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Dai raggi-X alla progettazione di farmaci: le radici matematiche e

fisiche della biologia del XXI secolo

Martino Bolognesi

Dipartimento di BioScienzeUniversità di Milano

http://users.unimi.it/biolstru/Home.html

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- VITA ORDINE, ORGANIZZAZIONE, COMPLESSITA’

- LA MATERIA BIOLOGICA E’ UNA MANIFESTAZIONEDEI PRINCIPI FONDAMENTALI DELLA FISICA E DELLA CHIMICA, CHE IN QUESTO CASO RAGGIUNGONO COMPLESSITA’ MASSIME

- OGGI DISPONIAMO DI APPROCCI MULTI-DISCIPLINARI PER STUDIARE LA MATERIA E I PRINCIPI FONDAMENTALI DELLA BIOLOGIA

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PERCHE’ LE PROTEINE ?- Le proteine sono gli attuatori della cellula

- Disponibilita’ di nuovi strumenti(sincrotroni, super-computing, microscopie)

- La material biologica a risoluzione atomica

- Le sfide della biologia moderna(biochimica, genomicsa, proteomica, …)

- Applicazioni(farmaci, biotecnologie, biosensori …)

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La complessita’ strutturale delle proteine

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Nuovi strumenti per lo studio della materia biologica

• Microscopie ottiche (200 nm)

• microscopia a “Forza Atomica” (1 nm)

• Diffrazione di elettroni (0.5 nm)

• NMR (0.5 nm)

• Microscopie elettroniche (0.1 nm)

• Diffrazione di raggi-X (0.05 nm)

- 1 nm = 10-9 m -

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Raggi-X• “Microscopia” a livello atomico – risolve gli atomi

• La risoluzione della struttura 3D avviene in maniera“indiretta”, attraverso la misura di diagrammi di diffrazione

• La risoluzione delle strutture 3D richiede un approcciocomputazionale intensivo, spesso abbinato a metodi di simulazione computazionale.

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I metodi della bio-cristallografia

Ribosoma 19198 protein atoms 32470 RNA atoms

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V. Ramakrishnan T.A. Steitz A.E.Yonath

(Courtesy

Premi Nobel per la Chimica 2009

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Cristalli di diverse proteine di interesse biotecnologico

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Cristalli di proteine:

Cristallo volume 0.1 mm3

Cella elem. > 100 Å Contenuto solvente 30% - 80% v/v Bassa stabilita’ meccanica (Estab.< 10 kcal/mol)

molecolaCella elementare

cristalloUnita’ asimmetrica

symmetry

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Crescita di cristalli:Variazione di parametri chimico-fisici che influenzano la solubilita’delle proteine

forza ionica (conc. sali)

pH

temperatura

concentrazione proteica

additivi (molecole organiche)

costante dielettrica del solvente

gravità

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Approcci robotici allacrescita di cristalli

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L vs. nL

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Crescita di cristalli in micro-gravita’ (Stazione Spaziale Internazionale)

ASI - NASA

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Microgravità:

In assenza di moti convettivi:

Maggiore ordine intrinseco

Minore formazione di nuclei

Minore incorporazione di contaminanti

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L’esperimento di diffrazione

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Apparato per

Diffrazione di raggi-X

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ESRF - Grenoble - F

ELETTRA -Trieste

SORGENTI DI RAGGI-X

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Radiazione di sincrotrone

http://biosync.sbkb.org/regionallisting.do?region=European

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Stazione sperimentale ad ESRF

= 0.933 Å (13.294 keV)

9.6 < E < 14.5 keV

Beamsize 50-200 m

dmax= 0.97 Å

http://www.esrf.eu/UsersAndScience/Experiments/MX/

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Diffrazione di raggi-X da parte di un cristallo:

detector

2raggi X

cristallo

h = 2, k = 1, l = 0 h = 1, k = 3, l = 0

Ihkl

2dhkl sin= n (Bragg’s eqn.)

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Perche’ i sincrotroni?

e4 Vx

I (hkl) = ------------ Io 3 ALP ------- F2(hkl)m2 c4 Vc

2

http://www.esrf.eu/UsersAndScience/Experiments/MX

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Il «problema della fase»

?

