barriera ematoencefalica mediante leucociti infetti;

2. attraversamento diretto della barriera ematoencefalica, a seguito di compromissione

della sua integrità e infezione delle cellule endoteliali dell’encefalo;

3. ingresso attraverso il trasporto assonale retrogrado a seguito dell’infezione del

sistema nervoso periferico.

Di queste tre ipotesi le prime due sono le più supportate [Beasley et al., 2002; Lim et al.,

2011; Donadieu et al., 2013].

Il periodo di incubazione dal momento della puntura della zanzara varia fra 2 e 14 giorni,

ma può essere anche di 21 giorni nei soggetti con deficit a carico del sistema immunitario.

La maggior parte delle persone infettate non sviluppa segni clinici (Figura 22). Circa il 20-

30% dei soggetti infettati sviluppa sintomi simil-influenzali, quali febbre, mal di testa,

nausea, vomito, tremore, linfonodi ingrossati, sfoghi cutanei. Questo quadro clinico, che

prende il nome di West Nile fever (WNF) o West Nile Disease (WND), dura in genere

pochi giorni, in rari casi qualche settimana. I sintomi possono variare molto a seconda

dell’età della persona: nei bambini è più frequente una febbre leggera, nei giovani la

sintomatologia è caratterizzata da febbre mediamente alta, arrossamento degli occhi, mal di

testa e dolori muscolari; negli anziani e nelle persone debilitate, invece, la sintomatologia

può essere più grave e risultare fatale. Un’infezione da WNV in gravidanza può causare

aborto, meningite congenita e disturbi legati alla crescita. I sintomi più gravi si presentano

in media in meno dell’1% delle persone infette (1 persona su 150), manifestandosi come

malattia neuro-invasiva (West Nile Neurological Disease, WNND) che può generare

encefalite, meningo-encefalite, poliomielite (paralisi flaccida). Il rischio di contrarre la

forma neurologica aumenta all’aumentare dell’età, soprattutto nei soggetti di età superiore

ai 60 anni, e negli immunocompromessi. Le sequele neurologiche possono durare per

periodi lunghi nel 50% dei casi e spesso possono essere permanenti. Il tasso di mortalità

nei casi ospedalizzati di encefalite è del 10% ed è correlato all’età, alla compromissione

del sistema immunitario e a particolari malattie come il diabete mellito [Campbell et al.,

2002; Samuel et al., 2006; Lim et al., 2011; Sambri et al., 2013]. Dati recenti indicano una

correlazione tra infezione neuroinvasiva da WNV e sviluppo di malattia cronica renale, ma

non è ancora chiara la relazione causa-effetto [Nolan et al., 2012].

Introduzione

41

Figura 22. Rappresentazione ad iceberg dell’infezione da WNV nell’uomo.


L’infezione da WNV, generalmente presenta una sintomatologia sovrapponibile ad altre

sindromi neurologiche, ma si possono anche avere infezioni inapparenti. Per questi motivi,

i criteri diagnostici devono includere una combinazione di valutazioni cliniche e di prove

di laboratorio. La conferma di WND può essere fatta direttamente, rilevando la presenza

del virus nel sangue o negli organi bersaglio, o indirettamente, attraverso la ricerca di

anticorpi specifici.

Nella prima fase della malattia la diagnosi può essere effettuata attraverso la ricerca

dell’RNA virale su sangue intero, liquido cerebrospinale e urine o mediante isolamento

virale in colture cellulari o dimostrando la risposta immunitaria specifica contro il WNV.

L’identificazione del genoma virale mediante tecniche molecolari è però complicata dal

fatto che la viremia è piuttosto breve o assente quando insorgono i sintomi e il titolo del

virus è basso. Con la comparsa degli anticorpi anche l’isolamento virale risulta piuttosto

complesso; a rendere difficile la diagnosi vi sono anche le reazione di cross-reattività con

altri Flavivirus, che richiedono la conferma con test di neutralizzazione, e la persistenza

delle IgM per diversi mesi dopo l’infezione. La breve durata della viremia e la bassa carica

del virus rappresentano un problema anche per la ricerca del WNV mediante test di

Introduzione

42

amplificazione di acidi nucleici (NAAT) in sangue e organi dei donatori: sono stati infatti

documentati casi in cui si è avuta la trasmissione del virus attraverso donazioni di organi in

soggetti che erano risultati negativi alle analisi molecolari [Barzon et al., 2013b].

Gli anticorpi di classe IgM sono determinati a partire dal secondo giorno dalla comparsa

dei primi sintomi, attraverso test sierologici (ELISA o immunofluorescenza) effettuati su

siero e, dove indicato, su liquido cerebrospinale. Questi anticorpi possono persistere per

periodi anche molto lunghi nei soggetti malati (fino a un anno), pertanto la positività a

questi test può indicare anche un’infezione pregressa. Talvolta i campioni raccolti entro 8

giorni dall’insorgenza dei sintomi potrebbero risultare negativi, pertanto è consigliabile

ripetere a distanza di tempo il test prima di escludere la malattia. Gli anticorpi di classe

IgG sono determinabili invece 2 giorni dopo la comparsa delle IgM. La differenziazione tra

infezioni acute e quelle passate avviene con il test di avidità delle IgG: l’identificazione di

anticorpi IgG a bassa avidità prova un’infezione primaria o acuta, mentre quella ad alta

avidità indica un’infezione passata o una riattivazione dell’infezione da WNV. Poiché le

specie appartenenti ai Flavivirus sono correlate tra loro, sono possibili cross-reazioni e di

conseguenza si consiglia di titolare e analizzare i campioni positivi anche per le IgM/IgG

specifiche per tutti Flavivirus; il confronto del titolo permette di confermare o meno il

risultato iniziale [Levett et al., 2005].


I sintomi sono simili a quelli causati da altri virus come TBEV, JEV o MVEV o altri

Arbovirus o da batteri che causano meningiti a liquor limpido (Toxoplasma, trichine,

leptospire, Borrelia, Rickettsie, infezioni tubercolari e da Candida spp.). La diagnosi

differenziale è necessaria quando un paziente presenta febbre improvvisa, encefalite o forte

cafalea o meningite [Rossi et al., 2010].

Terapia

Non esiste una terapia specifica per il West Nile virus. Nella maggior parte dei casi, i

sintomi scompaiono da soli dopo qualche giorno o possono protrarsi per qualche settimana.

Nei casi più gravi è invece necessario il ricovero in ospedale, dove i trattamenti

somministrati comprendono fluidi intravenosi e respirazione assistita.

1.4.4. EPIDEMIOLOGIA DEL WEST NILE VIRUS

Il West Nile virus è tra gli Arbovirus maggiormente distribuiti nel mondo essendo presente

Introduzione

43

in tutti i continenti ad eccezione dell’Antartide (Figura 23); è diffuso non solo nelle aree

tropicali ma anche nelle zone a clima moderato.

Cenni storici e distribuzione geografica

Il WNV è stato isolato per la prima volta nel 1937 in Uganda, nel distretto West Nile (da

cui prende il nome), in un campione di sangue appartenente ad una donna che presentava

febbre di natura sconosciuta accompagnata da problemi neurologici. Nel 1950 il virus è

stato isolato da uomini, zanzare e uccelli in Egitto, dove è diffuso endemicamente, con

sintomatologia lieve e aspecifica. Nel 1957 in Israele il virus fu responsabile di una

dozzina di casi di encefalite nell’uomo, mentre casi di encefalite negli equini furono

osservati per la prima volta nel 1960 in Egitto e in Francia. In un’epidemia scoppiata nel

1974 in Sudafrica il numero dei casi è stato stimato in circa 18 mila, senza morti. Dagli

anni Novanta sono stati segnalati diversi focolai nel bacino del Mediterraneo e, dal 1999,

soprattutto in America. Nel 1996 in Romania il virus West Nile fu responsabile di oltre 350

casi umani di cui 20 mortali. Altri focolai umani sono stati segnalati nella Repubblica Ceca

nel 1997 (5 casi), in Russia nel 1999 (826 pazienti ricoverati, 183 casi confermati e 40

morti) e in Francia nel 2003 (7 casi).

Nel 1999 WNV è stato isolato in Nord America da corvi trovati morti; prima di allora il

virus non era mai stato evidenziato nell’emisfero occidentale. Dal 2000 la diffusione in

America è drammaticamente aumentata con numerosi casi di encefalite e meningite, con

elevata letalità. Negli anni successivi il virus si è diffuso da costa a costa interessando sia il

confine canadese che quello messicano e causando numerosi casi di encefalite nell’uomo.

Nel 2002 è stato rilevato un nuovo genotipo che l’anno dopo ha causato l’epidemia più

grande di WND osservata nell’uomo (quasi 10 mila casi accertati, dei quali 262 mortali).

Dal 2003 è considerato endemico nel Nord America ed è presente in Canada, Messico,

Porto Rico, Repubblica dominicana, Giamaica, Guadalupa e El Salvador. Non si è mai

capito come il virus abbia raggiunto il territorio americano ma analisi filogenetiche

dimostrano che il ceppo isolato a New York nel 1999 (NY99) risulta molto simile a quelli

isolati in Israele. La diffusione del WNV negli Stati Uniti ha dimostrato che gli Arbovirus

sono in grado di insediarsi in una nuova area, trovando vettori efficienti e vertebrati

suscettibili in cui replicarsi riescono a generare un ciclo di trasmissione e meccanismi di

mantenimento virale [Lanciotti et al., 1999; Giladi et al., 2001; Campbell et al., 2002].

Dal 1958, oltre alla determinazione degli anticorpi diretti contro il WNV nel siero di due

albanesi, si sono verificati diversi casi in Europa meridionale e orientale e

Introduzione

44

contemporaneamente in Europa centrale e occidentale. Il primo caso è stato segnalato nel

sud della Francia (Camargue) nel 1962 in un cavallo; in questa zona il virus è poi

ricomparso nel 2000 e si sono susseguiti tre focolai di infezione nel 2003, 2004 e 2006

[Murgue et al., 2001]. Tra gli anni ’60-’80 il WNV è stato isolato da zanzare, uccelli e

mammiferi in diversi paesi dell’Europa (Spagna, Portogallo, Romania, Repubblica Ceca,

Slovacchia, Polonia, Russia), ma non si sono verificati casi umani fino 1985 quando il

virus ha fatto la sua comparsa in Ucraina. Successivamente si sono verificate due principali

epidemie in Romania nel 1996 (835 casi e 17 morti) e in Russia nel 1999 (826 casi e 40

morti) [Cernescu et al., 2000; Platonov et al., 2008]. Dal 2003 WNV si è diffuso anche in

Ungheria e nel 2007 il virus è stato isolato in Spagna ed in Grecia. Nel 2008 la presenza

del WNV è stata segnalata anche in Austria, dove il virus è stato isolato in uccelli selvatici,

mentre in Ungheria e Romania sono stati segnalati casi nell’uomo [Zehender et al, 2011;

Bakonyi et al, 2013; Engler et al, 2013]. Nei paesi del Bacino del Mediterraneo dagli anni

’90 il numero delle epidemie e la gravità della sintomatologia hanno registrato un costante

aumento. Tra il 2010 e il 2013 numerosi casi umani sono stati segnalati in Austria, Bosnia e

Herzegovina, Croazia, Grecia, Kosovo, Italia, Montenegro, Serbia, Spagna, Russia,

Ucraina ed Ungheria. Si è poi confermata la presenza del virus anche in Portogallo,

Repubblica Ceca e Turchia.

Figura 23. Distribuzione globale del WNV: in rosso sono indicate le aree in cui sono stati segnalati i casi o le sieropositività nell’uomo; in blu i casi e le sieropositività su animali e vettori; in grigio le aree dove non vi sono riportati dati o positività; le linee nere evidenziano le aree in cui si trovano principalmente i vettori; i

numeri cerchiati rappresentano i Lineage più frequenti in quella zona [Chancey et al., 2015].

Introduzione

45

Dati i recenti focolai, è stato ipotizzato che i possibili turbamenti dell’ecosistema

dell’Europa meridionale dovuti ai cambiamenti climatici, hanno favorito la diffusione del

WNV nelle aree in cui è nota la presenza di vettori competenti [Di Sabatino et al., 2014;

Chancey et al., 2015].

In Italia, dal 1998 ad oggi sono stati segnalati 2 focolai epidemici. Il primo si è verificato

in Toscana (Palude di Fucecchio) dove ha causato 14 casi clinici in cavalli, di cui 6 mortali.

Nel corso dell’epidemia, pur in assenza di malattia conclamata, vennero rilevate positività

anticorpali in persone che condividevano con i cavalli il rischio delle punture di zanzara

[Cantile et al., 2000; Autorino et al., 2002].

A distanza di 10 anni dalla prima notifica, nell’agosto 2008 il virus ha fatto la sua

ricomparsa in Italia nell’area del delta del Po, interessando i territori delle province di

Ferrara, Bologna, Modena, Rovigo, Padova e Mantova, con casi confermati di infezione in

cavalli e volatili. Successivamente sono stati segnalati tre casi umani di malattia di West

Nile (WND): uno in provincia di Bologna e due in provincia di Ferrara. Nello stesso anno

si sono verificati per la prima volta casi di malattia neuro-invasiva di West Nile (WNND)

nell’uomo in alcune province dell’Emilia Romagna e del Veneto.

Nel 2009 si sono verificati 16 casi di WNND (il doppio rispetto all’anno precedente)

nell’uomo nelle regioni Emilia Romagna (8 casi), Veneto (6 casi) e Lombardia (2 casi)

[Mancini et al., 2008; Barzon et al., 2009; Rizzo et al., 2009; Busani et al., 2011].

Nel 2010 si sono riportati focolai di infezione nelle province di Trapani, Campobasso,

Bologna e Venezia (cavalli), di Modena (ghiandai), di Rovigo, Modena e Venezia (zanzare)

e in Veneto (uomo).

Nel 2011 la presenza del virus è stata confermata in Veneto e ha fatto la sua comparsa in

Sicilia.

Durante il 2012 sono stati segnalati 28 casi confermati di malattia neuro invasiva da WNV

(WNND) in Basilicata, Friuli Venezia Giulia, Sardegna e Veneto. Sono risultati positivi

allo screening 14 donatori di sangue asintomatici.

Nel 2013 sono stati confermati 40 casi (ultimo caso a settembre) in Emilia-Romagna,

Lombardia, Puglia e Veneto. Tra i donatori asintomatici sono state trovate 12 positività.

Per il 2014 i casi confermati sono stati 21 in Emilia-Romagna, Lombardia e Veneto.

Nel 2015 infine sono stati segnalati 35 casi confermati di malattia neuro-invasiva da West

Nile Virus (Emilia-Romagna, Lombardia e Veneto) e 10 casi confermati di febbre con

infezione da WNV (8 in Emilia-Romagna e 2 in Lombardia). Inoltre sono risultati positivi

Introduzione

46

allo screening 13 donatori di sangue: 6 in Emilia Romagna, 7 in Lombardia [Di Sabatino et

al., 2014; Reparto di Epidemiologia delle Malattie Infettive, CNESPS - Istituto Superiore

di Sanità, http://www.epicentro.iss.it/problemi/westNile/westNile.asp; European Centre for

Disease Prevention and Control, http://ecdc.europa.eu/en/healthtopics/west_nile_fever

/West-Nile-fever maps/pages/index.aspx].

Vettori e ospiti del West Nile virus

Una delle peculiarità di questo Flavivirus è la possibilità di essere trasmesso da differenti

generi e specie di zanzare. Le specie di zanzare dalle quali il WNV è stato isolato sono

almeno 65; la maggior parte appartiene al genere Culex, in particolare Culex pipiens, Cx.

quinquefasciatus, Cx. tarsalis, Cx. univittatus, Cx. antennatuse e Cx. modestus. In Europa

Cx. pipiens è considerato il principale vettore, e probabilmente la specie coinvolta

nell’epidemia toscana del 1998, mentre in America sembra essere Cx tarsalis. Diversi studi

hanno riportato che anche le zanzare del genere Aedes possono essere coinvolte nel ciclo di

trasmissione del West Nile virus [Colpitts et al., 2012; Petersen et al., 2013].

Il WNV può infettare una grande varietà di specie selvatiche e domestiche di uccelli e di

mammiferi, ma anche anfibi e rettili [Klenk et al., 2003; Klenk et al., 2004]. Tuttavia tra i

vertebrati i principali ospiti reservoir ed amplificatori del WNV sono gli uccelli poiché

sviluppano elevati e persistenti livelli di viremia; le specie maggiormente colpite sono

gazze, corvi, ghiandaie, passeri, fringuelli e merli. Una delle ipotesi che spiegherebbe il

verificarsi di sporadici focolai di WNV in Europa, anche in aree distanti tra di loro, è la

presenza di uccelli migratori. Durante lo svernamento in Africa, gli uccelli possono

infettarsi e, con la migrazione primaverile nei mesi di aprile-maggio, trasportare il virus

verso Nord in Europa. Il virus, nel giro di 2-3 mesi, è così trasmesso agli uccelli di specie

stanziali (ospiti amplificatori) grazie alla presenza della popolazione autoctona di vettori.

Una volta stabilitosi il ciclo endemico e di amplificazione tra la popolazione di uccelli

selvatici e di vettori, l’infezione può accidentalmente trasmettersi attraverso la puntura

delle zanzare anche a mammiferi presenti nella stessa area geografica, incluso l’uomo ed il

cavallo, dove l’infezione si rende clinicamente manifesta. L’interessamento, quindi, delle

specie di mammiferi avviene tardivamente nel corso della stagione epidemica, e ciò spiega

il motivo per cui in Europa i focolai clinici di WND si evidenziano tra luglio e settembre.

Gli equidi e l’uomo sono ospiti terminali dell’infezione o a fondo cieco epidemiologico in

quanto non sviluppano una viremia tale da infettare i vettori e contribuire così alla

prosecuzione del ciclo di trasmissione [Bowen et al., 2007].

Introduzione

47

La sintomatologia clinica riconducibile a WNV, oltre che nell’uomo come già descritto, è

riscontrabile anche negli equidi e negli uccelli; tuttavia, generalmente, la maggior parte

delle infezioni decorre in modo asintomatico. Negli uccelli le lesioni più importanti sono

caratterizzate da meningoencefalite con uno spiccato coinvolgimento delle cellule del

Purkinje del cervelletto, emorragie a carico dell’encefalo, splenomegalia, miocardite e

coinvolgimento epatico e renale. Nei cavalli non sono presenti lesioni macroscopiche a

carico degli organi, le lesioni sono visibili solo a livello microscopico e sono

esclusivamente a carico del sistema nervoso centrale [Pauli et al., 2013; Chancey et al.,

2015].

Trasmissione virale

Il ciclo di trasmissione di WNV coinvolge artropodi (vettori) e vertebrati (ospiti). La

trasmissione nei vettori può avvenire sia per via transovarica che transtadiale. L’uomo è

coinvolto dall’infezione solo accidentalmente. Il WNV è mantenuto in natura da due

diversi cicli:

- ciclo primario o ciclo endemico: prevede la trasmissione zanzara-uccello-zanzara; esso

avviene attraverso il continuo passaggio tra i vettori ematofagi e gli uccelli (reservoir di

infezione o ospiti amplificatori). Il WNV, quindi, una volta ingerito, è in grado di

diffondere nell’organismo della zanzara, dove si moltiplica localizzandosi a livello delle

ghiandole salivari per poi essere trasmesso all’ospite vertebrato. Il periodo di tempo che

intercorre dall’assunzione del virus sino alla sua localizzazione nelle ghiandole salivari

viene definito periodo di incubazione estrinseca, che dura circa 10-14 giorni. Questo

periodo identifica il tempo che trascorre tra il pasto infettante e il momento in cui la

zanzara è di nuovo in grado di trasmettere il virus all’ospite vertebrato.

- ciclo secondario o ciclo epidemico: si manifesta quando, a causa di particolari condizioni

ecologiche, ospiti accidentali, come il cavallo e l’uomo, entrano nel ciclo di trasmissione.

In questo caso gli artropodi vengono chiamati vettori ponte. I mammiferi infettati si

comportano come ospiti accidentali a fondo cieco in quanto la viremia non presenta un

titolo tale da poter infettare nuovamente un vettore competente. Gli animali possono inoltre

infettarsi nutrendosi con prede infette [Campbell et al., 2002; Colpitts et al., 2012].

Le zanzare cessano la loro attività durante i mesi freddi; tuttavia è stata dimostrata la

capacità del virus di sopravvivere, durante questo periodo, nelle zanzare infette che

superano l’inverno in luoghi chiusi [Petersen et al., 2013].

In Europa il ciclo di trasmissione del WNV può essere confinato in due principali

Introduzione

48

ecosistemi: rurale o selvatico che si instaura in prossimità delle zone umido-paludose tra

uccelli selvatici e zanzare ornitofile, e sinantropico/urbano che si instaura tra uccelli

sinantropici o domestici e zanzare, che possono effettuare il pasto di sangue sia sugli

uccelli che sull’uomo (Figura 24).

Figura 24. Cicli di trasmissione del WNV [Chancey et al., 2015].

È importante sottolineare che il virus non si trasmette da persona a persona, né da cavallo a

persona a causa dei bassi livelli di viremia. Altre modalità di infezione, che non prevedono

il coinvolgimento diretto del vettore, anche se molto più rare, sono trapianti di organi,

trasfusioni di sangue, allattamento al seno e la trasmissione madre-feto in gravidanza. Sono

documentati anche casi di infezione dovuti ad incidenti in laboratori attraverso ferite aperte

che sono venute in contatto con tessuti cerebrali infetti o tramite placenta [Campbell et al.,

2002; Zhang et al., 2009; Pauli et al., 2013; Peterson et al., 2013].


Attualmente non ci sono vaccini approvati per l’uomo, ma ne esistono tre per cavalli:

immunizzazione con WNV inattivato con formalina (West Nile-Innovator®), vaccino con

virus ucciso (Vetera® WNV vaccine) e vaccino ricombinante (Recombitek® Equine West

Nile Virus Vaccine) [De Filette et al., 2012]. Si stanno studiando delle alternative anche per

Introduzione

49

l’uomo: diversi vaccini sono stati testati in studi pre-clinici e ad oggi ci sono stati 8 studi

clinici, con risultati promettenti in termini di sicurezza ed induzione dell’immunità

[Amanna et al, 2014]. Tuttavia per il momento la prevenzione consiste soprattutto nel

ridurre l’esposizione alle punture di zanzare [Campbell et al., 2002; Pauli et al., 2013].

L’eradicazione del WNV è impossibile a causa del ciclo biologico uccello-zanzara che lo

mantiene in natura, ma la formazione delle persone (campagna di prevenzione), le misure

individuali precauzionali e la protezione diretta contro i morsi degli insetti (pantaloni

lunghi, zanzariere, repellenti, pesticidi, rimozione di acque stagnanti) sono contributi

essenziali per le misure di profilassi dirette contro le infezioni da WNV.

A seguito dei casi riportati, i sistemi di sorveglianza sia umana che animale sono stati

implementati. Tutti i casi sospetti di meningoencefalite vengono analizzati mediante

indagini sierologiche e molecolari; per quanto riguarda gli animali si sono attivati sistemi

di sorveglianza su cavalli, uccelli selvatici e zanzare. In Emilia-Romagna ad esempio, nella

stagione 2009, 9 casi sono risultati positivi su 78 sospettati con sintomatologia neurologica

(3 morti), 26 casi su 46 cavalli sono stati confermati e 44 di 1218 uccelli analizzati sono

risultati positivi per il genoma virale. La sorveglianza entomologica e il programma di

sorveglianza veterinario hanno mostrato la presenza di positività circa 2-3 settimane prima

dell’insorgenza del primo caso neurologico umano. Anche la sorveglianza passiva sui

cavalli si è dimostrata uno strumento utile e precoce per l’identificazione dell’attività del

WNV sui cavalli (la siero-conversione è risultata del 13%) ma sembra essere meno

sensibile in quanto dal 2009 è stato proposto un intensivo programma di vaccinazione per

cavalli [Angelini et al., 2010]. Negli anni successivi, Bellini e collaboratori hanno condotto

uno studio in cui venivano illustrati risultati soddisfacenti ottenuti dalla successiva

implementazione dei sistemi di sorveglianza sia ambientale (zanzare e uccelli) che umana

per aumentare la conoscenza sulla circolazione del WNV e ridurre la possibilità di

trasmettere l’infezione tramite trasfusioni di sangue e donazioni di organi e tessuti [Bellini

et al., 2014].

I donatori asintomatici che presentano viremia in assenza di anticorpi specifici contro il

WNV sono da considerare infetti e hanno un alto rischio di trasmettere l’infezione; per tale

motivo tutti i campioni devono essere testati per escludere la presenza del virus. Ogni

anno, durante la stagione estivo-autunnale, vengono fornite dal Ministero della Salute delle

indicazioni per la sorveglianza e la prevenzione della trasmissione trasfusionale del WNV

[http://www.centronazionalesangue.it/notizie/west-nile-virus-stagione-2015].

Introduzione

50

In particolare si raccomanda di sospendere le donazioni di sangue ed emocomponenti

temporaneamente (28 giorni) se il soggetto ha soggiornato anche solo per una notte in un

luogo in cui si è confermata la presenza del virus (nell’area occidentale della Sardegna,

nella pianura padana e in alcune aree del Friuli Venezia Giulia). La stessa profilassi viene

adoperata per soggetti che hanno soggiornato in Canada, Stati Uniti e alcuni Paesi dell’Ue

(Romania, Israele, Austria, Serbia, Ungheria, Portogallo). L’elenco completo dei luoghi

considerati a rischio di contrarre l’infezione viene tenuto aggiornato e si può consultare nel

sito sopra citato.

1.5. DENGUE VIRUS

1.5.1. CLASSIFICAZIONE E SIEROTIPI DEL DENGUE VIRUS

Il Dengue virus è un virus a RNA appartenente alla famiglia delle Flaviviridae, genere

Flavivirus [Kuno et al., 1998]. Grazie ai test di neutralizzazione, sono stati individuati

quattro diversi sierotipi, DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4, ciascuno dei quali può

essere ugualmente causa della malattia.

Si ritiene che l’infezione con un sierotipo conferisca un’immunità a vita per il sierotipo in

questione, ma solo a breve termine nei confronti degli altri. L’ulteriore infezione con un

altro sierotipo comporta un aumento del rischio di complicanze gravi. La forma severa

della malattia in caso di infezione secondaria avviene in particolar modo per gli individui

esposti a DENV-1 che contraggano l’infezione da DENV-2 o DENV-3, oppure in persone

esposte prima a DENV-3 e poi a DENV-2 [Guzman et al., 2010].

Recentemente è stato identificato un quinto sierotipo (DENV-5), isolato da una persona

affetta da Dengue in Malesia. Si tratta di un virus geneticamente divergente dagli altri

sierotipi e la risposta anticorpale è ben distinguibile da quella nei confronti di DENV-4. I

dati però non sono ancora stati pubblicati

1.5.2. GENOMA

Il genoma del virus contiene 11 mila paia di basi e codifica per tre proteine strutturali che

formano il virione (C, prM, E) e sette diverse proteine non strutturali necessarie per la

replicazione virale (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) [Gubler et al., 1998].

NS1 è una proteina altamente conservata e fortemente immunogenica: stimola infatti gli

Introduzione

51

anticorpi con attività di fissazione del complemento.


La virulenza e la diffusione dell’infezione da Dengue virus dipendono dalla risposta

dell’ospite, dai diversi sierotipi e dalle condizioni favorevoli che permettono la

replicazione virale nei vettori [Gurugama et al., 2010]. Quando la zanzara infetta punge un

essere umano, il virus penetra la cute insieme alla saliva dell’insetto. Una volta all’interno

dell’organismo, si lega ai leucociti e si riproduce al loro interno. In particolare il virus lega

le cellule di Langerhans, entrandovi tramite endocitosi mediata dall’interazione tra proteine

virali e specifiche proteine di membrana della cellula (lectina DC-SIGN, CLEC5A e

recettore per il mannosio). Il leucocita si sposta verso il linfonodo più vicino, mentre al suo

interno il virus replica, in vescicole legate al reticolo endoplasmatico, dove il genoma

virale viene copiato e vengono prodotte le proteine virali. Il virione immaturo si sposta

dunque all’apparato di Golgi dove avviene la maturazione definitiva grazie alla

glicosilazione delle proteine virali ed esce dalla cellula mediante esocitosi. Oltre alle

cellule di Langerhans, vengono infettati anche monociti e macrofagi.

I leucociti infetti rispondono con la produzione di numerosi fattori, tra cui l’interferone,

responsabili della maggior parte delle manifestazioni cliniche, quali febbre, dolore e altri

sintomi simil-influenzali. La produzione di interferone aumenta il livello di difesa da

infezioni virali, favorendo la produzione di proteine del sistema di trasduzione mediato da

JAK; alcuni sierotipi di Dengue virus sembrano avere la capacità di inibire questo segnale.

La produzione di interferone attiva anche la produzione di anticorpi diretti contro antigeni

virali, che mediano l’attivazione dei linfociti T contro le cellule infette. Gli anticorpi

permettono l’opsonizzazione e la conseguente fagocitosi da parte di cellule specializzate;

alcuni di essi però, non legando completamente l’antigene, trasportano il virus lontano dai

lisosomi del fagocita, in modo che esso non sia distrutto ma possa, bensì, continuare a

replicare [Martina et al., 2009].

Nelle infezioni gravi la replicazione virale è molto aumentata, avviene anche in organi

quali il fegato e il midollo osseo e causa il passaggio di liquidi dal torrente circolatorio alle

cavità corporee, attraverso l’endotelio dei piccoli vasi sanguigni [Varatharaj et al., 2010].

Ciò causa una riduzione del sangue circolante e la conseguente riduzione della pressione

arteriosa, che può portare a uno stato di shock ipovolemico. D’altro canto la replicazione

virale a livello del midollo osseo causa una disfunzione dell’emopoiesi, cui consegue la

piastrinopenia responsabile delle emorragie tipiche della Dengue. La morte delle cellule

Introduzione

52

infette a livello di questi organi può portare a un grande rilascio di citochine e fattori

fibrinolitici, che peggiorano il quadro emorragico e favoriscono ulteriormente il danno

endoteliale [Martina et al., 2009]. Non è del tutto chiaro perché un’infezione secondaria

dovuta a un diverso sierotipo porti a sviluppare un rischio sensibilmente aumentato di

forma grave della malattia. L’ipotesi maggiormente condivisa si basa su un potenziamento

mediato da anticorpi che si suppone possa essere causato dallo scarso legame di anticorpi

non neutralizzanti e un direzionamento dei virioni verso il compartimento cellulare errato

nei globuli bianchi che hanno fagocitato il virus per permetterne la distruzione [Guzman et

al., 2010]. Si ritiene tuttavia che questo possa non essere l’unico meccanismo patogenetico

delle formi gravi di Dengue; altri possibili fattori che potrebbero avere un ruolo sono i

linfociti T, alcune citochine e proteine del sistema del complemento [Martina et al., 2009].

In alcuni pazienti la malattia progredisce in una fase critica, successiva alla

normalizzazione della temperatura corporea, che dura tipicamente uno o due giorni.

Durante questa fase si può presentare un accumulo di liquidi nel torace (versamento

pleurico) e nell’addome (ascite) in conseguenza dell’aumento della permeabilità dei

capillari. Questo può generare una condizione di ipovolemia e di scarsa perfusione degli

organi vitali, spesso associata a disfunzione organica ed emorragie, in particolar modo

digestive. La condizione di shock o di febbre emorragica si manifesta in meno del 5% dei

pazienti e sono in particolar modo quelli infettati una seconda volta da un diverso sierotipo

del Dengue virus a essere a rischio.

Il periodo di incubazione dura tra 3-14 giorni, ma è solitamente compreso tra i 4-7 giorni; è

possibile quindi escludere la presenza della malattia in pazienti che manifestino sintomi

oltre due settimane dopo il ritorno da un soggiorno in un’area endemica.

Tipicamente i soggetti infettati da DENV sono asintomatici nell’80% dei casi (Figura 25);

nella restante percentuale presentano manifestazioni cliniche leggere, quali febbre (spesso

superiore ai 40°C), cefalea, dolori attorno e dietro agli occhi, forti dolori muscolari e alle

articolazioni, nausea e vomito, oltre al caratteristico esantema cutaneo che inizia

tipicamente durante il 1º o 2º giorno (Figura 26). Questa forma di infezione dura

solitamente tra i 2 e i 7 giorni ed è conosciuta come Dengue fever (DF).

In una piccola percentuale dei casi si sviluppa una forma di febbre emorragica (Dengue

hemorrhagic fever, DHF), con trombocitopenia, emorragie e perdita di liquidi, che può

evolvere in shock circolatorio e morte (Dengue shock syndrome, DSS). La forma

emorragica viene suddivisa dalla WHO (World Health Organization) in quattro gradi di

Introduzione

53

gravità:

- grado I: ecchimosi e positività alla prova del laccio in un paziente con febbre;

- grado II: emorragia spontanea a carico di cute o altri organi;

- grado III: shock;

- grado IV: shock grave, con polso e pressione arteriosa non rilevabili.

I gradi III e IV sono definiti sindrome da shock Dengue. In Asia sono i bambini a

sviluppare le forme più severe di infezione, mentre nelle Americhe si osservano forme di

DHF e DSS nella popolazione adulta [Martina et al., 2009].

L’infezione può risultare particolarmente pericolosa in individui affetti da malattie

croniche, quali il diabete mellito e l’asma bronchiale. Anche se il DENV non è considerato

un virus neurotropo, occasionalmente può causare disturbi neurologici come encefaliti,

meningiti, encefalopatie, ictus e la sindrome di Guillain-Barré [Rao et al., 2013; Madi et

al., 2014; Ralapanawa et al., 2015]. Altre complicanze che possono verificarsi sono

insufficienza epatica e miocarditi [Gurugame et al., 2010]. Studi recenti hanno evidenziato

che il polimorfismo di alcuni geni umani risulta correlato a maggior rischio di malattia

grave. Tra questi sono compresi mutazioni del TNFα, del CTLA-4, del TGFβ e particolari

forme alleliche del complesso maggiore di istocompatibilità; la carenza di glucosio-6-

fosfato deidrogenasi, molto comune nei paesi africani, sembra anch’essa aumentare i rischi

[Martina et al., 2009].

