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Definizione di genoteca (o library) di DNA

Collezione completa di frammenti di DNA, inseriti singolarmente in un vettore di clonaggio.

Possono essere di DNA genomico o di cDNA.

Libreria genomica: collezione di cloni che include tutto il DNA genomico di una certa specie

Libreria di cDNA: collezione di cloni che include tutte le specie di mRNA (trascritte in cDNA) espresse in un dato

tessuto, incluso quelle piu’ rare

Rappresentatività: una libreria si dice rappresentativa quando contiene, in almeno una copia, tutte le possibili

sequenze

Ridondanza: una libreria si dice ridondante quando contiene molte copie di alcune sequenze, complicando la

ricerca e selezione (screening) della sequenze che vogliamo analizzare

2 CONCETTI GENERALI IMPORTANTI

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1- Frammentazione del genoma (Digestione con endonuclesi di restrizione, Frammentazione meccanica)

2- Ligazione con il vettore (Ligazione con estremità coesive, estremità piatte)

3- Introduzione nella cellula ospite (Trasformazione con DNA plasmidico ricombinante, Trasfezione con DNA fagico,

Impacchettamento in vitro capsidi fagici)

4- Screening dei cloni di interesse (Ibridazione, PCR)

FASI GENERALI PER LA COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA GENOMICA

Preparazione dei frammenti da clonare

a) Digestione parziale con endonucleasi di restrizione

Se si utilizza un enzima di restrizione con un sito di riconoscimento di 6bp (EcoRI), i frammenti generati

avrebbero dimensioni in media di 4x103 bp, se la composizione in basi del DNA fosse casuale. In realtà i frammenti che si ottengono sono troppo

grandi o molto piccoli e questi sarebbero più rappresentati nella library.

Una strategia comunemente usata è quella di

digerire il genoma con un enzima che taglia siti a 4 basi (Sau3A, AluI, HaeIII), avendo cura di effettuare la digestione in condizioni tali che la digestione sia parziale (tempi di digestione o quantità di enzima

sub-ottimali).

Le digestioni parziali di un genoma garantiscono la produzione di una collezione di cloni sovrapposti.

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b) Frammentazione DNA (metodi fisici)

E’ possibile frammentare il DNA con metodi fisici, come la sonicazione, o il passaggio attraverso un sottile ago di una siringa, oppure meccanicamente (vortex)

Questi metodi presentano il vantaggio di produrre frammentazioni casuali (maggiore rappresentatività), ma lo svantaggio di produrre frammenti sia con estremità “blunt”

che con estremità 5’ e 3’ “sporgenti”, non adatte alla ligazione, che devono essere rese blunt.

Adattatori!!!!

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Costruzione di librerie genomiche

Librerie cDNA

Preparazione del cDNA

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Librerie cDNA basate su PCR

Clonaggio direzionale del cDNA Utilizzando oligonucleotidi modificati che

inseriscono siti unici di restrizione ad entrambe le estremità del cDNA a doppio filamento è possibile ottenere il clonaggio

direzionale nel vettore scelto

La sintesi del cDNA produce, a partire da molecole di messaggero uguali, molecole di DNA di diversa lunghezza. Sovra-rappresentazione del 3’ se la

sintesi è innescata da oligo-dT

AAAAAAAA 3’ 5’

TTTTTTTT 5’ 3’

mRNA

cDNA 1 (full-lenght)

AAAAAAAA 3’ 5’

TTTTTTTT 5’ 3’

cDNA 1-2

AAAAAAAA 3’ 5’

TTTTTTTT 5’ 3’ cDNA 1-3

AAAAAAAA 3’ 5’

TTTTTTTT 5’ 3’ cDNA 1-4

Librerie cDNA classiche

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Questo inconveniente può essere superato utilizzando random

primer al posto dell’oligo dT per la

sintesi del cDNA.

Costruzione di librerie cDNA

Per il clonaggio del cDNA sono aggiunti alle estremità piatte del cDNA degli adattatori in modo da rendere le molecole di cDNA

compatibili con il vettore scelto.

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Plasmidi

Cromosomi artificiali di lievito (YAC)

Cromosomi artificiali di batteri (BAC)

Batteriofago λ

Cosmidi

Vettori usati per librerie genomiche e cDNA

Plasmidi

Ø Derivano da elementi presenti in

natura

Ø  permettono di clonare frammenti fino a 5-10.000 bp

…. Librerie cDNA e Librerie shotgun APPLICAZIONI

libreria conservata in E.coli

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Batteriofago “λ” (lamda)

È costituito da 2 componenti principali che sono il capside/parti proteiche costitutive e DNA genoma

Ciclo litico e lisogenico del batteriofago “λ”

Il batteriofago “λ” è caratterizzato dalla presenza dei siti cos estensione a singolo filamento di 12 nucleotidi complementari tra loro che permettono

al DNA genomico di circolarizzare una volta entrato nel batterio ospite

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Il sistema lisogenico e la ricombinazione sito specifica ….

