A.S. 2015/2016 CLASSI TERZE LICEO Responsabile: Prof.ssa Laura Persico

ESTRAZIONE DEL DNA DA MATRICE VEGETALE

Attività svolta presso l’Unità di ricerca di Turi (BA) del:

PREPARAZIONE DEI CAMPIONI

Prelievo delle foglie giovani di vite, posizionate in fogli di carta stagnola (numerati).

Rilevazione del peso dei campioni con la bilancia analitica

e prelievo di circa 100 mg, inserimento in delle apposite

provette (eppendorf) insieme a delle biglie di tungsteno.

L’estrazione del DNA da una cellula vegetale richiede dei pas-

saggi aggiuntivi rispetto a quella animale poiché presenta una

membrana esterna detta parete cellulare, la quale garantisce e

preserva la struttura e il nutrimento della pianta.

Rottura della parete cellulare

Congelamento dei campioni in azoto liquido, per agevola-re la rottura della parete.

Rottura meccanica dei tessuti cellulari grazie all’agitatore Tissue Lyser, il quale con oscillazioni orizzontali fa muove-re le biglie all’interno delle provette favorendo la lacera-zione delle foglie e l’omogeneizzazione dei tessuti.

Dopo aver rotto la parete esterna, si procede con la lisi della

membrana interna:

Aggiunta della mix buffer AP1+RNase per favorire la rottura delle membrane e l’eliminazione dell’RNA;

Utilizzo del vortex per mescolare vigorosamente il contenuto delle provette;

Incubazione in un bagnomaria alla temperatura di 65°C.

Lisi delle cellule

Precipitazione e allontanamento

delle proteine e polisaccaridi

Aggiunta del Buffer AP2 (130µl) e miscelazione;

Incubazione per 5 minuti in ghiaccio;

Centrifugazione per 5 minuti alla velocità di 14000 rpm.

Eliminazione dei precipitati e

dei detriti cellulari

Trasferimento della soluzione ottenuta in colonnine (lilac spin column) con dei particolari filtri che per affinità trattengono gli scarti della cellula e fanno passare il DNA;

Centrifugazione per 2 minuti alla velocità di 14000 rpm,

Legame del DNA alla membrana

della colonna cromatografica

Trasferimento dell’eluato (contenente il DNA) in provette da 2ml e aggiunta del Buffer AP3 con etanolo per favori-re la precipitazione del DNA. Trasferimento in colonnine con affinità per il DNA.

Lavaggi della membrana alla

quale è legato il DNA

Eliminazione dell’eluato e aggiunta sul filtrino della colon-

nina del Buffer di lavaggio AW (500µl) centrifugazioni di 1

minuto a 8000 rpm per garantire una maggiore efficacia del

processo. I lavaggi vanno ripetuti 2 volte.

Eluizione del DNA della colon-

na cromatografica

Aggiunta del Buffer AE (40 µl + 30 µl);

Incubazione per 5 minuti a temperatura ambiente; Centrifuga di 1 minuto a 8000 rpm.

Lettura allo spettrofotometro

per misurare la quantità del

DNA estratto e valutarne la qua-

lità

Ottenuto il DNA, è necessario quantificarlo e valutarne la pu-

rezza mediante lettura allo spettrofotometro, eseguendo

letture a 230,280,260 nm.

La quantità del DNA viene valutata in base all’assorbanza a

260 nm.

La purezza del DNA si ricava dai rapporti tra le assorbanze

230,280,260 nm:

il rapporto A260/A280 ci permette di valutare la contami-

nazione da proteine (deve essere intorno a 1,8);

Il rapporto A260/A230 ci permette di valutare la contami-

nazione da carboidrati e fenoli (solventi organici). Deve

mantenersi intorno a 2,2.

Un ringraziamento speciale al CREA di Turi e ai ricercatori:

Fiammetta Alagna, Maria Francesca Cardone e Carlo Bergamini.

A cura di:

Giuseppe Longo Claudia De Pascale