Figura 25. Classificazione delle infezioni da Dengue virus

Introduzione

54

Figura 26. Decorso dell’infezione da DENV [World Health Organization, 2009].


La diagnosi è probabile se vengono rilevati in un paziente residente in un’area endemica,

oltre alla febbre elevata, due tra i seguenti: nausea e vomito, esantema, dolore

generalizzato, leucopenia, positività alla prova del laccio. Questi segnali d’allarme si

presentano tipicamente prima dell’esordio della forma grave di Dengue. La prova del

laccio, particolarmente utile quando non sono disponibili esami di laboratorio, si esegue

con l’applicazione per cinque minuti di uno sfigmomanometro al braccio e tramite la conta

delle emorragie petecchiali che si presentano: maggiore è il loro numero, più probabile è la

diagnosi di malattia.

La diagnosi è normalmente effettuata in base ai sintomi, ma può essere più accurata con la

ricerca del virus o di anticorpi specifici in campioni di sangue.

La prima alterazione visibile agli esami di laboratorio è il ridotto numero di globuli

bianchi, condizione spesso seguita da un calo del numero di piastrine e acidosi metabolica.

Nella forma grave la perdita di liquidi porta a emoconcentrazione, con aumento

Introduzione

55

dell’ematocrito, e a riduzione dell’albumina circolante. Versamento pleurico e ascite

possono essere rilevati clinicamente solo quando importanti, mentre l’ecografia permette

una diagnosi più precoce, anche se il suo utilizzo è limitato dalla scarsa disponibilità delle

apparecchiature in alcuni paesi [Gurugama et al., 2010].

L’RNA virale o lo stesso virus possono essere evidenziati solamente durante la fase

viremica entro i primi 2-7 giorni della malattia utilizzando metodiche molecolari su siero o

sangue intero (real time RT-PCR) o eseguendo una coltura virale in vitro. Recentemente si

è trovato il genoma virale anche su campioni di urina e saliva, permettendo di eseguire una

diagnosi precoce anche quando non è possibile effettuare un prelievo di sangue come

spesso accade per i bambini o nei casi in cui i pazienti presentano sindrome emorragica

[Drosten et al., 2002; Poloni et al., 2010; Hirayama et al., 2012; Andries et al., 2015].

Ultimamente si sono resi disponibili dei kit commerciali in grado di rilevare precocemente

l’antigene NS1 del Dengue virus nel siero umano prima della comparsa degli anticorpi

specifici. Tuttavia, questi test non permettono di distinguere quale sia il sierotipo

responsabile dell’infezione. L’antigene NS1 può essere rilevato nel siero durante

l’infezione acuta a partire dal primo giorno e fino a 9-10 giorni dall’insorgenza dei sintomi

sia nei casi di infezione primaria che secondaria. Da uno studio recente è emerso che

l’antigene NS1 può essere rilevato anche nelle urine e nella saliva [Korhonen et al., 2014].

La ricerca delle IgG e IgM specifiche, può essere utilizzata per confermare la diagnosi di

Dengue anche nelle fasi tardive. Nell’80% dei casi di infezione primaria, gli anticorpi di

classe IgM compaiono dal 5° giorno dall’inizio dei sintomi, per quanto riguarda l’infezione

secondaria hanno invece titoli più bassi e durano di meno: diventano infatti non rilevabili

30-90 giorni dopo l’infezione primaria, ma in caso di infezioni successive, scompaiono più

rapidamente. Le IgG invece rimangono rilevabili per più di sessant’anni, anche in assenza

di sintomi, è quindi risultano un ottimo indicatore di infezioni pregresse. Dopo l’infezione

primaria raggiungono il loro picco nell’arco di 2-3 settimane, mentre in corso di infezioni

successive il picco è raggiunto prima e il titolo è solitamente più alto. Sia le IgG che le

IgM provvedono all’immunità nei confronti di un determinato sierotipo. In test di

laboratorio queste immunoglobuline possono legare altri Flavivirus, rendendo difficile

l’interpretazione dell’esame. La rilevazione unicamente delle IgG non è considerata

diagnostica a meno che il loro titolo non quadruplichi in campioni di sangue raccolti ad

almeno due settimane di distanza dalla precedente raccolta. In una persona sintomatica, la

rilevazione delle sole IgM è considerata diagnostica [Gurugama et al., 2010; Hirayama et

al., 2012].

Introduzione

56


L’infezione da Dengue virus, a causa della sintomatologia aspecifica, soprattutto nelle fasi

precoci, è difficile da distinguere da altre infezioni virali. La Dengue entra in diagnosi

differenziale in ciascun individuo che manifesti febbre entro due settimane da un soggiorno

in aree tropicali e subtropicali. Altri Flavivirus che causano una sintomatologia simile sono

Yellow fever virus, Japanese encephalitis virus, St Louis encephalitis virus, Zika virus e

West Nile virus. È difficilmente distinguibile anche da sintomatologia causata da alcuni

Alphavirus come ad esempio dal Sinbis virus ma soprattutto dal Chikungunya virus, che

genera una malattia virale simile alla Dengue sia per manifestazioni cliniche, sia per

localizzazione delle aree endemiche. Spesso l’iter diagnostico è orientato a escludere altre

malattie simili, quali malaria, leptospirosi, febbre tifoide e meningite meningococcica,

rickettsiosi ((Rickettsia prowazeki, R. mooseri, R. conori, R. rickettsi, Orientia

tsutsugamushi, Coxiella burneti, etc.), morbillo, enterovirus, influenza ed infezioni simil-

influenzali [World Health Organization, 2009].

Terapia

La terapia è di supporto e si basa sull’idratazione in caso di una forma lieve-moderata di

malattia, mentre nei casi più gravi, sulla somministrazione endovenosa di liquidi e

sull’emotrasfusione. Procedure più invasive quali l’inserimento di un sondino naso-

gastrico, l’iniezione intramuscolare e le punture arteriose devono essere evitate a causa del

rischio di sanguinamento. Il paracetamolo viene utilizzato per il trattamento sintomatico

della febbre e del dolore, mentre i FANS come l’aspirina o l’ibuprofene vanno evitati per

non peggiorare il rischio di emorragia. La trasfusione di sangue, sangue intero o globuli

rossi concentrati, viene richiesta precocemente nei pazienti con segni vitali instabili e con

ematocrito diminuito [Gurugama et al., 2010].


L’infezione da Dengue virus è tra le più importanti arbovirosi e come malattia tropicale la

Dengue è ritenuta seconda in importanza solo alla malaria; l’Organizzazione Mondiale

della Sanità (WHO) la considera una delle sedici malattie tropicali neglette. Nel 2009 ha

stimato che 2.5 bilioni di persone vivono in aree in cui è possibile contrarre il Dengue virus

e circa 50 milioni di persone vengono infettate ogni anno.

Introduzione

57


Le origini del termine Dengue non sono note, ma sembra che derivi dalla frase “ka kadinga

pepo” in lingua swahili (lingua africana) che significa convulsioni simil-crampi causate da

uno spirito maligno. Il termine dinga potrebbe aver dato origine alla parola spagnola

Dengue, che significa fastidioso o attento, aggettivi che descrivono il dolore alle ossa

caratteristico della malattia. Gli schiavi delle Indie Occidentali erano chiamati dandy

(damerino, in italiano) a causa della postura e dell’andatura, pertanto la malattia è

conosciuta anche come febbre dandy. Il termine febbre spaccaossa fu invece utilizzato per

la prima volta durante l’epidemia del 1789-90 a Filadelfia. Il termine Dengue divenne il

più utilizzato solo a partire dal 1828.

Il primo caso di Dengue mai documentato risale probabilmente all’enciclopedia medica

cinese realizzata durante la Dinastia Jìn, tra il 265 e il 420, in riferimento a un veleno

acquoso associato a insetti. Numerose epidemie sono state descritte durante il XVII secolo,

ma la prima documentata è quella che, tra il 1779 e il 1780 colpì Africa, America

Settentrionale e gran parte dell’Asia. Nel 1906 fu confermata la trasmissione della malattia

mediata da zanzare del genere Aedes e, nel 1907, la Dengue divenne la seconda malattia

dopo la febbre gialla dove fosse stata dimostrata un’eziologia virale. Fino agli anni

quaranta del XX secolo, le epidemie furono infrequenti. La diffusione della Dengue

durante e dopo la seconda guerra mondiale è stata attribuita al dissesto ecologico causato

dalla guerra stessa, che portò alla propagazione della malattia in varie aree del mondo

prima risparmiate e alla comparsa della forma emorragica. Questa forma è stata descritta

per la prima volta nelle Filippine nel 1953, diventando, a partire dagli anni Settanta, una

delle principali cause di mortalità infantile nelle Americhe e nelle isole dell’Oceano

Pacifico. Nel 1981 si è sviluppata un’epidemia da virus DENV-2 in pazienti dell’America

Centrale e Meridionale che avevano contratto il DENV-1 diversi anni prima e ha fatto per

la prima volta la sua comparsa lo shock caratteristico della fase critica della malattia

[Gubler et al., 1998].

Il Dengue virus è ampiamente diffuso in tutto il mondo ed è particolarmente presente

durante e dopo la stagione delle piogge nelle zone tropicali e subtropicali di Africa

(Burkina Faso, Costa d’Avorio, Kenya, Mozambico, Nigeria, Senegal, Somalia), Sudest

asiatico (Bangladesh, Birmania, Korea, India, Indonesia, Maldive, Nepal, Pakistan, Sri

Lanka, Thailandia, Timor Est), Cina, Medioriente (Arabia Saudita, Egitto, Yemen),

America latina e centrale (Argentina, Barbados, Bolivia, Brasile, Cile, Colombia, Costa

Introduzione

58

rica, Ecuador, El Salvador, Guatemala, Guyana francese, Messico, Paraguay, Perù, Porto

Rico, Repubblica dominicana, Uruguay, Venezuela), Nord America (Hawaii, Texas),

Australia (Queensland) e diverse zone del Pacifico (Cambogia, Filippine, Malesia,

Micronesia, Nuova Caledonia, Polinesia francese, Vietnam) [World Health Organization,

2009].

Inizialmente si registravano lunghi intervalli di tempo tra un’epidemia e l’altra (10-40

anni) poiché vi erano meno possibilità di esporsi al virus e ai nuovi sierotipi, soprattutto

perché i viaggi intercontinentali erano limitati. Il trasporto del virus e dei suoi vettori via

mare era piuttosto lento, compromettendo quindi la loro capacità di sopravvivenza. Nel

1950 infatti, l’infezione da Dengue virus interessava solo 9 stati, ma al giorno d’oggi la sua

presenza è riportata in oltre 100 paesi in tutto il mondo. Dal 1975 il Dengue virus viene

considerato una causa frequente di morbilità e mortalità, soprattutto nei bambini, nel sud-

est asiatico. Negli ultimi anni sono aumentate anche le epidemie causate da più di un

sierotipo (iperendemicità) e la popolazione è a rischio nelle aree urbane sia tropicali che

subtropicali. Ogni anno si registrano 100 milioni di casi di Dengue fever e mezzo milione

di Dengue hemorrhagic fever, con una percentuale di mortalità che si aggira sui 5%. Il 90%

dei pazienti con DHF sono bambini che hanno meno di 15 anni. Nelle regioni asiatiche il

sierotipo predominante era il DENV-2, come è stato documentato nella prima grande

epidemia indiana che si è verificata nel 1991; nel 2003 si è verificata la co-circolazione di

tutti è quattro i sierotipi ma il maggiormente diffuso attualmente è il DENV-3. Nel corso

degli anni l’epidemiologia è mutata ad esempio in base ad aspetti demografici, economici,

comportamentali e sociali: crescita della popolazione, urbanizzazione incontrollata delle

zone tropicali e subtropicali, aumento della proliferazione e della diffusione delle zanzare

della specie Aedes, assenza di meccanismi di controllo dei vettori [Guha-Sapir et al., 2005;

Gurugama et al., 2010].

Negli ultimi decenni, la diffusione della Dengue è aumentata non solo in molte regioni

tropicali ma anche in paesi dell’emisfero nord ed in particolare in Europa costituisce un

pericolo di salute globale, dato che si manifesta soprattutto come malattia di importazione

(Figura 27).

Introduzione

59

Figura 27. Viaggi, commercio e clima influenzano la distribuzione delle zanzare e dell’infezione da DENV.

In passato, la Dengue era endemica nei paesi balcanici e nell’area del Mediterraneo e

probabilmente i casi importati con la presenza del vettore hanno contribuito al diffondersi

del virus anche in questa zona. L’ultima epidemia è stata registrata in Grecia tra il 1927 e il

1928, in cui si è avuta un’alta mortalità ed il vettore responsabile era stato Aedes aegipty.

Dal 1970, ha iniziato a diffondersi anche la specie Aedes albopictus in vari paesi europei,

come Francia, Grecia, Italia, Paesi Bassi, Slovenia e Spagna. Soprattutto negli ultimi anni,

sono stati documentati diversi casi di Dengue fever importati in Europa. I primi casi

autoctoni di Dengue virus sono stati segnalati nel sud est della Francia nel settembre 2010

(2 casi) e successivamente in Croazia in un turista tedesco, sempre nello stesso periodo. In

Francia i due casi sono stati riportati a Nizza, dove Ae. albopictus è particolarmente

diffuso; la presenza sporadica del vettore era già stata segnalata in Normandia nel 1999, ma

dal 2004 si è stabilita nel sud est francese. Tra il 2006 ed il 2009 sono stati importati circa

350-400 casi all’anno, e nel 2010, fino a settembre ne erano stati segnalati 120 [La Ruche

et al., 2010]. Un altro caso autoctono di Dengue è stato diagnosticato, sempre nel sud della

Francia, nel 2013 [Marchand et al., 2013]. In Croazia la presenza della zanzara Ae.

albopictus era già stata riportata nel 2004, mentre ancora prima in uno studio siero-

epidemiologico condotto nel 1980 erano stati trovati anticorpi specifici per il DENV2

(3.9%) e DENV1 (2.1%) nella popolazione sana. Durante il biennio 2011-2012, sono stati

raccolti e testati 1180 sieri di residenti della Croazia: in 7 campioni sono stati riscontarti gli

anticorpi specifici di classe IgG per il DENV. In Turchia, da uno studio è emerso che lo

Introduzione

60

0.9% dei donatori di sangue presentava le IgG specifiche [Gjenero-Margan et al., 2011;

Pem-Novosel et al., 2015].

Vettori e trasmissione del Dengue virus

Come molti Arbovirus, il virus della Dengue permane in natura in quanto utilizza vettori

ematofagi e ospiti vertebrati. Il Dengue virus è trasmesso soprattutto dalle zanzare del

genere Aedes, in particolar modo la specie Aedes aegypti, ma anche Aedes albopictus,

Aedes polynesiensis e Aedes scutellaris (Figura 28) [Gubler et al., 1998]. Gli esseri umani

sono gli ospiti primari del virus il quale può però essere rinvenuto anche in altri primati. Il

virus si riproduce attraverso la proliferazione delle zanzare che avviene principalmente nei

pressi di pozze d’acqua (acqua stagnante), sia in ambienti aperti che chiusi. Il clima

influenza in modo diretto le caratteristiche biologiche dei vettori e di conseguenza la loro

abbondanza e distribuzione. Si ritiene quindi che la trasmissione di questa infezione

dipenda molto dalle caratteristiche climatiche [Baba et al., 2011].

Figura 28. I principali vettori del Dengue virus: Aedes aegypti (a sinistra) e Aedes albopictus (a destra).

Una femmina di zanzara che acquisisce sangue umano infetto diventa a sua volta infetta,

con il virus localizzato a livello dell’apparato digerente. Circa 8-10 giorni dopo, il virus

invade e colonizza le cellule di altri tessuti, in particolar modo le ghiandole salivari, dalle

quali è espulso insieme alla saliva. L’infezione non sembra avere effetti sulla zanzara, che

rimane portatrice della malattia per il resto della propria vita. Aedes aegypti, a differenza

delle altre, preferisce vivere e deporre le proprie uova in stretto rapporto con gli esseri

Introduzione

61

umani, che rappresentano la sua fonte preferenziale di nutrimento rispetto ad altri

vertebrati. Non si ha quindi contagio diretto tra esseri umani, anche se l’uomo è il

principale ospite del virus. Il virus circola nel sangue della persona infetta per 2-7 giorni, e

in questo periodo, vista la viremia piuttosto alta (circa 109 copie genomiche virali/mL), la

zanzara può prelevarlo e trasmetterlo ad altri [Gubler et al., 1998].

Nelle zone rurali la trasmissione avviene solitamente tramite puntura da parte di Aedes

aegypti e altre specie del genere Aedes, tra le quali Ae. albopictus, mentre nelle città

avviene quasi esclusivamente tramite Ae. aegypti, che risulta molto addomesticata (Figura

29) [Gubler et al., 1998].

Figura 29. Cicli di trasmissione del Dengue virus [Gubler et al., 1998].

L’infezione da DENV può essere trasmessa anche tramite infusione di emocomponenti o

emoderivati e attraverso il trapianto di organi. In paesi dove la malattia è endemica, come

nel caso di Singapore, il rischio di infezione tramite trasfusioni di sangue è abbastanza

elevato. Inoltre sono stati documentati casi di trasmissione verticale durante la gravidanza

o l’allattamento.

Introduzione

62


Gli sforzi della ricerca scientifica per prevenire e trattare la Dengue si basano sul controllo

del vettore, sullo sviluppo di un vaccino efficace e sullo studio di farmaci antivirali.

Attualmente si stanno studiando una serie di vaccini, anche se la conoscenza del virus e del

suo meccanismo di azione sono aumentate solo negli ultimi anni, dopo che si è registrato

un incremento della diffusione della malattia. Il meccanismo immunologico primario che

conferisce protezione dal Dengue virus è la neutralizzazione mediata da anticorpi: i vari

vaccini candidati attualmente in studio hanno infatti lo scopo di suscitare alti livelli di

anticorpi neutralizzanti. L’aumento della co-circolazione di tutti i sierotipi implica la

necessità di avere un vaccino tetravalente. Inoltre, l’aver contratto la Dengue protegge la

persona solo contro il sottotipo che l’ha causata ma non contro gli altri tre sottotipi virali.

Questo fattore sta sicuramente aumentando le difficoltà nello sviluppo di un vaccino

specifico ed efficace. L’induzione di protezione, la risposta degli anticorpi neutralizzanti

contro tutti e 4 i sierotipi contemporaneamente dovrebbe evitare il rischio teorico di

valorizzazione anticorpo-dipendente indotta dal vaccino in soggetti vaccinati. I vaccini in

via di sviluppo al momento sono di quattro tipi: vivo attenuato, chimerico vivo- attenuato,

inattivato o sub-unità, e a base di acidi nucleici [World Health Organization, 2009].

Non essendoci attualmente vaccini approvati per il Dengue virus, la prevenzione della

malattia si basa quindi sul controllo della popolazione della zanzara vettrice e sulla

protezione dal contatto dei residenti delle zone endemiche.

Il principale metodo di controllo di Aedes aegypti consiste nell’eliminazione del suo

habitat, cioè mediante svuotamento dei contenitori di acqua e l’utilizzo di agenti di

controllo, ovvero specie animali la cui presenza riduca quella del vettore, o di insetticidi,

anche se gli organofosfati o piretroidi non risultano efficaci. La riduzione dei ristagni di

acqua all’aria aperta attraverso interventi ambientali è il metodo più utilizzato, dati gli

effetti negativi sulla salute da parte degli insetticidi e le maggiori difficoltà logistiche per

l’uso gli agenti di controllo. La popolazione può prevenire le punture da parte del vettore

utilizzando abiti che coprano completamente la cute, zanzariere o repellenti per insetti

[Gubler et al., 1998; Gurugama et al., 2010].

La sorveglianza entomologica, infine, è un utile strumento per determinare i cambiamenti

nella distribuzione geografica del vettore, per monitorare e valutare l’efficacia dei

programmi di controllo, per ottenere misure relative sulla popolazione del vettore nel corso

del tempo e per facilitare le decisioni appropriate e tempestive per quanto riguarda gli

Introduzione

63

interventi. Inoltre, con i sistemi di sorveglianza si possono identificare le aree ad alta

intensità di zanzare e i periodi in cui la popolazione di queste cresce e si sviluppa [World

Health Organization, 2009].

1.6. FLAVIVIRUS EMERGENTI

1.6.1. USUTU VIRUS

L’Usutu virus (USUV) è un virus della famiglia Flaviviridae, genere Flavivirus, trasmesso

da zanzare. È un membro del gruppo del Japanese encephalitis virus (JEV) assieme al

Japanese encephalitis virus (JEV), Murray Valley encephalitis virus (MVEV), Saint Louis

encephalitis virus (SLEV) e West Nile virus (WNV). L’USUV è strettamente correlato al

WNV [Kuno et al., 1998; Pauli et al., 2014]. Come tutti i membri di questo gruppo, il virus

è mantenuto in natura attraverso un ciclo biologico uccelli-zanzare; gli uccelli migratori

giocano un ruolo fondamentale nella propagazione di questa zoonosi. Anche se è

raggruppato con importanti patogeni per l’uomo, USUV è stato considerato per molti anni

un virus esotico di minore importanza, confinato ad una piccola area dell’Africa e

caratterizzato da bassa patogenicità per l’uomo e per gli animali [Weissenböck et al., 2009;

Nikolay et al., 2011; Savini et al., 2011].

Per la diagnosi, vista l’elevata cross-reattività tra i membri del sierogruppo JEV, sono da

preferire i test molecolari a quelli sierologici, anche se questi ultimi sono fondamentali per

le infezioni che non sono in fase viremica. L’unico metodo per poter identificare

correttamente la risposta anticorpale è il test di neutralizzazione di riduzione delle placche

(PRNT), come per tutti i Flavivirus [Cavrini et al., 2011].

Epidemiologia

L’Usutu virus, il cui nome deriva da quello di un fiume in Swaziland, è stato isolato per la

prima volta da zanzare della specie Culex neavei in Sudafrica nel 1959 e da allora è stato

descritto in molti Paesi dell’Africa sub-Sahariana. Nell’uomo è stato isolato per la prima

volta nel 1982 nella Repubblica Centro-Africana; il paziente mostrava sintomatologia

febbrile e rush cutaneo. Il virus è stato riscontrato nei roditori e negli uccelli di vari paesi

africani e sembra essere piuttosto diffuso anche in Europa centrale e occidentale [Nikolay

et al., 2011; Vazquez et al., 2011].

Introduzione

64

Nel 2001 il virus è stato identificato per la prima volta in Europa centrale, in Austria

(Vienna e zone limitrofe), in merli (Turdus merula), in allocchi di Lapponia (Strix

nebulosa) e in rondini (Hirundo rustica) trovati morti. Al tavolo anatomo-patologico gli

uccelli mostravano congestione epatica e splenica con vari gradi di necrosi multifocale

acuta ed enterite sieromucoide. Le uniche lesioni a livello nervoso erano presenti nei rapaci

dove si evidenziavano encefaliti caratterizzate da aree multifocali di neuronofagia e

microgliosi. Il ceppo virale isolato in Austria ha mostrato similitudini con il ceppo Africano

(97% di omologia) e il coinvolgimento di rondini confermava l’ipotesi di trasmissione

virale attraverso le migrazioni di questi uccelli o altri grandi migratori con successivo

passaggio a popolazioni locali di zanzare [Bakonyi et al., 2004; Chavala et al., 2004;

Weissenböck et al., 2003].

Dopo diverse segnalazioni in Austria e Ungheria [Chavala et al., 2004; Bakonyi et al.,

2007], il virus ha fatto la sua comparsa anche in Italia: nel 2005 è stato identificato in polli

sentinella in Trentino [Savini et al., 2011]. Successivamente nel 2006, vicino Milano, è

stato isolato per la prima volta in un allocco di Lapponia e successivamente in una coppia

di civetta capogrosso (Aegolius funereus) e in un merlo catturati sempre nella stessa zona.

Anche in questi casi, come per gli uccelli austriaci, le principali lesioni macroscopiche

risultavano in epato-splenomegalia mentre l’istologia mostrava quadri di encefalite,

miocardiopatia e necrosi epatica e splenica. Il virus ha rilevato un’elevata affinità con il

ceppo virale austriaco dimostrando la possibilità di una lenta trasmissione da questo paese

verso l’Italia attraverso movimenti di uccelli per lo più stanziali che compiono brevi

migrazioni [Manarolla et al., 2010].

In realtà, l’Usutu virus è comparso prima in Italia diffondendosi poi in Austria ed in altri

paesi europei. I risultati ottenuti da Weissenböck e colleghi hanno fornito evidenze di

un’introduzione molto più precoce (1996) del virus in Europa rispetto a quanto fin ad ora

ritenuto (2001). Lo studio descrive l’analisi retrospettiva dei campioni tissutali di numerosi

uccelli morti, principalmente merli, nel 1996 in Toscana (nelle province di Firenze e

Pistoia) e ha consentito di identificare un Usutu virus identico al ceppo Vienna 2001

[Weissenböck et al., 2013].

Tra il 2008 ed il 2009 è stato condotto uno studio per monitorare la circolazione

dell’USUV in Italia (Figura 30): sono state condotte analisi molecolari e sierologiche in

cavalli e polli sentinella, uccelli selvatici e zanzare. Si è visto che il virus era presente in

Toscana, Emilia-Romagna, Veneto e Friuli Venezia Giulia. In Veneto ha causato la morte di

circa 100 esemplari. Sono stati identificati 11 ceppi virali negli organi di merli e gazze del

Introduzione

65

Veneto e dell’Emilia-Romagna. Il virus è stato riscontrato anche in pool di Culex pipiens

catturate in Toscana. Confrontando le sequenze ottenute, nelle varie regioni non si sono

notate variazioni notevoli dei ceppi circolanti: nel nord-est Italia hanno mostrato parecchie

omologie con quelli austriaci isolati a Vienna e a Budapest, mentre qualche differenza si è

notata con i ceppi ottenuti dai pool di zanzare [Savini et al., 2011].

Nel 2009 durante uno studio di sorveglianza per stabilire gli Arbovirus trasmessi da

zanzare in Emilia-Romagna, è stata rilevata la presenza dell’USUV, oltre che del WNV: 56

pool di zanzare sono risultati positivi per USUV, mentre il WNV è stato trovato in 27 pool.

L’USUV è stato riscontrato sia nelle zanzare Culex pipiens che nella specie Aedes

albopictus. Inoltre in 8 pool si è osservata la co-circolazione di entrambi i virus [Calzolari

et al., 2010].

Figura 30. Aree italiane in cui nel 2008-2009 si sono effettuati gli studi di sorveglianza per verificare la presenza dell’USUV [Savini et al., 2011].

A questi casi negli animali hanno fatto seguito due isolamenti virali in due pazienti donne:

una sessantenne in Emilia Romagna, dove nello stesso periodo era in corso una importante

epidemia di West Nile, ed una quarantenne di ritorno da un viaggio in Egitto, colpite

rispettivamente da meningo-encefalite ed encefalite gravi. Entrambe le pazienti avevano

Introduzione

66

ricevuto una trasfusione di sangue nello stesso periodo (agosto 2009) e avevano il sistema

immunitario compromesso da patologie concomitanti; questo potrebbe aver amplificato

l’effetto patogeno del virus che nell’uomo non aveva mai provocato sintomatologia grave.

Nel primo caso la paziente era affetta da un linfoma B a grosse cellule recatasi dal medico

per la presenza di febbre e sintomi neurologici; gli è stata quindi diagnostica una meningo-

encefalite. Il liquido cerebrospinale era positivo per USUV, così come il siero e il plasma

analizzati mediante real-time RT-PCR e sequenziamento. Si è ipotizzato che il virus fosse

stato trasmesso dalle zanzare [Pecorari et al., 2009].

Nel secondo caso, la donna, tornata da un viaggio in Egitto ha ricevuto una trasfusione di

plasma dopo aver sviluppato la porpora trombotica trombocitopenica (TTP). Dopo due

settimane presentava febbre, mal di testa, rash ed è stata ricoverata. Gli esami hanno

escluso qualsiasi segno di ricaduta di TTP. In breve tempo ha sviluppato un’epatite

fulminante e sintomatologia nervosa, ricevendo quindi un trapianto di fegato. Si sta ancora

approfondendo l’ipotesi di trasmissione virale attraverso donazioni di sangue sottoponendo

a screening sierologico i campioni ematici dei donatori. Inoltre è ancora in corso uno

studio per identificare l’USUV in plasma e tessuti ottenuti dalla stessa paziente per

quantificare la carica virale, la sua persistenza nella fase viremica e per capire il possibile

coinvolgimento del virus nel decorso della malattia epatica [Cavrini et al., 2009]. Le

sequenze parziali ottenute dal liquido cerebrospinale e dal plasma delle due pazienti hanno

mostrato un’omologia del 98% con i ceppi isolati a Vienna e Budapest. Grazie ad ulteriori

studi filogenetici si è potuta individuare una distribuzione del virus in Europa

raggruppando in un unico cluster i ceppi circolanti in zanzare e uccelli e quelli ottenuti

dalle sequenze umane [Vazquez et al., 2011].

L’USUV è stato segnalato anche in altri Paesi europei come Svizzera, Spagna, Repubblica

Ceca, Germania. Nell’estate del 2006 l’USUV è stato identificato in uccelli morti in

Svizzera (Zurigo); il ceppo circolante ha mostrato parecchie omologie con quello isolato a

Vienna nel 2001 e a Budapest nel 2005 [Steinmetz et al, 2011]. In Spagna ha fatto la sua

comparsa nel 2006 analizzando dei pool di Culex e nel 2009 in pool di Culex perexiguus.

[Busquets et al., 2008; Vazquez et al., 2011]. In Repubblica Ceca il virus è stato isolato da

due uccelli trovati morti a Brno nel 2011 e nel 2012 [Rudolf et al., 2015]. In Germania il

virus è stato identificato e isolato da varie specie di uccelli e pool di zanzare nel 2010-2011

[Jöst et al., 2011; Becker et al., 2012], mentre tra settembre-ottobre 2013 è stato isolato dai

tessuti cerebrali di due pipistrelli trovati morti nel sud-est della Germania. I due genotipi

Introduzione

67

risultanti hanno mostrato un’identità nucleotidica del 99.9% e hanno mostrato un’omologia

tra il 78.3% e il 99.3% comparati ai vari ceppi isolati in Europa da uccelli, zanzare e

dall’uomo [Cadar et al., 2014]. I pipistrelli risultano quindi essere ospiti reservoir anche

dell’Usutu virus; questi animali sono infatti considerati reservoir di molti Flavivirus in

quanto contribuiscono a mantenere, diffondere e far replicare i patogeni grazie alle loro

caratteristiche: scelte alimentari, durata della vita, elevata densità di popolazione, natura

coloniale o solitaria, capacità di volare, migrazione stagionale e modelli di movimento

quotidiano, torpore e ibernazione [Calisher et al. 2006].

Studi sierologici che hanno dimostrato la presenza di USUV in uccelli selvatici sono stati

effettuati in Repubblica Ceca (2005), Inghilterra (2001-2002), Germania (2007), Italia

(2007), Polonia (2006), Spagna (2003-2006) e Svizzera (2006). Nella Figura 31 possiamo

vedere una rappresentazione dei Paesi europei del network European Network for

Diagnostics of Imported Viral Diseases (ENVID) in cui è stata verificata la presenza del

virus in zanzare, uccelli, cavalli e/o uomo. Vengono indicati di colori diversi i territori in

cui si sono utilizzati metodi diretti (colture cellulari o amplificazione del genoma virale)

e/o metodi indiretti (presenza di anticorpi in risposta all’infezione). I simboli degli animali

in bianco indicano dove si è identificato l’RNA virale mentre in grigio scuro dove è stata

verificata la presenza di anticorpi neutralizzanti [Vazquez et al., 2011]. Recentemente, in

Croazia, in tre pazienti con sindrome neurologica sono stati riscontrati gli anticorpi

specifici dell’Usutu virus [Rudolf et al., 2015].

Figura 31. Rappresentazione dei Paesi europei del network ENVID in cui è stata verificata la presenza del virus in zanzare, uccelli, cavalli e/o uomo [Vazquez et al., 2011].

Introduzione

68

Trasmissione, vettori ed ospiti

Il virus viene trasmesso da un ciclo silvestre che coinvolge le zanzare come vettori e i

volatili come ospiti reservoir; negli uccelli causa una blanda o addirittura assente

sintomatologia clinica, mentre altre specie fungono da ospiti accidentali e come tali

possono essere più o meno resistenti o sensibili all’infezione, con possibilità di originare

episodi di malattia conclamata [Chavala et al., 2004].

Le zanzare del genere Culex sembrano essere i principali vettori dell’infezione, in

particolare la zanzara della specie Cx. perfuscus. Altre specie di vettori da cui è stato

isolato il virus sono Cx. neavei, Mansonia africana nella Repubblica Centro-Africana e

Coquilletidia aurites in Uganda. Recentemente l’USUV è stato identificato nella specie Cx.

modestus ed è emerso che può co-circolare con il WNV nello stesso ciclo silvestre nello

stesso habitat, suggerendo che entrambi i virus possono essere mantenuti in due

ecosistemi: uno silvestre tra Cx. pipiens/Cx. modestus e gli uccelli acquatici e uno urbano

che coinvolge Cx. pipiens e i merli o occasionalmente altre specie [Rudolf et al., 2015].

1.6.2. ZIKA VIRUS

Lo Zika virus (ZIKV) è un mosquito-borne flavivirus che causa infezione nell’uomo in

Africa e in Asia ed è fortemente legato filogeneticamente al Dengue virus [Kuno et al.,

1998]. Questo virus rappresenta un problema attuale di sanità pubblica in quanto le persone

che ritornano infette (in fase viremica) dai paesi in cui lo Zika virus è endemico, possono

innescare una trasmissione locale vista la disponibilità di vettori suscettibili nel nostro

territorio.

