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Determinazione Microbiologica e

Farmacocinetica di Parametri di

Resistenza Antibiotica nella Specie

Ovina

Stefano A. Lollai

Progetto di Ricerca: IZS SA 08/2015 RC

Individuazione di valori breakpoint per la resistenza

antibiotica nell’ovino,

con particolare riferimento alle mastiti

Partecipanti

U.O. 1 - Centro di Referenza Nazionale delle Mastopatie degli Ovini e dei Caprini/Laboratorio Diagnostica e

Controllo delle Mastiti – IZS Sardegna, Sassari,

Responsabile Eugenia A. Cannas

U.O. 2 - Laboratorio Farmaco e Analisi dei Residui - IZS Sardegna, Sassari,

Responsabile Cecilia Testa

U.O. 3 - Struttura Complessa Territoriale di Cagliari - IZS Sardegna,

Responsabile Manuele Liciardi

U.O. 4 - Laboratorio di Microbiologia Speciale – IZS Sardegna, Sassari,

Responsabile Stefano A. Lollai

U.O. 5 - Central Veterinary Institute (CVI) of Wageningen, Lelystad and Utrecht University (NL),

Responsabile D. J. (Dik) Mevius (VetCAS)

U.O. 6 - Department of Comparative Biomedical Sciences - Royal Veterinary College, RVC, London (UK),

Responsabile Ludovic Pelligand (VetCAS)

U.O. 7 - Dipartimento di Scienze Biomediche - Università degli Studi, Sassari,

Responsabile Giovanni Sotgiu

U.O. 8 - Centro di Referenza Nazionale per l’Antibiotico Resistenza – IZS Lazio e Toscana, Roma,

Responsabile Antonio Battisti

Introduzione

La ricerca intendeva individuare i criteri interpretativi della resistenza antibiotica di

patogeni nella specie ovina

In particolare di patogeni trattabili per via sistemica, quali lo Streptococcus uberis,

responsabile anche di patologie mammarie, verso antibiotici di largo impiego,

come la (oxy)tetraciclina

Una corretta terapia antibiotica si basa su test in vitro: patogeni sono classificati S o R se il grado di resistenza supera valori soglia detti cutoff o breakpoint Tali criteri sono definiti su base microbiologica, ma non solo …

per il successo della terapia, infatti, l’antibiotico deve permanere nei siti corporei a concentrazioni superiori alla R del batterio

dato microbiologico integrato quindi con dati farmacocinetici-dinamici (o clinici) legati alla specie animale indici integrati di R e di successo terapeutico

Perché un progetto dedicato?

I test di sensibilità (o antibiogrammi) vengono normalmente e facilmente eseguiti in tutti i

laboratori ?

Perché è preferibile « misurare » sull’ animale interessato la Resistenza del patogeno

distribuzione dei valori di R dei patogeni andamento della C di antibiotico nel siero

R

Sensibili

La specie ovina manca di criteri interpretativi per la resistenza antibiotica

Per la lettura degli antibiogrammi vengono generalmente usati criteri « umani »

Metodologia

Attività svolte

Indagine in vivo: Capi ovini sani e affetti naturalmente da mastite causata da S. uberis sono stati sottoposti a terapia standard con oxytetraciclina per via parenterale;

Determinazione dell’antibiotico nel sangue e nel latte: l’antibiotico è stato determinato nel sangue e nel latte a intervalli regolari

Indagine microbiologica: Popolazione circolante di S. uberis saggiata per la resistenza antibiotica alla OTC

Elaborazione: i dati microbiologici sono stati integrati con i dati farmacocinetici con l’ausilio di software specifici

La cinetica dell’antibiotico nel sangue è stata quindi esaminata alla luce degli indici farmacocinetici-

dinamici (PK/PD) predittivi del successo terapeutico, quali l’AUC (area sottesa alla curva

dell’antibiotico nel tempo) e il periodo di permanenza della concentrazione dell’antibiotico al di

sopra della MIC del patogeno (T > MIC). I diametri interpretativi da assumere nell’antibiogramma

sono stati quindi ricalcolati su questa base.

