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Determinazione dei batteri lattici nei prodotti lattiero caseari: metodi, terreni, tecniche

Angiolella LombardiVeneto Agricoltura

Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari

MontegrottoTerme, 6-7 dicembre 2012

12° Meeting responsabili e tecnici laboratorio settore lattiero caseario

Il ruolo positivo dei batteri lattici nella produzione di latti fermentati

� Acidificazione (fermentazione lattica)

� Produzione di acetaldeide

� Produzione di polisaccaridi

- Batteri lattici con caratteristiche probiotiche

2A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari

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Il ruolo positivo dei batteri lattici nella produzione di formaggi

• Acidificazione (fermentazione lattica)

• Produzione di enzimi che agiscono su:

� Proteine-peptidi-aminoacidi

� (lipidi)

� Altre componenti

(es. citrato)

Batteri lattici starter

Batteri lattici non starter

Maturazione prodotto, caratteristiche organolettiche -

nutrizionali

3A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari

Aspetti negativi legati allo sviluppo di batteri lattici nei formaggi

� Produzione di gas (batteri lattici eterofermentanti,

occhiatura eccessiva, gonfiori)

� Produzione di amine biogene (tiramina, istamina)

� Produzione di sapori anomali (peptidi amari)

� Acidificazione eccessiva-gessatura

4A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari

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BATTERI LATTICI Caratteristiche generali

� Batteri Gram positivi

� Ubiquitari

� Morfologia differente: bacilli/cocchi

� Non sporigeni

� Acido tolleranti e talvolta acidofili

� Temperatura ottimale di crescita: ampio range (termofili/ mesofili)

� Catalasi negativi (eccetto alcune specie genere Pediococcus )

� Molto esigenti nutrizionalmente

� Non patogeni (gruppo 1, tranne L. rhamnosus ed enterococchi che rientrano in gruppo 2)

� Anaerobi (aerotolleranti)

� Metabolismo fermentativo (omofermentanti, eterofermentanti)

5A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari

Principali generi/specie di batteri lattici settore lattiero-caseario

Microrganismo Morfologia Fermentazione Temperatura Applicazioni

Streptococcusthermophilus

Cocchi Omolattica Termofili Formaggi, lattifermentati

Lactococcuslactis

Cocchi Omolattica Mesofili Formaggi, burro

Enterococchi Cocchi Omolattica Mesofili, termodurici

Formaggi* (no QPS)

Pediococchi Cocchi a tetradi Omolattica Termofili

Vegetali fermentati, insaccati, maturazione formaggi

Leuconostoc Cocchi Eterolattica Mesofili Burro, vegetali fermentati, paste acide

Lactobacilli Bastoncini Omolattica

Eterolattica

Mesofili. termofili

Formaggi, lattiferm., insaccati, paste acide, vegetali

6A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari

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Perchè cercare i batteri lattici nei prodotti lattiero caseari?

A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 7

� Requisiti di prodotto (es S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus yogurt)

� Requisiti certificazioni ( es. Mozzarella STG)

� Controllo qualità colture starter (inclusi sieroinnesti/lattoinnesti)

� Monitoraggio probiotici (L. acidophilus, L. rhamnosus, L casei/paracasei, Bifidobacterium*)

� Conteggio LAB responsabili difetti (eseterofermentanti obbligati, enterococchi)

Conteggio batteri lattici – Metodi normati

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Microrganismo Metodo Campo applicazione

S. thermophilus ISO 7889-IDF117: 2003

Yogurt

Lactobacillusdelbrueckii subsp. bulgaricus

ISO 7889-IDF117: 2003

Yogurt

Lactobacillusacidophilus

ISO 20128-IDF292: 2006

Latti fermentati e non fermentati, latte in polvere

Batteri lattici mesofilie termofili (diverse specie e generi)

ISO 27205-IDF149: 2010

Colture starter per prodotti fermentati a base di latte (no probiotici)

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Conteggio batteri lattici – Metodi normati

A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 9

Microrganismo Metodo Campo applicazione

Enterococchi CCFRA Met. 2.2.1:2007

Alimenti , inclusi prodotti lattiero caseari , mangimi

Bifidobatteri (NB non LAB)

ISO 29981-IDF220: 2010

Latti fermentati e non fermentati, latte in polvere, formulazioni per l’infanzia,colture starter

Leuconostoc (FIL149A:1997) Colture starter

Batteri lattici citrato fermentanti (Leuconostoc, Lc.lactiscit+)

ISO17792-IDF 180 : 2006

Colture starter e prodotti lattiero caseari in cui sono presenti lattici citrato ferm.

