DIAGNOSI DELLE ANEMIE EMOLITICHE:

CORSO TEORICO PRATICO

DIAGNOSI DELLE ANEMIE EMOLITICHE:

CORSO TEORICO PRATICO

La diagnosi molecolare nelle anemie emolitiche congenite

Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico

Paola Bianchi

1-2 Marzo 2018

� Valore aggiunto della diagnosi molecolare

� Contributo delle nuove tecnologie di NGS

� Indicazioni delle indagini molecolari nelle singole patologie

� La nostra esperienza

Summary

MUTAZIONI MISSENSE

c.48T>A p.Arg19Trp (R19W)

MUTAZIONI NONSENSE

Stop codon c.2152 C>T p.Arg718X (R718X)

Ins/Del frameshift c.639-644del p.Gly215GlyfsX5

Mutazioni di splicing c. 318 +1g>a

c.319 -1t>g

Caratterizzazione molecolare: tipo di mutazioni

VARIANTI IPOMORFICHE c.309+102 T>A

MUTAZIONI IN REGIONI REGOLATORIE

Caratterizzazione molecolare: metodi di indagine

NEXT GENERATION SEQUENCING:NEXT GENERATION SEQUENCING:

TARGETED SEQUENCING PANELS TARGETED SEQUENCING PANELS

WHOLE EXOME SEQUENCING (WES)WHOLE EXOME SEQUENCING (WES)

CLINICAL EXOME SEQUENCING (CES)CLINICAL EXOME SEQUENCING (CES)

WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS) WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS)

SEQUENZIAMENTO MEDIANTE SANGER SEQUENZIAMENTO MEDIANTE SANGER

RICERCA RICERCA DIDI MUTAZIONI NOTEMUTAZIONI NOTE

??

Mutazioni frequenti

Studi familiari

Diagnosi prenatale

STUDI STUDI DIDI ESPRESSIONE: RQESPRESSIONE: RQ--PCR, PCR, dPCRdPCR

DIFETTI DI MEMBRANA

• Differenti geni coinvolti

• La maggior parte delle mutazioni sono «private»

• Mutazioni localizzate in differenti posizioni di uno stesso gene possono

esitare in patologie differenti ( HS, HE, HSt, SAO)

Tutti questi fattori contribuiscono alla notevole eterogeneita’ fenotipica della

presentazione clinicaBianchi, Mohandas, 2017

“Consideration for molecular analysis is a case by case decision,

which is often the last option in a diagnostic plan for the

patient.

A general approach is that molecular analysis of membrane

protein genes for HS and HE does not add extra information

for the patient whose family is already known to have the

red cell disorder.”

A recessive mode of inheritance, and a case of suspected de novo

mutation or compound heterozygosity do warrant further

investigation using DNA sequencing.”

King et al, 2015

Low expression αααα spectrin allels

(Sp αααα LEPRA)

Spαααα LEPRA + HS mutations

Severe HS phenotype

Coinheritance of spectrin mutations with low-expression polimorphic

alleles (i.e. SpαLEPRA) may worsen the clinical presentation and

explains in some cases intra-family variability.

RICERCA DI ALLELI A BASSA ESPRESSIONE SPETTRINA

ELLISSOCITOSI EREDITARIA

� Hereditary pyropoikilocytosis (HPP)

- Severe hemolytic anemia – trasfusion dependency

- Altered morphology, heat lability

- Recent evidence implies that HPP is a severe form of HE

- Within a family, HE and HPP may both be present

Caused by:

coinheritance of a low-expression allele for α-spectrin

compound heterozygosity for two HE alleles

HE homozygosity.