Ø  Hanno siti di taglio per l’inserimento del DNA

Ø  Si riescono a clonare frammenti di 15-20.000 bp

Ø  DNA del virus ingegnerizzato (vengono utilizzati batteriofagi che attuano il ciclo litico e non quello lisogenico)

Ø  Sono costituiti da DNA double-stranded lineare della lunghezza di 45 kb con un braccio dx ed uno sx sui quali sono presenti i geni per il ciclo litico

DNA dispensabile Braccio dx Braccio sx

Mappa del genoma di λ

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DNA dispensabile Braccio dx

Sito cos Sito cos

Braccio sx

15-20.000 bp Sito di taglio Sito di taglio

15-20.000 bp

DNA da clonare

40-45 kb

40-45 kb

Ligazione del DNA esogeno

Vettore ricombinante da usare per la fase successiva di packaging

Digestione del DNA fagico

DNA dispensabile eliminato

Struttura di due vettori di sostituzione λ EMBL3 e EMBL4 in commercio

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Naturale processo di impacchettamento (packaging)

del DNA genomico di λ

I concatameri da circa 45 kb (braccio dx + DNA genomico/cDNA + braccio sx) con a monte e a valle i siti cos vengono

efficacemente impacchetati nella struttura fagica

Impacchettamento (packaging) in vitro dei concatameri di λ in presenza

della miscela di 2 estratti di E.coli

Impacchettamento DNA λ (Packaging)

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Packaging in vitro

Infezione e recupero lisato libreria conservata in fagi λ

Sito cos Sito cos

ospite

….. Librerie cDNA e Librerie genomiche

APPLICAZIONI

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Cosmidi Ø Non derivano da elementi presenti

in natura a differenza dei plasmidi e dei fagi,

ma derivano dalla combinazione delle caratteristiche dei plasmidi e dei fagi

Ø  permettono di clonare frammenti fino a 40-45.000 bp

ospite

Ø  Plasmidi che contengono un frammento di DNA del fago λ con

all’interno il sito Cos

Ø  Plasmidi è piccolo rispetto alle braccia del fago

….. Librerie genomiche

libreria conservata in E.coli

APPLICAZIONI

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Cromosomi Artificiali Batterici (BAC)

Struttura di un BAC (geni oriS e repE garantiscono la replicazione

unidirezionale, parA e parB controllano il n° di copie del vettore, CmR

marcatore per resistenza al cloranfenicolo, cosN e loxP siti di

taglio per terminasi λ e proteina cre, HindIII e BamHI

Sono dei cromosomi artificiali costituiti da:

3) parA, B, C controllo del

numero di copie

Ø  possono essere clonati frammenti di DNA da 100-300.000 bp

2) repE controllo della replicazione

1) ori per i batteri

9) marcatore selettivo per la resistenza ad un antibiotico

8) siti di restrizione multipli

sito cos N (4 sito lox p (5

Promotore T7/SP6 (6 Gene lacZ (7

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ospite

….. Librerie genomiche

libreria conservata in E.coli APPLICAZIONI

Cromosomi Artificiali di Lievito (YAC)

telomeri sequenza

centromerica

marcatore selettivo indipendenza da

triptofano ed uracile

ori per i lieviti

Ø  possono essere clonati frammenti di DNA da 1.000.000 bp

siti di restrizione

multipli

BRACCIO SX BRACCIO DX

Sono dei cromosomi artificiali costituiti da:

ARS CEN TRP1 URA3 TEL TEL

ori per i batteri

Ø  La loro stabilità è tanto maggiore quanto più grandi sono gli inserti clonati (contrariamente a quanto succede per fago, cosmidi e BAC)

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ospite

libreria conservata in S. cerevisiae

Una volta che si sono collezionati centinaia di migliaia di frammenti di DNA in una biblioteca genomica o a

cDNA, come si fa a trovare il gene che si vuole studiare?

È come cercare un ago in un pagliaio

Screening di una genoteca

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ü  Librerie genomiche: introni, esoni, regioni regolative (promotore/enhancer)

ü  Librerie genomiche: associazione del nostro gene con altri nella stessa regione cromosomica

ü  Librerie cDNA: sequenza dell’mRNA (5’ e 3’ UTR), possibili varianti di splicing

Risultati attesi dallo screening di librerie cDNA/genomiche

ü  Mappatura fisica dei cloni genomici sui cromosomi (in situ)

ü  Correlare il clone isolato con regioni cromosomiche associate a caratteri di interesse per il miglioramento genetico (resistenze, controllo fenomeni

biologici importanti es. fioritura, produttività etc)

Applicazioni