Streptococcus thermophilus

A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 10

Norma cod. ISO 7889 - IDF 117:2003

Norma titolo Yogurt - Enumeration of characteristic microorganisms – Colony count technique at 37°C

Conteggio di Streptococcus thermophilus

Mezzo di coltura M 17, pH 6.8 dopo sterilizzazione (consigliabile aggiungere il lattosio dopo sterilizzazione)

Inoculo inclusione

Atmosfera incubazione

aerobiosi

Incubazione 37+/-1°C x 48 h

Lettura colonie colonie lenticolari del diametro di 1-2 mm.

Conferma colorazione gram (+, forma coccica del diametro di 0.7-0.9 micron in coppia o a catena) e catalasi(neg.) (vedi FIL 146/ISO 9232)

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Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

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Norma cod. ISO 7889 - IDF 117:2003

Norma titolo Yogurt- Enumeration of characteristic microorganisms – Colony count technique at 37°C

Conteggio di Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

Mezzo di coltura MRS acid. pH 5.4 con acido acetico

Inoculo inclusione

Atmosfera incubazione

anaerobiosi

Incubazione 37+/-1°C x 72 h

Lettura colonie colonie lenticolari, spesso a forma laminare del diametro di 1-3 mm

Conferma colorazione gram (+, bastoncini, generalmente corti) e catalasi (neg.) (vedi FIL 146/ISO 9232)

ISO 20128-IDF192:2006Milk Products – Enumeration of presumptive Lactobacillus

acidophilus on a selective medium-Colony count technique at 37°C

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Conteggio di Lactobacillus acidophilus

Mezzo di coltura MRS + Clindamycin + Ciprofloxacin

Inoculo spatolamento

Atmosfera incubazione anaerobiosi

Incubazione 37°C x 72 +/-3 h

Lettura colonie colonie piatte opache

grigio biancastre

bordi irregolari

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ISO 27205-IDF149:2010-Fermented milk Products – Bacterial starter cultures – standard of identity

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Specifica caratteristiche delle colture starter del settore lattierocaseario (batteri lattici, ma anche bifidobatteri e propionibatteri)

Microrganismo Metodo

L.delbrueckii subsp. bulgaricus

MRS acidificato come ISO 7889-IDF117:2003

L. acidophilus MRS+ Cli e Cipro come ISO 20128-IDF 292: 2006

S. thermophilus M17 pH6,8 come ISO 7889-IDF117: 2003

Lattococchi M17pH7,2, come da ISO 7889 incubato in aerobiosi a 30 °C per 72 ore

Colture miste S. thermophilus -lattococchi

S.thermophilus : M17pH6,8 45 °C aerobiosi 48 hLattococchi M17pH7,2 20 °C aerobiosi 5 g

CCFRA Method 2.7.1:2007Enumeration of presumptive Enterococcus

species:colony count technique

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Il metodo propone diversi mezzi per il conteggio degli enterococchinegli alimenti e nei mangimi: KF streptococcus agar, Kanamicina,-esculina-azide agar (KAA), Slanetz e Bartley agar (SB)

�KAA inoculo per spreading,�37 °C per 24 h ± 4 h

�Necessaria conferma

�Sodio azide e kanamicinaagenti selettivi

�Esculina agente differenziale

Colonie bianche o grigie circondate da un alone nero da confermare

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ISO 29981-IDF220:2010 Milk Products-Enumeration of presumptive bifidobacteria-Colony count technique at 37 °C

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�TOS-MUP propionato agar + agenti selettivi (litio-mupirocina) egalatto-oligosaccaridi (TOS)

� Inoculo per inclusione, incubazione 37 ° C per 72 h in anerobiosi

Litio e mupirocina inibisconocrescita S. thermophilus, L.delbrueckii subsp. bulgaricus, L.acidophilus, L. casei, L.rhamnosus, Lactococcus lactis,

Galatto-oligosaccaridi (TOS)favoriscono sviluppo deibifidobatteri

Colonie bianche piccole da confermare

FIL-IDF 149A. 1997. Levains lactiques de cultures de bactéries lactiques. Norme de composition

Leuconostoc

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�MSE Agar (Mayeux, Sandine, Elliker),

� Inoculo per spreading, incubazione a 22 °C per 4-5 g in aerobiosi

.