Low expression α spectrin allels (Sp α Lely)

Alpha LELY in trans + HE Sp mutations

Hereditary Pyropoikilocytosis

αSp low HE Sp

HPP: αSp low /HESp

HEALTHY MILD HE

Sequenziamento diretto mediante Sanger (ABI 310)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 181 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

LRPK gene (erythrocytic)

Genomic DNA

GPI gene (ubiquitous)

RNA RT PCR

One temperature

PCR amplification step

Direct sequencing

PK deficiencyExon 11

c. 1456T Arg486Trp

c. 1529A Arg 510 Gln30/40 % of mutated alleles

Frequent mutations

TPI deficiencyExon 3

c. 315C Glu104Asp

DIFETTI ENZIMATICI

RBC ENZYME DEFECTS ESONI N. PAZIENTI

CARATTERIZZATI

AK1 NM_000476 7 3

CYB5R3 NM_000398 9 27

GPI NM_000175.3 18 12

NT5C3A NM_016489.12 10 19

PGK1 NM_000291.3 11 1

PKLR NM_000298.5 12 180

TPI1 NM_000365.5 7 7

IDENITIFICAZIONE CARENZA ENZIMATICA

CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE

Dosaggio biochimico Caratterizzazione molecolare

Rapidita’ di risposta (2-10 gg) Puo’ discriminare tra eterozigote e omozigoti/doppi

eterozigoti

Economico (costo 6-40€) Non risente dell’interferenza da trasfusione

Disponibilita’ in differenti

centri

Non risente della reticolocitosi/contaminazione leucociti

/piastrine

Indicato nei neonati (piccole quantita’ di materiale

richiesto)

Effettuabile con campioni sottoposti a lunghe spedizioni

Permette una diagnosi prenatale

Nuove terapie? Terapia genica?

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

SEC23BSEC23B

Missense

Frameshift/stop

Splicing

Large deletion

Del 1aa, ins/del

Znf btrunk bsheet helical gelsolin

1 57 98 126 392 403 506 521 621 631 720 767

ANEMIA DISERITROPOIETICA CONGENITA TIPO II

Bianchi et al 2009

Schwartz, et al 2009

Diagnosi molecolare di CDAII

Identificazione di casi atipici di CDAII

Basi patogenetiche della CDAII

Abbassamento dell’eta’ alla diagnosiCorrelazione genotipo-fenotipo

Pellegrin S, Haydn-Smith K, O’Neil L, Hawley BR, Heesom K, Fermo E,

Bianchi P, Toye AM In press, 2018

Nuove terapie?

Sec23A

Sec23B

Sec23A

Sec23B

CDAII

CDAII

CDAN1 C15orf41 SEC23B KIF23 KLF

ANEMIE DISERITROPOIETICHE CONGENITE (CDA)

Heterogeneous group of hemolytic anemias characterized by ineffective erythropoiesis and by

distinct morphological abnormalities of erythroblasts in the bone marrow.

CDAN I C15orf41 SEC23B KIF23 KLF1

Heimpel H, 2003

PIEZO1 SLC4A1 RhAG GLUT1

DIFETTI DELLA PERMEABILITADIFETTI DELLA PERMEABILITADIFETTI DELLA PERMEABILITADIFETTI DELLA PERMEABILITA’’’’ DI MEMBRANA DI MEMBRANA DI MEMBRANA DI MEMBRANA STOMATOCITOSI EREDITARIASTOMATOCITOSI EREDITARIASTOMATOCITOSI EREDITARIASTOMATOCITOSI EREDITARIA

KCNN4

Dehydrated

Stomatocytosis

Overhydrated

Stomatocytosis

Cryohydrocytosis SAO, Sphero-stomatocytosis

ABCB6

Familial

pseudoiperkaliemia

Overhydrated stomatocytosis Dehydrated stomatocytosis

Badens &Guizouran, 2016

Evoluzione di sequenziatori per NGS

Analisi biostatistica!