Si stima che in circa il 18% delle infezioni umane da ZIKV si sviluppano delle

manifestazioni cliniche; i sintomi sono simili a quelli causati da Dengue e Chikungunya

virus, anche se più lievi, quali febbre, dolori articolari e muscolari, eruzioni cutanee,

congiuntivite, linfoadenopatia e diarrea. Un’infezione da Zika virus potrebbe quindi

passare inosservata o essere addirittura attribuita a uno degli altri virus citati. Dopo una

puntura di zanzara infetta, i sintomi compaiono solitamente dopo un periodo di

incubazione dai 3 ai 12 giorni e possono durare da 2 a 7 giorni. Vi sono dati a favore del

fatto che il virus infetti le cellule dendritiche nel sito di inoculo arrivando poi ai linfonodi e

in circolo. La malattia raramente richiede il ricovero ospedaliero [Faye et al., 2013].

Durante alcune epidemie si è osservato una correlazione tra l’infezione da ZIKV e la

Introduzione

69

sindrome di Guillain-Barré [Cardoso et al., 2015]. Nella Polinesia Francese infatti, su 8503

casi, 74 hanno sviluppato complicanze neurologiche su base immunitaria, di cui 41

Guillain-Barré. Nonostante i sintomi legati alla malattia siano decisamente lievi e simil-

influenzali, il virus sembra collegato alla nascita di neonati con derformità encefaliche

(microcefalia). Secondo il ministero della Salute brasiliano, infatti, da ottobre 2015 sono

3530 i bambini nati con microcefalia. Si sta ancora indagando in merito

La diagnosi risulta essere abbastanza impegnativa, come per tutti i Flavivirus: utilizzando

tecniche sierologiche bisogna tener conto delle reazioni crociate con altri Flavivirus e/o

dell’assenza o basso titolo di anticorpi IgM e IgG nella fase precoce di infezione;

l’isolamento virale è laborioso e lungo e richiede strutture adeguate. La real-time RT-PCR

è rapida, sensibile e specifica ma consente di identificare l’infezione in fase viremica. In

ogni caso le tecniche molecolari consentono di identificare con precisione l’agente

eziologico in zone in cui sono presenti focolai di infezione causate da altri Arbovirus come

Dengue e Chikungunya [Faye et al., 2013].

Epidemiologia

Lo Zika virus è mantenuto in natura grazie ad un ciclo biologico che coinvolge come

vettori le zanzare della specie Aedes, in particolare Aedes aegypti e Ae. Africanus, e come

ospiti reservoir varie specie di scimmie e forse anche i roditori. Il virus prende il nome

dalla foresta dell’Uganda in cui venne identificato per la prima volta nel sangue di una

scimmia sentinella (rhesus macaque, Macaca mulatta); è stato poi isolato da un pool di

zanzare raccolte nella stessa foresta nel 1948. Negli esseri umani è invece stato isolato per

la prima volta negli anni Settanta [Haddow et al., 1964; Duffy et al., 2009].

Successive analisi sierologiche ed entomologiche hanno riportato la presenza del virus in

diverse parti dell’Africa: Burkina Faso, Costa d’Avorio, Egitto, Mozambico, Nigeria,

Uganda, Repubblica dell’Africa centrale e Senegal [Faye et al., 2013]. La sua virulenza è

emersa solo con le recenti epidemie. Una delle più rappresentative si è registrata nel 2007

in Micronesia (Stato di Yap), dove si sono confermati 49 casi. I pazienti presentavano rash,

febbre, dolori articolari e congiuntivite; non sono state riportate manifestazioni

emorragiche o casi fatali [Lanciotti et al., 2008; Duffy et al., 2009]. I recenti focolai di

febbre da ZIKV al di fuori dell’Asia e dell’Africa, le epidemie in Polinesia francese e

Nuova Caledonia e la sua presenza incipiente nelle Americhe, mostrano che questo virus

ha il potenziale per divulgarsi in aree dove sono presenti zanzare Aedes (Figura 32)

Introduzione

70

[Lanciotti et al., 2008; Duffy et al., 2009].

Figura 32.Distribuzione dello Zika virus (dati aggiornati a dicembre 2015) [Fauci et al., 2016]

Sono stati riportati dei casi importati in Italia (Firenze) dopo un viaggio tra dicembre 2013

e gennaio 2014 nella Polinesia francese. Entrambi i pazienti, una coppia di circa 30 anni,

presentavano febbre, malessere, congiuntivite, mialgia, artralgia, edema alle caviglie e

linfoadenopatia ascellare ed inguinale. Uno dei due mostrava inoltre leucopenia con

monocitosi e trombocitopenia. La donna ha manifestato sanguinamenti alle gengive dopo

qualche giorno dall’inizio dei sintomi. Febbre e rash sono scomparsi dopo due giorni ma il

malessere, la debolezza e i dolori muscolari sono durati una settimana circa. La diagnosi si

è basata per entrambi i casi sulla sieroconversione degli anticorpi IgG ed IgM e in un caso

è stato possibile identificare l’RNA virale tramite real-time RT-PCR. Durante i test

sierologici si sono verificate reazioni di reattività crociata con gli antigeni del Dengue virus

[Zammarchi et al., 2015].

Recentemente (2014-2015), le autorità sanitarie del Brasile hanno confermato la

trasmissione del virus nella parte nord-orientale del Paese [Cardoso et al., 2015]. I

ricercatori dell’Institut de recherche pour le développement di Marsiglia e del Centre

International de Recherches Medicales de Franceville (Gabon) hanno analizzato il sangue

di più di 4000 pazienti colpiti da Dengue o Chikungunya in Gabon, dal 2007 al 2010, anni

in cui in questo Paese si sono verificati numerosi casi. Hanno analizzato anche i vettori

prelevati nello stesso periodo, appartenenti a nove specie. I risultati mostrano che lo ZIKV

era presente in numerosi sieri, ed è quindi probabile che abbia avuto un ruolo importante, e

Introduzione

71

sottovalutato, nelle epidemie attribuite alle altre febbri. Il virus è stato trovato anche nelle

zanzare, e in particolare in numerosi campioni di Ae. albopictus [Grard et al., 2014].

Nel marzo 2014, il Cile ha riferito alle organizzazioni PAHO/OMS (Pan American Health

Organization/Organizzazione Mondiale della Sanità) la conferma di un caso di

trasmissione indigena di febbre da Zika virus nell’Isola di Pasqua, in concomitanza con la

presenza di altri focolai nelle isole del Pacifico della Polinesia francese, Nuova Caledonia e

Isole Cook. Nel novembre 2015 sono stati identificati dei casi autoctoni di infezione da

Zika virus nel Suriname (America latina).

Data la maggiore trasmissione del virus nella regione delle Americhe, PAHO/OMS ha

raccomandato agli Stati Membri di identificare e confermare i casi di infezione e di

implementare una strategia di comunicazione pubblica efficace per ridurre le zanzare che

trasmettono la malattia, in particolare nelle aree in cui questo vettore è presente.

In Italia, la diffusione di questi virus è monitorata da programmi specifici, come indicato

nella circolare del Ministero della Salute “Sorveglianza dei casi umani delle malattie

trasmesse da vettori con particolare riferimento a Chikungunya, Dengue, Zika virus e West

Nile Disease - 2014”.

In letteratura si possono trovare documentati dei casi di ZIKV in cui chiaramente la

trasmissione non è avvenuta per opera del vettore. Nel 2008 è stata riportata una probabile

trasmissione intraumana quando due scienziati americani hanno contratto il virus mentre

lavoravano nel sud-est del Senegal. Uno dei due, una volta tornato nel paese d’origine, ha

poi contagiato la moglie, la quale non aveva appunto viaggiato in zone in cui il virus è

endemico. Si ipotizza che la trasmissione del virus sia avvenuta per via sessuale [Foy et al.,

2011]. La trasmissione di un Arbovirus per via sessuale non era stata finora documentata.

Tuttavia, vi sono studi che dimostrano che il Japanese encephalitis virus si ritrova nello

sperma di maiali infettati sperimentalmente ed è in grado di infettare femmine di maiale

via inseminazione artificiale.

Nel 2014, nella Polinesia francese, subito dopo l’epidemia di ZIKV, sono stati descritti due

casi di infezione perinatale, in cui probabilmente la trasmissione è avvenuta per via

transplacentare o durante il parto. Nel primo caso la madre presentava rash senza febbre

ma il neonato non ha mostrato nessun sintomo; nel secondo caso il neonato ha manifestato

una severa ipotrofia e ipoglicemia e la conferma di infezione da ZIKV è stata effettuata

grazie a indagini molecolari sul siero del neonato prelevato 4 giorni dopo il parto. Altri

Arbovirus in cui è stata documentata la trasmissione perinatale sono Dengue virus,

Introduzione

72

Chikungunya virus, West Nile virus e Yellow Fever virus. Ci sono anche casi in cui DENV

e WNV si sono trasmessi durante l’allattamento. In alcuni neonati si sono riscontrate delle

gravi complicanze: encefalopatia e febbre emorragica per il CHIKV, parto pretermine,

morte, basso peso alla nascita, anomalie fetali, distress fetale per il DENV [Besnard et al.,

2014]. Sono stati inoltre riportati casi in cui la trasmissione è avvenuta in laboratorio

[Zammarchi et al., 2015].

1.6.3. MARISMA VIRUS

Recentemente, durante la sorveglianza entomologica per West Nile Virus, è stata rilevata la

presenza di un altro Flavivirus, chiamato Marisma virus (MMV), appartenente ai

mosquito-borne virus (MBV). Da vari studi emerge che il Marisma virus è correlato

filogenicamente a Yellow Fever virus, mentre i vettori principalmente coinvolti sono le

zanzare della specie Ochlerotatus caspius.

Il Marisma virus è stato identificato per la prima volta nel 2012 nel sud della Spagna e nel

2013 è stato rinvenuto in Piemonte (provincia di Alessandria) ed Emilia Romagna [Rizzo

et al., 2014]. Analisi retrospettive hanno dimostrato la sua presenza nel Friuli Venezia

Giulia già nel 2011. Infatti in un lavoro recente basato su analisi di zanzare raccolte nel

Nord-Est Italia tra il 2010 e il 2014, 105 pool sono risultati positivi per MBF e tra questi in

10 pool è stato identificato il MMV.

Dagli alberi filogenetici, i 10 ceppi isolati sembrano essere suddivisi in due cluster,

entrambi correlati ai ceppi del virus trovato in Spagna (Figura 33).

Inoltre, è emerso che oltre dalla specie sopra citata, il virus in questione può essere

trasmesso anche da Ae. albopictus e Ae. vexans (Figura 34).

Attualmente il MMV risulta essere presente nel Nord Italia, in Spagna ed in Portogallo

[Vázquez et al., 2012]. Non è però ancora chiara la sua patogenicità nell’uomo e negli

animali.

Introduzione

73

Figura 33. Albero filogenetico basato sulle sequenze del gene NS5 del MMV.

Figura 34. Rappresentazione degli specifici mosquito-borne virus correlati alle specie di zanzare coinvolte nella trasmissione del MMV.

Introduzione

74

1.7. FAMIGLIA TOGAVIRIDAE, GENERE ALPHAVIRUS

La famiglia Togaviridae si divide in due generi: gli Alphavirus, a cui appartiene il

Chikungunya virus, e i Rubivirus, tra i quali vi è il Rubella virus, l’agente eziologico della

rosolia. In questa tesi i Rubivirus non vengono trattati in quanto non appartengono alla

grande famiglia degli Arbovirus.

Il genere Alphavirus è rappresentato da una trentina di specie di virus trasmessi da zanzare,

distribuiti in sette gruppi in base alla cross-reattività sierologica (Tabella 3). Questi virus

sono diffusi in tutto il mondo e sono in grado di infettare numerosi vertebrati tra i quali

anche l’uomo.

Complesso antigenico Specie

Barmah Forest Barmah Forest virus (BFV)

Eastern equine encephalitis Eastern equine encephalitis virus (EEEV)

Middelburg Middelburg virus (MIDV)

Ndumu Ndumu virus (NDUV)

Semliki Forest

Bebaru virus (BEBV) Chikungunya virus (CHIKV)

Getah virus (GETV) Mayaro virus (MAYV)

O’nyong nyong virus (ONNV) Ross River virus (RRV)

Semliki Forest virus (SFV) Una virus (UNAV)

Venezuelan equine encephalitis

Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV) Mosso das Pedras virus (MDPV)

Everglades virus (EVEV) Mucambo virus (MUCV)

Tonate virus (TONV) Pixuna virus (PIXV)

Cabassou virus (CABV) Rio Negro virus (RNV)

Western equine encephalitis

Aura virus (AURAV) Sindbis virus (SINV)

Whataroa virus (WHAV) Fort Morgan virus (FMV) Highlands J virus (HJV)

Western equine encephalitis virus (WEEV)

Unclassified Trocara virus (TROV)

Salmon pancreas disease virus (SPDV) Southern elephant seal virus (SESV)

Tabella 3. Classificazione delle specie degli Alphavirus [Powers et al., 2007]

Introduzione

75

Le analisi filogenetiche hanno portato alla suddivisione degli Alphavirus in due gruppi:

∗ virus appartenenti al Vecchio Mondo (Asia, Australia, Europa ed Africa): Sindbis

virus, Chikungunya virus, O’Nyong Nyong virus, Middelburg virus, Ross River

virus e Semliki Forest virus;

∗ virus appartenenti al Nuovo Mondo (Nord e Sud America): Venezuelan equine

encephalitis virus (VEEV), Eastern equine encephalitis virus (EEEV) e Western

equine encephalitis virus (WEEV) [Luers et al., 2005].


Il genoma degli Alphavirus è costituito da un singolo filamento positivo di RNA di circa

11-12 kb; è organizzato in due regioni principali: un dominio non strutturale, posto verso

l’estremità 5’, che codifica per le proteine non strutturali e un dominio strutturale verso il

3’ che codifica per tre proteine strutturali (Figura 35).

Figura 35. Genoma lineare a singolo filamento a polarità positiva (ssRNA +) di circa 11-12 kb.

Le proteine non strutturali vengono tradotte in una o due poliproteine che vengono poi

scisse per produrre quattro proteine denominate nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4. Il dominio

strutturale invece viene tradotto a partire da un mRNA sub-genomico (26S mRNA di circa

4100 nucleotidi) in un’unica poliproteina. Quest’ultima viene processata per produrre le

proteine dell’envelope (E1 e PE2, precursore di E2), la proteina del capside (proteina C) e

Introduzione

76

due piccoli polipeptidi chiamati E3 e 6K. La proteina C viene subito assemblata con l’RNA

genomico nel nucleocapside, PE2 e E1 vengono trasportate con 6K alla membrana

plasmatica attraverso la pathway di secrezione cellulare; successivamente PE2 viene

processata in E2 [Luers et al., 2005; Strauss et al., 1994].

I virioni degli Alphavirus sono costituiti da un nucleocapside a simmetria icosaedrica

avvolto da una membrana lipoproteica virale, denominata envelope. Al microscopio

elettronico, appaiono di forma sferica (diametro di circa 40 nm) o pleiomorfi (diametro di

circa 60-70 nm) e sono localizzati nel citoplasma della cellula ospite (Figura 36). Sulla sua

superficie appaiono prolungamenti lunghi circa 10 nm costituiti da glicoproteine virali, di

cui due (denominate E1 ed E2) sono antigenicamente ben caratterizzate e permettono una

classificazione sierologica degli Alphavirus [Strauss et al., 1994].

Figura 36. Virione degli Alphavirus sferico, a simmetria icosaedrica. L’envelope contiene 80 prolungamenti (spikes) formati da trimeri delle proteine E1/E2.

Gli Alphavirus replicano sia negli artropodi che negli ospiti vertebrati, producendo

un’infezione persistente nei primi, mentre nei secondi di breve durata. Questo si presenta

anche nelle colture cellulari: nelle cellule di zanzara si ha un’infezione lunga dove le

cellule sopravvivono e si continua a produrre virus, mentre nelle cellule di vertebrati si ha

Introduzione

77

un’infezione breve di tipo citolitico [Strauss et al., 1994].

Dopo la penetrazione nella cellula infettata, l’RNA virale scapsidato funziona da RNA

messaggero, dirigendo la sintesi delle proteine virali. Viene sintetizzato un singolo lungo

polipeptide che successivamente viene tagliato in frammenti per formare un certo numero

di proteine più piccole. Si ha prima la traduzione dell’estremità 5’, che codifica per le

proteine funzionali; dopo la replicazione del genoma vengono prodotti mRNA

subgenomici che produrranno le proteine strutturali corrispondenti all’estremità 3’ [ten

Dam et al., 1999]. I nucleocapsidi completi acquistano l’involucro dalla membrana

plasmatica cellulare e solo allora il virione diviene infettivo (Figura 37).

Figura 37. Replicazione degli Alphavirus.

Introduzione

78


Una volta che un vertebrato viene morso dalla zanzara infetta, il virus può entrare nel

flusso sanguigno, provocando viremia; a loro volta le zanzare acquisiscono il virus

ingerendo sangue di un ospite viremico; il virus si moltiplica nei tessuti e negli organi della

zanzara, comprese le ghiandole salivari. Nella maggior parte dei casi l’infezione nei

vertebrati è asintomatica: per esempio gli uccelli che hanno contratto la Western equine

encephalitis virus appaiono sani e non infetti. Altre volte, tuttavia, compaiono malattie

(Tabella 4). Nell’uomo queste ultime sono essenzialmente di due categorie:

1. sindromi febbrili con eruzioni cutanee e poliartriti, causate ad esempio da

Chikungunya virus, Ross River virus, Sindbis virus, ovvero dagli Alphavirus

appartenenti al Vecchio Mondo [Harley et al., 2001];

2. encefaliti talora mortali, come nel caso del VEEV, EEEV o WEEV, ovvero

Alphavirus appartenenti al Nuovo Mondo [Steele et al., 2010].

Alphavirus Malattia umana Serbatoio

(vertebrato) Diffusione geografica

Sindbis virus Rush, artrite Uccelli Europa, Africa,

Australia

Semliki forest virus Rush, artrite Uccelli Africa

O’nyong’nyong virus Rush, artrite primati, Uomo Africa

Chikungunya virus Febbre di Chikungunya (rash, artrite) Primati, Uomo Africa, India, SE

Asia

Mayaro virus Rash, artrite Primati, Uomo Sud America

Ross River virus Rash, artrite Mammiferi, Uomo Australia, Sud

Pacifico

Barmah Forest virus Febbre, malessere, rash, dolore articolare,

debolezza muscolare Uomo Australia

Eastern equine encephalitis virus

Encefaliti Uccelli Americhe

Western equine encephalitis virus

Encefaliti Uccelli,

Mammiferi Nord America

Venezuelan equine encephalitis virus

Encefaliti Roditori, Cavalli Americhe

Tabella 4. Alcuni dei più importanti Alphavirus patogeni per l’uomo

Gli Alphavirus hanno un range di ospiti molto vasto che comprende sia ospiti invertebrati

(zanzare o altri insetti ematofagi che fungono da vettori) sia vertebrati (volatili, mammiferi,

rettili e anfibi). La replicazione virale avviene in vari tipi cellulari, compresi neuroni e

cellule della glia, cellule muscolari, cellule sinoviali, cellule del tessuto adiposo. I vari

Introduzione

79

recettori che vengono espressi sulla superficie di tutti questi tipi cellulari sono condivisi da

più Alphavirus; inoltre da alcuni studi è emerso che un singolo virus può utilizzare recettori

differenti. Una o più mutazioni sulle glicoproteine dell’envelope possono incidere sulla

scelta del recettore da parte del virus. La natura del recettore può determinare in parte la

virulenza. Per quanto riguarda i mammiferi, i recettori che mostrano un’affinità più elevata

sono quelli della laminina.

L’infezione da Alphavirus può essere impedita dal sistema immunitario producendo

interferone [Griffin et al., 2010]; nell’immunità specifica sono invece coinvolti anticorpi

neutralizzanti e cellule T.

La diagnosi viene effettuata dall’evidenza clinica considerando il rischio di essere stati

esposti al virus. La conferma viene effettuata mediante isolamento ed identificazione virale

(real-time RT-PCR) e con la valutazione della presenza di anticorpi specifici.

1.8. CHIKUNGUNYA VIRUS

1.8.1. CLASSIFICAZIONE E SOTTOTIPI DEL CHIKUNGUNYA VIRUS

Il Chikungunya virus (CHIKV) appartiene alla famiglia Togaviridae, genere Alphavirus.

Alcuni studi di microscopia elettronica hanno dimostrato che la morfologia del virus nelle

colture di cellule VERO è quella caratteristica degli Alphavirus, mentre la cross-reattività

sierologica osservata pone il CHIKV all’interno del sierocomplesso del Semliki Forest

virus (SFV) [Powers et al., 2007].

Basandosi sulle sequenze di una parte o dell’intero genoma della glicoproteina strutturale

E1 di campioni raccolti durante le epidemie nella Réunion e di altre isole dell’Oceano

Indiano, sono stati identificati quattro sottotipi di CHIKV (Figura 38) [Parola et al., 2006]:

� East/Central African;

� Eastern/Southern Africa;

� West African;

� Asian.

L’East/Central African e l’Eastern/Southern Africa spesso vengono raggruppati nello stesso

genotipo: East-Central-South-African (ECSA) [Thiberville et al., 2013]. L’Asian e l’ECSA

sembrano essere più vicini antigenicamente rispetto al terzo genotipo, al punto che,

divergendo di circa il 15% dal West African, per alcuni vengono considerati appartenenti

allo stesso lineage [Powers et al., 2007].

Introduzione

80

Figura 38. Analisi filogenetiche di CHIKV relative ad un frammento di 1044 nucleotidi (posizione genomica 10243-11286 nt) del gene E1 di campioni raccolti durante le epidemie nella Réunion e in altre isole dell’Oceano Indiano. Nell’albero filogenetico vengono rappresentati i principali lineage evolutivi:

East/Central African (marrone), eastern/southern Africa (rosso), West African (blu) ed Asian (giallo) [Parola et al., 2006].

1.8.2. GENOMA E REPLICAZIONE

Il genoma del CHIKV, come per tutti gli Alphavirus, è lineare ed è costituito da un singolo

filamento di RNA a polarità positiva di circa 11.8 kb (Figura 39). A racchiudere le due

ORF, alle due estremità vi sono le regioni non codificanti 5’NCR e 3’NCR; anche le

regioni di giunzione (J) sono non codificanti. L’ORF al 5’ viene tradotto dall’RNA

genomico e codifica per 4 proteine non strutturali (nsP1, 2, 3 e 4); l’ORF al 3’ invece viene

tradotto dall’RNA 26S sub-genomico e codifica per la proteina C del capside, due

glicoproteine dell’envelope (E1 ed E2) e due piccoli peptidi chiamati E3 e 6K. Le varie

proteine vengono generate dopo il taglio proteolitico dei precursori delle poliproteine

[Powers et al., 2013].

Introduzione

81

Figura 39. Organizzazione del genoma del CHIKV [Thiberville et al., 2013].

Il virus entra nelle cellule mediante endocitosi, con un meccanismo dipendente dal pH, che

culmina con la fusione ed il successivo rilascio del nucleocapside nel citoplasma. Il

processo comincia con l’ancoraggio di E2 ai recettori cellulari e la fusione delle particelle

virali con la membrana delle cellule ospiti. Il peptide di fusione è localizzato nel dominio II

di E1, in prossimità dell’aminoacido 226. Dopo l’entrata del virus, l’RNA genomico a

viene usato direttamente come messaggero e parzialmente tradotto (estremità 5’) per

produrre le proteine non strutturali. Queste saranno responsabili della replicazione e della

formazione del filamento negativo complementare, templato per la successiva sintesi del

filamento positivo. La replicazione dell’mRNA sub-genomico (26S) avviene attraverso la

sintesi dell’intero RNA a polarità positiva, regolata da nsP4 e il precursore p123 nella

prima fase dell’infezione e più tardi dalle proteine non strutturali mature. Si ha la

produzione di 5 proteine strutturali (C, E3, E2, 6k ed E1) che serviranno per

l’incapsidazione e la generazione dell’envelope. Il rilascio e la maturazione avvengono

quasi contemporaneamente.

1.8.3. MANIFESTAZIONI CLINICHE

Dopo un periodo di incubazione di 3-12 giorni, si manifesta una sintomatologia simil-

influenzale che include febbre alta, brividi, cefalea, nausea, vomito e soprattutto importanti

artralgie, tali da limitare molto i movimenti (Figura 40): i pazienti tendono a rimanere

Introduzione

82

assolutamente immobili, in posizione antalgica. La febbre si risolve dopo 4 giorni. Si può

sviluppare anche una seconda fase della malattia un esantema maculopapulare pruriginoso

su tutto il corpo e dalla ricomparsa della febbre. Le complicanze più gravi sono rare e sono

di natura emorragica (ma non in modo così grave come nella dengue) entro 3-5 giorni, o

neurologica, principalmente nei bambini. Durante l’epidemia nello Sri Lanka nel 1972 è

stato riportato un caso di miocardite dopo la fase febbrile [Powers et al., 2007]. In rari casi

può essere fatale, soprattutto in soggetti anziani con sottostanti patologie di base. La

malattia si risolve spontaneamente, ma i dolori articolari possono persistere per mesi.

Figura 40. Rappresentazione di organi e tessuti coinvolti nell’infezione da CHIKV [Caglioti et al., 2013]


La diagnosi è sospettata sulla base della clinica e dell’epidemiologia del virus, cioè se vi è

una malattia febbrile con artralgie in pazienti di ritorno da Africa o da Asia in

Introduzione

83

concomitanza di un’epidemia. Clinicamente, si può manifestare una modesta leucopenia

con linfocitosi relativa e un importante aumento della velocità di eritrosedimentazione

(VES) e della proteina C reattiva (PCR).

La diagnosi viene confermata con test sierologici. Per un’ulteriore conferma è necessario

rilevare gli anticorpi specifici in un secondo prelievo di siero. Vi sono a disposizione anche

metodiche molecolari (real-time RT-PCR) e di isolamento virale su coltura cellulare.

La terapia è sintomatica e si basa sul controllo delle artralgie. Per trattare l’infezione

vengono utilizzati paracetamolo o acetaminofene come antipiretici e farmaci

antinfiammatori non steroidei. Recenti studi hanno portato all’individuazione di nuovi

antivirali candidati che inibiscono il meccanismo virale nei sistemi cellulari e nei modelli

animali. Protocolli terapeutici per i casi più gravi prevedono l’uso di immunoglobuline o di

molecole che possono interferire con alcuni aspetti della risposta infiammatoria; per le

manifestazioni croniche reumatiche e poliartritiche che perdurano per più di 2-3 mesi viene

consigliata la somministrazione di metotrexato [Thiberville et al., 2013].



Il termine chikungunya significa ciò che piega o contorce e fu impiegato durante la prima

epidemia, avvenuta in Tanzania (Makonde Plateau) nel 1952, a causa delle limitazioni

articolari dovute alle importanti artralgie che caratterizzano la malattia. Inizialmente si

pensava fosse un’epidemia di Dengue virus ma le analisi sierologica e la caratterizzazione

dei ceppi isolati hanno dimostrato la vicinanza antigenica al Mayaro virus e al Semliki

Forest virus, appartenenti al siero gruppo Semliki Forest degli Alphavirus. Analisi

retrospettive hanno ipotizzato che probabilmente si era già avuta un’epidemia di

Chikungunya in Indonesia nel 1779. A partire dagli anni Cinquanta, varie epidemie si sono

verificate in Asia e in Africa. Tra gli anni Sessanta e Novanta infatti il virus è stato isolato

da numerose zone dell’Africa centrale e meridionale, come Sudan, Uganda, Congo,

Repubblica dell’Africa Centrale, Malawi, Zimbabwe, Kenya e Sud Africa. Il CHIKV è

stato isolato anche da casi dell’Africa occidentale (Nigeria, Senegal, Costa d’Avorio). Nel

sud est asiatico sono state riportate varie epidemie tra il 1960 ed il 2003 in India, Malesia,

Indonesia, Cambogia, Vietnam, Myanmar, Pakistan e Thailandia. In numerose città come

Calcutta e Bangkok sono stati identificati dei siti attivi di trasmissione del CHIKV. Tra le

Introduzione

84

epidemie più importanti ricordiamo quelle documentate in Senegal nel 1986 e nel 1996-97,

in Costa d’Avorio nel 1996-97, in Indonesia nel 2003, in Kenya nel 2004, nelle isole

Seychelles, Mauritius e Réunion (Oceano Indiano) ed in Madagascar tra il 2005 e il 2006.

Tra il 2004 e il 2007 sono stati segnalati centinaia di migliaia di casi e sono state coinvolte

nuove aree geografiche (Figura 41).

Figura 41. Distribuzione geografica del CHIKV [Powers et al., 2007].

Prima del 2013 epidemie di Chikungunya sono state identificate in Africa, Asia, Europa e

nell’Oceano Indiano e Pacifico. La prima trasmissione locale del virus nelle Americhe è

stata riportata nei Caraibi verso la fine del 2013 [Fauci et al., 2016]. Prima di allora il virus

era stato trovato solo in casi di viaggiatori tornati da Paesi affetti. Nella figura 42 si

possono vedere i territori in cui è stata riportata la presenza del virus fino ad ottobre 2015

[Fonte CDC, http://www.cdc.gov/chikungunya/geo/index.html].

In Europa (Belgio, Francia, Germania, Inghilterra, Italia, Norvegia, Repubblica Ceca e

Spagna) sono stati riportati alcuni casi importati da turisti rientrati da India e dalle isole

dell’Oceano Indiano, dagli Stati Uniti, Hong Kong, Canada, Taiwan e Sri Lanka [Panning

Introduzione

85

et al., 2008; Powers et al., 2007; Thiberville et al., .2013].

Figura 42. Territori in cui è stato riportato il CHIKV fino ad Ottobre 2015 [Fonte CDC, http://www.cdc.gov/chikungunya/geo/]

In Italia nell’estate 2007 sono stati notificati i primi casi autoctoni in Emilia Romagna, a

Castiglione di Cervia e Castiglione di Ravenna (ambedue in provincia di Ravenna). Sono

stati identificati 205 casi tra luglio e settembre; quasi tutti i pazienti hanno mostrato una

sintomatologia lieve (febbre e artralgia), tranne un anziano che è deceduto. Le analisi

molecolari e sierologiche sui campioni clinici e sulle zanzare catturate nell’area in

questione hanno permesso di stabilire con certezza che si è trattato di Chikungunya virus.

Il presunto responsabile della diffusione dell’infezione sembra essere un uomo indiano

rientrato in Italia dopo avere contratto la malattia nel suo paese natale. Le analisi

filogenetiche relative alla regione del gene E1 hanno mostrato un’elevata omologia tra le

sequenze ottenute dai ceppi isolati in Italia e quelli identificati durante l’epidemia

nell’Oceano Indiano. Non si è esclusa l’ipotesi che alcuni casi possano essersi diffusi per

contagio interumano, in quanto un piccolo numero di contagiati aveva riferito di non avere

subito (o quanto meno avvertito) punture della temibile zanzara. In ogni caso questo

focolaio di infezione in una zona non-tropicale sottolinea la necessità di preparazione e

risposta alle malattie infettive emergenti nell’era della globalizzazione [Rezza et al., 2007].

Introduzione

86

Trasmissione e vettori

L’infezione viene trasmessa dalla puntura di zanzare infette del genere Aedes, presenti

soprattutto in zone rurali. Il ciclo di trasmissione del Chikungunya virus richiede un pasto

di sangue viremico da parte di zanzare femmine su un ospite vertebrato, seguito da un

periodo di incubazione e di trasmissione ad un altro ospite vertebrato durante il pasto

successivo [Thiberville et al., 2013].

Vi sono due diversi cicli di trasmissione per questo virus:

∗ ciclo silvestre presente in Africa; il virus è trasmesso da Ae. africanus, Ae.

neoafricanus, Ae. furcifer, Ae. taylori e Ae. Luteocephalus e viene mantenuto in

natura da primati non umani, come cercopitechi e babbuini, e probabilmente

roditori [Diallo et al., 1999; Powers et al., 2007].

∗ ciclo urbano diffuso in Asia, nell’Oceano Indiano, in Africa ed in Europa; è

caratterizzato dall’assenza di animali reservoir durante il periodo epidemico

(trasmissione uomo-zanzara-uomo), mentre durante i periodi inter-epidemici

vengono coinvolti scimmie, roditori e volatili come ospiti. Il vettore principale è la

zanzara Aedes aegypti (la stessa che trasmette la febbre gialla e la Dengue), attivo

soprattutto in Asia. Un altro importante vettore è Aedes albopictus, comunemente

chiamata zanzara tigre, poiché è caratterizzata dalla presenza di strisce bianche sul

corpo e sulle zampe di colore nero [Figura 43]. Questo vettore è il responsabile

della diffusione del virus nelle isole dell’area indiana ed è presente anche nei centri

abitati del nostro paese. Nelle recenti epidemie Ae. albopictus ha assunto un ruolo

importante a causa di mutazioni adattative nel genoma virale, in particolare la

mutazione A226V nella glicoproteina E1, che aumenta la replicazione virale nel

vettore [Caglioti eta al., 2013; Thiberville et al., 2013].

Figura 43. Il vettore Ae. albopictus.

Introduzione

87

Alcuni studi hanno dimostrato che anche varie specie del genere Culex sono potenziali

vettori per il CHIKV.

A differenza di altre specie (come quelle indigene dell’Europa), la zanzara tigre è attiva

durante il giorno, e non solamente all’alba o al tramonto. Le zanzare tigre depongono le

uova spesso in piccoli contenitori con quantità di acqua: vasi, sottovasi, fognature otturate,

grondaie, recipienti di scarto. La zanzara tigre ha un limitato raggio d’azione (meno di 200

metri): i luoghi di deposizione delle uova sono vicini dunque a dove si osservano le

zanzare [Caglioti et al., 2013].

Sebbene Ae. albopictus sia indigena in zone tropicali e subtropicali, si sta adattando con

successo anche a climi più freddi. Nelle zone tropicali calde e umide è attiva tutto l’anno,

in regioni più temperate sverna. Le uova delle varietà presenti nelle zone temperate

tollerano meglio il freddo (temperature sotto zero, neve) di quelle presenti in regioni più

calde. Inoltre, le zanzare tigre adulte possono sopravvivere durante l’inverno in

microhabitat adeguati.

