DIAGNOSTICA DI LABORATORIO

2

WWW.FISIOKINESITERAPIA.BIZ

Gli autoanticorpi più comunementericercati nelle malattie autoimmuni

sistemicheFattore reumatoideAnticorpi anti-fosfolipidiANA (anticorpi anti-nucleo)Anticorpi anti-DNAAnticorpi anti-ENAANCA

Gli autoanticorpi: significato clinico

Valore diagnostico: anticorpi marker

Valore prognostico: correlazione fra anticorpidi determinate specificità e danno d’organo o attività di malattia

Il ruolo del laboratorio nelladiagnostica delle connettiviti

sistemicheMetodiche:

immunofluorescenzaimmunoelettroforesiELISAimmunoblot

Fonte di antigeni:tessutiestratti tissutaliproteine purificateproteine ricombinanti

Anticorpi anti-nucleoDeterminatiDeterminati mediantemediante immunofluorescenzaimmunofluorescenzaindirettaindiretta susu fegatofegato didi rattoratto o o susu lineelinee cellularicellulariumaneumane (Hep2).(Hep2).Il diverso pattern di fluorescenza si correlacon la specificità degli anticorpi.

♦ Diffuso: anti-complesso DNA-istoni♦ Periferico: anti-DNA♦ Speckled: anti-snRNP o anti-SSA o anti-SSB♦ Nucleolare: anti-RNA nucleolare♦ Centromerico: anti-centromero.

Determinazione di ANA

SubstratoSubstrato: : lineelinee cellularicellulari eses HEp2 (HEp2 (linealinea epitelialeepiteliale dadacarcinoma carcinoma laringeolaringeo umanoumano))

Le Le lineelinee cellularicellularicontengonocontengono pipiùù cromatinacromatinacontengonocontengono antigeniantigeni espressiespressi in in tuttetutte le le fasifasi del del ciclociclocellularecellulareconsentonoconsentono didi determinaredeterminare anticorpianticorpi speciespecie--specificispecifici

Anticorpi anti-nucleo

La determinazione dei pattern di fluorescenzanon è nè sensibile nè specifica.Spesso si modifica con la diluizione del siero per la presenza simultanea di anticorpi di diversaspecificità.Necessarie altre tecniche per determinare la natura dell’antigene riconosciuto.

Anticorpi anti-nucleoUtili per la diagnosi Talvolta utili per la diagnosi

Malattia % Positività Malattia % PositivitàLES 95-100 SS 40-70SSc 60-80 PM/DM 30-80Utili per il monitoraggio o per la prognosi Parte integrante per la diagnosiMalattia % Positività Malattia % PositivitàRA giovanile (uveite) 20-50 LES da farmaci 100Fen. Raynaud 20-60 Epatite Autoimm. 100

MCTD 100Non utili per la prognosi Non utili per la diagnosiMalattia % Positività Malattia % PositivitàRA 30-50 Imp. Silicone 15-25MS 25 Fibromialgia 15-25ITP 10ITP 10--30 30 ParentiParenti didi pazpaz. . autoimmuniautoimmuni 55--2525M. Tiroide 30-50 M.Infettive variaDLE DLE 55--25 25 NeoplasieNeoplasie variavaria

ANA in malattie non autoimmuni

Malattie infettive (ascessi cronici, TBC, endocardite batterica subacuta, malaria, EBV)In corso di neoplasieIn corso di terapie con farmaci noti per indurrequesto tipo di autoanticorpi e non sempre associati con manifestazioni cliniche(procainamide, idralazina, isoniazide, cloropromazina, beta bloccanti etc)Parenti (apparentemente sani) di pazienti con malattie autoimmuni sistemiche

ANA positive healthy subjects1:401:40 32%32%1:1601:160 5%5%

(Tan et al, Arthritis Rheum, 1997)(Tan et al, Arthritis Rheum, 1997)

1:401:40 27%27% (34% women, 18% men)(34% women, 18% men)1:1601:160 8%8% (13%women, 3% men)(13%women, 3% men)

SPECIFICITYSPECIFICITY SENSITIVITYSENSITIVITY1:401:40 7373 92921:1601:160 9292 8181

(Hayashi et al, (Hayashi et al, ClinClin ChemChem, 2001), 2001)

Specificity of anti-DNAantibodies in lupus

Denatured DNANative and denatured DNANativeBase sequencesZ-DNA

Antigenic determinants in DNA

Purines and pyrimidinesNucleosidesSugar-phosphate backbone

Structure of anti-DNA antibodies

Minority: encoded by unmutated germ line genesMajority:

mutated in third hypervariable regionhigh replacement/silent mutationsincrease in arginine and asparagine

Specificity ofanti-DNA antibodies

Polyspecific in the binding of:Nucleic acidsCardiolipin and phospholipidsProteins

Comparison of assays that detect anti-nDNA antibodies

assay high affinityanti-DNA

low affinityanti-DNA

specificity sensitivity

Farr assay + - high highELISA + + low highCrythidia Luciliae + + high low

Sensitivity SpecificityCLIF 99ELISA 70 84

62

DeterminazioneDeterminazione deglidegli ENAENA

ControimmunoelettroforesiControimmunoelettroforesi ((estrattiestrattiantigeniciantigenici: : timotimo o o milzamilza o o renerene))ELISA (ELISA (proteineproteine purificatepurificate e/o e/o proteineproteinericombinantiricombinanti))immunoblotimmunoblot ((estrattiestratti antigeniciantigenici))dot blot (dot blot (proteineproteine purificatepurificate e/o e/o proteineproteinericombinantiricombinanti))