Patogenica Benigna

PVS1 Very strong BA1 Stand alone

PS1-4 Strong BS1-4 Strong

PM1-6 Moderate BP 1-7 Supporting

PP1-5 Supporting

Criteri per classificare varianti patogenetiche

2015

Richards et al , 2015

Next generation sequencing genes panel

� Utile nello studio molecolare e nella diagnosi dei difetti della

membrana eritrocitaria

� Altre anemie emolitiche rare

� Particolarmente utile per chiarire le basi molecolari di pazienti

con forme atipiche

� Utile nei pazienti trasfusi

Piattaforma NGS anemie emolitiche congenite

Pabinger, Brief bioinform 2013

1) Disegno della Piattaforma regione target 1 kb to 5 Mb

Agilent’s SureDesign tool

www.agilent.com/genomics/suredesign

2) Preparazione di un Kit

3) The HaloPlex HS Target Enrichment System amplifica

migliaia di regioni target nella stessa reazione

Il DNA digerito viene ibridizzato con sonde indicizzate

permettendo di analizzare contemporaneamente un

pool di differenti campioni

I campioni contengono anche delle sequenze «barcode»

che permettono di tracciare i singoli amplificati durante

il sequenziamento

Amplificazione mediante PCR

HaloPlex HSTarget Enrichment System Agilent

Sequenziamento: My seq Illumina

RBC MEMBRANE DEFECTS

Gene Sequenza riferimento

ANK1 NM_000037.3

SPTA1 NM_003126.2

SPTB NM_000347.5

EPB41 NM_004437.3

EPB42 NM_000119.2

SLC4A1 NM_000342.3

ABCB6 NM_005689

PIEZO1 NM_001142864.2

RHAG NM_000324.2

KCNN4 NM_002250

RBC ENZYME DEFECTS

AK1 NM_000476

ALDOA NM_000034.3

BPGM NM_001293085

CYB5R3 NM_000398

ENO1 NM_001428.3

GPI NM_000175.3

GPX1 NM_000581.2

GCLC NM_001498.3

GCLM NM_001308253

GSR NM_000637

GSS NM_000178

G6PD NM_001042351.2

HK1 NM_033497

NT5C3A NM_016489.12

PFKM NM_000289.5

PFKL NM_001002021

PGK1 NM_000291.3

PGM1 NM_001172819

PKLR NM_000298.5

TPI1 NM_000365.5

CONGENIOTAL DYSERYTRHOPOIETIC ANEMIAS

CDAN1 NM_138477.2

C15orf41 NM_001130010.1

SEC23B NM_006363.4

KIF23 NM_138555.2

GATA1 NM_002049.3

KLF1 NM_006563.3

Amplicon Summary

Total Amplicons: 13974

Total Target Bases Analyzable: 357.443 kbp

Total Sequenceable Design Size: 603.046 kbp

Target Coverage: 99.68 %

Fermo, Bianchi, unpublished 2018

Enzimopatie

2 casi LRPK

1 caso GPI

1 caso TPI1

1 caso CYB5R3

Difetti di membrana

7 casi PIEZO1

1 caso KCNN4

1 caso ABCG8

Chiarita l’eterogenita’

fenotipica in 3 famiglie HS/HE

CDAs

1 caso SEC23B

1 famiglia ALAS2

53 casi anemia emolitica congenita

40 famiglie

33 casi

no diagnosi dopo

indagini estese

12 casi

indagini non effettuabili

per trasfusioni recenti

spedizione dei campioni

7 casi

3 famiglie con

difetti di membrana

Piattaforma NGS anemie emolitiche congenite

•Identificato il difetto nel 40% dei pazienti unrelated

•8 mutazioni note; 15 nuove varianti

n.a. n.a.

F11-817

SPTA1: L154F/wt

SLC4A1 : S510R/wt

EMA-binding: ↓↓

SDS-Page: spectrin ↓

F11- 816

SPTA1: L154F/wt

EMA-binding: Norm

SDS-Page: Norm

HS/HE HE

F13 -723* F13-776

Hb (g/dL) 13.5 12.3

Retic (abs n.) 176 183

MCV (fL) 108 97.3

Ferritin 817 181

Osm fragility ↓ ↓

Ema-binding ↓ ↓ n.a.