I primi esemplari di Ae. albopictus in Europa si sono osservati in Albania, probabilmente il

mezzo responsabile fu una nave cargo proveniente dalla Cina attraccata a Durazzo. In Italia

ha fatto la sua comparsa nel 1990 a Genova, in un deposito di pneumatici usati importati

dagli Stati Uniti (Georgia), e l’anno dopo a Padova. Si è poi diffusa praticamente in tutta la

penisola in particolare in Emilia Romagna, sconfinando fino in Francia, Spagna e Svizzera

e nei porti delle città europee, dimostrando quindi un’alta capacità di ambientazione

[Rezza et al., 2007].

Anche se la trasmissione avviene tramite puntura di zanzara infetta, non si esclude a priori

la possibilità di un contagio interumano (per via aerea, per contatto con fluidi biologici...)

specialmente tra soggetti che restano in prolungato contatto con malati. Sono stati descritti

anche casi di trasmissione tramite donatori aintomatici di sangue e di organi e tessuti (per

esempio trapianto di cornea) [Thiberville et al., .2013].

Prevenzione

Non esiste ancora un vaccino per il CHIKV, ma sono stati fatti vari tentativi, utilizzando sia

virus inattivati che attenuati, proteine ricombinanti, vaccini a DNA. Si è sviluppato un

vaccino umano che prevede l’uso di un virus inattivato con formalina; gli effetti sono stati

testati su cellule di rene di scimmia (green monkey kidney cells, GMKC): i livelli degli

Introduzione

88

anticorpi sono elevati, non vi è viremia e sembra proteggere le scimmie dall’infezione.

Sembra però che gli effetti indesiderati siano parecchi. Si è allora passati ad utilizzare il

siero di un paziente (Tahilandia) che sembra non avere effetti collaterali in topi e nei

pazienti volontari; tutti i soggetti sviluppano anticorpi neutralizzanti. A partire dal ceppo

isolato si è provato a sviluppare un vaccino di seconda generazione che sembra garantire

un’alta protezione. Si stanno ancora effettuando ulteriori trial clinici [Caglioti et al., 2013;

Powers et al., 2007].

1.8. FAMIGLIA BUNYAVIRIDAE, GENERE BUNYAVIRUS

La famiglia Bunyaviridae comprende una serie di arthropod-borne e rodent-borne virus;

prende il nome da Bunyamwera (Uganda) dove, dalle zanzare, è stato isolato il primo

virus. Questi virus sono responsabili di patologie febbrili nell’uomo ed in altri vertebrati. Il

ciclo biologico comprende un ospite roditore o un vettore artropode e un ospite vertebrato.

La maggior parte sono Arbovirus (arthropod-borne viruses) essendo prevalentemente

diffusi tramite artropodi (zanzare, zecche, flebotomi). Fanno eccezione gli Hantavirus -

Robovirus (rodent borne virus) - che infettano solo i mammiferi e sono diffusi tramite le

urine e le feci di roditori.

Le analisi filogenetiche hanno consentito la suddivisione in 4 generi principali di interesse

medico: Bunyavirus, Phlebovirus, Nairovirus e Hantavirus (Tabella 5). Questi virus sono

suddivisi in 35 sierogruppi con oltre 330 tipi e sottotipi. Esiste anche un quinto genere,

Tospovirus, che recentemente ha suscitato notevole interesse in campo botanico.

Genere Principali virus Patologia Vettore/serbatoi Distribuzione

geografica

Bunyavirus California LaCrosse Tahyna

meningo-encefalite encefalite

febbre, esantema zanzara

Stati Uniti, Europa

Phlebovirus Toscana virus, Napoli virus, Sicilian virus

Febbre della Rift Valley

febbre, encefalite, meningite

febbre emorragica flebotomo

Centro e nord Africa, Asia medio-orientale e

meridionale, area mediterranea

Nairovirus Virus della febbre

emorragica Crimea-Congo

Febbre emorragica zecca Africa centrale, Asia,

Europa orientale

Introduzione

89

Genere Principali virus Patologia Vettore/serbatoi Distribuzione

geografica

Hantavirus Belgrado, Hantaan

Febbre emorragica con sindrome renale (HFRS); sindrome

polmonare da Hantavirus; nefropatia

epidemica

roditore Asia, Nord e Sud America, Europa

Tospovirus Tomato spotted wilt

virus

virus delle piante, nessuna patologia umana conosciuta

- -

Tabella 5. Generi della famiglia Bunyaviridae.


I Bunyavirus sono particelle sferiche dotate di envelope aventi un diametro di 80-120 nm

(Figura 44). Il genoma, contenuto in nucleocapsidi elicoidali, è costituito da RNA singolo

filamento a polarità negativa (ssRNA-), di 11-12 kb, segmentato in tre parti (Figura 44):

� segmento L (large) di 6400-6700 nucleotidi che contiene una singola ORF che

codifica per la RNA polimerasi-RNA dipendente (proteina L);

� segmento M (medium) di circa 4215 nucleotidi che codifica per le proteine

superficiali G1 e G2 e per una proteina non strutturale NSm;

� segmento S (small) di 1869 nucleotidi che codifica per la proteina

nucleocapsidica N e proteine non strutturali NS.

Figura 44. Rappresentazione del virione (A) e del genoma (B) dei Bunyavirus.

Introduzione

90

Sulla superficie (pericapside) sono espresse due glicoproteine virus specifiche, G1 e G2,

che formano proiezioni superficiali, hanno come bersaglio anticorpi neutralizzanti,

capacità emoagglutinanti e sono responsabili dell’interazione del virus con la cellula ospite

[Di Bonito et al., 1997; Lappin et al., 1994; Valassina et al., 2003].

La replicazione dei Bunyavirus avviene nel citoplasma. L’interazione di G1 con i recettori

cellulari permette la penetrazione per fusione (endocitosi recettore mediata); il PH basso

induce la fusione del virus con la membrana della vescicola, rilasciando il genoma virale

nel citoplasma. L’RNA genomico è poi trascritto in mRNA dalla polimerasi virale (RdRp).

Dalla traduzione degli mRNA si ottengono le proteine virali: il filamento M codifica la

proteina NS e le glicoproteine G1 e G2 vengono glicosilate nel Golgi ed espresse sulla

membrana; il filamento L codifica invece la proteina L (polimerasi), mentre il tratto S

codifica per le proteine non strutturali NS e N. La replicazione citoplasmatica dell’RNA

genomico (ssRNA-) avviene attraverso la produzione di un intermedio di RNA

complementare a polarità positiva ssRNA+(cRNA). Avviene dunque l’assemblaggio della

proteina N con il genoma virale neoformato (ssRNA+) generando il nucleocapside. Questo

viene trasportato al Golgi o alla membrana citoplasmatica. Dopo la maturazione le

particelle virali (nucleocapside + proteine dell’envelope) vengono rilasciate per

gemmazione intracellulare nel Golgi. In alternativa la liberazione dei virioni può avvenire

tramite lisi cellulare.


I Bunyavirus si replicano negli artropodi. La persistenza in natura è legata alla possibilità

di instaurare un ciclo artropode vettore (zanzara, zecca o flebotomo) - ospite vertebrato

(generalmente piccoli mammiferi ma anche uccelli) che diventa quindi il serbatoio del

virus. Nell’artropode l’infezione persiste in assenza di malattia. Alcuni Bunyavirus (per

esempio il virus della febbre da flebotomi, presente in Italia, tipo napoletano o tipo

siciliano), sono trasmessi per via transovarica: in questo caso l’artropode e insieme

serbatoio e vettore. Nel ciclo naturale l’uomo si ammala quando è punto da un artropode

infetto, ma il sangue umano raramente può infettare l’artropode, cosicché l’uomo

rappresenta l’ospite terminale.

Il virus si moltiplica nelle cellule epiteliali del tratto digerente dell’artropode, infetta le

ghiandole salivari e si moltiplica. Quando il vettore punge l’ospite, rigurgita la saliva

Introduzione

91

contenente i virioni; la saliva infetta penetra nei capillari e nei vasi linfatici. L’endotelio

vascolare della cute e i linfonodi regionali rappresentano quindi il sito primario di

replicazione del virus che giunge al circolo sanguigno generando viremia. Al termine della

viremia, vi è la comparsa degli anticorpi e l’ospite va incontro a guarigione.

L’infezione è generalmente asintomatica, a meno che non sia stato infettato uno specifico

organo (endotelio vascolare, fegato, encefalo, reni, polmoni). Il danno è prevalentemente

attribuibile alla diretta invasione dei tessuti da parte del virus, piuttosto che ad una reazione

infiammatoria mediata dall’ospite. La risposta iniziale all’infezione da Bunyavirus consiste

nella produzione di interferone (IFN). La scomparsa del virus nel sangue si accompagna

alla comparsa di anticorpi. L’IFN, unitamente all’immunità umorale, svolge un ruolo

protettivo sull’andamento dell’infezione.

I Bunyavirus causano febbre talvolta con rash. In aggiunta, Crimean-Congo hemorrhagic

fever virus può causare emorragie; Rift Valley fever virus può causare epatiti emorragiche,

encefaliti o cecità; La Crosse virus e virus simili possono causare encefaliti; Hantaan River

virus causa emorragie e danni renali o la sindrome polmonare da Hantavirus che ha un

tasso di mortalità del 36%.

1.8.3. DIAGNOSI E PREVENZIONE

La diagnosi sierologica viene effettuata mediante riscontro di anticorpi delle classi IgM o

IgG (ELISA o immunofluorescenza indiretta). La presenza di IgM nei sieri di pazienti in

fase acuta deve essere confermata da IgG in prelievo effettuato dopo circa 2 settimane.

Nella fase viremica è possibile applicare tecniche immunoenzimatiche (ELISA) per il

rilevamento di antigeni virali o indagini molecolari (RT-PCR) per l’amplificazione di

sequenze specifiche. Si moltiplicano in colture cellulari di diverse specie animali

(vertebrati e invertebrati), in particolare in un’ampia varietà di linee cellulari d’origine

renale, incluse le cellule VERO e in cellule macrofagiche di topo, dove sono in grado di

produrre un evidente effetto citopatico. Per alcuni virus particolarmente pericolosi si rende

indispensabile la disponibilità di un laboratorio autorizzato al trattamento di agenti

infettanti di classe 3 (es. Febbre della Valle del Rift) e 4 (Virus della febbre emorragica di

Crimea/Congo).

Per il virus della Rift Valley (Phlebovirus) sono stati allestiti vaccini per uso umano

Introduzione

92

preparati con virus inattivati con formalina. Questi vaccini non sono ancora ottimali,

poiché sono necessari diversi richiami per ottenere un’adeguata risposta anticorpale. Per la

febbre emorragica con sindrome renale (Hantavirus) sono stati utilizzati diversi tipi di

vaccini inattivati nei confronti dei virus Hantaane Seoul e numerosi vaccini ricombinanti

sono attualmente in studio. In assenza di vaccini efficaci in commercio, la prevenzione

verso l’infezione da Bunyavirus (esclusi gli Hantavirus) consiste nell’evitare il contatto tra

l’uomo e l’artropode vettore (repellenti, insetticidi, vestiti protettivi, zanzariere, tende). Per

quanto riguarda la prevenzione dell’infezione da Hantavirus deve essere effettuata

principalmente con il controllo dei roditori.

1.8.4. PHLEBOVIRUS

I Phlebovirus comprendono circa 37 specie, raggruppate in 9 sierotipi; tra questi abbiamo i

Sandfly fever virus, che sono trasmessi ai vertebrati da flebotomi. I Phlebovirus sono

geograficamente distribuiti in Europa (Italia inclusa, Tabella 6), Africa, Asia centrale e

Nord e Sud America.

Famiglia/genere Virus Anno Luogo Identificazione virale

Bunyaviridae/ Phlebovirus

Arbia 1981 Toscana, Marche P. perniciosus, P.

perfiliewi

Sandfly fever Naples 1944 Campania uomo

Sandfly fever Sicilian 1943 Sicilia uomo

Toscana 1971 Italia centrale e

meridionale P. perniciosus, P. perfiliewi, uomo

Tabella 6. Sandfly-borne virus isolati in Italia.

Si conosce ancora poco sugli ospiti reservoir e sembra che il ruolo degli animali sulla

sopravvivenza del virus sia secondario all’amplificazione orizzontale che comunque

garantisce la trasmissione transovarica e venerea. Tra i Phlebovirus i più importanti sono il

virus della Rift Valley e i virus da febbre da flebotomi (Sandfly fever virus). Quest’ultimi

circolano in Europa e sono responsabili di sintomatologia simil-influenzale: in particolare,

abbiamo i sierotipi Sicilian virus, Naples virus e Toscana virus (TOSV). I primi due sono

presenti in Asia centrale e medio-orientale e hanno la stessa distribuzione dei vettori. Il

Introduzione

93

Toscana virus è invece presente in Italia, Algeria, Spagna, Portogallo e Cipro (Eitrem et al.,

1991). Il TosV e il Rift Valley virus sono gli unici del genere ad essere neurotropi. A

differenza di Sicilian virus e Naples virus, che causano patologia febbrile, il Toscana virus

è responsabile di febbre alta, cefalea grave, meningite asettica con prognosi benigna

seguita da convalescenza di media-lunga durata.

1.8.5. TOSCANA VIRUS

Il Toscana virus (TOSV), appartenente alla famiglia Bunyaviridae, genere Phlebovirus, è

un Sandfly fever virus responsabile di infezioni neurologiche nell’uomo. Viene trasmesso

da flebotomi, in particolare Phlebotomus perniciosus e P. perfiliewi; il virus può essere

trasmesso per via transovarica tra i vettori, ma non sono ancora stati identificati gli ospiti

serbatoio. Dato che il TOSV è stato isolato dal cervello di un pipistrello (Pipistrellus kuhli)

potrebbe esserci un possibile coinvolgimento di questa specie nell’ecologia del virus. Da

uno studio condotto in Turchia è emerso che i cani potrebbero essere candidati come ospiti

reservoir poiché sono stati identificati sia l’RNA virale che gli anticorpi neutralizzanti in

campioni raccolti durante la stagione estiva [Dincer et al., 2015].

L’incubazione del virus va da pochi giorni a due settimane. Nella maggior parte dei casi

determina solo un’infezione in forma leggera, asintomatica o paucisintomatica con

sintomatologia simil-influenzale (febbre, cefalea, nausea, vomito, mialgia e rigidità al

collo). Nei casi più gravi questo Arbovirus può causare meningite con o senza

sintomatologia encefalitica (meningo-encefalite). La prognosi è favorevole.

Non esiste una terapia specifica ma solo un trattamento sintomatico.

La diagnosi viene effettuata mediante test molecolari ed immunoenzimatici, i quali sono

rapidi e sensibili. La diagnosi diretta prevede metodiche come la nested PCR e la real-time

RT-PCR, che oltre a permettere una rapida identificazione hanno permesso di dimostrare la

circolazione di diversi ceppi di Toscana virus [Valassina et al., 1998]. La diagnosi indiretta

è utile invece sia per identificare l’infezione in acuto (IgM) sia in fase cronica ma con i test

sierologici si possono avere reazioni di cross-reattività con gli altri due sierotipi circolanti,

Naples e Sicilian virus [Eitren et al., 1991].

Recenti studi hanno dimostrato le proprietà antigeniche delle proteine virali

(nucleoproteina N e glicoproteine di superficie G1 e G2) per capire meglio il loro ruolo

immunogenico [Ciufolini et al., 1999; Valassina et al., 1998].

Il Toscana virus può essere isolato in vitro su colture cellulari di Vero [Verani et al., 1984]

Introduzione

94

oppure mediante inoculazione intracerebrale in topi.

La frequenza di questa infezione aumenta nel periodo estivo, con picchi in agosto nelle

aree mediterranee endemiche ovvero Italia, Portogallo, Spagna e Cipro (Figura 45) [Cusi et

al., 2010]. In Portogallo è stato condotto uno studio retrospettivo su campioni di liquido

cerebrospinale di pazienti con diagnosi di meningite: il 5.6% rivelava la presenza di TOSV

[Santos et al., 2007]. Una sieroprevalenza ancora più elevata, 24.9%, è stata osservata in

Spagna; il virus però sembra essere meno virulento di quello che circola in Italia [Cusi et

al., 2010]. Durante un programma di sorveglianza per il WNV nel sud della Francia,

diversi campioni di pazienti con meningite sono risultati positivi per TOSV [Peyrefitte et

al., 2005]. Il virus è stato poi isolato su colture cellulari da campioni clinici e dai vettori

[Charrel et al., 2007]. Da uno studio è emerso che tra i donatori di sangue il 12%

presentava IgG per TOSV; un’alta percentuale di anticorpi è stata trovata anche tra pazienti

ospedalizzati con sindrome neurologica. Inoltre è stato descritto anche un caso importato in

Germania dalla Francia. Grazie a queste evidenze è stato possibile dimostrare la

circolazione del Toscana virus sul territorio francese [Cusi et al., 2010; De Lamballerie et

al., 2007].

Sono poi documentati vari casi importati dall’Italia in altri paesi europei e in America,

alcuni dei quali vengono elencati qui di seguito:

- un caso importato in Svizzera dall’Isola d’Elba nell’agosto 2008 [Sonderegger et al.,

2009] e uno nell’agosto 2009 [Gabriel et al., 2010];

- un americano di 66 anni tornato da Roma [Calisher et al., 1987], uno di 65 anni recatosi

in Sicilia nell’estate del 2009 [Kay et al., 2010] e uno di 82 anni in vacanza sulla costiera

amalfitana nel 2014 [Howell et al., 2015].

Vari ceppi di TOSV sono stati isolati sia da campioni clinici che da Phlebotomus spp. e i

loro genomi sono stati sequenziati parzialmente o per intero descrivendo un quadro dei

ceppi circolanti nell’area Mediterranea. Sono stati identificati due principali genotipi

(Figura 46): il genotipo A circola principalmente in Italia, mentre il B in Spagna,

suggerendo che la distribuzione geografica probabilmente è legata alla circolazione dei

vettori. Questa distribuzione ha implicazioni nell’epidemiologia del TOSV poiché è in

continua evoluzione in quanto correlata con il clima, la globalizzazione e la modificazione

degli habitat [Cusi et al., 2010].

Introduzione

95

Figura 45. Circolazione del Toscana virus in Europa: * casi autoctoni, * casi importati, • sieropositività nella popolazione (Cusi et al., 2010).

Figura 46. Province di Italia e Spagna nelle quali sono stati documentati casi clinici di Toscana Virus e dove sono stati condotti studi di sieroprevalenza (Charrel et al., 2005).

Introduzione

96

In Italia il Toscana Virus è stato isolato per la prima volta nel 1971 a Monte Argentario

(Grosseto, Toscana). Nel 1983 è stato per la prima volta associato a patologia neurologica,

quando è stato isolato da una giovane donna con meningite linfocitaria [Nicoletti et al.,

1991]. Tra il 1995 e 1998 è stato condotto uno studio epidemiologico su pazienti

ospedalizzati residenti in Toscana: circa l’80% dei casi di meningite asettica è stato

attribuito al TOSV [Cusi et al., 201]. Successivi studi hanno poi sottolineato il ruolo di

questo virus come agente eziologico di patologie neurologiche. Analisi sierologiche sono

state condotte su popolazione ad alto rischio di contrarre il virus in Toscana e Piemonte

(esempio guardie forestali); in queste regioni, dove il vettore è molto presente, si è

osservato che l’infezione può manifestarsi in maniera asintomatica o può generare una

sintomatologia lieve [Valassina et al., 2003b]. Un altro studio condotto a Siena tra il 1993

ed il 2008 ha mostrato un’alta incidenza di TOSV (399 casi) con un picco nel 2005 e nel

2006, forse a causa dell’aumento delle temperature. Successivamente il virus è stato

riscontrato in Piemonte ed Emilia Romagna, ed in altre regioni come Marche, Umbria,

Lazio, Campania, Sardegna (la sieroprevalenza è maggiore nell’Italia Centrale) [Cusi et al.,

2010; Di Nicuolo et al., 2005; Remoli et al., 2014].

Tra il 2010 ed il 2012 è stato condotto uno studio interessante in varie province dell’Emilia

Romagna: sono stati analizzati i campioni raccolti all’interno della sorveglianza delle

infezioni da WNV (pazienti con meningite asettica) con metodiche sierologiche e

molecolari. In totale sono stati testati 120 campioni: 37 sono risultati positivi per IgG anti-

TosV e di questi 14 presentavano anche IgM anti-TosV, 1 paziente mostrava solo IgM

positive. Di questi 37 era disponibile anche il CSF per 11 pazienti. Alle analisi molecolari

gli 8 pazienti che avevano IgM ed IgG positive sono risultati positivi anche in RT-PCR; nei

3 casi rimanenti non erano stati riscontarti anticorpi specifici. Basandosi su questi dati, 18

pazienti su 120 (15%) erano in fase acuta dell’infezione da TosV (15 IgM positivi, 3 RT-

PCR positivi senza anticorpi specifici). 11 pazienti erano delle provincia di Bologna. 13

casi sono stati definiti come autoctoni mentre per i restanti 5 sono stati descritti viaggi

precedenti alla comparsa dei sintomi in zone in cui il virus è presente. Non si è riscontrata

nessuna associazione significativa tra infezione ed età dei pazienti; la durata media della

sintomatologia è stata di 8 giorni e i sintomi maggiormente riscontarti sono stati febbre e

cefalea; 14 presentavano meningite, 2 encefalite e 2 meningoencefalite. La prognosi è stata

positiva per tutti i casi [Vocale et al., 2012].

97

2. SCOPO DELLA TESI

L’insorgenza e la diffusione delle patologie trasmesse da vettori rappresentano un problema

attuale di sanità pubblica in costante aumento in diverse aree geografiche, Italia inclusa.

Nel corso degli ultimi 20 anni si è infatti osservato un notevole incremento della

prevalenza di vettori infetti, dell’incidenza delle patologie associate nell’uomo e di un

ampliamento delle aree endemiche. Secondo una valutazione promossa dall’ECDC

(European Centre for Disease Prevention and Control), i cambiamenti climatici e

ambientali, sotto forma di temperatura e umidità più elevate, favoriscono il diffondersi di

vettori e ospiti intermedi e in ultima analisi delle infezioni stesse. La comparsa e la rapida

diffusione di queste infezioni sono dovute anche all’aumento di viaggi a lunga distanza e

alla globalizzazione del commercio. In particolare, in Europa e in Italia, si è assistito al

progressivo aumento di casi importati ed autoctoni di alcune malattie virali di origine

tropicale trasmesse da zanzare oggi molto diffuse anche in questi territori.

Per una corretta identificazione degli Arbovirus occorrono più metodiche, sia sierologiche

che molecolari. La diagnosi sierologica di queste infezioni si basa principalmente su

tecniche immuno-enzimatiche. Questi saggi talvolta possono dare problemi di reattività

crociata tra i membri della famiglia Flavivirus. Questo fenomeno avviene perché nella

risposta immunitaria vengono prodotte immunoglobuline specifiche, principalmente dirette

verso la proteina E che contiene determinanti antigenici comuni a tutti i Flavivirus. Per

ovviare questo problema che talvolta si verifica con le attuali metodiche, si rende

necessario introdurre nuovi metodi come il test di riduzione di neutralizzazione delle

placche (PRNT).

Alla luce di quanto detto, questo progetto di ricerca si propone di monitorare e migliorare i

sistemi di sorveglianza delle arbovirosi nella regione Friuli Venezia Giulia, mediante:

∗ determinazione del potenziale epidemico di TBEV nei vettori (zecca I. ricinus),

verificando nel tempo la frequenza dell’infezione, la sua distribuzione e le

caratteristiche dei ceppi presenti nell’area di studio;

Scopo

98

∗ monitoraggio delle infezioni da TBE e West Nile virus in campioni di pazienti con

encefalite e/o meningite;

∗ monitoraggio delle infezioni da Dengue e Chikungunya virus in pazienti con

patologia febbrile in rientro da viaggi in aree endemiche;

∗ miglioramento e ottimizzazione delle metodiche esistenti e introduzione di nuovi

test sia per garantire un’identificazione più sensibile e specifica delle arbovirosi

(test di riduzione di neutralizzazione delle placche, PRNT), sia per ridurre i tempi

di screening;

∗ ricerca di nuovi bersagli per il sequenziamento (caratterizzazione molecolare) per

determinare e monitorare la distribuzione dei ceppi virali circolanti nel territorio e

per ampliare le conoscenze riguardo l’epidemiologia di tali virus.

99

3. MATERIALI E METODI

3.1. IDENTIFICAZIONE DEL TBEV NEI VETTORI

Il flusso di lavoro seguito nell’analisi di ciascun campione è stato il seguente:

� raccolta delle zecche e campionamento;

� suddivisione in pool e omogeneizzazione;

� estrazione degli acidi nucleici;

� controllo di estrazione (gene 16S);

� indagini molecolari;

� sequenziamento e analisi filogenetica;

� colture cellulari.

I campioni risultati positivi in real-time RT-PCR sono stati ulteriormente testati mediante

sequenziamento del gene NS5 e del gene E per la genotipizzazione e la successiva

costruzione di alberi filogenetici. Inoltre sono stati condotti tentativi di isolamento in

colture cellulari Vero E6, eseguite in laboratorio di biosicurezza BSL-3.

Tutte le analisi mediante real-time RT-PCR sono state condotte con lo strumento LC480 II

(Roche Italia, Monza, Italia).

3.1.1. RACCOLTA DELLE ZECCHE E CAMPIONAMENTO

Metodo di raccolta di Ixodes ricinus

Il campionamento delle zecche è stato eseguito da ricercatori del Dipartimento di Biologia

e Protezione delle Piante dell’Università degli Studi di Udine. Il metodo impiegato è

denominato dragging sample (trascinamento) o flagging o metodo della coperta strisciata,

che consiste nel raccogliere le zecche allo stato libero trascinando lentamente un telo di

pile bianco (1m2 ) con delle aste, su una superficie di terreno di 100m2; le zecche che si

trovano attaccate vengono prelevate con delle pinzette e conservate all’interno di una

provetta. Il metodo si basa sul caratteristico comportamento (ambushing) di molti Ixodidi,

tra cui anche I. ricinus, che attendono appostati sull’erba o sui cespugli, il passaggio di un

Materiali e metodi

100

potenziale ospite su cui attaccarsi.

Allo scopo di seguire la dinamica stagionale delle popolazioni di zecche e determinarne

l’abbondanza nei vari ambienti, sono stati eseguiti due tipi di campionamento:

- campionamento mensile: effettuato ogni 30 giorni circa dall’inizio della primavera

all’autunno inoltrato, solo in alcuni siti rappresentativi, sia in ecotoni che in boschi;

- campionamento di massa: in concomitanza con i picchi di attività primaverile e autunnale

delle zecche, in tutti i siti, su una superficie di alcune centinaia di metri quadrati, sia in

ecotoni che in boschi. Per ecotoni si intendono prati dove non vengono eseguiti sfalci

periodici; si presentano con erbe alte e arbusti; al suolo c’è uno spesso strato di

vegetazione; sono normalmente adiacenti a boschi.

Gli esemplari raccolti sono stati catalogati per stadio maturativo (adulto o ninfa), sesso (se

l’individuo è adulto), sito di prelievo (Tabella 8) e tipologia del territorio (B=bosco,

E=ecotono, X=non specificato). Ad ogni singolo acaro è stato attribuito un codice univoco

composto da quattro cifre: la prima corrispondente alla data di raccolta, la seconda alla

sede, la terza allo stadio e l’ultima al numero di zecche contenute nella provetta. Le

provette sono state conservate a -80°C fino al momento dell’analisi.

Campionamento periodico delle zecche e area di studio

Il Friuli Venezia Giulia è una regione estremamente eterogenea dal punto di vista

geografico, climatico e della distribuzione della vegetazione; infatti ciascuna delle aree

campionate può essere collocata all’interno di una specifica area geoclimatica (Tabella 7 e

Figura 47).

Sono state identificate 7 zone:

1. Zona alpina, che comprende la Carnia Occidentale e Centro-Orientale

2. Zona prealpina, che comprende le Prealpi Carniche e le Prealpi Giulie

3. Zona valliva, che comprende Canal del Ferro-Valcanale

4. Zona collinare, che prevede sia colline moreniche che eoceniche

5. Zona pianeggiante, che comprende alta e bassa pianura

6. Zona carsica

7. Zona lagunare, che racchiude il litorale

Materiali e metodi

101

CODICE ZONA SITI

CO Carnia Occidentale Forni di Sopra, Forni di Sotto

CC Carnia Centro-orientale Amaro, Ampezzo, Imponzo, Ovaro, Paluzza, Paularo,

Ravascletto, Rigolato, Socchieve, Val Apua

PC Prealpi Carniche Bordano, Claut, Clauzetto, Tramonti di Sopra,

Trasaghis

VC Valcanale Fusine, San Leopoldo, Tarvisio, Valbruna

CF Canal del Ferro Pontebba, Raccolana, Roveredo

PG Prealpi Giulie Gemona del Friuli, Lusevera, Montenars, Povici,

Pulfero, Taipana,

CM Colline Moreniche Pagnacco, Rive D’Arcano

CE Colline Eoceniche Buttrio, Cividale, Gorizia, Medea, Tarcento

AP Alta Pianura Flaibano, Martignacco, Polcenigo

BP Bassa Pianura Bertiolo, Chions, Muzzana

CG Carso Goriziano Doberdò del Lago, Redipuglia

LI Litorale Grado, Lignano

Tabella 7. Suddivisione delle aree geo-climatiche.

Figura 47. Rappresentazione delle stazioni di prelievo (numerate dall’1 al 52; vedi tabella 7) e loro raggruppamento in area geografica di appartenenza. [Per gentile concessione del Dip. di Biologia e

Protezione delle Piante dell’Università degli Studi di Udine].

Materiali e metodi

102

CODICE SITO CODICE SITO

1 MONTENARS 27 TRASAGHIS

2 OVARO 28 ARTEGNA

3 RACCOLANA 29 BERTIOLO

4 FORNI DI SOTTO 30 BUTTRIO

5 PONTEBBA 31 CHIONS

6 ROVEREDO 32 CIVIDALE

7 ENEMONZO 33 CLAUT

8 IMPONZO 34 CLAUZETTO

9 PAULARO 35 DOBERDÒ DEL LAGO

10 PALUZZA 36 FLAIBANO

11 AMARO 37 GORIZIA

12 VAL AUPA 38 GRADO

13 TARVISIO 39 LIGNANO

14 POVICI 40 LUSEVERA

15 TRAMONTI DI MEZZO 41 MARTIGNACCO

16 TRAMONTI DI SOPRA 42 MEDEA

17 TRAMONTI DI SOTTO 43 MUZZANA

18 GEMONA DEL FRIULI 44 PAGNACCO

19 FUSINE 45 POLCENIGO

20 ORIGNE 46 PULFERO

21 RAVASLETTO 47 REDIPUGLIA

22 RIGOLATO 48 RIVE D’ARCANO

23 AMPEZZO 49 TAIPANA

24 FORNI DI SOPRA 50 TARCENTO

25 BORDANO 51 VALBRUNA

26 SOCCHIEVE 52 SAN LEOPOLDO

Tabella 8. Elenco delle stazioni di campionamento nelle stagioni 2011-14.

Materiali e metodi

103

3.1.2. SUDDIVISIONE IN POOL E OMOGENEIZZAZIONE

Le zecche adulte sono state analizzate singolarmente, mentre le ninfe sono state

raggruppate in pool da 2 a 10 esemplari; questa scelta è stata determinata dai seguenti

fattori:

- numero notevolmente inferiore di adulti rispetto alle ninfe;

- le tecniche utilizzate sono caratterizzate da elevata sensibilità che può determinare false

positività che abbassano la predittività positiva dell’analisi.

L’omogeneizzazione è stata condotta sotto preparando per ogni ciclo 48 provette con:

∗ due biglie metalliche per l’omogeneizzazione;

∗ 500 µL di terreno di trasporto;

∗ 1 adulto oppure 2-10 ninfe prelevati con delle pinze di plastica sterili.

L’omogeneizzazione è stata condotta in laboratorio BSL3 con il dispositivo Tissue Liser

(QIAGEN), impostando i seguenti parametri:

∗ frequenza (1/s) � 300

∗ time (min/sec) � 30 minuti.

Le biglie metalliche, dopo l’utilizzo, sono state sottoposte a lavaggi di sterilizzazione con

una soluzione di ipoclorito 50% per 20/30 minuti, risciacquate in acqua ed infine

autoclavate.

L’omogenato è stato poi suddiviso in due aliquote:

1. una per l’estrazione e i test molecolari;

2. una per ulteriori indagini molecolari o per isolamento virale.

Tutte le aliquote sono state conservate a - 80°C.

3.1.3. ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI

L’estrazione degli acidi nucleici è stata effettuata mediante due metodiche:

1. estrazione manuale per i pool di zecche;

2. estrazione con estrattore automatico per surnatanti e campioni biologici umani.

Estrazione manuale

L’estrazione degli acidi nucleici è stata eseguita con il kit commerciale QIAamp® Viral

RNA Mini Kit Qiagen RNA Extraction (QIAGEN), seguendo il protocollo suggerito dalla

ditta. L’eluato (70 µL), contenente l’estratto, è stato utilizzato per le analisi molecolari

oppure conservato a -80°C se queste venivano effettuate in un secondo momento.

Materiali e metodi

104

Estrazione con estrattore automatico NucliSENS® easyMAG®

L’RNA è stato estratto mediante l’estrattore automatico NucliSENS® easyMAG®, della

ditta Biomerieux. Lo strumento esegue uno step di pre-lisi per favorire la rottura capsidica

e il rilascio degli acidi nucleici; successivamente attua cicli di adsorbimento ed eluizione

del DNA/RNA mediante microbeads di silice paramagnetica e buffer di estrazione. Tale

metodica è comparabile al protocollo dell’estrazione manuale con il kit QIAGEN.

Prima di procedere con l’estrazione i campioni sono stati pre-lisati con un tampone di lisi

impiegato dallo strumento (NucliSENS easyMAG Lysis Buffer, Biomerieux). Tale fase,

che rende inattivo il virus, viene necessariamente svolta nel laboratorio BSL-3 al fine di

garantire la sicurezza degli operatori. Al termine dell’estrazione gli acidi nucleici ottenuti

sono stati utilizzati per le analisi molecolari oppure conservato a -80°C se queste venivano

effettuate in un secondo momento.