Ihkl (x,y,z)

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Il «problema della fase»

Ihkl |Fhkl|2

N atomi

j = 1Fhkl = fj exp [2i (hxj + kyj + lzj)] = |Fhkl| exp (ihkl)

Fattore di struttura Fhkl = (x,y,z) exp [2i(hx+ky+lz)] dV

VcellF

P

i

rf1

f2

f3

(x,y,z) = |Fhkl| exp [-2i(hx+ky+lz-’hkl)]1V hkl

Densità elettronica

Non misurabile sperimentalmente

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Dal cristallo alla struttura 3D – un processo lineare

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Legame di molecole/farmaci a proteine

N

C

Strutture 3D presenti nel Protein Data Bank

discovery

applicazioni

http://www.rcsb.org/pdb/

UNA VISONE DEL PRESENTE

La ricerca di farmaci antivirali

La battaglia contro le malattie infettive haallungato la vita media dell’uomo

• Nell’Inghilterra di metà ‘800 il 60% dellemorti era dovuto a malattie infettive

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Il dilagare di malattie infettive

Ebola deathsFigures up to 3 February 2015

9,019Deaths - probable, confirmed and suspected(Includes one in the US and six in Mali) 3,746 Liberia 3,301 Sierra Leone 1,957 Guinea 8 NigeriaSource: WHO

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EU HEALTH-2010 Collaborative Project

Il Progetto SILVER

Norovirus una minaccia per la salute nei paesi tropicali e non solo

Il Norovirus (NV) e’ una delle principali cause dimalattie trasmesse attraverso il cibo, ed e’ causa dimorbidità e mortalità particolarmente tra i bambinidelle regioni tropicali.

NV e’ altamente infettivo e non esiste un vaccino.32

La RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) e’ unodei bersagli piu’ interessanti in quanto:

- enzima essenziale per la replicazione del virus- enzima non presente nell’uomo.

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Bersagli di farmaci nel genoma di NV (ca. 7.4 kb)

34Mastrangelo et al. J.Mol.Biol. (2012)

Diversi cristalli di RdRp di NV, preparati sotto opportune condizioni sperimentali,sono stati utilizzati per le analisi cristallografiche sulla struttura 3D dell’enzima

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Norovirus RdRPumana

Norovirus RdRpmurina

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I composti migliori selezionati presentano (alla simulazione)“energie di legame” all’enzima favorevoli.Quindi potrebbero agire da inibitori bloccando l’attivita’dell’enzima (e la replicazione del virus)

Ricerca di ligandi tramite simulazioni

computazionaliVolume esplorato

Suramin

NF023

Due potenziali inibitori della RdRP di NV

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* L’analisi biochimica ha confermato cheSuramina e NF023 si legano alla RdRp e la inibiscono (Drug Hit)

Caratterizzazione in vitro

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Una serie di studi cristallograficiha permesso di studiare il modo di legame degli inibitori alla RdRp e progettare modifiche chimiche delle molecole che le rendano «Drug LEADS»

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41Croci, et al. (2014) PloS one 9, e91765

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Phe 29

Lys 419

Tyr 418

Gln 414

Gln 439

Arg 436

Arg 393

Arg 392

Amido group 1

Cpd6 legato in prossimita’ del dominio “Thumb” di mRdRp.

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Cpd6 legato alle RdRp murina e umana (strutture 3D sovrapposte)

IC50 (nM)

MNVRdRp hNVRdR

p

Suramin 70±3 27±3

Cpd3 200±10 1280±70

Cpd4 160±7 1100±20

0

Cpd6 115±15 1000±90

Cpd7 160±6 1100±50

Cpd 8 60±4 28±4

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Principi dedotti per l’inibizione di NV RdRP a partire dalle analisi cristallografiche e biochimiche.Gli inibitori da noi studiati:

a) Bloccano l’accesso di NTP al sito attivo per effetti sterici ed elettrostatici.

b) Limitano il corretto posizionamento dei NTP bloccando la formazione di RNA

c) Inteferiscono con il posizionamento del dsRNA e limitano la via di uscita della catena nascente di RNA dall’enzima.

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Mario MilaniEloise MastrangeloMichela BollatiFederica CossuDelia TarantinoMargherita PezzulloRomina CrociLouise GourlayPatricia LassauxMarco NardiniLucia PerlettiRiccardo VillaFrancesca PedrettiStefano RicagnoLevon Chant HalabelianMatteo DeRosa

Dip. BioScienzeU. MILANOIBF-CNR MILANO