SDS-PAGE Bd3 38% ↓ Bd3 17 %↓

Transfusions Tx until spl No

Splenectomy Yes 6yr No

Other sympt. Priapism No

* Post splenectomy

F13-723

SLC4A1

Abnormal splicing

+ R490H

+ QPLLPQ186Q

n.a.F13-776

SLC4A1

+ R490H

n.a.HS

HS

Basi molecolari dei difetti di membrana

Fermo, Bianchi, unpublished 2018

Whole Exome Sequencing:

identificazione di geni non noti associati alle anemie emolitiche

Exome Sequencing: sequenziamento delle regioni codificanti (esoni) dei geni di un

individuo.

-Whole Exome Sequencing (WES), che comprende tutti i 20.000 e passa geni del

genoma umano,

-Clinical Exome Sequencing (CES), che comprende tutti i geni fino ad ora noti per

essere associati a malattia (circa 6.000).

La regione codificante rappresenta soltanto l’1% di tutto il genoma, ma si stima

che fino all’85% di tutte le mutazioni patogene siano contenute in questa regione.

INDICATO PER MALATTIE MONOGENICHE

WES complete family

Father/mother/proband/

healthy brother (trios) Enrichment

Reads

Presso: Genomnia s.r.l, CNAG Barcellona, Boston Childrens’ Hospital

Preparazione library: 3μg gDNA - SureSelect XT Target Enrichment system for

SOLiD 5500 Multiplexed Sequencing, (Agilent Technologies).

Capture esoni: SureSelect XT Human All Exon V5 kit (Agilent).

Sequenziamento: Agilent SureSelect AllExon V5

Life Technolgies SOLiD 5500xl Genetic Analysis Sequencer

Conferma mutazione identificata by Sanger sequencing (ABI PRISM 310 Genetic

Analyzer, Applied Biosystems) using Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit.

6 pazienti carenze enzimatiche ma no mutazioni nei geni specifici >analisi risultati

1 paziente con CDA atipica

1 famiglia 5 soggetti con anemia undiagnosed > Gardos

2 sorelle gemelle no genitori con cda atipica > no risultati

1 famiglia 4 soggetti con anemia undiagnosed > CDA Atipica

1 famiglia 4 soggetti con anemia undiagnosed > no risultati

Esperienza WES

PARP4/vPARP

Poly (ADP-ribose) polymerase family

1) Famiglia di enzimi coinvolti nell’omeostasi cellular, trascrizione

del DNA, regolazione ciclo cellular, riparazione DNA

2) PARP4 (vault protein) drug resistance, trasporti nucleo-

citoplasma, regolazione signaling cellulare.

3) Tumori da difetti di riparazione del DNA (BRCA tumors) sono

sensibili agli inibit.ori di PARP, risultando in instabilita’

genomica e cell death

Ash Toye

Bristol University

Knockdown

Functional studies

Vijay Sankaran

Boston childrens Hospital

WES / Knockdown

Bery Paw

Harvard Inst. Medicine

Zebrafish model

No storia famigliare per difetti di membrana/ anemie emoliticheDiagnosi di HSSDS-PAGE: Deglicosilazione banda 3 > Diagnosi CDAIINO mutazioni in SEC23B > Diagnosi CDAII atipica

WES

BM Morphology

Erythroid hyperplasia (myeloid: erythroid ratio = 0.6) with binuclearity,

megaloblastic changes, occasional cytoplasmic bridging between cells at

different stage of maturation

Bianchi et al, ASH 2015

*

*

Electron microscopy

Bianchi et al, ASH 2015

PARP4 Is Necessary for Human Erythroid Cell Growth, Does Not Have Major Effect on Erythroid Specification, and increase apoptosis

Day 14 of differentiation

Day 14 of differentiation

Bianchi et al, ASH 2015

Morpholino-Mediated Knockdown of PARP4 Zebrafish Orthologue Causes a Mild Anemia

48 h.p.f.

Bianchi et al, ASH 2015

Il vecchio e il nuovo….

Studio molecolare 1-2 settimane

281.46 €

Dosaggio enzimatico

4 h

8.26 €

Ngs platforms / exome seq2- 4 settimane + analisi validazione dati

Diagnosi

Informazioni

cliniche

Evidenze

funzionali

Caratterizzazione

molecolare