3.1.4. CONTROLLO DI ESTRAZIONE

Il controllo dell’efficienza dell’estrazione e della valutazione della presenza di potenziali

inibitori della PCR è stato effettuato mediante l’amplificazione di una regione di 110 bp

dell’RNA ribosomiale 16S di Ixodes ricinus [Nilsson et al., 1999], mediante una real-time

RT-PCR con il kit Kapa Probe Fast Universal One-step qRT-PCR kit (Kapa Biosystems,

Inc. Wilmington, MA), seguendo le indicazioni di Shwaiger et al., 2003. Sono stati

impiegati i primer e la sonda Taqman (10 pmol/μL) e il profilo termico sotto elencati:

Primer e TaqMan probe (5’ → 3’) Posizione pb

F-16S Ixodes AAAAAAATACTCTAGGGATAACAGCGTAA 254-282

110 R-16S Ixodes ACCAAAAAAGAATCCTAATCCAACA 327-351

P-16S Ixodes 6FAM-TTTTGGATAGTTCATATAGATAAAATAGTTTGCGACCTCG -TAMRA

286-325

45 CICLI

95°C 95°C

5’ 5” + Cooling

60°C 40°C

35” 30”

42°C

5’

Materiali e metodi

105

3.1.5. INDAGINI MOLECOLARI

La ricerca delle sequenze genomiche del virus TBE sulla prima aliquota di omogenato è

stata effettuata mediante real-time RT-PCR, con il kit Kapa Probe Fast Universal One-step

qRT-PCR kit (Kapa Biosystems, Inc. Wilmington, MA). Il target di amplificazione è stato

identificato in una sequenza di 70 pb della regione 3’-non coding (3’ NCR) del genoma

virale altamente conservata tra i diversi ceppi appartenenti al sottotipo Europeo e a quello

FarEastern [Shwaiger et al., 2003]. Sono stati impiegati i primer e la sonda Taqman

(concentrazione di 10 pmol/μL) e il profilo termico sotto elencati:

Primer e TaqMan probe (5’ → 3’) Posizione pb F-TBE GGGCGGTTCTTGTTCTCC 11054-11071

70 pb R-TBE ACACATCACCTCCTTGTCAGACT 11099-11121 PROBE-TBE FAM-TGAGCCACCATCACCCAGACACA-TAMRA 11073-11095

45 CICLI

95°C 95°C

5’ 5” + Cooling

60°C 40°C

35” 30”

42°C

5’

Per la conferma della positività è stata utilizzata una seconda real-time diretta ad una

regione di 87 pb del gene E [Gaumann et al., 2010].

Le cariche virali sono state quantificate grazie alla creazione di una curva standard con un

plasmide di concentrazione a noi nota. Il plasmide è stato realizzato in collaborazione con

il gruppo di Virologia molecolare dell’ICGEB di Trieste.

Sono stati impiegati i primer e la sonda Taqman (concentrazione di 10 pmol/μL) e il profilo

termico sotto elencati:

Primer e TaqMan probe (5’ → 3’) Posizione pb TBEE-F6 GGCTTGTGAGGCAAAAAAGAA 1329-1349

87 pb TBEE-R2 TCCCGTGTGTGGTTCGACTT 1397-1416 TBEE-P4 FAM-AAGCCACAGGACATGTGTACGACGCC-BHQ1 1349-1374

Materiali e metodi

106

45 CICLI

95°C 95°C

5’ 5” + Cooling

60°C 40°C

35” 30”

42°C

5’

3.1.6. SEQUENZIAMENTO ED ANALISI FILOGENETICA

Per la caratterizzazione molecolare dei campioni risultati positivi allo screening per TBEV

e dei surnatanti ottenuti dalle colture cellulari sono state analizzate le seguenti regioni del

genoma del virus: una porzione del gene NS5, una in corrispondenza alla giunzione tra i

geni NS4 e NS5 (regione NS4/5) ed una regione parziale del gene codificante per la

glicoproteina E dell’envelope. I protocolli sono stati ottimizzati a partire da primer e

condizioni termiche descritti in letteratura [Puchhammer et al., 1995; Haglund et al., 2003;

Melik et al., 2007]. È stato seguito il flusso di lavoro sottostante:

a) PCR di sequenziamento;

b) purificazione della PCR;

c) PCR di marcatura;

d) purificazione della marcatura;

e) pequenziamento capillare, assemblaggio ed editing.

Tutte le reazioni di PCR end point (PCR tradizionali) sono state condotte con i

termociclatori GeneAmp® PCR System 9700 thermal cycler (Applied Biosystem - Life

Technologies).

La presenza degli amplificati è stata verificata su gel di agarosio all’1% previa aggiunta di

6X Loading Buffer (blu bromofenolo, xilene cianolo, glicerolo), utilizzando come peso

molecolare il DNA Molecular Weight Marker VIII (Roche).

La corsa elettroforetica è stata eseguita a voltaggio costante di 200 V, per circa 20 minuti,

usando come tampone di corsa TBE 1X. I gel sono stati poi colorati per 10 minuti in una

soluzione contenente un colorante fluorescente, Gel Red 10000X (Diatech).

Materiali e metodi

107

a) PCR DI SEQUENZIAMENTO

Amplificazione del gene NS5

È stata amplificata una regione di 252 bp del gene della polimerasi NS5, utilizzando una

RT-Nested PCR [Puchhammer et al., 1995; Jaakselainen et al., 2006]. Per la prima reazione

si è utilizzato il kit Ready-to-go RT-PCR Beads (GE Healthcare UK Limited, Little

Chalfont, UK) e i seguenti primer (10 pmol/μL) e profilo termico:

Primer (5’ → 3’) Posizione pb

FSM1 GAGGCTGAACAACTGCACGA 7687-7706 357

FSM2 GAACACGTCCATTCCTGATCT 8024-8044

35 cicli

94°C 94°C

10’ 30” 68° 68°

30” 5’ 55°C

30” 37°C

60’

4°

∞

Per il secondo step si è adoperato il kit Ready-to-go PCR Beads (GE Healthcare UK

Limited, Little Chalfont, UK) e i seguenti primer (10 pmol/μL) e profilo termico:


FSM1 interno ACGGAACGTGACAAGGCTAG 7748-7768 252

FSM2 interno GCTTGTTACCATCTT TGGAG 7980-7999

35 cicli

94°C 94°C

5’ 30” 68° 68°

30” 5’ 56°C

30”

4°

∞

Materiali e metodi

108

Amplificazione della regione NS4/5

Con una RT-PCR one step si è amplificata una regione dei geni NS4/5 di 1186 pb, con il kit

SuperScript™ III One-Step RT-PCR with Platinum Taq System (Invitrogen - Life

Technologies) e i seguenti primer (10 pmol/μL) e profilo termico [Kupca et al., 2010]:


TBE-7547 CTGACACGTTGTGGACGATG 7547-7567 1186

TBE-c8732 AACACTCTCTGCTGTCCGAAAG 8732-8710

35 cicli

94°C 94°C

10’ 30” 68° 68° 30” 5’ 60°C 30”

48°C 40’

4°

∞

Amplificazione del gene E

I campioni positivi sono stati anche testati per il gene che codifica per la glicoproteina E

dell’envelope, andando ad amplificare una regione di 1621 pb. In questo caso sono state

effettuate un’unica reazione di retro-trascrizione e quattro Nested PCR. Per il primo step si

è utilizzato il kit Ready-to-go RT-PCR Beads (GE Healthcare UK Limited, Little Chalfont,

UK) e i seguenti primer (10 pmol/μL) e profilo termico [Melik et al., 2007]:


ENV outF CGGGGAGGGGACACAAATGG 785-804 1775

ENV outR AGGCATAGTTGTCATACC 2543-2560

Materiali e metodi

109

35 cicli

94°C 94°C

10’ 30” 68° 68°

60” 5’ 55°C

30” 37°C

60’

4°

∞

Per il secondo step si sono amplificati quattro diversi frammenti del gene E con il kit

Ready-to-go PCR Beads (GE Healthcare UK Limited, Little Chalfont, UK), usando i

seguenti primer (10 pmol/μL) e profilo termico [Haglund et al., 2003]:

Frammento Primer Sequenza (5’ → 3’) pb

1 F-B1 CTTGCCTTGGCAATGGTTA

417 R-B2 CTACCCTTTCCAAACAGTCC

2 F-B3 TGCCCAACAATGGGACCAGC

465 R-B4 GTTCCAGTTTTGCGCTCCCT

3 F-B5 CTTGGCCCAGACCGTCATCCTT

447 R-B6 ATCCATGTGCCACTGCCCTG

4 F-B7 CTGCGAAGTGGGACTGGAAAAACTG

625 R-B8 TCGCCACAGCGGAGCTCCAT

35 cicli

94°C 94°C

5’ 30” 68° 68° 30” 5’ 54°C 30”

4°

∞

b) Purificazione della PCR

I prodotti di amplificazione ottenuti seguendo i protocolli precedentemente descritti, sono

stati purificati con il kit Microcon centrifugal filter Devices (MILLIPORE) con il seguente

protocollo:

Materiali e metodi

110

1. in ciascuna provetta da 1.5 mL è stata inserito una colonna con filtro fornito dal kit

e 460 μL di H2O;

2. sono stati aggiunti 40 μL di prodotto di PCR;

3. le provette sono state centrifugate a 14000 rcf per 10 minuti;

4. al termine, ogni colonnina con filtro è stata capovolta in una nuova provetta

contenente 20 μL di H2O;

5. le provette sono state centrifugate a 1000 rcf per 2 minuti;

6. al termine, ogni filtro è stato eliminato e il purificato è stato utilizzato per gli step

successivi.

I purificati presenti nell’eluato sono stati diluiti in modo opportuno a seconda dell’intensità

della banda visualizzata nell’elettroforesi e processati per la marcatura.

c) PCR di marcatura

Nella marcatura sono stati impiegati gli stessi primer utilizzati nell’amplificazione genica,

diluiti ad una concentrazione di 3.2 pmol/μL.

d) Purificazione della marcatura

I prodotti di marcatura sono stati purificati utilizzando il kit BigDye®X-Terminator™

(Applied Biosystems), che consiste in due soluzioni:

∗ X-terminator™ solution, in grado di rimuovere i terminatori (ddNTPs) non

incorporati evitando la formazione di dye blobs e di catturare sali e altre molecole

che potrebbero andare ad interferire nella corretta interpretazione dei segnali

fluorescenti durante il sequenziamento automatizzato;

∗ SAM™ solution, contiene un detergente che favorisce l’azione della prima

soluzione.

I campioni sono stati posti in agitazione per 30 minuti, a temperatura ambiente, e

successivamente centrifugati per 1 minuto, per favorire la precipitazione della resina sul

fondo della provetta.

e) Sequenziamento capillare, assemblaggio ed editing

Le sequenze dei campioni sono state caricate nel sequenziatore automatico ABI Prism

3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) a 4 capillari, analizzate utilizzando il

software SeqAnalisys ed assemblate con Sequencher v4.5 (Gene Codes Corporation).

Materiali e metodi

111

Le sequenze assemblate e sottoposte ad editing venivano quindi convertite in un file di

testo, formato FASTA, per poter essere analizzate nel programma BLAST disponibile on

line (http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e successivamente confrontate con

quelle presenti in GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

3.1.7. ANALISI FILOGENETICA

L’analisi filogenetica permette di seguire l’evoluzione di organismi che mutano

rapidamente, come i virus, poiché consente di confrontare specifiche sequenze genomiche

o proteiche appartenenti a specie diverse. Grazie a tale analisi, è possibile definire i

rapporti evolutivi e stabilire se esiste un antenato comune. L’analisi filogenetica è stata

eseguita con il software Mega 6 che utilizza l’algoritmo ClustalX per l’allineamento

multiplo e il metodo Neighbor-Joining per la costruzione degli alberi filogenetici.

3.1.8. COLTURE CELLULARI

I campioni positivi con una carica virale adeguata (>100 cp/ μL) sono stati sottoposti alla

ricerca del virus mediante isolamento su colture cellulari. L’isolamento del TBEV è stato

condotto in laboratorio di sicurezza BSL-3 con un protocollo messo a punto dall’UCO

Igiene che utilizza la linea cellulare Vero clone E6, suscettibile agli Arbovirus, derivata da

cellule di rene di scimmia verde africana (African green monkey kidney).

Per l’isolamento del TBEV si sono seguiti i seguenti passaggi:

� allestimento della linea cellulare;

� semina dei campioni positivi;

� estrazione degli acidi nucleici da surnatante;

� analisi molecolari;

� sequenziamento.

Allestimento della linea cellulare

Per effettuare l’isolamento virale si è adoperata la linea cellulare Vero clone E6,

suscettibile agli Arbovirus, con morfologia simile ai fibroblasti e cariotipo 2n.

Le Vero E6 sono state coltivate in terreno di crescita Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

(D-MEM, SIGMA-Aldrich), arricchito con 10% di siero fetale bovino (FCS, SIGMA-

Aldrich) e soluzione di L-Glutamina 200 mM (SIGMA-Aldrich). Lo stesso terreno con una

Materiali e metodi

112

ridotta concentrazione di FCS (2%) e l’aggiunta di soluzione antibiotica e antimicotica

100X (SIGMA-Aldrich) all’1%, è stato impiegato come mezzo di mantenimento.

Semina dei campioni positivi e successive analisi

Per effettuare l’isolamento virale si è utilizzata la seconda aliquota di 300 μL conservata a -

80°C e mai scongelata:

- 200 μL di omogenato sono stati incubati con una miscela di antibiotici/antimicotici

(Antibiotic Antimycotic Solution; Gentamicin Solution, SIGMA-Aldrich) per

evitare contaminazioni da batteri e miceti. Successivamente i campioni sono stati

seminati su Trac Bottles con Vero E6, centrifugati per 1 ora a 1500g (rcf) ed

incubati a 37°C in atmosfera di CO2 al 5%.

- 100 μL di omogenato sono stati messi in estrazione seguendo il protocollo già

descritto (paragrafo 3.1.3) per verificare la presenza del virus.

Le cellule inoculate sono state quotidianamente osservate al microscopio per la ricerca

dell’effetto citopatico (CPE), tipico dell’infezione da TBE virus, che consiste nella

formazione di sincizi e cellule giganti multinucleate.

I surnatanti delle colture, prelevati dopo 3, 6, 10, 20 e 28 giorni, sono stati analizzati per la

ricerca del genoma virale mediante amplificazione genica in tempo reale per 3’NCR ed

env, previa estrazione degli acidi nucleici mediante estrazione semi-automatica (da 200 µL

in 110 µL). I surnatanti positivi alla real-time RT-PCR sono stati sottoposti ad analisi

genica per la regione NS4/5 e gene E e successivamente sequenziati con i protocolli

precedentemente descritti.

3.1.9. ANALISI STATISTICA

La prevalenza di TBEV nei pool di zecche è stata calcolata utilizzando EpiTools

epidemiological calculators della AusVet Animal Health Services and Australian

Biosecurity Cooperative Research Centre for Emerging Infectious Disease

[http://epitools.ausvet.com.au/content.php?page=home].

Materiali e metodi

113

3.2. IDENTIFICAZIONE DEL TBEV IN CAMPIONI UMANI

Sono stati raccolti campioni biologici di siero, sangue intero, liquido cerebrospinale (CSF)

ed urine di soggetti con sintomatologia neurologica.

I campioni sono stati estratti con lo strumento NucliSENS® easyMAG® (Biomerieux). I

campioni di sangue (100 µL) sono stati pre-lisati con con 900 µL dello stesso tampone di

lisi impiegato dallo strumento ed eluiti in volume di finale di 50 µL; i campioni di CSF

sono stati eluiti in 110 µL partendo da un volume di 500 µL, mentre i campioni di urine

sono stati estratti in 50 µL partendo da un volume di 500 µL.

Sangue, liquor ed urine sono invece stati analizzati con tecniche molecolari: due real-time

RT-PCR dirette alla regione 3’NCR e al gene E con lo strumento LC480 II (Roche Italia,

Monza, Italia).

I campioni positivi sono stati inoltre sequenziati ed isolati su colture cellulari di Vero E6.

Nel siero e nel CSF si sono cercati anticorpi IgM e IgG specifici mediante test ELISA. Le

letture dell’assorbanza sono state eseguite con lo strumento GloMax® (Promega, Italia).

3.2.1. DIAGNOSI SIEROLOGICA

Ricerca di anticorpi IgM ed IgG nel siero

La rilevazione qualitativa/quantitativa degli anticorpi IgG ed IgM specifici contro il virus

TBE nel siero o nel plasma umani è stata condotta con il kit Enzygnost® Anti-TBE Virus

(Siemens) seguendo le indicazioni fornite dalla ditta.

Dopo aver calcolato il cut-off aggiungendo 0.200 al valore dell’assorbanza del riferimento

N/N (controllo negativo), si sono confrontati i valori di assorbanza dei vari campioni: se

l’assorbanza superava il valore dato da cut-off + 0.100 i campioni sono stati considerati

positivi; sono poi stati calcolati gli indici: se l’indice superava il valore 1.4 allora il

campione era positivo.

Ricerca di anticorpi IgM nel CSF

Le indagini condotte sul liquido cerebrospinale (CSF) hanno un valore diagnostico

decisivo nei processi infiammatori acuti o cronici del sistema nervoso centrale: infatti, in

presenza di un’infezione del sistema nervoso centrale, gli anticorpi patogeno-specifici si

accumulano nel CSF. Per la rilevazione quantitativa di anticorpi IgM nel CSF di pazienti

con TBE si è utilizzato un test immunoenzimatico (ELISA) con il kit commerciale CSF:

Anti-TBE Virus ELISA (EUROIMMUN), specifico per IgM, seguendo il protocollo

Materiali e metodi

114

fornito dalla ditta.

Test di avidità

L’avidità di un anticorpo nei confronti di un antigene esprime la capacità che ha l’anticorpo

stesso di formare legami stabili con l’antigene. Il sistema immunitario reagisce

all’infezione formando prima anticorpi a bassa-avidità, col perdurare dell’infezione le IgG

si adattano all’antigene e l’avidità aumenta.

Per determinare l’avidità degli anticorpi anti TBE Virus (IgG) è stato utilizzato il test

ELISA, AVIDITY determination of antibodies against TBE Virus ELISA (IgG) della ditta

EUROIMMUN, seguendo il protocollo allegato.

L’avidità delle IgG con test ELISA si ottiene confrontando le densità ottiche ottenute con e

senza lavaggio del campione con soluzioni dissocianti di urea. La presenza di anticorpi a

bassa avidità viene quindi dimostrata se la densità ottica è ridotta dal trattamento con urea.

L’indice relativo di avidità (RAI) viene calcolato ed espresso in percentuale usando i valori

con e senza trattamento con urea, con la seguente formula:

RAI = Valore con trattamento urea * 100 / Valore senza trattamento urea

Se l’indice RAI è minore del 40%, significa che gli anticorpi sono a bassa avidità e

coincide con un’infezione acquisita negli ultimi due-tre mesi; se è compreso tra il 40 e

60% il risultato è dubbio; se è maggiore del 60%, gli anticorpi hanno invece alta avidità e

quindi l’infezione è in uno stato tardivo.

3.2.2. DIAGNOSI MOLECOLARE

Per la ricerca dell’RNA del TBEV nei campioni clinici si è adoperata una real-time RT-

PCR diretta alla regione 3’NCR e una real-time RT-PCR di conferma diretta al gene E.

Entrambe le metodiche sono state precedentemente descritte al paragrafo 3.1.3.

3.2.3. GENOTIPIZZAZIONE DEI CAMPIONI POSITIVI

Il TBEV è stato sequenziato per una regione del gene env e una di NS4/5. I protocolli sono

stati illustrati al paragrafo 3.1.6.

Materiali e metodi

115

3.2.4. ISOLAMENTO VIRALE

Si è inoltre isolato il virus su colture cellulari di Vero E6 e la carica virale è stata

monitorata in Real-Time RT-PCR.

Dopo aver preparato le trac bottles come già descritto (paragrafo 3.1.8), i campioni di

urina sono stati trattati con la soluzione antibiotico/antimicotico 100X e aggiunti allo

strato di cellule confluenti. Le provette sono state centrifugate a 3000 g per 60 minuti e

incubate a 35°C per 1 ora. Dopo aver sostituito il terreno, le colture sono state lasciate

incubare per una settimana a 35°C e giornalmente sono state osservate al microscopio per

verificare l’effetto citopatico. I surnatanti sono stati prelevati e testati per la presenza del

genoma virale mediante real-time RT-PCR per la regione 3’NCR, previa estrazione degli

acidi nucleici.

3.2.5. TEST DI RIDUZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE DELLE PLACCHE

Per confermare le positività di TBEV si è utilizzata la metodica delle placche messa a

punto durante il secondo anno di dottorato. Il test di neutralizzazione di riduzione delle

placche (Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT) è utile per rilevare gli anticorpi

neutralizzanti, incrementare la sensibilità e la specificità ovviando il problema della cross-

reattività degli anticorpi tra i diversi Flavivirus. Precedentemente il TBEV è stato titolato

mediante test delle placche. Il ceppo utilizzato appartiene al sottotipo europeo, isolato da

un pool di zecche raccolte a Raccolana durante la stagione 2011 (TP165/2011).

Titolazione virale

Il ceppo scelto per la metodica PRNT è stato messo in coltura. I surnatanti sono stati

prelevati ogni 3-4 giorni e sottoposti a real-time RT-PCR per verificare la positività e la

concentrazione. Raggiunta una carica virale elevata, i surnatanti sono stati raccolti e

stoccatti in crio vials e conservati a -80°C; si sono piastrate le cellule VERO in una 12

well-plate. Il giorno successivo un’aliquota di surnatante è stata scongelata e si è poi

passati ad eseguire la metodica delle placche per la titolazione virale secondo il seguente

protocollo:

1. sono state preparate diluizioni 10-fold col virus in DMEM w/o FBS (100 μL di

virus + 900 μL di DMEM);

2. dopo aver rimosso il terreno dalle cellule, sono stati aggiunti in doppio 200 μL di

diluizione (partendo da 1E-03); è stato messo anche un controllo negativo (solo

terreno DMEM). Le piastre sono state incubate 1h a 37°C e al 5% di CO2;

Materiali e metodi

116

3. dopo aver rimosso il terreno, sono stati aggiunti 1 mL di 6%CMC/DMEM4%FBS;

si sono incubate le piastre a 37°C e al 5% di CO2 per 5 giorni fino alla formazione

delle placche,;

4. dopo 5 giorni sono stati aggiunti 1 mL di PBS per diluire CMC (1:1);

5. dopo aver aspirato, si è aggiunta 1 mL di colorante crystal violetto e si sono lasciate

incubare le piastre per 30’ a TA;

6. sono stati effettuati vari lavaggi con H2O (almeno 3) finché le placche non erano

ben visibili;

7. una volta asciugate le piastre, si è infine passati a determinare il titolo del virus

contando il numero di placche prodotte da ogni diluizione.

Test PRNT

Si sono piastrate le cellule VERO in una 12 well-plate. Prima di procedere, i sieri sono stati

inattivati, per bloccare l’attività del complemento; questo processo è stato eseguito

riscaldando per 30 minuti il siero alla temperatura di 56°C. Il protocollo ha previsto poi i

seguenti passaggi:

1. si sono diluiti i sieri utilizzando come il terreno DMEM w/o FBS (diluizioni 1:5,

1:10 e 1:40);

2. ad ogni diluizione è stata aggiunta la stessa quantità di virus (ceppo aliquotato e

conservato a -80°C); il virus è stato aggiunto anche ad una quantità di DMEM

come controllo; le diluizioni siero-virus e il controllo DMEM-virus sono stati

lasciati incubare 1-2 h a 37°C;

3. dopo aver rimosso il terreno dalle cellule, sono stati inoculati 200 μL delle

diluizioni siero-virus e del controllo DMEM-virus (in doppio); le piastre sono state

incubate 1-2 h a 37°C e al 5% di CO2 ;

4. dopo aver rimosso il terreno, sono stati aggiunti 1 mL di 6%CMC/DMEM4%FBS;

si sono incubate le piastre per 5 giorni a 37°C e al 5% di CO2 fino alla formazione

delle placche;

5. trascorsi i 5 giorni, sono stati aggiunti 1 mL di PBS per diluire CMC (1:1);

6. dopo aver aspirato, si è aggiunto 1mL di colorante crystal violetto e si sono lasciate

incubare le piastre per 30’ a TA;

7. sono stati effettuati vari lavaggi con H2O (almeno 3) finché le placche non erano

ben visibili;

8. una volta asciugate le piastre, si è infine passati a determinare il valore di riduzione

Materiali e metodi

117

di neutralizzazione delle placche.

L’attività neutralizzante del siero è stata determinata dalla sua abilità di ridurre il numero di

placche virali rispetto a quelle contate nel pozzetto con il controllo con virus-diluent.

3.2.6. CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITÀ

I campioni di sangue-EDTA sono stati centrifugati in gradiente di densità mediante Ficoll

per verificare in quale frazione cellulare era presente il TBE virus.

I campioni sono stati trattati con 6%Destrano (1:5) e lasciati sedimentare per 20 minuti a

temperatura ambiente. Sono stati centrifugati (400 g per 5 minuti a 6°C) e lavati prima in

cloruro di ammonio allo 0.9% per l’emolisi degli eritrociti, successivamente con PBS

(phosphate buffered saline). Si sono prelevate le cellule polimorfo nucleate (PMNC). A 5

mL di sangue-EDTA si sono aggiunti 10 mL di Lymphoprep® e si è centrifugato a 400 g

per 30 minuti. Dalla stratificazione si sono così ottenute le cellule mononucleate del sangue

periferico (PBMC) che sono state raccolte e lavate con PBS. Dopo la centrifuga e la

rimozione della frazione di PBMC, dal pellet si sono poi ottenuti i globuli rossi (RBC). Lo

strato superficiale è stato eliminato e gli RBC, sul fondo della provetta, sono stati raccolti e

diluiti 1:2 con PBS.

A questo punto 100 µL di ogni popolazione cellulare sono stati sottoposti ad estrazione

degli acidi nucleici (con estrattore automatico) e successivamente analizzata in real-time

RT-PCR diretta alla regione 3’NCR del TBEV.

3.3. IDENTIFICAZIONE DEL WEST NILE VIRUS

Sono stati raccolti campioni biologici di siero, sangue intero, liquido cerebrospinale ed

urine di soggetti con sintomatologia neurologica.

I campioni sono stati estratti con lo strumento NucliSENS® easyMAG® (Biomerieux). I

campioni di sangue (100 µL) sono stati pre-lisati con con 900 µL dello stesso tampone di

lisi impiegato dallo strumento ed eluiti in volume di finale di 50 µL; i campioni di CSF

sono stati eluiti in 110 µL partendo da un volume di 500 µL, mentre i campioni di urine

sono stati estratti in 50 µL partendo da un volume di 500 µL.

Sangue, liquor ed urine sono invece stati analizzati con tecniche molecolari con lo

strumento LC480 II (Roche Italia, Monza, Italia).

I campioni positivi sono stati inoltre sequenziati ed isolati su colture cellulari di Vero E6.

Materiali e metodi

118

Nel siero e nel CSF si sono cercati anticorpi IgM e IgG specifici mediante test ELISA. Le

letture dell’assorbanza sono state eseguite con lo strumento GloMax® (Promega, Italia).


Ricerca di anticorpi IgM ed IgG nel siero

Per la ricerca degli anticorpi di classe IgM è stato utilizzato il kit WN-IgM (FOCUS

Diagnostic, DxSelecttm) e per quella degli anticorpi di classe IgG il kit WN-IgG (FOCUS

Diagnostic, DxSelecttm). Si sono seguiti i protocolli forniti dalla ditta.

Per calcolare i valori, è stata divisa la densità ottica rilevata del campione per la media dei

valori di assorbanza del cut-off (indice). I campioni sono considerati positivi per un indice

di IgM maggiore di 1.10 e di 1.50 per le IgG.

Da settembre 2015, la diagnosi sierologica è stata effettuata con il kit Anti-WNV ELISA

IgG/IgM (EUROIMMUN), per ottimizzare i tempi di esecuzione del test. Per valutare la

sensibilità del nuovo kit si sono testati alcuni campioni già analizzati in precedenza per

garantire la riproducibilità delle analisi. I valori ottenuti sono risultati sovrapponibili.

I nuovi parametri per valutare la positività dei campioni variano in base alla classe di

anticorpo esaminata: l’assorbanza delle IgM del controllo o dei campioni è stata divisa per

l’assorbanza del calibratore (utilizzato come cut-off); per le IgG, come cut-off si è

utilizzato il calibratore 2. In entrambi i casi, l’indice maggiore di 1.10 indica positività.

Test di avidità

I campioni in cui si sono riscontrate le IgG positive sono stati poi sottoposti al test di

avidità, per stabilire se l’infezione era più o meno recente. Il kit utilizzato è AVIDITY

determination of antibodies against WN Virus ELISA (EUROIMMUN), seguendo il

protocollo fornito dalla ditta. I valori dell’indice RAI si calcolano come per il kit del TBE.


Per la ricerca del WNV si sono utilizzate una real-time RT-PCR home made, specifica per i

Lineage 1 e 2, e due kit commerciali in grado di rilevare e quantificare l’RNA. Si tratta di

saggi molto sensibili e specifici che consentono di riscontrare tutti i vari Lineage del WNV

circolanti in Italia e nelle zone limitrofe. La riproducibilità dei risultati ottenuti dalle varie

Materiali e metodi

119

metodiche è stata verificata testando i pannelli per proficiency test QCMD 2011-2013-

2014-2015 West Nile Virus (RNA) EQA Programme (Qnostics Ltd, Regno Unito). Ogni 1-

2 anni, infatti, vengono inviati presso il nostro laboratorio controlli di qualità, denominati

Quality Control for Molecular Diagnostics (QCMD), per il miglioramento della qualità

della diagnostica molecolare.

Real-time RT-PCR home made

La presenza del WNV è stata rilevata mediante real-time RT-PCR diretta ad una zona

altamente conservata del genoma del WNV del Lineage 1 e 2, in prossimità della regione

5’ NCR e del gene della proteina C. È stato usato il kit Kapa Probe Fast Universal One-step

qRT-PCR kit (Kapa Biosystems, Inc. Wilmington, MA), seguendo le indicazioni di Linke

et al. (2007). Primer, sonda TaqMan e profilo termico vengono riportati qui di seguito:

Primer/TaqMan probe (5’ → 3’) Posizione pb

ProC-F CCTGTGTGAGCTGACAAACTTAGT 10-33

144 ProC-R GCGTTTTAGCATATTGACAGCC 132-153

ProC-Probe 6FAM-CCTGGTTTCTTAGACATCGAGATCT-TAMRA 89-113

45 CICLI

95°C 95°C

5’ 5’’

+ Cooling

60°C 40°C

35” 30”

42°C

25’

Real-time con kit commerciale LightMix® Kit West Nile Virus (Roche)

La retrotrascrizione è stata eseguita con il kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis

(Roche) seguendo le indicazioni fornite dalla ditta.

La real-time PCR è stata eseguita amplificando un frammento di 111 pb del gene NS5 del

genoma del WNV con il kit commerciale LightMix® Kit West Nile Virus (Roche),

seguendo le indicazioni fornite dalla ditta. Il kit prevedeva anche una reazione di controllo

e quattro standard a concentrazione nota per permettere la quantificazione.

Il profilo termico viene riportato qui di seguito:

Materiali e metodi

120

50 CICLI

95°C 95°C

10’ 5”

72°C + Cooling

15”

62°C 40°C

5” 30”

Real-time con kit commerciale ELITe MGB® (ELITechGroup)

Da luglio 2015 è stato sostituito il kit commerciale in uso con il kit West Nile Virus ELITe

MGB® (ELITechGroup). Questo cambiamento è stato effettuato per ottimizzare i tempi di

esecuzione del test e minimizzare le contaminazioni. La riproducibilità delle metodiche è

stata garantita testando i controlli QCMD come già descritto sopra. Anche questo test

amplifica una regione del gene NS5 del genoma del WNV e utilizza quattro standard a

concentrazione nota per permettere la quantificazione. Sono state seguite le indicazioni

fornite dalla ditta sia per la preparazione dei reagenti che per il profilo termico sotto

indicato.

45 CICLI

94°C 94°C

5’ 10”

72°C + Cooling

20”

60°C 40°C

30” 30” 50°C

20’


La caratterizzazione molecolare è stata ottimizzata a partire da lavori presenti in letteratura

[Vinayagamoorthy et al., 2005]. È stata amplificata una regione di 250 pb della proteina C

del Capside (Anchored Core Protein) con il kit SuperScript III One-Step RT-PCR system

with Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen). I primer (10 pmol/μL) e il profilo termico

utilizzati sono i seguenti:

Materiali e metodi

121


WNV1F GCCGGGCTGTCAATATGCTAAAA 10-33 250

WNV1R GCACTGGTCAAGGTCCCTAGTTC 132-153

40 CICLI

94°C 94°C

15’ 15”

68°C 68°C

30” 5’

59°C

30”

48°C

30’

4°C

∞

La regione di amplificazione è stata poi ampliata a 513 pb (arrivando a coprire anche una

porzione del gene E) utilizzando una nuova combinazione di primer [Lanciotti et al., 2002;

Vinayagamoorthy et al., 2005]. Si è utilizzato il kit SuperScript III One-Step RT-PCR

system with Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen). I primer (10 pmol/μL) e il profilo

termico utilizzati sono i seguenti:


WNV1F GCCGGGCTGTCAATATGCTAAAA 10-33 513

WNV640R CAGCCGACAGCACTGGACATTCATA 615-640

40 CICLI

94°C 94°C

15’ 15”

68°C 68°C

30” 5’

56°C

30”

48°C

30’

4°C

∞

Materiali e metodi

122

Per il sequenziamento e l’analisi filogenetica si è proceduto come già descritto al paragrafo

3.1.6.

3.3.4. ISOLAMENTO VIRALE

L’isolamento virale su campioni di urina è stato eseguito in maniera analoga a quello del

TBEV (paragrafo 3.2.4.).

3.3.5. TEST DI RIDUZIONE DI NEUTRALIZZAZIONE DELLE PLACCHE

Per confermare le positività di WNV, si è utilizzata la metodica delle placche messa a

punto durante il secondo anno di dottorato; si è titolato il virus mediante test delle placche.