Determinazione degli ENACIE: CIE: moltomolto specificospecifico, , pocopoco sensibilesensibile, non , non

automatizzabileautomatizzabile, non , non quantitativoquantitativo, , risultatirisultati in 3 in 3 giornigiorni..ELISA: ELISA: moltomolto sensibilesensibile, , risultatirisultati in in pochepoche ore, ore,

automatizzabileautomatizzabile, , quantitativoquantitativo, , specificitspecificitàà variabilevariabile..Western blot: Western blot: sensibilesensibile, , didi difficiledifficile interpretazioneinterpretazione..Dot blot: Dot blot: caratteristichecaratteristiche similisimili ad ELISAad ELISA

Le Le specificitspecificitàà comunementecomunemente determinate determinate sonosono 6: 6: antianti--SSA; antiSSA; anti--SSB; antiSSB; anti--SmSm; anti; anti--RNP; antiRNP; anti--SclScl70; anti70; anti--Jo1.Jo1.

Anti-Sm: marker di LES; la sensibilitˆ clinica varia dal 15 al 30%. Anti-U1RNP: Presenti nel 30-40% dei pazienti con LES; ad alto titolo costituiscono criterio diagnosticoirrinunciabile per la diagnosi di MCTD.Anti-SSA/Ro: Nei pazienti con SS sono presentifino al 60% se testati con immunodiffusione e fino al 90% se testati con ELISA; si associano piùfrequentemente a interessamento extraghiandolare. Possono inoltre essere presenti in circa il 30% deipazienti con LES. Alti titoli sono un fattore di rischioper lupus neonatale.

Anticorpi anti-ENA

Anti-SSB/La:Sia nei pazienti con SS che in quelli con LES sono presenti con frequenzainferiore rispetto agli anticorpi anti SSA/Ro. Si associano a lupus neonatale.Anti-centromero: associati a SSc limitata. Anti-Topoisomerasi I (Scl70): associati a SScdiffusa. Anti-Jo-1: specifici per PM/DM. Associati ad interstiziopatia polmonare e artrite.

Anticorpi anti-ENA

Anticorpi anti-ENA:specificità rare

Anti-PM-Scl, si associa a miopatia.Anti-U3-RNP (fibrillarina), presente nel4-8% dei pazienti con SSc.Anti-RNA polimerasi I, più frequentenelle forme progressive di SSc.Anti-polimerasi III, comune nella SSc.Anti-PCNA, si associa a LES in faseattiva.

A) 3D Rekonstruktion von U1 snRNP bei 1 nm Auflösung.B) U1 snRNP (semitransparent) mit Interpretation des molekularen Aufbaus. Das erhaltene Strukturmodell zeigt die Lageder einzelnen Proteine (A, 70K, C und Sm Heptamer-Ring) und der RNA (dunkelblau, rot und orange) von U1 snRNP.

Directed against the ribosomal P proteins P0, P1 e P2, Directed against the ribosomal P proteins P0, P1 e P2, acidic proteins localized in the major ribosomal subunit.acidic proteins localized in the major ribosomal subunit.

These proteins share the CThese proteins share the C--terminal sequenceterminal sequencewhich is the target of antiwhich is the target of anti--P antibodies.P antibodies.The antibodies are detected by The antibodies are detected by immunoblotimmunoblot on ribosomal on ribosomal

extracts or by ELISA on the Cextracts or by ELISA on the C--terminal sequence of P terminal sequence of P proteinsproteins

Anti-ribosomal antibodies

Anti-ribosomal antibodies in SLEFirst described in 1985 (First described in 1985 (ElkonElkon et al, J Exp et al, J Exp Med,162, 459)Med,162, 459)

Association with Association with neuropsychiatricneuropsychiatric manifestations manifestations suggested in 1987 (suggested in 1987 (BonfaBonfa et al, N et al, N EnglEngl J Med, J Med, 317, 265)317, 265)

Several studies thereafter (retrospective or Several studies thereafter (retrospective or prospective) gave very discordant resultsprospective) gave very discordant results

Anti-ribosomal antibodies and neuropsychiatric manifestations

Discordant results may be due to:Discordant results may be due to:different methods to detect antidifferent methods to detect anti--P antibodiesP antibodiesdifferent study formatdifferent study formatheterogeneity in the diagnostic criteria for heterogeneity in the diagnostic criteria for neuropsychiatricneuropsychiatric disordersdisorderslimited role of antilimited role of anti--P antibodies in the P antibodies in the pathogenesis of pathogenesis of neuropsychiatricneuropsychiatric disorders disorders

Anti-ribosomal antibodies:clinical associations

Associated with:Associated with:skin manifestationsskin manifestationshepatic involvementhepatic involvementrenal involvementrenal involvementdisease activitydisease activityleukopenialeukopenia

Frequently are detected in antiFrequently are detected in anti--SmSm and antiand anti--dsDNAdsDNApositive sera: positive sera: coexpressioncoexpression of 2 of 2 autoantibodiesautoantibodiesor double specificity of the same antibody or double specificity of the same antibody population?population?

Anti-C1q antibodiesDirected against the collagenDirected against the collagen--like region of C1qlike region of C1q

DetectedDetected in: in: SLESLE IgGIgG→→ 2020--80%80%Urticaria vasculitis syndromeUrticaria vasculitis syndrome

IgGIgG→→ 100%100%IgA nephropathyIgA nephropathy IgAIgA →→ 30%30%

IgG IgG →→ 2,5 %2,5 %Rheumatoid vasculitisRheumatoid vasculitis IgAIgA →→ 29%29%

IgGIgG →→ 61%61%

ANCAanti-citoplasma dei neutrofili

Anti-mieloperossidasi: sindrome diChurg-Strauss.Anti-proteinasi 3: granulomatosi diWegener.