Su loro richiesta, il progetto è stato

presentato alla riunione del VetCast

(Veterinary Subcommittee on Antimicrobial

Susceptibility Testing) ad Amsterdam nel

marzo 2017

10.00 Welcome (DM) and brief tour de table

10.15 Summary of JPIAMR project (Dik)

10.30 Introduction to and discussion of the VetCAST position paper on how to set CBP's in vet medicine (Pierre-Louis)

11.30 Introduction to and discussion on conflict of interest policy (Dik)

12.00 Lunch

12.30 Planned approach to PK data collection from the industry (Ludovic)

12.50 Status on collection of MIC data and setting of ECOFFS (Kees)

13.10 Update on EUCAST activities and the new "tentative ECOFF" (Gunnar)

13.30 Roundtable discussion about data collection and how VetCAST members may contribute to the tasks ahead.

14.40 Introduction to project on CBPs in sheep (Stefano)

15.00 Introduction to VetCAST workshop in September (Pierre-Louis)

15.15 Brainstorming on future joint research ideas and funding options including brief presentation of COST Action plan (Peter)

15.45 Any other business (all)

16:00 Closure

Somministrazione dell’antibiotico

Individuate 10 pecore di razza sarda sane e 10 con infezione mammaria naturale da S.

uberis, omogenee per età, peso, stato sanitario e stadio produttivo (lattazione)

somministrata Terramicina® (OTC) Long Acting 200 mg/mL, Pfizer, corrispondenti a 20

mg/kg, in un’unica somministrazione, secondo posologia standard

prelievo dei campioni di sangue e latte a intervalli regolari per la determinazione

dell’antibiotico

Schema di prelievo

Matrice Giorno 1 Giorno 2 Giorno 3 Giorno 4 Giorno 5

T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19

Inizio

trattamen

to

15 min 30 min 45 min 60 min 90 min 120 min 4 h 6 h 8 h 10 h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 84 h 96 h 108 h

Sangue

Latte

emimammella

(svuotamento

completo)

Ora 8:00 8:15 8:30 8.45 9 9:30 10:00 12:00 14:00 16:00 18:00 20 8:00 20:00 8 20:00 8 20:00 8 20:00

Matrice Giorno 6 Giorno 7 Giorno 8 Giorno 9 Giorno 10 Giorno 11 Giorno 12 Giorno 13 Giorno 14 Giorno 15 Giorno 16 Giorno 17 Giorno 18 Giorno 19 Giorno 20

T20 T21 T22 T23 T24 T25 T26 T27 T28 T29 T30 T31 T32 T33 T34 T35 T36

120 h 132 h 144 h 156 h 180 h 204 h 228 h 252 h 276 h 300 h 324 h 348 h 372 h 396 h 420 h 444 h 468 h

Sangue

Latte

emimammella

(svuotamento

completo)

Ora 8 20:00 8 20:00 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

Esame igienico-sanitario e chimico-fisico sui campioni di latte:

• 1. determinazione della quantità di latte prodotta/emimammella;

• 2. contenuto in grasso, proteine e lattosio; spettro degli acidi grassi;

• 3. caseine; urea; cloruri; pH;

• 6. punto di congelamento;

• 8. cellule somatiche;

• 9. carica batterica totale; esame colturale

Tramite spettrofotometria nel medio infrarosso a trasformata di Fourier con Milkoscan FT 6000, secondo ISO 9622 IDF 141:2013,

contenuto in cellule somatiche con Fossomatic FC, sec. UNI EN ISO 13366:2007

carica batterica totale con citofluorometria a flusso continuo (Bactoscan FC)

Microbiologia

Indagine microbiologica: Popolazione circolante di S. uberis saggiata per la resistenza

antibiotica: MIC verso OxyTetraCiclina e Kirby Bauer verso TETraciclina + geni di resistenza

Ricerca del valore MIC al di sotto del quale un microrganismo è

« microbiologicamente » sensibile (WildType cutoff)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0.0

01

0.0

02

0.0

04

0.0

08

0.0

16

0.0

31

0.0

63

0.1

25

0.2

5

0.5 1 2 4 8

16

32

64

12

8

25

6

51

2

10

24

Co

un

t

[(Oxy)Tetracycline MIC S_uberis]

Raw Count or % bar Raw Count or % Fitted Count or %

280 isolati di S. uberis sono stati saggiati per la resistenza alla TET e alla OTC con minima

concentrazione inibente (MIC) e diffusione in agar;

i ceppi provenivano in prevalenza da casi di mastite

le MIC sono state saggiate con micro diluizione in brodo (sec. ISO 20776), la diffusione in

agar secondo norma per i patogeni animali (CLSI VET08)

i geni di resistenza sono stati cercati negli isolati tramite PCR

[tet(M), tet(O), tet(K) e tet(L)]

Determinazione dell’antibiotico nel siero e

nel latte

… segue nell’intervento della Dott.ssa Severyn Salis

del Laboratorio Farmaco e Analisi dei Residui …