Il ceppo utilizzato appartiene al Lineage 1. Il protocollo osservato è analogo a quello per il

test PRNT per il TBEV (descritto al paragrafo 3.2.5.); l’unica variante è il tempo di

incubazione per la formazione delle placche: il WNV impiega solo 3 giorni, mentre il

TBEV, come abbiamo visto, 5 giorni.

3.4. IDENTIFICAZIONE DEL DENGUE VIRUS

Sono stati raccolti campioni biologici di siero e sangue di soggetti con sintomatologia

febrile rientrati da aree endemiche per Dengue virus.

100 µL di sangue-EDTA o di siero sono stati estratti con l’estrattore automatico, dopo

trattamento con tampone di lisi ed eluiti in volume di finale di 50 µL. L’indagine

molecolare è stata eseguita con lo strumento LC480 II (Roche Italia, Monza, Italia).

I campioni positivi sono stati genotipizzati.

Gli anticorpi specifici sono stati ricercati su siero mediante immunofluorescenza indiretta.


La determinazione degli anticorpi nel siero o nel plasma umano è stata eseguita mediante

immunofluorescenza indiretta con il kit Mosaico: Dengue virus tipo 1-4 (EUROIMMUN),

seguendo il protocollo fornito dalla ditta. Questo kit fornisce dei vetrini commerciali a

mosaico che permettono di rilevare gli anticorpi diretti contro tutti e quattro i sierotipi del

DENV. Nei casi di positività si è osservato un pattern di fluorescenza nell’area del

Materiali e metodi

123

citoplasma delle cellule infettate.

I quattro diversi sierotipi del DENV sono morfologicamente e immunologicamente simili,

pertanto sono prevedibili eventuali cross-reazioni. Tuttavia, si può distinguere i sierotipi

comparando i diversi titoli anticorpali.


L’analisi per la presenza dell’RNA del Dengue virus nei campioni clinici di sangue intero

e/siero è stata eseguita mediante real-time RT-PCR, con il kit Kapa Probe Fast Universal

One-step qRT-PCR kit (Kapa Biosystems, Inc. Wilmington, MA).

A seconda del sierotipo, sono state usate diverse coppie di primer della regione 3’ NCR:

una per i sierotipi da DENV1 a DENV-3) e una per DENV4 [Drosten et al., 2002; Azhar et

al., 2010]. I primer (10 pmol/μL) e il profilo termico utilizzati sono i seguenti:


DENV1-3

DenS2 GGATAGACCAGAGATCCTGCTGT 10615-10636

79 DenAS1-3 CATTCCATTTTCTGGCGTTC 10675-10694

DenP1-3 6FAM-CAGCATCATTCCAGGCACAG-TAMRA 10656-10675

DENV4

DenS2 GGATAGACCAGAGATCCTGCTGT 10615-10636

DenAS4 CAATCCATCCATCTTGCGGCGCTC 10671-10694 83

DenP4 6FAM-CAGCATCATTCCAGGCACAG-TAMRA 10656-10675

45 CICLI

95°C 95°C

5’ 5’’

+ Cooling

60°C 40°C

35” 30”

42°C

10’


Per determinare il sottotipo di DENV è stato amplificato un frammento di 511 pb del gene

E [Lanciotti et al., 1992], con il kit SuperScript™ III One-Step RT-PCR with Platinum Taq

Materiali e metodi

124

System (Invitrogen - Life technologies). I primer (10 pmol/μL) e il profilo termico

utilizzati sono i seguenti:


D1 TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG 134-161 511

D2 TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC 616-644

40 cicli

94°C 94°C

2’ 30” 68° 68°

30” 5’ 60°C

30” 48°C

30’

4°

∞

Per il sequenziamento e la successiva analisi filogenetica si è proceduto come già descritto

al paragrafo 3.1.6.

3.5. IDENTIFICAZIONE DEL CHIKUNGUNYA VIRUS

Sono stati raccolti campioni biologici di siero e sangue di soggetti con sintomatologia

febrile rientrati da aree endemiche per Chikungunya virus.

100 µL di sangue-EDTA o di siero sono stati estratti con l’estrattore automatico, dopo

trattamento con tampone di lisi ed eluiti in volume di finale di 50 µL. L’indagine

molecolare è stata eseguita con lo strumento LC480 II (Roche Italia, Monza, Italia).

Gli anticorpi specifici sono stati ricercati su siero mediante immunofluorescenza indiretta.


La determinazione degli anticorpi nel siero o nel plasma umano è stata eseguita mediante

immunofluorescenza indiretta con il kit Anti-Chikungunya IFA (EUROIMMUN),

Materiali e metodi

125

seguendo il protocollo fornito dalla ditta. Nei casi di positività si è osservato un pattern di

fluorescenza nell’area del citoplasma delle cellule infettate.


L’analisi per la presenza dell’RNA del CHIKV nei campioni di sangue intero o siero è stata

eseguita mediante real-time RT-PCR, con lo strumento LC480 II (Roche Italia, Monza,

Italia) e con il kit Kapa Probe Fast Universal One-step qRT-PCR kit (Kapa Biosystems,

Inc. Wilmington, MA).

Sono state utilizzate due coppie di primer: una per individuare una regione di 82 pb del

gene nsp2 del genotipo universale, l’altra per identificare un frammento di 77 pb genotipo

Indian Ocean, sempre del gene nsp2 [Panning et al., 2008]. I primer (10 pmol/μL) e il

profilo termico utilizzati sono i seguenti:


ChikSI TGATCCCGACTCAACCATCCT 241-261

82 ChikASI GGCAAACGCAGTGGTACTTCCT 323-302

ChikP 6FAM-TCCGACATCATCCTCCTTGCTGGC-BHQ1 300-277

ChikSII CCGACTCAACCATCCTGGAT 246-265

ChikASII GGCAGACGCAGTGGTACTTCCT 323-302 77

ChikP 6FAM-TCCGACATCATCCTCCTTGCTGGC-BHQ1 300-277

45 CICLI

95°C 95°C

5’ 5’’

+ Cooling

60°C 40°C

35” 30”

42°C

10’

Materiali e metodi

126

3.6. REAL-TIME RT-PCR PER ZIKA VIRUS

Sono stati fatti dei tentativi per l’ottimizzazione di una real-time RT-PCR per una regione

di 76 pb del gene E dello Zika virus [Lanciotti et al., 2008]. Le analisi sono state condotte

con lo strumento LC480 II (Roche Italia, Monza, Italia) e con il kit SuperScript® III One-

Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen - Life

technologies). I primer (10 pmol/μL) e il profilo termico utilizzati sono i seguenti:


ZIKV 835 TTGGTCATGATACTGCTGATTGC 835-857

76 ZIKV 911c CCTTCCACAAAGTCCCTATTGC 911-890

ZIKV 860 6FAM-CGGCATACAGCATCAGGTGCATAGGAG-TAMRA 860-886

45 CICLI

95°C 95°C

5’ 5’’

+ Cooling

55°C 40°C

35” 30”

42°C

40’

3.7. REAL-TIME RT-PCR FLAVIVIRUS UNIVERSALI (Pan-Fl avi)

È stato messo a punto un protocollo di real-time RT-PCR per l’identificazione di Flavivirus

emergenti (Pan-Flavi). Per questa metodica sono stati impiegati dei primer degenerati

diretti ad una regione del gene NS5, la cui sequenza è altamente conservata tra i Flavivirus

[Patel et al., 2013]. Le analisi mediante real-time RT-PCR sono state condotte con lo

strumento LC480 II (Roche Italia, Monza, Italia). Il kit utilizzato è Kapa Probe Fast

Universal One-step qRT-PCR kit (Kapa Biosystems, Inc. Wilmington, MA). I primer (10

pmol/μL) e il profilo termico utilizzati sono i seguenti:

Materiali e metodi

127

Primer e TaqMan probe (5’ → 3’) Posizione

Flavi all S TACAACATGATGGGGAARAGAGARAA 8993-9019 DEN4 F TACAACATGATGGGRAAACGTGAGAA 8996-9019

Flavi all AS 1 GAYACMGCHGGNTGGGAC 9236-9253

GATGAYACMGCTGGATGGGAC 9236-9256

Flavi all AS 2 GCWGATGACACMGCNGGCTGGGACAC 9232-9260 Flavi all probe 1 6FAM-AARGGHAGYMGNGCCATHTGGT-BHQ 9044-9065 Flavi all probe 2 6FAM-TGGTWYATGTGGYTNGGRGC-BHQ 9062-9082

Flavi all probe 3 mix

6FAM-TGGTWYATGTGGYTNGGRGC-BHQ 9062-9082 6FAM-CCGTGCCATATGGTATATGTGGCTGGGAGC-BHQ 9052-9081 6FAM-TTTCTGGAATTTGAAGCCCTGGGTTT-BHQ 9086-9012

Flavi all S2 TACAACATGATGGGMAAACGYGARAA 8996-9019 Flavi all AS 4 GAYGAYACMGCNGGCTGGGACAC 9235-9260

45 CICLI

95°C 95°C

5’ 15’’

+ Cooling

55°C 40°C

35” 30”

42°C

25’

128

4. RISULTATI

4.1. IDENTIFICAZIONE DEL TBEV NEI VETTORI

In questo lavoro vengono presentati i risultati delle indagini finalizzate allo studio

dell’epidemiologia del Tick-borne encephalitis virus nella regione Friuli Venezia Giulia

durante gli anni 2011, 2012, 2013 e 2014. Lo studio della presenza di TBEV è stato

valutato con la distribuzione geografica delle sedi di prelievo, con lo stadio maturativo

della zecca e con il periodo in cui sono stati effettuati i campionamenti.

Le zecche sono state prelevate in 52 sedi di campionamento del Friuli Venezia Giulia

(Tabella XX, paragrafo XX). Sulla base delle caratteristiche morfologiche, tutti gli

esemplari raccolti sono stati classificati come I. ricinus dai ricercatori dell’Università di

Udine. Inoltre, prima di procedere con le analisi molecolari per testare la presenza del

genoma virale, per tutti i campioni è stata verificata l’efficienza dell’estrazione e la

valutazione della presenza di potenziali inibitori della PCR. Tutti i campioni sono risultati

positivi per la regione di 110 bp dell’RNA ribosomiale 16S di Ixodes ricinus e quindi

ritenuti idonei per le successive indagini molecolari.

Stagioni 2011-2012

Complessivamente, per la stagione 2011 sono state raccolte ed analizzate 4628 zecche, di

queste 4298 ninfe e 330 adulti (125 femmine e 169 maschi). Per semplificare le analisi le

zecche sono state suddivise in pool considerato anche che, in uno studio precedente, la

prevalenza di TBEV nelle zecche era risultata inferiore al 1%.

Nella tabella 9 vengono riportati il numero di pool analizzati per ogni area geoclimatica e i

siti dove sono stati registrati il numero più alto e più basso di pool nell’area considerata.

Come aree geoclimatiche le Prealpi Giulie, il Canal del Ferro e le Prealpi Carniche

presentano i valori più elevati di zecche campionate rispettivamente con 287, 232 e 207

pool. Un numero relativamente elevato di pool è stato registrato anche nella Carnia Centro-

orientale (123). Le aree in cui vi sono stati meno pool sono invece la Valcanale e il Carso

Goriziano, con 14 e 17 pool rispettivamente. Nell’ambito di ciascuna area geoclimatica si è

osservata un’elevata variabilità della numerosità del campione, particolarmente evidente

nelle seguenti aree:

Risultati

129

∗ nella Carnia Centro-orientale varia da 2 pool a Ravascletto a 33 pool di Amaro;

∗ nelle Prealpi Carniche varia da 27 pool a Clauzetto a 95 pool di Tramonti di Sopra;

∗ nel Canal del Ferro varia da 38 a Pontebba a 110 di Roveredo.

AREA GEOCLIMATICA

N. Siti/area Totale Pool

MINIMO MASSIMO

N. Pool Sito N. Pool Sito

Carnia Occidentale 2 27 7 Forni di Sopra

20 Forni di Sotto

Carnia Centro-orientale

10 123 2 Ravascletto 33 Amaro

Prealpi Carniche 5 207 27 Clauzetto 95 Tramonti di

Sopra

Valcanale 4 14 2 Valbruna 5 Tarvisio

Canal del Ferro 3 232 38 Pontebba 110 Roveredo

Prealpi Giulie 6 287 24 Gemona del

Friuli 84 Lusevera

Colline Moreniche 2 35 17 Pagnacco 18 Rive

d’Arcano

Colline Eoceniche 5 87 11 Gorizia 26 Medea

Alta Pianura 3 47 4 Flaibano 35 Polcenigo

Bassa Pianura 3 43 7 Chions 22 Muzzana

Carso Goriziano 2 17 8 Redipuglia 9 Doberdò del

Lago

Litorale 2 29 2 Grado 27 Lignano

Tabella 9. Distribuzione per area geoclimatica dei pool di zecche nella stagione 2011 con indicazioni del

range e dei siti di raccolta.

Allo screening molecolare, mediante real-time RT-PCR (3’NCR) sono risultati positivi 6

pool di zecche del 2011. La positività dei campioni è stata confermata mediante una

seconda real-time RT-PCR per il gene env. Tutti i sei pool positivi erano composti da ninfe,

raccolte tra marzo e maggio 2011. Le sedi in cui si sono riscontrate le positività sono

Bordano (1 pool), Pontebba (1 pool) e Raccolana (4 pool). Sono risultati positivi ulteriori 5

pool di zecche raccolte a Raccolana il 18 aprile e il 16 maggio ma queste positività non

Risultati

130

sono state prese in considerazione perché presentavano una carica virale molto bassa con

un threshold cycle, o ciclo soglia, maggiore a 35 (ct>35).

Di seguito, nella tabella 10, sono riassunti i pool positivi, la data del prelievo, la sede, lo

stadio maturativo e i risultati delle due real-time RT-PCR con i relativi threshold cycle.

STAGIONE POOL + PRELIEVO SEDE STADIO Real-Time

NCR Real-Time

ENV

2011

165 16-mag-11 RACCOLANA NINFA Positivo ct=20

Positivo ct=20

296 18-apr-11 RACCOLANA NINFA Positivo ct=25

Positivo ct=27


Positivo ct=22


Positivo ct=35

364 22-mar-11 BORDANO NINFA Positivo ct=20

Positivo ct=21

644 23-apr-11 PONTEBBA NINFA Positivo ct=24

Positivo ct=24

Tabella 10. Pool positivi della stagione 2011.

La prevalenza complessiva dell’infezione da TBE virus nel vettore è stata del1’1.13% nel

2011 con un intervallo di confidenza 95% compreso tra 0.05 e 3.9% (Tabella 11). Le

prevalenze riscontrate in ciascun sito risultano rispettivamente dello 0.9% a Pontebba

(0.05-3.9%), dell’1.3% a Raccolana (0.42-3.07%) e dello 0.74% a Bordano (0.04-3.22%).

STAGIONE SEDE POSITIVI CI 95% (%) PREVALENZA (%)

2011

PONTEBBA 1 0.05 3.9 0.9

RACCOLANA 4 0.42 3.07 1.3

BORDANO 1 0.04 3.22 0.74

TOTALE 6 0.45 2.27 1.13

Tabella 11. Prevalenze per la stagione 2011.

Risultati

131

Per la stagione 2012 sono state testate 3849 zecche comprendenti 3577 ninfe e 272 adulti

(109 femmine e 163 maschi). La numerosità del campione è inferiore a quella dell’anno

precedente. Si sono ottenuti 838 pool, dei quali 566 erano costituiti da ninfe. Come già

detto, gli adulti sono stati analizzati singolarmente, mentre le ninfe sono state raggruppate

in pool da 2-10, fatta eccezione per una ninfa esaminata in singolo. Il numero dei pool

risulta nettamente inferiore rispetto al numero di quelli del 2011 (1148 pool).

AREA GEOCLIMATICA

N. Siti/area Totale Pool

MINIMO MASSIMO

Pool Sito Pool Sito

Carnia Occidentale 2 15 5 Forni di Sopra 10 Forni di Sotto


10 89 2 Ravascletto 22 Amaro

Prealpi Carniche 5 145 10 Bordano 47 Claut

Valcanale 4 11 2 Fusine, Tarvisio,

Valbruna 5 San Leopoldo

Canal del Ferro 3 112 32 Raccolana, Roveredo

48 Pontebba


Friuli 47 Pulfero

Colline Moreniche 2 60 20 Rive d’Arcano 40 Pagnacco

Colline Eoceniche 5 77 9 Gorizia, Tarcento 24 Buttrio

Alta Pianura 3 38 8 Flaibano 18 Martignacco


Carso Goriziano 2 39 8 Doberdò del

Lago 31 Redipuglia




Nella tabella 12 viene riportato il numero di pool analizzato per ogni area geoclimatica i

siti dove sono stati registrati il numero più alto e più basso di pool nell’area considerata. Le

aree geoclimatiche che presentano i valori più elevati di pool sono le Prealpi Giulie, le

Risultati

132

Prealpi Carniche e il Canal del Ferro, rispettivamente con 169, 145 e 112 pool analizzati.

Le aree in cui vi sono i numeri minori di pool sono la Valcanale e la Carnia Occidentale,

con 11 e 15 pool rispettivamente. I siti in cui sono registrati meno pool sono Ravascletto

appartenente alla Carnia Centro-orientale (2 pool), Fusine, Tarvisio e Valbruna dell’area

geoclimatica della Valcanale (2 pool in ciascun sito) e Grado appartenente al Litorale (2

pool). Al contrario, siti che possiedono i pool più numerosi sono Pontebba appartenente al

Canal del Ferro (48 pool), Claut dell’area delle Prealpi Carniche (47 pool) e Pulfero delle

Prealpi Giulie (47 pool).

Allo screening molecolare mediante real-time RT-PCR 3 dei 838 pool analizzati sono

risultati positivi per la regione 3’NCR del genoma del TBEV. Le tre positività sono state

confermate mediante la real-time RT-PCR per il gene env. Il virus è stato identificato in 2

pool di ninfe di Tarvisio e Tramonti di Sopra, rispettivamente di maggio e ottobre 2012, e

in un esemplare adulto di sesso maschile raccolto a Pontebba nel mese di maggio. Anche

nel 2012 sono risultati positivi ulteriori 4 pool di zecche raccolte a Pontebba il 15 maggio,

positività non prese in considerazione per la carica virale molto bassa (ct>35).

Nella tabella 13 sono indicati i pool positivi per la stagione 2012, la data del prelievo, la

sede, lo stadio maturativo e i risultati delle real-time RT-PCR con i relativi ct.

STAGIONE POOL + PRELIEVO SEDE STADIO Real-Time

NCR Real-Time

ENV

2012

458 15-mag-12 PONTEBBA ADULTO

(M) Positivo ct=18

Positivo ct=19

462 15-mag-12 TARVISIO NINFA Positivo ct=34

Positivo ct=35

817 29-ott-12 TRAMONTI DI SOPRA

NINFA Positivo ct=21

Positivo ct=20


Per la stagione 2012 la prevalenza complessiva dell’infezione da TBE virus nel vettore è

stata dello 0.8%, valore inferiore di quello trovato nell’anno precedente (Tabella 14) e con

un intervallo di confidenza 95% compreso tra 0.2 e 2.21%. Le prevalenze riscontrate nei

singoli siti positivi sono risultate rispettivamente a Pontebba dello 0.5% (0.03-2.34%), a

Tarvisio dell’ 1% (0.06-4.43%) e a Tramonti di Sopra dello 0.4% (0.02-1.76%).

Risultati

133

STAGIONE SEDE POSITIVI CI 95% PREVALENZA (%)

2012

PONTEBBA 1 0.03 2.34 0.5

TARVISIO 1 0.06 4.43 1

TRAMONTI DI SOPRA

1 0.02 1.76 0.4

TOTALE 3 0.2 2.21 0.8


Nella tabella 15 vengono riportate le principali caratteristiche dei campioni risultati positivi

nel biennio 2011-12. Le cariche virali osservate sono, ad eccezione dei campioni

FVG.Raccolana/T-302/2011 e FVG.Tarvisio/T-462/2012, molto elevate superando i valori

di 1E+06.

Anno Pool Data

prelievo Sito Stadio

Carica Virale

Isolamento virale

2011

FVG.Bordano/T-364/2011 22-mar Bordano Ninfa 1.49E+07 Si

FVG.Raccolana/T-296/2011 18-apr Raccolana Ninfa 3.26E+06 Si

FVG.Raccolana/T-299/2011 18-apr Raccolana Ninfa 1.19E+07 Si

FVG.Raccolana/T-302/2011 18-apr Raccolana Ninfa 4.48E+03 No

FVG.Pontebba/T-644/2011 23-apr Pontebba Ninfa 1.25E+08 Si

FVG.Raccolana/T-165/2011 16-mag Raccolana Ninfa 1.01E+08 Si

2012

FVG.Pontebba/T-458/2012 15-mag Pontebba Adulto 1.94E+09 Si

FVG.Tarvisio/T-462/2012 15-mag Tarvisio Ninfa 3.97E+02 No

FVG.TramontiDiSopra/T-817/2012 31-ott Tramonti di Sopra

Ninfa 1.75E+07 Si

Tabella 15. Caratteristiche dei campioni risultati positivi nel biennio 2011-2012.

È stato possibile isolare in colture cellulari 7 dei 9 campioni positivi:in particolare sono

stati isolati 5 dei 6 campioni positivi del 2011 e 2 su 3 di quelli del 2012. Non è stato

possibile isolare il virus dai campioni FVG.Raccolana/T-296/2011 e FVG.Tarvisio/T-

462/2012 poiché entrambi aventi carica virale sensibilmente più bassa di quella dei

Risultati

134

campioni che hanno consentito l’isolamento del TBE virus.

Per tutti i campioni è stato possibile ottenere la sequenza di 252 paia di basi del gene NS5 e

successivamente estendere la regione alla zona di giunzione NS4/5, per consentire

un’analisi filogenetica più approfondita. Tutti i campioni positivi inoltre sono stati

sequenziati per la regione env e sottoposti ad analisi filogenetica.

Le sequenze dei ceppi sono state allineate con alcune sequenze depositate in GenBank

rappresentative dei 3 sottotipi e con sequenze ottenute negli anni precedenti in uno studio

condotto nella stessa area (mostrate in viola, FVG.Sito/T cod/2007:Zecche 2007, Figura

48). Vengono mostrati in blu e in verde i ceppi da noi isolati dai vettori in questo studio per

il biennio 2011 e 2012 (FVG.Sito/T cod/2011:Zecche 2011, FVG.Sito/T cod/2012:Zecche

2012), mentre in rosso si possono notare le sequenze ottenute dai pazienti con TBE del

2012 e del 2013 e di uno del 2004 (FVG.H-Iniziali cod/anno).

L’analisi molecolare e lo studio filogenetico relativo al gene NS5 dei campioni 2011-2012

confermano la circolazione nell’area studiata di virus appartenenti al sottotipo europeo

occidentale. Le differenze nucleotidiche riscontrate tra i diversi campioni escludono la

possibilità di contaminazione di laboratorio. Le sequenze ottenute si raggruppano in cluster

evolutivi differenti: il principale presenta un elevato grado di identità con il ceppo

finlandese Isosaari; un altro gruppo comprende ceppi in parte riconducibili alla variante

Hypr circolante nei paesi vicini, Slovenia e Austria; in particolare vi sono delle similitudini

con il ceppo sloveno Cerkno H55. I campioni positivi degli anni precedenti (2005, 2006 e

2007) vengono invece raggruppati con il prototipo Neudoerfl, ceppo vaccinale.

Nell’albero filogenetico relativo al gene env (Figura 49) si possono distinguere in rosa ed

in verde le sequenze ottenute nel biennio 2011-2012 (FVG.Sito/Tcod/2011:Zecche2011,

FVG.Sito/Tcod/2012:Zecche2012), in rosso quelle ottenute dai casi umani (FVG.H-Iniziali

cod/anno), in viola invece quelle degli anni precedenti (FVG.Sito/Tcod/2007:Zecche 2007).

Risultati

135

Figura 48. Albero filogenetico di una regione di 252 paia di basi nel gene NS5 dei campioni di zecche risultati positivi nel periodo di studio confrontate con i campioni di zecche positive delle stagioni precedenti,

con campioni di pazienti positivi e con sequenze di riferimento dei tre sottotipi.

Risultati

136

I ceppi ottenuti dai pool positivi del 2011 si raggruppano assieme ai ceppi ottenuti nella

stessa area geoclimatica (Canal del Ferro) e a quelli identificati nella stessa area negli anni

precedenti e hanno elevate omologie con ceppi sloveni (Slovenia.Trzic/H-58/2009 e

JQ654701 Ljubljana) e con il ceppo tedesco EU872053/T1401/Germania. Il ceppo

ottenuto dal campione del 2012 si raggruppa invece con un ceppo ceco, HM46819

Unterengstringen (CH), molto simile al ceppo da noi isolato da un campione umano del

2013 (FVG/H-ZT1941/2013).

Figura 49. Albero filogenetico di una regione di 1322 paia di basi nel gene Env degli isolati virali da campioni di zecche delle stagioni 2011-2012; le sequenze vengono confrontate con campioni di pazienti con

TBE e con sequenze di riferimento dei tre sottotipi.

Risultati

137

Stagioni 2013-2014

Nel 2013-2014 è proseguita la ricerca del TBE virus nei vettori raccolti nel FVG, nelle

stesse sedi di campionamento delle stagioni precedenti. Le zecche sono state sempre

suddivise in pool ed omogenate. Per la ricerca del TBEV si è utilizzato lo stesso protocollo

di screening delle stagioni precedenti mediante real-time RT-PCR diretta alla regione

3’NCR altamente conservata tra i diversi ceppi appartenenti al sottotipo europeo

occidentale e a quello Far-Eastern. Per la conferma della positività è stata utilizzata una

seconda real-time RT-PCR diretta ad una regione del gene E. Per la caratterizzazione

molecolare sono state analizzate una regione parziale del gene codificante per la

glicoproteina E dell’envelope ed una in corrispondenza alla giunzione tra i geni NS4 e

NS5.

Complessivamente per la stagione 2013 sono state raccolte e analizzate 5097 zecche, di cui

4743 ninfe e 354 adulti (161 femmine e 193 maschi). Sono stati formati 701 pool, 347

costituitu da ninfe e i restanti 354 da adulti. Il numero di pool è risultato inferiore rispetto a

quello delle stagioni precedenti, rispettivamente 1148 pool nel2011 e 838 pool nel 2012.

Nella tabella 16 possiamo vedere il numero di pool analizzato per ogni area geoclimatica e

i siti dove sono stati registrati il numero più alto e più basso di pool nell’area considerata.

Come aree geoclimatiche le Prealpi Giulie, le Prealpi Carniche e il Carnia Centro-orientale

presentano i valori più elevati di zecche campionate rispettivamente con 137, 124 e 108

pool. Le aree in cui vi sono stati meno pool sono invece la Carnia Occidentale e il Carso

Goriziano, con 10 e 12 pool rispettivamente. Nell’ambito di ciascuna area geoclimatica si è

osservata un’elevata variabilità della numerosità del campione, particolarmente evidente

nelle seguenti aree:

∗ nelle Prealpi Carniche varia da 2 pool di Trasaghis a 60 di Tramonti di Sopra;

∗ nella Carnia Centro-orientale varia da 3 pool di Ovaro a 21 di Paluzza;

∗ nelle Prealpi Giulie varia da 4 pool di Montenars a 55 di Lusevera.

Risultati

138

AREA GEOCLIMATICA

N. Siti/area

Totale Pool

MINIMO MASSIMO Pool Sito Pool Sito

Carnia Occidentale 2 10 2 Forni di Sotto 8 Forni di Sopra


10 108 3 Ovaro 21 Paluzza

Prealpi Carniche 5 124 2 Trasaghis 60 Tramonti di

Sopra

Valcanale 4 7 1 Fusine,

Valbruna 3

San Leopoldo

Canal del Ferro 3 50 4 Raccolana 38 Pontebba

Prealpi Giulie 6 137 4 Montenars 55 Lusevera

Colline Moreniche 2 37 17 Rive d’Arcano 20 Pagnacco

Colline Eoceniche 5 56 6 Gorizia 18 Buttrio


Bassa Pianura 3 52 9 Muzzana 21 Bertiolo


Lago 7 Redipuglia


Tabella 16. Distribuzione per area geoclimatica dei pool di zecche nella stagione 2013 con indicazioni del range e dei siti di raccolta.

Allo screening molecolare sono risultati positivi 4 pool di zecche del 2013. I campioni

risultati positivi sono stati confermati mediante una seconda real-time RT-PCR per il gene

env. Le cariche virali sono state quantificate grazie alla creazione di una curva standard con

un plasmide avente concentrazione nota. Anche per la stagione 2013 sono risultati positivi

ulteriori quattro pool di zecche raccolte il 14 maggio ad Amaro, sette pool di zecche

raccolte a Lusevera il 15 maggio e due pool di zecche raccolte a Pontebba il 18 maggio.

Queste positività, come in precedenza, non sono però state prese in esame

nell’elaborazione dei dati perché presentavano una carica virale molto bassa (ct>35).

Tra i pool positivi 3 erano composti da ninfe e uno da un esemplare adulto di sesso

femminile, tutti raccolti tra aprile e maggio 2013. Le sedi in cui si sono riscontrate le

positività sono Tramonti di Sopra, Amaro, Lusevera e Pontebba (esemplare adulto).

La semina dei campioni in colture cellulari, non ha consentito l’isolamento del TBE

nonostante le cariche virali fossero piuttosto elevate (1.83E+09, 3.44E+06, 3.85E+07 e

3.00E+07 copie/µL). Di seguito sono riassunti nella tabella 17 i pool positivi, la data del

prelievo, la sede, lo stadio maturativo e i risultati della real-time RT-PCR (3’NCR) con i

relativi ct e concentrazioni (copie/µL):

Risultati

139

STAGIONE POOL + PRELIEVO SEDE STADIO real-time

NCR COPIE/µL

2013

9 26-apr TRAMONTI DI SOPRA

NINFA Positivo ct=19

1.83E+09

214 14-mag AMARO NINFA Positivo ct=21

3.44E+06

282 15-mag LUSEVERA NINFA Positivo ct=21

3.85E+07

341 18-mag PONTEBBA ADULTO

(F) Positivo ct=20

3.00E+07


Per la stagione 2013 la prevalenza complessiva dell’infezione da TBE virus nel vettore è

stata dello 0.13%, con un intervallo di confidenza 95% compreso tra 0.04 e 3.00%, valore

inferiore di quello trovato nelle stagioni precedenti (Tabelle 11 e 14). Le prevalenze

riscontrate nei singoli siti positivi sono risultate rispettivamente a Tramonti di Sopra dello

0.21% (0.01-0.93%), ad Amaro dello 0.82% (0.05-3.50%), a Lusevera dello 0.24% (0.01-

1.03%) e a Pontebba del 2.94% (1.18-5.87%) (Tabella 18).

STAGIONE SEDE POSITIVI CI 95% PREVALENZA (%)

2013

TRAMONTI DI SOPRA

1 0.01 0.93 0.21

AMARO 1 0.05 3.50 0.82

LUSEVERA 1 0.01 1.03 0.24

PONTEBBA 1 1.18 5.87 2.94

TOTALE 4 0.04 3.00 0.13


Complessivamente per la stagione 2014 sono stati analizzati 621 pool (255 composti da

ninfe) corrispondenti a 2513 zecche, di queste 2149 ninfe e 366 adulti (149 femmine e 217

maschi).

Nella tabella 19 possiamo vedere il numero di pool analizzato per ogni area geoclimatica e

il range con indicazione del sito dove è stato registrato il numero più alto e più basso di

Risultati

140

pool nell’area considerata. Come aree geoclimatiche le Prealpi Giulie, il Canal del Ferro e

le Prealpi Carniche presentano i valori più elevati di zecche campionate rispettivamente

con 120, 114 e 103 pool. Le aree in cui vi sono stati meno pool sono invece il Carso

Goriziano e il Litorale, con 9 e 18 pool rispettivamente.

AREA GEOCLIMATICA

N. Siti/area

Totale Pool

MINIMO MASSIMO

Pool Sito Pool Sito

Carnia Occidentale 2 22 7 Forni di Sopra 15 Forni di Sotto


10 64 4 Ampezzo, Paularo,

Ravascletto 12 Imponzo

Prealpi Carniche 5 103 12 Bordano 30 Clauzetto

Valcanale 4 31 5 Fusine, Valbruna 15 Tavisio

Canal del Ferro 3 114 13 Pontebba 66 Raccolana


Friuli 50 Lusevera

Colline Moreniche 2 23 7 Pagnacco 16 Rive d’Arcano

Colline Eoceniche 5 60 3 Cividale 28 Buttrio




Lago 5 Redipuglia




Per la stagione 2014, allo screening molecolare non sono stati rilevati pool positivi.

Per tutti i campioni positivi del 2013 è stato possibile ottenere la sequenza di 252 paia di

basi del gene NS5 e in alcuni casi estendere la regione alla zona di giunzione NS4/5, per

consentire un’analisi filogenetica più approfondita. Tutti i campioni positivi inoltre sono

Risultati

141

stati sequenziati per la regione env e sottoposti a successiva analisi filogenetica. Le

sequenze dei campioni positivi del 2013 sono state allineate con alcune sequenze

depositate in GenBank rappresentative dei tre sottotipi e con sequenze ottenute negli anni

precedenti in uno studio condotto nella stessa area, mostrate in blu (FVG.Sito/T cod/2005:

Zecche 2005, FVG.Sito/T cod/2006: Zecche 2006, FVG.Sito/T cod/2007: Zecche 2007,

Figura 50). Vengono mostrati in giallo e in verde i ceppi da noi isolati dai vettori in questo

studio per il biennio 2011 e 2012 (FVG.Sito/T cod/2011: Zecche 2011, FVG.Sito/T

cod/2012: Zecche 2012), mentre in rosso si possono notare le sequenze ottenute dai

pazienti con TBE (FVG. H cod/anno). Le sequenze ottenute nella stagione 2013 sono

mostrate in rosa (FVG.Sito/T cod/2013: Zecche 2013).