L. mesenteroides dextranicum forma colonie mucose, gelatinose, altri Leuconostoc formano colonie piccole incolori

Sodio azide del terrenoinibisce batteri Gram - elattococchi

Saccarosio favorisceformazione destrani.

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ISO17792-IDF180:2006Milk, milk products and mesophilic starter cultures –Enumeration of citrate fermenting bacteria.Colony

count technique at 25 °C

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Microrganismi interessati:

� Lactococcus lactis subsp. lactis cit +

� Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, cremoris, dextranicum

� Leuconostoc lactis

Terreno di Nickels eLeesment, contenente citratoe calcio lattato, incubato a 25°C in aerobiosi per 72 h. Dopoincubazione viene aggiunto X-gal, ulteriore incubazione per24 ore

Citrato fermentanti presentano alone attorno alla colonia

Lactococcus colonie bianche

Leuconostoc colonie blu

Altri batteri lattici

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L. casei/paracasei, L. rhamnosus, L.plantarumNSLAB formaggi Latti fermentati, probiotici

MRS agar + vancomicina ( 10 µg/ml)

Incubazione 30 °C , anaerobiosi, 72 h.

In questo terreno possono sviluppare

anche pediococchi e Leuconostoc

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Batteri lattici eterofermentanti

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�Terreno HHD consente differenziare batteri lattici omo edeterofermentanti in base alla differente acidificazione delfruttosio presente in bassa concentrazione in questo mezzo.

�Dopo incubazione 30 °C per 72 h i batteri omofermentanticrescono con colonie blu-verdi, mentre quelli eterofermentanti concolonie incolori (non acidificano e quindi non determinano il viraggiodel verde bromocresolo)

�In alternativa per il conteggio degli eterofermentanti:

MRS; verifica produzione gas in un numero rappresentativo dicolonie

Leuconostoc: MSE 22°C per 4-5 g

Metodi di controllo sieroinnesti-Criticità

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-2-8 x 108 ufc/ml-dominanza L. helveticus (80-85%), presenza di diversibiotipi-L. delbrueckii subsp. bulgaricus e subsp. lactis-L. fermentum (eterofermentante)-Talora presenza di S. thermophilus

Caratteristiche

sieroinnesti

�MRS acidificato?�MRS + casaminoacids?�Agar siero?

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Metodi controllo lattoinnesti naturali-criticità

A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 21

Microrganismo Metodo Campo applicazione

Terreno

S. thermophilus ISO 7889-IDF 117: 2003

Yogurt M17 agar, aerobiosi a 37 °C per 48 ore

Colture miste S. thermophilus -lattococchi

ISO 27205 - IDF 149:2003

Colture starter termofile

S.thermophilus : M17

pH6,8 45 °C aerobiosi 48 h

Risultati molto variabili in funzione di:

�Brand commerciale terreno�Modalità di aggiunta del lattosio �Temperatura di incubazione�Aggiunta di ulteriori “ingredienti” (latte peptonizzato)

E i probiotici?

A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 22

Es latte fermentato contenente S. thermophilus, L.bulgaricus, L. acidophilus, Bifidobacterium lactisS. thermophilus ISO 7889-IDF 117: 2003

B. lactis ISO 29981- IDF 220: 2010

L. acidophilus ISO 20128-IDF 292: 2006

L. delbrueckii subsp. bulgaricus ?�ISO 7889-IDF 117: 2003 non consente conta differenziale

L. bulgaricus-L. acidophilus�Semina per spreading e differenziazione morfologia colonie?

�Conferma colonie mediante ISO 9232: 2003-IDF 146?

�Conferma mediante PCR?

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Conclusioni

A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 23

� Sono disponibili diversi metodi per il conteggio dibatteri lattici.

� Tuttavia, data la complessità di questo gruppomicrobico e la presenza in uno stesso alimento di piùgeneri/specie permangono delle criticità

� Adattamento del metodo in funzione del prodotto

� Necessità di confronti interlaboratori su matrici reali

� Sviluppo di metodi che consentano di individuaregruppi di batteri lattici con attività potenzialmentenegative (es. proteolitici,, eterofermentantiobbligati)?