L’analisi molecolare delle sequenze relative al gene NS5 dei campioni del 2013 conferma

la circolazione nell’area studiata di virus appartenenti al sottotipo europeo occidentale. Le

sequenze ottenute si raggruppano in cluster evolutivi differenti: la sequenza ottenuta dal

pool di Lusevera si raggruppa con i campioni positivi degli anni precedenti (2005, 2006 e

2007) e mostra omologie con il ceppo Neudoerfl (ceppo vaccinale). La sequenza di

Tramonti di Sopra risulta legata filogeneticamente con il ceppo Toro, mostrando omologie

con ceppi del 2011 e 2012 e con un campione umano del 2004, oltre che con un campione

umano del 2012. Le varianti Toro e Neudoerfl circolano entrambi in Austria e Slovenia. La

sequenza del pool di Pontebba presenta un elevato grado di identità con il ceppo finlandese

Isosaari. Infine, un ulteriore cluster raggruppa la sequenza di Amaro e ceppi da noi isolati

nel FVG nelle stagioni precedenti, includendo anche un caso umano del 2012.

Risultati

142

Figura 50. Albero filogenetico di una regione di 252 paia di basi nel gene NS5 dei campioni di zecche risultati positivi nel periodo di studio (2013) confrontate con i campioni di zecche positive delle stagioni

precedenti, con campioni di pazienti positivi e con sequenze di riferimento dei tre sottotipi.

Nell’albero filogenetico relativo al gene env si possono distinguere in giallo ed in verde le

sequenze ottenute nel biennio 2011-2012 (FVG.Sito/T cod/2011:Zecche2011, FVG.Sito/T

cod/2012:Zecche2012, Figura 51), in rosso quelle ottenute dai casi umani (FVG. H

cod/anno), in rosa quelle della stagione 2013 (FVG.Sito/T cod/2013:Zecche 2013).

Possiamo vedere come le sequenze di Amaro e Pontebba si raggruppano in un cluster

evolutivo legato a ceppi isolati in Slovenia (Ljubljana-like). Il pool di Pontebba è legato

filogeneticamente ai campioni umani del 2012 e al ceppo sloveno Cerkno/H-55/2007.

Infine la sequenza di Lusevera mostra elevate omologie con i ceppi appartenenti al cluster

cecoslovacco Stara Ves.

Risultati

143

Figura 51. Albero filogenetico di una regione di 1322 paia di basi nel gene Env degli isolati virali da campioni di zecche del 2013; le sequenze vengono confrontate con campioni di pazienti con TBE e con

sequenze di riferimento dei tre sottotipi.

Nelle tabelle riportate qui di seguito possiamo vedere il numero di pool analizzati in ogni

sede di campionamento per ogni stagione (Tabella 20) e il numero di zecche (ninfe e

adulti) analizzate per ogni stagione di studio (Tabella 21). Nella tabella 22 sono indicate

invece le prevalenze relative alle diverse aree geoclimatiche.

Risultati

144

SITO 2011 2012 2013 2014

AMARO 33 22 15 10

AMPEZZO 5 5 6 4

BERTIOLO 14 14 21 6

BORDANO 41 10 7 12

BUTTRIO 24 24 18 28

CHIONS 7 8 22 5

CIVIDALE 12 19 13 3

CLAUT 35 47 27 17

CLAUZETTO 27 25 28 30

DOBERDÒ DEL LAGO 9 8 5 4

FLAIBANO 4 8 4 6

FORNI DI SOPRA 7 5 8 7

FORNI DI SOTTO 20 10 2 15

FUSINE 3 2 1 5

GEMONA DEL FRIULI 24 11 15 6

GORIZIA 11 9 6 4

GRADO 2 2 3 2

IMPONZO 5 5 11 12

LIGNANO 27 25 47 16

LUSEVERA 84 42 55 50

MARTIGNACCO 35 18 45 14

MEDEA 26 16 8 9

MONTENARS 72 36 4 15

MUZZANA 22 34 9 19

OVARO 17 12 3 5

PAGNACCO 17 40 20 7

PALUZZA 23 9 21 7

PAULARO 6 4 6 4

POLCENIGO 8 12 9 7

PONTEBBA 38 48 38 13

POVICI 36 18 13 0

PULFERO 40 47 28 38

RACCOLANA 84 32 4 66

RAVASCLETTO 2 2 4 4

Risultati

145

SITO 2011 2012 2013 2014

REDIPUGLIA 8 31 7 5

RIGOLATO 5 4 9 5

RIVE D’ARCANO 18 20 17 16

ROVEREDO 110 32 8 35

SAN LEOPOLDO 4 5 3 6

SOCCHIEVE 9 20 19 5

TAIPANA 31 15 22 11

TARCENTO 14 9 11 16

TARVISIO 5 2 2 15

TRAMONTI DI SOPRA 95 38 60 26

TRASAGHIS 9 25 2 18

VAL AUPA 18 6 14 8

VALBRUNA 2 2 1 5

TOTALE POOL 1148 838 701 621

Tabella 20. Numero dei pool di zecche analizzati durante le stagioni 2011, 2012, 2013 e 2014

ANNO NINFE ADULTI TOTALE

ZECCHE/ANNO

2011 4298 330 4628

2012 3577 272 3849

2013 4743 354 5097

2014 2149 364 2513

TOTALE 14767 1320 16087

Tabella 21. Numero delle zecche analizzate durante le stagioni 2011, 2012, 2013 e 2014.

Risultati

146

Stagione area geoclimatica N. pool N.

positivi prevalenza (%) CI 95% (‰)

2011

Carnia Occidentale 27 Carnia Centro-

orientale 123

Prealpi Carniche 207 1 0.12 0.1 5.2

Valcanale 14

Canal del Ferro 232 5 0.5 1.8 10.6

Prealpi Giulie 287

Colline Moreniche 35

Colline Eoceniche 87

Alta Pianura 47

Bassa Pianura 43

Carso Goriziano 17

Litorale 29

Totale 2011 1148 6 1.13 4.5 22.7

2012


orientale 89


Valcanale 11 1 1.46 0.8 62.6

Canal del Ferro 112 1 0.17 0.1 7.5

Prealpi Giulie 169

Colline Moreniche 60

Colline Eoceniche 77

Alta Pianura 38

Bassa Pianura 56

Carso Goriziano 39

Litorale 27

Totale 2012 838 3 0.8 2 22.1

2013


orientale 108 1 0.99 3.5 21.1


Valcanale 7 Canal del Ferro 50 1 3.02 21.1 60.1

Prealpi Giulie 137 1 1.18 5.7 21.1

Colline Moreniche 37 Colline Eoceniche 56

Alta Pianura 58 Bassa Pianura 52

Carso Goriziano 12 Litorale 50

Totale 2013 701 4 0.13 0.4 30.0

Tabella 22. Prevalenze nelle aree geoclimatiche delle zecche analizzate delle stagioni 2011, 2012, 2013.

Risultati

147

4.2. IDENTIFICAZIONE DEL TBEV IN CAMPIONI UMANI

A inizio 2013, il TBEV è stato identificato e sequenziato retrospettivamente in due pazienti

del 2012, uno della provincia di Udine (anno di nascita 1951) e uno della provincia di

Pordenone (anno di nascita 1946). Per il primo paziente è stato possibile raccogliere 3

campioni di siero (prelevati a distanza di qualche giorno), sangue intero in EDTA, liquido

cerebrospinale (CSF); per il secondo paziente invece solo un campione di siero (siero 5).

Di seguito vediamo riportati i risultati relativi alle due real-time RT-PCR (Tabella 23) e ai

test immunoenzimatici (Tabella 24).

CAMPIONE REAL-TIME 3’NCR (CT) REAL-TIME ENV (CT)

Paziente 1

SANGUE-EDTA - -

CSF - -

SIERO 1 29 30

SIERO 2 40 40

SIERO 3 - 38

Paziente 2 SIERO 5 38 40

Tabella 23. Risultati alle indagini molecolari (real-time RT-PCR) dei campioni dei due pazienti del 2012.

CAMPIONE DATA

PRELIEVO IgM INDICE IgG INDICE

Paziente A

SIERO1 27/10/2012 NEG - NEG -

SIERO2 31/10/2012 POS 4.93 NEG -

SIERO3 02/11/2012 POS 4.99 POS 1.73

CSF 16/11/2012 - - - -

Paziente B SIERO5 21/11/2012 POS 1.93 NEG -

Tabella 24. Risultati alle indagini sierologiche (Test ELISA) dei campioni dei due pazienti del 2012.

Risultati

148

I campioni sono stati sottoposti ad amplificazione del gene NS5, ed è stato possibile

dimostrare la presenza dell’RNA virale solo nel sangue e nel 1° siero del paziente A e nel

siero del paziente B. Si è quindi proceduto al sequenziamento e all’analisi filogenetica. Le

sequenze relative al gene NS5 e al gene env sono state allineate con le sequenze dei

campioni di zecche delle varie stagioni (Figura 48, 49, 50 e 51): sequenza FVG/H-

ZN1951/2012 relativa al paziente A (Udine) e sequenza FVG/H-IB1946/2012 relativa al

paziente B (Pordenone).

A maggio 2013 è stato da noi diagnosticato il primo caso di TBEV nella provincia di

Trieste in un paziente immunodepresso, con linfoma a cellule B. Il paziente, di 71 anni, era

in cura chemioterapica per una neoplasia a cellule dendritiche plasmocitoidi blastiche

recidivante. Nel 2010 gli era stato diagnosticato un linfoma a cellule B di basso grado.

All’inizio di maggio 2013 ha sviluppato debolezza senza dolore o parestesie, e febbre

(38°C) e non rispondeva al trattamento con Levofloxacina. Alcuni giorni dopo, la

debolezza agli arti superiori è peggiorata ed è comparsa la paralisi all’arto superiore

sinistro e opsoclono, ovvero un movimento involontario incontrollato degli occhi, caotico e

multivettoriale. Gli esami del liquido cerebrospinale mostravano alterazioni con un

fenotipo cellulare suggestivo di neoplasia a cellule dendritiche plasmocitoidi blastiche. Nel

giugno 2013, il quadro neurologico è peggiorato rapidamente con disorientamento, afasia,

movimenti involontari. Il paziente è morto di sepsi ad ottobre 2013.

Qui di seguito vengono riportati i parametri di laboratorio del paziente in un campione del

5 giugno 2013:

− Eritrociti 3.23 x 10^6/mcL,

− Emoglobina 11.5 g/dL,

− Ht 34.6%, piastrine 109 x 10^3/mcL,

− Globuli bianchi 3.67 x 10^3 /mcL,

− Neutrofili 3.13 x10^3/mcL,

− Linfociti 0.21 x 10^3/mcL,

− Monociti 0.32 x 10^3/mcL,

− CD4 82 x 10^3 /mcL,

− CD4+ percentuale 39.2%,

− Rapporto CD4+/CD8+ 0.95,

− IgG 1810 mg/dL,

− IgA 148 mg/dL,

Risultati

149

− IgM 192 mg/dL.

Nel maggio 2013 il paziente aveva riportato un morso di zecca mentre praticava

un’escursione nei boschi attorno alla città di Trieste (Carso triestino). L’infezione da TBEV

è stata dimostrata mediante real-time RT-PCR quantitativa (bersaglio 3’NCR) su campioni

di sangue intero, liquido cerebrospinale e urine. La conferma è stata realizzata con la real-

time RT-PCR diretta al gene env. Da sottolineare che oltre che nel sangue e nel CSF il

TBEV era presente anche nelle urine. I test sierologici su siero e CSF dimostravao la

presenza di anticorpi di classe IgM e IgG specifiche (ELISA e test dell’avidità delle IgG).

L’infezione si è manifestata con viremia persistente e IgM positive per oltre 4 mesi. La

presenza del virus nel sangue è stata riscontrata diverse volte fino al 30 luglio, mentre nelle

urine fino al 5 luglio. Il CSF già dal secondo prelievo è risultato invece negativo. Nel

grafico seguente possiamo vedere l’andamento dei valori sierologici (IgM e IgG) e della

viremia (real-time RT-PCR su sangue e urine) del paziente (Figura 52):

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0 5 14 19 26 31 48 73 79 121

Vir

al l

oa

d

Ind

ex

EL

ISA

Sampling time (days)

index IgGTBEindex IgMTBErt PCRBloodrt PCRUrine

Figura 52. Rappresentazione della valutazione sierologica e virologica di infezione da TBEV in un paziente immunocompromesso. Gli indici IgG e IgM sono il rapporto tra i valori di assorbanza dei campioni ed il cut-off. La carica virale di TBEV è stata calcolata moltiplicando il valore ottenuto dalle analisi molecolari per il fattore di concentrazione di estrazione dell'RNA (100/50 e 500/50 per il sangue per l’urina, rispettivamente).

Risultati

150

Per ricercare in quale frazione cellulare fosse presente il TBE virus si sono separate le

popolazioni cellulari mediante Ficoll e si è osservato che la presenza del virus era

dimostrabile solo nella frazione eritrocitaria. Nella figura sottostante viene riportata

l’immagine del gel di agarosio ottenuto con i campioni del paziente immunocompromesso.

Si possono vedere il sangue intero e le varie frazioni cellulari ottenute con il Ficoll e il

campione di urine (Figura 53). I campioni sono stati raccolti il 25 giugno 2013, più di un

mese dopo la diagnosi di TBE.

Il controllo positivo è stato ottenuto inserendo un inserto di 20 pb alla sequenza del TBEV

(ceppo Neudoerfl) grazie alla realizzazione di un plasmide (pBluescript II phagemid

vector), effettuata in collaborazione con il gruppo di ricerca di Virologia Molecolare

dell’ICGEB di Trieste.

Figura 53. Gel di agarosio 1X con i campioni di un paziente con TBEV: 1.sangue intero-EDTA, 2.eritrociti, 3.plasma, 4.linfociti, 5.granulociti, 6.siero, 7.urine, 8.controllo positivo, 9.controllo negativo, 10.DNA

Molecular Weight Marker VIII (Roche Life Science).

Il TBEV è stato quindi sequenziato per una regione del gene env e una di NS4/5. Si è

inoltre isolato il virus su colture cellulari di Vero E6 e la carica virale è stata monitorata in

real-time RT-PCR prelevando i surnatanti. Dalle analisi filogenetiche si è riscontrata una

forte omologia tra le sequenze del paziente e quelle dei ceppi isolati in Slovenia e in

Europa centrale e settentrionale, appartenenti al sottotipo europeo (Figura 54).

Risultati

151

Figura 54. Albero filogenetico ottenuto da una sequenza di 1077 pb di una regione del gene env.

Nel 2013 sono stati segnalati altri due casi di infezione TBE nella provincia di Trieste. Un

secondo caso è stato dimostrato nel giugno 2013 in un paziente di 68 anni, sempre della

provincia di Trieste. L’uomo ricordava di essere stato morso da una zecca in un prato a 7

km di distanza dall’area frequentata dal caso precedente. Nei campioni di siero e CSF sono

state dimostrati gli anticorpi IgM ed IgG specifici mediante ELISA.

Infine, un terzo caso ha coinvolto un ragazzo di 15 anni, proveniente dalla stessa area dei

casi precedenti, che mostrava febbre e cefalea; nel siero sono stati trovati anticorpi

specifici anti-TBEV. Il paziente, riferiva di non aver subito punture di zecche, ma di essere

abituale consumatore di latte crudo.

Risultati

152

In entrambi i casi erano stati raccolti campioni di sangue intero, CSF ed urine per la ricerca

del genoma virale mediante tecniche molecolari, ma purtroppo non è stato possibile

identificare l’RNA del TBEV, forse perché non erano più in fase viremica dato che erano

già comparse le IgG. Di seguito vediamo riportati i valori ottenuti con i test ELISA:

DATA PRELIEVO

ANNO-MESE

ETÀ CAMPIONE IgM INDICE IgG INDICE real-time 3’NCR

01/07/13 2013-LUG 68 SIERO POS 5.36 POS 2.22 -

01/07/13 2013-LUG 68 SANGUE

EDTA - - - - NEG

01/07/13 2013-LUG 68 CSF POS

NEG - NEG

01/07/13 2013-LUG 68 URINE - - - - NEG

20/12/13 2013-DIC 68 SIERO Debolmente

reattivo 1.36 POS 3.14 -

10/07/13 2013-LUG 16 SANGUE

EDTA - - - - NEG

10/07/13 2013-LUG 16 CSF POS - NEG - NEG

10/07/13 2013-LUG 16 URINE - - - - NEG

10/07/13 2013-LUG 16 SIERO POS 5.48 Debolmente

reattivo 0.98 -

17/09/13 2013-SET 16 SIERO POS 5.00 POS 3.64 -

Tabella 25. Riassunto dei risultati (test sierologici e molecolari) dei campioni di due pazienti con TBEV del

2013. Gli indici IgG e IgM sono il rapporto tra i valori di assorbanza dei campioni ed il cut-off.

I test ELISA possono presentare reattività crociata tra anticorpi diretti nei confronti di

membri della famiglia Flavivirus. Per ovviare a questo è stato introdotto il test di

neutralizzazione di riduzione delle placche PRNT (Plaque Reduction Neutralization Test).

La metodica PRNT è stata applicata per la prima volta nel caso di TBEV nel paziente

immunocompromesso. Il siero ha mostrato capacità di inibizione virale. Il ceppo utilizzato

per la metodica è quello ottenuto dall’isolamento del pool di zecche raccolte a Raccolana

nel 2011, il cui titolo è stato calcolato e risulta 1.1E+07 (Figura 55). Nell’immagine

possiamo veder nei primi due pozzetti il controllo negativo (solo cellule) e a seguire le

varie diluizioni di virus da 1E-01 a 1E-05 analizzate in duplicato (due pozzetti per ogni

diluizione) per aumentare la riproducibilità del metodo.

Risultati

153

Figura 55. Titolazione del TBEV mediante test delle placche.

4.3. IDENTIFICAZIONE DEL WNV

La presenza del West Nile virus nella regione Friuli Venezia Giulia è stata riportata per la

prima volta nel 2011 (2 casi). Da allora sono stati implementati i sistemi di sorveglianza sia

veterinaria che su campioni umani.

Tra settembre e ottobre 2012 nel nostro laboratorio sono stati osservati complessivamente

7 casi di infezione da WNV: 5 presentavano una forma neuro invasiva e due, asintomatici,

sono stati individuati nelle analisi di screening dei donatori di sangue. I casi erano

localizzati nelle province di Udine, Gorizia e Pordenone e nella parte meridionale della

regione FVG.

Nel 2013 è stato possibile caratterizzare il virus di uno dei casi del 2012, una paziente, che

presentava sintomatologia neurologica ed era residente nella provincia di Gorizia. È stata

dimostrata la presenza del virus nelle urine (campione del 7/09/2012) mediante real-time

RT-PCR (ct=35) e PCR di sequenziamento. La sequenza di una regione di 930 pb del gene

env è stata allineata con alcuni ceppi ottenuti in Italia (Veneto e Ancona) negli anni

precedenti (mostrati in blu, Figura 56). L’analisi filogenetica ha rivelato che il virus

appartiene al Lineage 1 ed ha un’elevata identità con il ceppo Italy/2012/Livenza/31.1

identificato in provincia di Venezia nel 2012.

Non è stato possibile isolare il virus dal campione di urine su colture cellulari di Vero E6.

Risultati

154

Figura 56. Albero filogenetico di una regione di 930 pb del gene env del WNV. In rosso si può vedere la sequenza della paziente del 2012 da noi ottenuta retrospettivamente, allineata con alcuni ceppi ottenuti in

Italia (Veneto e Ancona) negli anni precedenti (blu).

Nella stagione 2013 in un solo caso, un paziente della provincia di Pordenone, si sono

riscontrate IgM (indice 1.51) ed IgG (indice 2.45) specifiche nel siero (prelievo del

23/10/2013) ma non è stato possibile dimostrare la presenza del virus a livello molecolare

anche perché il titolo anticorpale IgG era ormai elevato. Per escludere la possibilità di

cross-reattività con altri Flavivirus si è utilizzata la tecnica di PRNT e si è riscontrata una

neutralizzazione quasi completa (80%), come si può notare nella figura 57. Questo

conferma l’infezione di WNV anche se non è stato trovato l’RNA virale.

Risultati

155

Figura 57. Test PRNT con il campione di siero del paziente del 2013 affetto da WNV.

Durante la stagione di sorveglianza del 2014 per due pazienti sono state trovate IgM ed

IgG specifiche. Si tratta per entrambi i casi di infezioni contratte all’estero.

Il primo caso riguarda un uomo di 28 anni originario del Burkina Faso. Il paziente, in Italia

dal 2009, è stato ricoverato per febbre dopo qualche giorno dal rientro dal paese natale

dove era soggiornato nei mesi di luglio e agosto. Agli esami ematochimici presentava

leuco-piastrinopenia e alterazione delle transaminasi. Mostrava inoltre epatosplenomegalia.

Dopo aver escluso la diagnosi per malaria, essendo risultato negativo al test specifico, il

sospetto diagnostico era orientato su un’infezione da Dengue o Chikungunya virus. Anche

in questo caso il paziente è risultato negativo sia ai test molecolari che sierologici. Sono

invece risultati positivi gli anticorpi specifici per West Nile virus su siero (IgM positive

con indice di 1.85, IgG debolmente positive con indice di 0.46). Non è stato però possibile

trovare il virus in real-time RT-PCR. Non è esclusa una possibile reattività crociata con

altri Flavivirus.

Per il secondo caso, un signore di 47 anni appena tornato dalla Serbia (paese d’origine),

l’RNA virale è stato invece identificato su sangue-EDTA, liquido cerebrospinale ed urine.

Le cariche virali nei vari campioni biologici sono state determinate grazie all’uso di

campioni a concentrazione nota forniti di origine commerciale e la creazione di una curva

Risultati

156

standard.

DATA PRELIEVO

ANNO-MESE

ETÀ CAMPIONE IgM INDICE IgG INDICE

26/08/14 2014-AGO 28 SIERO POS 1.85 Debolmente

positivo 0.46

26/08/14 2014-AGO 28 URINE - - - -

05/09/14 2014-SET 28 SIERO Debolmente

positivo 0.95

Debolmente positivo

1.38

15/09/14 2014-SET 47 SIERO POS 2.91 POS 1.38

15/09/14 2014-SET 47 CSF Debolmente

positivo 0.66 NEG -

15/09/14 2014-SET 47 SANGUE

EDTA - - - -

15/09/14 2014-SET 47 URINE - - - -

DATA PRELIEVO ANNO-MESE ETÀ CAMPIONE REAL-TIME CT copie/µL

26/08/14 2014-AGO 28 SIERO - - -

26/08/14 2014-AGO 28 URINE NEG - -

05/09/14 2014-SET 28 SIERO - - -

15/09/14 2014-SET 47 SIERO - - -

15/09/14 2014-SET 47 CSF POS 36 7.78E+01

15/09/14 2014-SET 47 SANGUE

EDTA POS 32 1.26E+03

15/09/14 2014-SET 47 URINE POS 22 1.46E+06

Tabella 26. Riassunto dei risultati (test sierologici e molecolari) dei campioni di due pazienti del 2014. Gli

indici IgG e IgM sono il rapporto tra i valori di assorbanza dei campioni ed il cut-off.

Per entrambi i pazienti si è adoperata la metodica PRNT per confermare la diagnosi di

West Nile virus, previa titolazione (Figura 58). Il ceppo adoperato appartiene al Lineage1.

Per il primo paziente, il ragazzo rientrato dal Burkina Faso, non è stata osservata riduzione

di neutralizzazione; infatti come si può vedere dalla figura 59 il numero di placche è

Risultati

157

praticamente invariato per le diverse diluizioni del siero.

Il test PRNT è stato effettuato anche per il secondo paziente del 2014. In questo caso

invece la riduzione di neutralizzazione evidenziava un tasso di inibizione dell’85% (Figura

60).

Di seguito vengono riportate la piastre della titolazione del virus (Figura 58), la PRNT per

il paziente del Burkina Faso (Figura 59) e la piastra con la PRNT relativa al paziente della

Serbia (Figura 60). In ciasuna piastra, nei pozzetti 1 e 2 si trova il controllo negativo con

solo cellule, nei pozzetti 3 e 4 il controllo positivo con il virus WNV precedentemente

titolato, nei pozzetti 5 e 6 il virus più il terreno, nei pozzetti 7 e 8, 9 e 10 e 11 e 12

rispettivamente il virus più la diluizione 1: 5, 1: 10 e 1: 40 del siero. Nell’ultima diluizione

il numero di placche è uguale a quello del controllo virus+terreno.

Figura 58. Titolazione del WNV mediante test delle placche.

Risultati

158

Figura 59. PRNT con il siero di un paziente rientrato dal Burkina Faso. La riduzione di carica da neutralizzazione non si è osservata; probabile reattività crociata con altri Flavivirus.

Figura 60. PRNT con il siero di un paziente rientrato dalla Serbia. La riduzione di neutralizzazione è avvenuta in quanto il numero di placche contato nelle varie diluizioni di siero è particolarmente ridotto

rispetto ai controlli.

Risultati

159

Nel caso del paziente rientrato dalla Serbia, vista l’alta carica di WNV presente nelle urine

(1.46E+06), è stato possibile isolare il virus su colture cellulari di Vero E6. I surnatanti

sono stati prelevati e sequenziati. La sequenza ottenuta dall’amplificazione di una porzione

del gene C del capside è stata sottoposta ad analisi filogenetica per avere informazioni

sull’origine e l’evoluzione del ceppo virale responsabile, il quale è risultato appartenere al

Lineage 2. Vi sono omologie con i ceppi circolanti in Europa centrale e anche in Italia e

viene raggruppato nel cluster detto greco/ungherese (Figura 61).

Figura 61. Albero filogenetico di una regione del gene env del WNV. In rosso si può vedere la sequenza della paziente del 2014, allineata con alcuni ceppi apparteneti al Lineage 1 e al Lineage.

Inoltre, il ceppo ottenuto è stato titolato mediante tecnica delle placche (titolo di 2.35E+07)

e successivamente utilizzato nella metodica PRNT per verificare se i diversi lineage (1 e 2)

agiscono allo stesso modo nella neutralizzazione. Questo perché in letteratura non sono

descritte le caratteristiche lineage-specifiche della risposta neutralizzante, ma che per

analogia con altri Flavivirus, come ad esempio il Dengue virus, potrebbero condizionare il

test di PRNT.. Gli esperimenti effettuati non hanno evidenziato differenze di

neutralizzazione in funzione del lineage di WNV utilizzato.

Nella stagione di sorveglianza del 2015 sono stati trovati gli anticorpi specifici in tre

Risultati

160

donatori di sangue asintomatici (Tabella 27, 28). Per due casi sono state rilevate le IgM

mentre in un caso solo le IgG specifiche. L’RNA virale non è stato però riscontrato, forse

perché i campioni sono stati prelevati quando la fase viremica era ormai terminata.

CAMPIONE DATA PRELIEVO REAL-TIME

Donatore 1

PLASMA 27/08/2015 NEG


SANGUE-EDTA 08/09/2015 NEG


Donatore 2


URINE 10/09/2015 NEG

SIERO 10/09/2015 NEG


Donatore 3







Tabella 27. Campioni dei donatori asintomatici analizzati in real-time RT-PCR.

Risultati

161

CAMPIONE DATA

PRELIEVO IgM INDICE IgG INDICE

Donatore 1

PLASMA 27/08/2015 NEG - NEG -

PLASMA 08/09/2015 NEG - NEG -

SIERO 23/09/2015 NEG - POS 1.71

Donatore 2

SIERO 10/09/2015 NEG - NEG -

SIERO 12/09/2015 Debolmente

POS 1.02 NEG -

Donatore 3

SIERO 10/09/2015 Debolmente

POS 0.76 NEG -

SIERO 12/09/2015 POS 1.60 NEG -

SIERO 17/09/2015 POS 2.78 NEG -

Tabella 28. Campioni dei donatori asintomatici analizzati in ELISA.

Per escludere una possibile reattività crociata con altri Flavivirus, nel caso con IgG positive

è stata effettuata la metodica PRNT: sono stati rilevati gli anticorpi neutralizzanti quindi si

tratta sicuramente di un caso di WNV (Figura 62). La metodica PRNT è stata effettuata con

il protocollo standard: nei pozzetti 1 e 2 si trova il controllo negativo con solo cellule, nei

pozzetti 3 e 4 c’è il controllo positivo al titolo utilizzato nel test, nei pozzetti 7 e 8, 9 e 10 e

11 e 12 rispettivamente il virus più la diluizione 1:5, 1:10 e 1:40 del siero.

Negli atri due casi dei donatori non è stato possibile effettuare la conferma con la PRNT

perché non presentavano anticorpi di classe IgG e rimane pertanto il dubbio che possa

trattarsi di casi di cross-reattività.

Risultati

162

Figura 62. PRNT con il siero di un donatore di sangue asintomatico che presentava IgG specifiche anti-WNV. La riduzione della neutralizzazione è del 70%.

4.4. IDENTIFICAZIONE DI CHIKUNGUNYA E DENGUE VIRUS

Negli ultimi anni si è verificato un incremento di casi importati di Dengue virus e

Chikungunya virus; al fine di monitorare la circolazione di queste infezioni si è attuato un

sistema di sorveglianza.

Chikungunya virus

Nell’agosto 2014, una ragazza di 24 anni rientrata dalla Thailandia è risultata positiva alle

analisi di Chikungunya virus. In questo caso è stato possibile trovare l’RNA virale in real-

time RT-PCR, probabilmente perché l’infezione era ancora in fase acuta visto che sono

stati rilevati solo gli anticorpi di fase IgM (titolo maggiore di 40). Nelle cellule infettate si

è infatti osservato un pattern di fluorescenza a livello del citoplasma.

Sempre nello stesso periodo una donna di 45 anni mostrava nel siero anticorpi specifici

contro il CHIKV (sia IgM che IgG), ma non si è identificato il virus a livello molecolare.

Nell’ultimo anno abbiamo trovato altri 2 casi di CHIKV: un signore di 45 anni e uno di 52.

Per entrambi sono stati determinati gli anticorpi specifici con il test sierologico

dell’immunofluorescenza indiretta, ma non si è trovato l’RNA virale forse perché erano già

presenti elevati titoli di IgG. Nella tabella sottostante possiamo vedere riassunti i risultati ai

test sia sierologici che molecolari per i pazienti risultati positivi per CHIKV nel corso di

Risultati

163

questi anni.

DATA PRELIEVO

ANNO-MESE

ETÀ CAMPIONE IgM TITOLO IgG TITOLO real-time

06/08/2014 2014-AGO 24 SIERO POS >1:40 NEG - POS

06/08/2014 2014-AGO 45 SIERO POS <1:20 POS >1:128 NEG

17/06/2015 2015-GIU 52 SIERO POS >1:160 POS >1:256 NEG

08/07/2015 2015-AGO 45 SIERO POS >1:160 POS >1:256 NEG

Tabella 29. Riassunto dei risultati (test sierologici e molecolari) dei campioni dei pazienti con CHIKV.

Dengue virus

In real-time RT-PCR negli anni precedenti erano stati trovati 2 casi di pazienti positivi per

DENV nel 2010 e 3 casi DENV nel 2011 (Tabella 30). Non sono state possibili ulteriori

analisi molecolari retrospettive poiché i campioni non erano più disponibili.

DATA PRELIEVO

ANNO-MESE


18/08/2010 2010-AGO 52 SIERO POS 1:160 POS 1:80 -

18/08/2010 2010-AGO 52 SANGUE-EDTA - - - - POS

20/08/2010 2010-AGO 52 SANGUE-EDTA - - - - POS

10/09/2010 2010-SET 52 SIERO POS 1:80 POS >1:200 -

23/12/2010 2010-DIC 35 SIERO POS 1:160 POS 1:128 -

23/12/2010 2010-DIC 35 SANGUE-EDTA - - - - POS

05/09/2011 2011-SET - SANGUE-EDTA - - - - POS



Tabella 30. Riassunto dei risultati (test sierologici e molecolari) dei campioni dei 5 pazienti con infezione da

Dengue virus del 2010 e 2011.

Risultati

164

Altri 6 casi di DENV sono stati diagnosticati solo con tecniche sierologiche e i risultati

vengono di seguito riportati:

DATA PRELIEVO

ANNO-MESE

ETÀ CAMPIONE IgM TITOLO IgG TITOLO

23/12/2008 2008-DIC 52 SIERO POS 1:40 POS >1:160

23/12/2008 2008-DIC 53 SIERO POS 1:40 POS >1:160

18/05/2009 2009-MAG 53 SIERO NEG - POS >1:160

09/09/2010 2010-SET 57 SIERO POS 1:40 POS >1:100

04/10/2010 2010-OTT 46 SIERO POS 1:80 POS 1:800

28/02/2011 2011-FEB 36 SIERO POS 1:20 NEG -

17/04/2013 2013-APR 40 SIERO POS <1:10 NEG -

Tabella 31. Riassunto dei risultati dei campioni dei 6 pazienti con infezione da Dengue virus diagnosticati tra

il 2008 e il 2013 con test sierologici.

Tra il 2014 e l’inizio del 2016 sono stati identificati 5 casi di Dengue virus:

∗ un ragazzo di 23 anni ricoverato per febbre Dengue, rientrato da un viaggio in India

(vicino Calcutta) a metà ottobre 2014; presentava febbre, atromialgie, rash eritematoso

diffuso, irritazione congiuntivale, e, agli esami ematochimici, leuco-piastrinopenia e

PCR negativa. Sono stati ritrovati anticorpi specifici (IgM con titolo maggiore di 1:80 e

IgG con titolo 1:128) e l’RNA virale (ct=35); il campione di sangue-EDTA è stato poi

sottoposto a genotipizzazione;

∗ un 26enne rientrato da un viaggio in Costa Rica (ottobre-novembre 2014), ricoverato

per febbre Dengue; il paziente presentava gli stessi sintomi del precedente e in aggiunta

linfoadenomegalie laterocervicali e retronucali; sono stati inoltre riportati due episodi di

scariche diarroiche e un episodio di vomito in corso di febbre. Anche in questo caso

sono stati ritrovati anticorpi specifici (IgM con titolo minore di 1:20 e IgG con titolo

1:512) e l’RNA virale (ct=33); il campione di sangue-EDTA è stato poi sottoposto a

genotipizzazione;

∗ un uomo di 39 anni anche lui rientrato dalla Costa Rica (ottobre-novembre 2014); il

paziente mostrava una chiara sintomatologia riconducibile ad un’infezione da febbre

Dengue con febbre, atromialgie, rash eritematoso diffuso, irritazione congiuntivale; agli

Risultati

165

esami ematochimici si sono riscontrate leuco-piastrinopenia e PCR negativa. Con il test

dell’immunofluorescenza sono stati individuati anticorpi di classe IgM (titolo 1:10) ma

le IgG non erano ancora comparse. È stato possibile quindi individuare il genoma virale

sul campione di sangue-EDTA mediante real-time RT-PCR (ct=31) e successivamente è

stata condotta la caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento;

∗ un ragazzo di 23 anni rientrato dal Bangladesh nell’ottobre 2015. Il paziente ha

mostrato un titolo anticorpale maggiore di 1:100 sia per le IgM che per le IgG. Si è

riscontrato l’RNA virale in real-time RT-PCR (ct=37) e RT-PCR di sequenziamento. Il

campione è stato quindi genotipizzato.

∗ una donna di 38 anni, tornata da un viaggio in Thailandia e Cambogia ad inizio gennaio

2016. Alle indagini molecolari il campione è di sangue-EDTA è risultato positivo

(ct=37). Sono ancora in corso le analisi per la genotipizzazione.

Per alcuni di questi campioni, ovvero per i due pazienti tornati dalla Costa Rica e per il

ragazzo rientrato da Calcutta, si è tentato di isolare il virus su colture cellulari di Vero E6

ma senza successo.

DATA PRELIEVO

ANNO-MESE


19/11/2014 2014-NOV

23 SANGUE-

EDTA - - - - POS

18/11/2014 2014-NOV

23 SIERO POS >1:80 POS 1:128 -

19/11/2014 2014-NOV

26 SANGUE-

EDTA - - - - POS

18/11/2014 2014-NOV

26 SIERO POS <1:20 POS >1:512 -

05/12/2014 2014-DIC 26 SIERO POS 1:320 POS 1:1048 POS

19/11/2014 2014-NOV

39 SANGUE-

EDTA - - - - POS

18/11/2014 2014-NOV

39 SIERO POS 1:10 NEG - -

23/10/2015 2015-OTT 23 SANGUE-

EDTA - - - - POS

12/11/2015 2015-NOV

23 SIERO POS >1:100 POS >1:100 -

14/01/2016 2016-GEN 38 SANGUE-

EDTA - - - - POS

14/01/2016 2016-GEN 38 SIERO POS 1:100 POS >1:100 -

Tabella 31. Riassunto dei risultati dei campioni dei

5 pazienti con infezione da Dengue virus diagnosticati tra il 2014 e l’inizio del 2016 con test sierologici.

Risultati

166

DATA PRELIEVO

ANNO-MESE

ETÀ CAMPIONE real-time CT RT-PCR SIEROTIPO

19/11/2014 2014-NOV 23 SANGUE-EDTA POS 35 POS DEN1



23/10/2015 2015-OTT 23 SANGUE-EDTA POS 37 POS DEN1

14/01/2016 2016-GEN 38 SANGUE-EDTA POS 37 - -

Tabella 32. Riassunto dei risultati ai test molecolari dei campioni dei 5 pazienti con infezione da Dengue

virus diagnosticati tra il 2014 e l’inizio di gennaio 2016 in cui si è riscontrato l’RNA virale.

I campioni positivi alla real-time RT-PCR sono stati sottoposti a RT-PCR di

sequenziamento. Dalle analisi delle sequenze è emerso il sierotipo DEN1 in tutti e tre i

casi. Nell’albero filogenetico relativo al gene E del Dengue virus possiamo vedere le

sequenze di 3 pazienti del 2014 e di 1 del 2015 allineate con alcune sequenze

rappresentative dei vari sierotipi. Le sequenze da noi ottenute vengono mostrate in viola e

sono (Figura 63):

� DEN/FVG.ITA/47.2014/2/5057;

� DEN/FVG.ITA/47.2014/3/9176;

� DEN/FVG.ITA/47.2014/1/5056;

� DEN/FVG.ITA/43.2015/1/5184.

Figura 63. Albero filogenetico relativo alle sequenze dei pazienti del 2014 e di uno del 2015.

167

5. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI

I risultati ottenuti in questo progetto di dottorato di ricerca confermano che le arbovirosi

rappresentano un problema emergente di sanità pubblica per il nostro Paese e in particolare

per la regione Friuli Venezia Giulia. L’aumento dei viaggi internazionali e del commercio

ha cambiato la distribuzioni di queste infezioni a livello globale, facilitando la diffusione

dei vettori e dei virus in nuove aree, con caratteristiche climatiche e geografiche piuttosto

diverse da quelle di origine. Gli Arbovirus infatti possono essere introdotti da viaggiatori,

uccelli migratori o vettori trasportati attraverso gli scambi tra le nazioni. La zanzara tigre

ne costituisce sicuramente un esempio paradigmatico: la zanzara asiatica, Aedes

albopictus, è stata infatti introdotta in Italia tramite il commercio di pneumatici e si è poi

diffusa su tutto il territorio. In Emilia-Romagna è stata coinvolta in un’epidemia causata

dal Chikungunya virus a partire da un caso importato dall’India. La stessa specie di

zanzara è stata responsabile di casi autoctoni di Dengue virus in Francia ed in Croazia

[Roiz et al., 2012].

La sinergia tra sorveglianza entomologica, veterinaria e umana risulta essere un importante

strumento di monitoraggio delle arbovirosi, soprattutto nel caso di virus emergenti. Per

capire meglio la diffusione e distribuzione dei virus studiati nella nostra regione è utile

trattarli separatamente.

Nel corso di questi ultimi dieci anni l’attività di sorveglianza ha dimostrato che in Friuli

Venezia Giulia la TBE è endemica solo in alcune aree della regione, come le Prealpi

Orientali, la Valcanale, le Alpi Carniche e la zona dell’Alto Tagliamento. Il primo caso

autoctono di TBEV in FVG è stato riportato nel 2001; da allora sono stati identificati 86

casi di infezione, distribuiti prevalentemente nell’area alpina settentrionale. Nel 2013 sono

stati segnalati per la prima volta dei casi in provincia di Trieste, in particolare

nell’altopiano carsico [Caracciolo et al., 2015]. Analizzando i dati raccolti per la SIR FVG

(Sistema Informativo Regionale Friuli Venezia Giulia), si è osservato che il numero dei

casi risulta aumentato nel 2005 (11 casi), nel 2006 (10 casi), nel 2009 (10 casi), nel 2012

(11 casi) e nel 2013 (10 casi). La sintomatologia predominante è stata quella neurologica

(70 casi) e nella maggior parte i soggetti avevano più di 60 anni. Circa 1/3 dei pazienti

ricordava di aver subito un morso di zecca, 1/3 non ricordava di essere stato esposto al

Discussione e conclusioni

168

vettore e alcuni hanno riportato di essere stati in zone a rischio. I casi sono stati poi

suddivisi in base alla zona di esposizione al vettore dichiarata dall’anamnesi, così da

delineare la distribuzione geografica del rischio: la maggior parte delle infezioni è stata

contratta nelle Prealpi Carniche (17 casi), nella Valcanale (14 casi) e nel Canal del Ferro

(19 casi), zone in cui sono state rinvenute zecche positive grazie agli studi sui vettori da

noi effettuati nel corso degli anni. Alcuni contagi sono avvenuti al di fuori del FVG ovvero

in Austria, Slovenia e Ungheria, aree endemiche per TBEV.

La sorveglianza su Ixodes ricinus, vettore del sottotipo europeo del virus, si è dimostrata

un indicatore precoce e sensibile di malattia in quanto si è visto che le positività riscontrate

nei vettori nei siti campionati hanno preceduto l’insorgenza di nuovi casi di infezione

nell’uomo. Dagli studi condotti sui vettori nel corso degli anni si è dimostrata la presenza

del TBE virus in FVG in forma endemica. Un primo studio nel biennio 2005-06 aveva

evidenziato una prevalenza del virus nel vettore dello 0.27%, con una distribuzione

geografica concentrata in Canal del Ferro nei siti di Roveredo e Val Raccolana e con una

positività isolata a Forni di Sotto [D’Agaro et al., 2009], inizialmente considerata un falso

positivo e successivamente rivalutata alla luce del caso di TBE del 2009. Nel 2007 si è

evidenziata una prevalenza dello 0.28%, nel 2008 dello 0.48% e nel 2009 dello 0.58%, con

un apparente trend in crescita. La distribuzione delle zecche infette era inizialmente

raggruppata in una zona ben delimitata nella regione alpina del FVG, dove si erano

verificati i primi casi umani di TBE. L’area si è poi allargata fino a comprendere l’area

prealpina. La prevalenza di TBEV nelle zecche nelle stagioni 2011, 2012 e 2013 è risultata

complessivamente dell’1.3% nel 2011 (CI 95% 4.5 e 22.7%), dello 0.8% nel 2012 (CI

95% 2 e 22.1%) e dello 0.13% nel 2013 (CI 95% 0.4 e 30%). Valutando le prevalenze nelle

diverse aree geoclimatiche si possono osservate valori diversi e variabili. Nelle Prealpi

Carniche la prevalenza registrata nel corso degli anni è rimasta costante, ovvero è stata di

0.12% nel 2011 (CI 95% 0.1 e 5.2‰), 0.15% nel 2012 (CI 95% 0.1 e 6.6‰) e 0.14% nel

2013 (CI 95% 0.1 e 6.3‰). Nel Canal del Ferro invece i valori sono risultati di 0.5% nel

2011 (CI 95% 1.8 e 10.6‰), di 0.17% nel 2012 (CI 95% 0.1 e 7.5‰) e di 3.02% nel 2013

(CI 95% 21.1 e 60.1‰). Nel 2013 positività si sono registrate anche nella Carnia Centro-

orientale, con una prevalenza dello 0.99% (CI 95% 3.5 e 21.1‰), e nelle Prealpi Giulie,

con una prevalenza dell’1.18% (CI 95% 5.7 e 21.1‰). Questi valori sono comparabili a

quelli descritti in altre aree dell’Europa occidentale dove si rileva una prevalenza

generalmente compresa tra lo 0.2 ed il 2% [Suss et al., 2006].

Allo screening molecolare, sono risultati positivi ulteriori 5 pool di zecche raccolte a


169

Raccolana il 18 aprile e il 16 maggio 2011. Anche per la stagione 2012 sono risultati

positivi alle indagini molecolari ulteriori 4 pool di zecche raccolte a Pontebba il 15

maggio. Per la stagione 2013 sono risultati positivi ulteriori 13 quattro pool di zecche

ripettivamente quattro ad Amaro (raccolte il 14 maggio), sette a Lusevera (raccolte il 15

maggio) e due a Pontebba (raccolte il 18 maggio). Queste positività non sono però state

prese in considerazione nell’elaborazione dei dati perché presentavano una carica virale

molto bassa. Queste zecche erano contenute nelle stesse provette di zecche positive ad

elevata carica virale e le sequenze ottenute da questi pool erano identiche a quelle dei pool

con carica virale elevata. Riteniamo queste positività come effetto di una contaminazione

superficiale da parte della saliva infetta delle zecche positive ad elevata carica in un

momento successivo alla raccolta nella provetta o nella manipolazione dei vettori durante

la loro identificazione/classificazione.

Nel 2014 non ci sono state positività ma i dati sono parziali e non confrontabili con quelli

delle stagioni precedenti in quanto è stato effettuato un singolo campionamento stagionale

e non due come di routine. Infatti i pool, e quindi il numero di zecche, sono inferiori

rispetto alle altre stagioni: le zecche analizzate complessivamente sono state 2513, quasi la

metà rispetto alla stagione precedente (5097).

Per avere risultati affidabili sulle prevalenze totali è quindi necessario analizzare un

numero consistente di campioni.

La prevalenza per area geoclimatica invece non sembra essere correlata alla numerosità

delle zecche campionate; infatti zecche infette con TBEV sono state riscontrate sia in aree

come il Canal del Ferro dove in ogni stagione sono state raccolte quantità elevate di

zecche, sia in Valcanale dove ne sono state campionate il numero minore. È interessante

notare come aree in cui vi è un’abbondante densità del vettore, ovvero nelle Prealpi Giulie

e nelle Prealpi Carniche si siano trovate zecche infette solo nel 2013. A Lusevera infatti,

fino al 2013, non erano mai state rilevate positività nonostante l’elevato numero di vettori

campionati ogni stagione.

La distribuzione geografica dei campioni positivi conferma quindi la presenza di un’area

endemica che comprende il Canal del Ferro e le aree vicine della Valcanale, oltre ad

identificare un allargamento dell’area alla fascia prealpina della regione che coinvolge le

Prealpi Carniche e le Prealpi Giulie.

L’analisi molecolare ha evidenziato la circolazione di diverse varianti distinte del sottotipo

europeo occidentale. La differenze nelle sequenze ottenute, soprattutto quelle del gene Env

che sono più significative perché più lunghe, sembrano suggerire un’evoluzione dei virus


170

in relazione all’area di campionamento e quindi alla loro diffusione.

Le differenze nucleotidiche riscontrate tra i diversi campioni non solo sono importanti per

lo studio dell’evoluzione e dell’epidemiologia molecolare dei virus circolanti ma perché

confermano indirettamente la validità dei risultati escludendo la presenza di false

positività da contaminazione di laboratorio. Infatti, le tecniche di amplificazione

molecolare utilizzate per l'identificazione del TBEV nei campioni sono caratterizzate da

un'elevata sensibilità analitica essendo in grado di riconoscere poche copie di templato. La

bassa prevalenza e l’elevata sensibilità analitica possono comportare una drammatica

riduzione della predittività positiva legata principalmente a problemi di contaminazione

da ampliconi nelle tecniche di PCR tradizionale. Per ovviare a questo problema sono state

utilizzate nello studio due Real-time RT-PCR per l’amplificazione di regioni del 3’ NCR e

del gene E. La real-time RT-PCR infatti, essendo un sistema di amplificazione chiuso, è

meno soggetta a problemi di contaminazione e di false positività e semplifica la

quantificazionedell templato presente nel campione.

L’analisi molecolare e lo studio filogenetico relativo al gene NS5 dei campioni 2011-2012

confermano la circolazione nell’area studiata di virus appartenenti al sottotipo europeo

occidentale. Le sequenze ottenute si raggruppano in cluster evolutivi differenti: il

principale presenta un elevato grado di identità con il ceppo finlandese Isosaari; un altro

gruppo comprende ceppi in parte riconducibili alla variante Hypr circolante nei paesi

vicini, Slovenia e Austria; in particolare vi sono delle similitudini con il ceppo sloveno

Cerkno H55.

Nell’analisi molecolare relativa al gene env, i ceppi identificati nei pool del 2011 si

raggruppano assieme a quelli ottenuti nella stessa area geoclimatica (Canal del Ferro) negli

anni precedenti e hanno elevate omologie con ceppi sloveni (Slovenia.Trzic/H-58/2009 e

Ljubljana) e con il ceppo tedesco EU872053/T1401/Germania. Il ceppo ottenuto dal

campione del 2012 si raggruppa invece con un ceppo svizzero, HM46819

Unterengstringen (CH), molto simile al ceppo da noi isolato da un campione umano del

2013 (FVG/H-ZT1941/2013).

La sequenza relativa al gene NS5 ottenuta dal pool di Lusevera del 2013 si raggruppa

invece con i campioni positivi degli anni precedenti (2005, 2006 e 2007) e mostra

omologie con il ceppo Neudoerfl (ceppo vaccinale). La sequenza di Tramonti di Sopra del

2013 risulta legata filogeneticamente con il ceppo Toro, mostrando omologie con ceppi del

2011 e 2012 e con un campione umano del 2004, oltre che con un campione umano del

2012. Le varianti Toro e Neudoerfl circolano entrambi in Austria e Slovenia. La sequenza


171

del pool di Pontebba (sempre del 2013) presenta un elevato grado di identità con il ceppo

finlandese Isosaari. Un ulteriore cluster evolutivo raggruppa la sequenza di Amaro del

2013 e ceppi da noi isolati nel FVG nelle stagioni precedenti, includendo anche un caso

umano del 2012.

Per quanto riguarda il gene env, le sequenze di Amaro e Pontebba 2013 si raggruppano in

un cluster evolutivo legato a ceppi isolati in Slovenia (Ljubljana-like). Il pool di Tramonti

di Sopra è legato filogeneticamente ai campioni umani del 2012 e al ceppo sloveno

Cerkno/H-55/2007. Infine la sequenza di Lusevera mostra elevate omologie con i ceppi

appartenenti al cluster ceco Stara Ves.

Come già detto, le aree più interessate dall’infezione sono risultate essere la zona alpina e

prealpina delle province di Udine e di Pordenone. Fino al 2013 non era stato documentato

nessun caso autoctono di TBE nelle province di Gorizia e di Trieste. Quest'ultima è

caratterizzata da un’elevata diffusione della zecca Ixodes ricinus, spesso portatrice di

Borrelia burdgorferi, agente eziologico della malattia di Lyme. La prevalenza di B.

burdgorferi nelle zecche del Carso triestino è la più alta della regione (≥ 40%). I tre casi

diagnosticati nel 2013 nella provincia di Trieste potrebbero essere associati ad una

diffusione di zecche infette provenienti da aree limitrofe confinanti con la Slovenia, zona

endemica per il virus [Knap et al., 2013].

Il primo caso diagnosticato in provincia di Trieste vede coinvolto un paziente con linfoma

a cellule B e neoplasia a cellule dendritiche plasmocitoidi blastiche. L’infezione si è

caratterizzata da una prolungata presenza del virus nel sangue e nelle urine. L’infezione è

stata confermata con metodi sierologici evidenziando una chiara positività per gli anticorpi

di classe IgM, mentre le IgG hanno mostrato un decorso atipico: il paziente aveva un

deficit di produzione di IgG specifiche. Da quanto emerge dalla letteratura, questo è anche

il primo caso riportato di infezione persistente di TBEV in un paziente immunodepresso.

Vi sono infatti documentate infezioni più brevi in animali con sistema immunitario

compromesso come criceti e topi diabetici affetti da WNV [Mateo et al., 2006; Kumar et

al., 2012], ma si sa ancora poco di quanto accade nell’uomo. Inoltre va sottolineatoche

l’escrezione urinaria del TBEV è stata dimostrata solo recentemente [Veje et al., 2014] e

che la viremia è stata identificata nella frazione eritrocitaria, mentre solitamente il

bersaglio dei Flavivirus è costituito dalla linea monocito-macrofagica. Quest’ultima

interessante caratteristica era già stata descritta precedentemente in merito a infezioni da

WNV in donatori di sangue [Rios et al., 2007]. Si pensa che la presenza del virus a livello


172

eritrocitario potrebbe determinare un rischio di trasmissione attraverso trasfusioni nelle

aree endemiche per TBE virus. La dimostrazione della presenza del TBE virus nelle urine,

invece, potrebbe diventare un utile strumento per la diagnosi e per gli studi di

epidemiologia molecolare. Tuttavia rimane da chiarire se la presenza del virus nelle urine

sia confinata a casi particolari, come ad esempio in soggetti immunodepressi, oppure possa

essere ricercata nella diagnosi di routine. Dalle analisi filogenetiche si è riscontrata sia una

forte omologia tra le sequenze del paziente e quelle dei ceppi isolati in Slovenia e in

Europa centrale e settentrionale (sottotipo europeo) sia una somiglianza con i ceppi da noi

isolati dai vettori.

Dopo i tre casi di TBE del 2013 non sono stati segnalati altri casi, probabilmente perché

osservando i dati di copertura vaccinale della regione FVG, c’è stato un aumento di

vaccinazioni. Il numero dei soggetti vaccinati è più elevato nella provincia di Udine (più di

31 mila dal 2006 al 2014), seguito da Pordenone (oltre gli 11 mila), mentre la copertura

vaccinale in provincia di Gorizia e di Trieste è minore, con circa 3 mila e 5 mila soggetti

vaccinati rispettivamente. Nella provincia di Trieste nel 2013 e 2014 la percentuale di

vaccinati è aumentata del 50% (936 vaccinazioni nel 2013 e 869 nel 2014). Il calo di

incidenza dell'infezione potrebbe essere peraltro spiegato anche da una diminuzione di

positività nei vettori.

Il West Nile virus è presente in Italia dal 1998 (epidemia in cavalli in Toscana). Nel 2008

sono stati segnalati i primi casi di forme neuro invasive in Emilia-Romagna (FE e BO) e in

Veneto (RO), in concomitanza di un’estesa epidemia nei cavalli (più di 700). Nel 2009

l’infezione si è diffusa alle province di Modena, Mantova e Venezia seguita da un

rallentamento nel 2010 con soli tre casi in Veneto. Nel 2011 si sono avuti invece 8 casi in

Veneto, 4 in Sardegna e 2 nel Friuli Venezia Giulia. Dal 2009 è stato attuato, nelle zone di

circolazione virale, lo screening delle donazioni di sangue con NAT (Nucleic acid testing).

Tra settembre e ottobre 2012 nel nostro laboratorio sono stati osservati complessivamente

7 casi di infezione da WNV. Negli anni successivi si sono riportati 1 caso per il 2013, 2 per

il 2014 (casi importati) e 3 casi in donatori di sangue asintomatici nel 2015.

La sorveglianza ha potuto identificare e confermare nel corso degli anni la circolazione del

WNV sul territorio regionale. L’analisi filogenetica delle sequenze del paziente del 2012

condotta retrospettivamente ha rivelato che il virus appartiene al Lineage 1 ed ha

un’elevata identità con il ceppo Italy/2012/Livenza/31.1 (Venezia 2012). Il ceppo di West

Nile virus da noi isolato nel 2014 mostra invece forti omologie con i ceppi del Lineage 2


173

circolanti in Europa centrale (Austria 2008 e Serbia 2013) e meridionale (Grecia e Italia

2013), raggruppandosi nel così detto cluster greco/ungherese. I diversi lineage sono in

circolazione da diversi anni e si diffondono lentamente ad aree vicine. In questa

trasmissione e diffusione gioca un ruolo fondamentale il fatto che il virus sopravvive nelle

zanzare durante la stagione invernale e si amplifica nelle popolazioni di volatili locali,

mentre la reintroduzione del virus da parte di uccelli migranti dalla lunga distanza Africa-

Europa sembra essere associata all’introduzione di nuovi virus (lineaggi). Infatti il WNV è

mantenuto in natura da un ciclo di trasmissione zanzara-volatile-zanzara, in particolare del

genere Culex.

Da segnalare inoltre che per l’anno 2014, nei paesi europei e del bacino mediterraneo, sono

stati riportati 136 casi. Di questi, 51 sono stati segnalati in Serbia, paese d’origine del

paziente preso da noi in esame e 9 in Italia Settentrionale.

Una particolare attenzione va posta alla questione dei donatori di sangue asintomatici: solo

nel 2015 l’Istituto Superiore di Sanità (ISS) ha segnalato 13 positività per WNV in

donatori di sangue in Emilia Romagna ed in Lombardia. Nella nostra regione sono stati

evidenziati nello stesso anno 3 casi, solo con diagnosi sierologica e in un unico caso anche

mediante conferma con test PRNT.

Si rende quindi necessario segnalare tempestivamente i casi di infezione in modo da poter

aggiornare l’elenco dei Paesi esteri e delle zone italiane a rischio per il diffondersi del

virus. Infatti le donazioni vanno sospese per 28 giorni dopo aver lasciato una zona con casi

di malattia nell’uomo nell’anno in corso nei periodi di endemia o dopo la risoluzione dei

sintomi se il donatore ha contratto l’infezione. Per ciò che riguarda l’Italia, nel 2015, non

hanno potuto donare sangue per 28 giorni tutti i soggetti che hanno soggiornato anche solo

per una notte nell’area occidentale della Sardegna, nella pianura padana e in alcune aree

del Friuli Venezia Giulia. Stessa profilassi è stata adottata per Canada, Stati Uniti e alcuni

Paesi dell’Unione Europea (Romania, Israele, Austria, Serbia, Ungheria, Portogallo).

È importante sottolineare che generalmente le arbovirosi causate da TBE e WN virus

rimangono asintomatiche. Infatti solo una minoranza dei pazienti sviluppa una

sintomatologia, che è spesso aspecifica e può facilmente essere confusa con una generica

infezione da virus influenzale. La patologia si risolve spontaneamente nel giro di qualche

giorno e non si ha bisogno di cure mediche specialistiche. Nei casi più gravi, in cui vi è

coinvolgimento neurologico, la sintomatologia non è specifica ed è spesso sovrapponibile

ad altre sindromi neurologiche. Per questi motivi, i criteri diagnostici devono includere una


174

combinazione di valutazioni cliniche e di prove di laboratorio ad ampio spettro.

L’identificazione del genoma virale mediante tecniche molecolari è complicata dal fatto

che la viremia è piuttosto breve, che generalmenteè assente quando insorgono i sintomi e

che il titolo del virus è basso. Spesso i campioni vengono prelevati quando la viremia è già

terminata e il titolo anticorpale è ormai elevato, rendendo difficile l’identificazione dei

patogeni. La diagnosi sierologica di queste infezioni, che si basa principalmente su

tecniche immuno-enzimatiche, può dare problemi di reattività crociata tra membri della

famiglia Flavivirus filogenicamente correlati. Questo fenomeno avviene perché nella

risposta immunitaria vengono prodotte immunoglobuline specifiche, principalmente dirette

verso la proteina E che contiene determinanti antigenici comuni a tutti i Flavivirus. Il test

di neutralizzazione di riduzione delle placche (PRNT) si è dimostrato utile per rilevare gli

anticorpi neutralizzanti, incrementando la specificità e superando il problema della cross-

reattività degli anticorpi. Questa metodica è stata particolarmente utile ad esempio

nell’escludere la diagnosi di WNV in un paziente del 2014 rientrato dal Burkina Faso, nel

cui siero erano stati identificati anticorpi specifici anti-WNV. Si tratta però di una metodica

più lunga e laboriosa che richiede l’uso di colture cellulari in strutture adeguate

(laboratorio di biosicurezza di livello 3). Questo test purtroppo non può essere facilmente

impiegato nelle analisi di routine e in qualunque struttura sanitaria. La tempestiva raccolta

di campioni è quindi fondamentale per la diagnosi e per successivi studi epidemiologici.

Inoltre, vista la sintomatologia simile tra le diverse arbovirosi, si ritiene fondamentale

implementare le metodiche per poter identificare diversi patogeni emergenti. Si sta già

cercando infatti di mettere a punto dei protocolli per l’identificazione ed il sequenziamento

di Flavivirus emergenti e Toscana Virus, di cui è documentata la presenza in Europa e

soprattutto in Italia.

La diffusione di patologie trasmesse da vettori è sicuramente aumentata a causa della

globalizzazione, dell’incremento dei trasporti internazionali (scambio di merci) e di viaggi

in aree endemiche, dell’introduzione di specie esotiche di zanzare in aree in cui possono

costituire i potenziali vettori di infezioni esotiche, dell’inadeguato controllo dei vettori, dei

cambiamenti climatici. Questo ad esempio è avvenuto in Asia dove si è ormai diffusa la

Yellow Fever, infezione trasmessa da Ae. Aegypti in Africa e Sud America. Anche la

diffusione del WNV nel 1999 negli Stati Uniti, come già detto, ha dimostrato che gli

Arbovirus sono in grado di insediarsi in una nuova area, se trovano vettori efficienti e

vertebrati suscettibili [Lanciotti et al., 1999]. Altro esempio è la diffusione della Dengue


175

fever arrivata nelle Americhe, del Chikungunya virus nei Caraibi e in America Centro-

meridionale nel 2013 e dello Zika virus in Brasile e in America Centro-meridionale [Fauci

et al., 2016]. Per quanto riguarda il Dengue virus sono aumentate anche le epidemie

causate da più di un sierotipo (iperendemicità) e la popolazione è a rischio sia nelle aree

tropicali che subtropicali.

Negli ultimi anni si è verificato un incremento di casi importati di Dengue virus e

Chikungunya virus anche nel nostro Paese. Tra il 2014 ed il 2015 si sono riportati infatti 4

casi di infezione da Chikungunya virus e 5 da Dengue virus. Altri 6 casi di Dengue virus

erano stati diagnosticati nell’arco di 5 anni (dal 2008 al 2013).

Con l’immunofluorescenza indiretta vengono rilevati gli anticorpi diretti contro tutti e 4 i

sierotipi del DENV. Questi sono morfologicamente ed immunologicamente simili, pertanto

sono prevedibili eventuali cross-reazioni. Una differenziazione è stata possibile però

comparando i diversi titoli anticorpali. Solo con il sequenziamento si è potuto individuare

con certezza il sierotipo. Nei casi in cui è stata possibile la genotipizzazione, il sierotipo

identificato è stato il Dengue 1.

I viaggiatori infetti rappresentano un problema di sanità pubblica perché, ritornando nelle

città natali ancora viremici, possono dar luogo ad infezioni autoctone in quanto nel nostro

Paese le zanzare del genere Aedes sono ormai molto diffuse.

Concludendo, i risultati dello studio del TBE virus nelle zecche I. ricinus evidenziano un

progressivo incremento della prevalenza nel vettore dal 2005 al 2011, per poi diminuire nei

due anni successivi. Durante il corso degli anni si è osservato anche un allargamento

dell’area interessata dall’infezione da TBEV alla fascia prealpina della regione. La

sorveglianza entomologica si conferma quindi un buon indicatore (precoce e sensibile) di

circolazione virale. I dati relativi alla caratterizzazione molecolare dei campioni positivi

confermano la circolazione di virus appartenenti al sottotipo europeo nell’area studiata. Le

differenze nucleotidiche riscontrate tra i diversi campioni confermano la validità dei

risultati e permettono di raggruppare le sequenze in cluster evolutivi in parte riconducibili

alle varianti circolanti nei paesi vicini (Austria e Slovenia), ma anche in territori più

distanti come la Germania e la Repubblica Ceca. Inoltre, i tre casi di TBE identificati nel

corso del 2013 nella provincia di Trieste suggeriscono una recente diffusione di zecche

infette da TBEV anche nel territorio, finora indenne, della provincia di Trieste ed in

particolare nell’area del Carso triestino.

Dal piano regionale delle vaccinazioni per TBEV si è notato un aumento del numero di


176

vaccinati negli ultimi tre anni: rimane da capire se è per questo che è calata l’incidenza o se

è reale il calo della prevalenza del virus nel vettore osservato negli ultimi anni. Si conferma

in ogni caso l’importanza della profilassi vaccinale nella regione FVG, resa gratuita per

tutti i residenti dal 2012 (DGR n.1311).

Grazie all’attiva sorveglianza si è potuta identificare e confermare nel corso degli anni la

circolazione del WNV sul territorio regionale. Il ceppo di West Nile virus del 2012

(Lineage 1) e quello da noi isolato nel 2014 (Lineage 2), dimostrano la circolazione di

virus diversi legati in parte alla sopravvivenza del virus nei vettori durante la stagione

invernale ma anche all’introduzione nel territorio di nuove varianti.

Negli ultimi anni i cambiamenti climatici e la globalizzazione hanno aumentato il rischio

di introduzione e di diffusione anche di patologie trasmesse da vettori di origine tropicale.

Si è infatti verificato un incremento di casi importati di infezioni causate da virus quali

Dengue virus e Chikungunya virus.

Rimane tutt’oggi il problema della tempestiva raccolta di campioni per la diagnosi di

infezione da Arbovirus e per successivi studi epidemiologici e la necessità di implementare

le metodiche per poter diagnosticare con certezza questi patogeni. La tecnica PRNT messa

appunto si è dimostrata una metodica specifica consentendo di superare (anche se ancora

non del tutto) il problema di cross-reattività tra Flavivirus. Sono in corso ulteriori studi per

poter identificare altri Flavivirus emergenti tramite metodiche molecolari.

Alla luce di quanto è emerso in questa tesi, risulta importante continuare l’attività di

sorveglianza delle Arbovirosi sia per problemi legati alla sanità (donatori infetti

asintomatici) sia per la possibile insorgenza di casi autoctoni a partire da casi importati

viremici.

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48° congresso nazionale SItI 2015 - Milano 14-17 0ttobre (Poster T06-P163).

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RINGRAZIAMENTI

Non sono mai stata brava a esprimere a parole l’affetto che provo per le persone che mi

circondano, ma mi rendo conto che talvolta è importante farlo e questa mi pare un’ottima

occasione. Il mio pensiero va quindi a tutte le persone che mi sono state vicine, a tutti

quelli che hanno creduto (e credono!!) in me e mi hanno sostenuta, in diversi modi e

misure, in questo lungo percorso.

Vorrei ringraziare in particolare il Prof. D’Agaro per avermi dato la possibilità di lavorare a

questo progetto presso il Laboratorio di Virologia, per avermi aiutata a formarmi

professionalmente grazie alla sua competenza e agli utili suggerimenti e consigli.

Ringrazio la mia correlatrice, la Dott.ssa Santon (AuarDani), nonché amica e compagna di

banco, per il prezioso supporto e per aver sempre creduto in me, accompagnandomi in tutti

questi anni.

Un grazie va anche a Elena e Sara, non solo per il supporto tecnico, ma soprattutto per

l’affetto e l’amicizia che non mi hanno mai fatto mancare, per le pause-merenda, per i caffè

e per gli attesissimi panino-day!

Ringrazio infinitamente i miei genitori per il loro sostegno e per avermi dato tutti i mezzi

possibili per arrivare fin qui.

Ringrazio tutti i miei amici, quelli veri; sono consapevole di essere molto fortunata ad

essere circondata da persone splendide su cui posso contare in ogni istante; ognuno di loro

a suo modo ha contribuito a rendermi migliore e a fare di me quella che sono oggi.

Infine, the last but not the least, un pensiero speciale va al mio ragazzo Marco per essermi

sempre stato accanto e per avermi incoraggiata ad andare avanti nonostante le difficoltà

incontrate, sopportandomi e supportandomi. È a lui, l’altra parte di me, il mio punto di

riferimento, il mio futuro, che dedico questo successo.

Grazie di cuore a tutti!

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