Corso di Laurea Specialistica in Metodologie chimiche avanzarte...
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Anno Accademico 2010/2011 Laurea Magistrale in CHIMICA Analisi degli alimenti (LMC-1: LIPIDI) Giorgio Bonaga
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Anno Accademico 2010/2011 Laurea Magistrale in
CHIMICA
Analisi degli alimenti(LMC-1: LIPIDI)
Giorgio Bonaga
NUTRIENTI• lipidi• glucidi• protidi• sostanze minerali• vitamine• acqua
ALTRE SOSTANZE
• XENOBIOTICIadditivi alimentaricontaminanti chimicisostanze tossiche naturalisostanze di origine endogenacontaminanti biologici
• INTEGRATORIprodotti dieteticiintegratori alimentarinutraceutici e alimenti funzionali
ALIMENTO
ALIMENTI DI ORIGINE VEGETALE
1. Cereali 2. Olio di oliva 3. Oli di semi, grassi idrogenati,
margarine
4. Frutta
5. Legumi 6. Verdure, ortaggi
7. Alimenti nervini (caffè, tè, cacao)
ALIMENTI DI ORIGINE VEGETALE
1. Carni fresche, trasformate, conservate
2. Prodotti ittici 3. Latte, yogurt 4. Burro
5. Formaggi, latticini
6. Uova 7. Miele
NON ALCOLICHE
BEVANDEALCOLICHE
1. Vino 2. Birra 3. Altre bevande
4. Bevande a base di frutta
5. Bevande di fantasia
COMPOSIZIONE CHIMICA E ANALISIDEI LIPIDI
LIPIDIÈ la classe di nutrienti che comporta le maggiori difficoltà di tipo analitico per i seguenti motivi:
1. la complessità strutturale;
2. la diffusione in natura e negli alimenti (frazione visibile e invisibile);
3. l’instabilità di alcune loro strutture (rancidità);
4. l’importanza merceologica e commerciale della loro composizionechimica: genuinità e qualità legate alla provenienza geografica (DOC = denominazione di origine controllata, DOCG = denominazione di origine controllata e garantita, DOP=denominazione di origine protetta);...
5. la rilevanza tossicologica di alcuni prodotti della loro degradazione,in particolare quella ossidativa;
6. le numerose applicazioni di metodi cromatografici che può richiedere.
LIPIDIDEFINIZIONI
1. Sono “lipidi” le miscele di trigliceridi misti. . (Michel Eugène Chevreul - 1823)
2. Sono “lipidi” gli acidi grassi e i loro derivati che si trovano in natura. .(Franck D. Gunstone - 1968)
3. Sono “lipidi” le sostanze di origine biologica solubili in solventi non polari. .
(IUPAC - 1995)
LIPIDIFUNZIONI
isolanti termici isolanti elettrici
elementi strutturali fonti di energia
mitocondrio
ADP + P1 ATPacidi grassi
LIPIDI
glicerina
energia
+++ +
+++
+++ +
+++++
++
++
+
++
++
++
+
-
-- - -
--
-
O2
CO2
H2O
• cellulari (fosfolipidi, colesterolo, glicolipidi)• di deposito (trigliceridi, acidi grassi)• cuticolari (cere, steroli, alcoli terpenici, alcoli alifatici a lunga
catena)• intracellulari (gliceridi, steroli, tocoferoli) • extracellulari (gliceridi, steroli, tocoferoli)
LIPIDILOCALIZZAZIONE
lipidi cellulari lipidi di deposito lipidi cuticolari
COMPONENTI MAGGIORICOMPONENTI MAGGIORI(97-98%)(97-98%)
TRIGLICERIDI
STRUTTURA DEI GLICERIDI
sn-glicerolo(sn = sterically numbered)
C1
C2
C3
C1C2
C3
sn-glicerolo
C HHO
CH2OH
CH2OH
’
solo nel caso di coppie
enantiomeriche
CH2OHCHOCH2OH
H
1
2
3
Monogliceridi (monoacilgliceroli)
2-monogliceride 1-monogliceride 3-monogliceride
enantiomeri
* *CH2OH
COCH2OH
HC
O
R
1
3
2
3
1 CH2
CHOCH2OH
HO
CO
R
2
3
1 CH2OHCHOCH2
HO
C RO
2
Digliceridi (diacilgliceroli)
2,3-digliceride 1,2-digliceride 1,3-digliceride
enantiomeri
* *CH2OH
CO
CH2
HC
O
RO
CO
R
1
3
2
3
1 CH2
CO
CH2OH
H
OC
OR
CR
O 2
3
1 CH2OH
CHO
CH2
H
OC R
O
2
Trigliceridi (triacilgliceroli)
1,2,3-trigliceride
semplici R = R’ = R”
trigliceridi R R’ = R”
misti R = R’ R”
R R’ R”
3
1 CH2
CO
CH2
H
OC
OR
C
R'
OO
CO
R"
2
residuo di glicerolo(glicerile)
TRIGLICERIDE (lauromiristocaprato di glicerile )
C12:0
C10:0
C14:0
TrigliceridiPPP tripalmitato di glicerile (tripalmitina)C48SSS tristearato di glicerile (tristearina)C54OOO trioleato di glicerile (trioleina) C54LLL trilinoleato di glicerile (trilinoleina)C54PPS dipalmitostearato di glicerile (dipalmitostearina)C50PSS palmitodistearato di glicerile(palmitodistearina) C52SOL stearooleolinoleato di glicerile (stearooleolinoleina)C54LMC ecc.POLPOSSOPecc.
a. butirrico (butanoico)a. capronico (esanoico)a. caprilico (ottanoico)a. caprico (decanoico) a. laurico (dodecanoico)a. miristico (acido
tetradecanoico)a. palmitico (esadecanoico)a. stearico (ottadecanoico)a. arachico (eicosanoico)a. behenico (docosanoico)a. lignocerico (tetracosanoico)
Acidi grassi saturi a catena lineare
C4:0C6:0C8:0C10:0C12:0C14:0C16:0C18:0C20:0C22:0C24:0
a. caproleico (cis-9-decenoico)a. miristoleico (cis-9-
tetradecenoico)a. palmitoleico (cis-6-
esadecenoico) - (trans-9-
esadecenoico) a. oleico (cis-9-ottadecenoico)a. elaidinico (trans-9-
ottadecenoico)a. vaccenico (trans-11-
ottadecenoico)a. gadoleico (cis-9-eicosenoico)a. cetoleico (cis-11-docosenoico)a. erucico (cis-13-docosenoico)a. secaloleico (cis-13-
tetracosenoico)
Acidi grassi monoenoici a catena lineare
cis-9-C10:1cis-9-C14:1cis-6-C16:1trans-9-C16:1cis-9-C18:1trans-9-C18:1trans-11-C18:1cis-9-C20:1cis-11-C22:1cis-13-C22:1cis-13-C24:1
a. sillingico (cis-2,cis-4-decadienoico)a. linoleico (cis-9,cis-12-
ottadecadienoico) - (cis-13,cis-16-
docosadienoico)
Acidi grassi dienoici a catena lineare
Acidi grassi polienoici a catena lineare
a. -linolenicoa. -linolenicoa. arachidonico
cis-6, cis-9, cis-12-C18:3cis-9, cis-12, cis-15-C18:3cis-5, cis-8, cis-12, cis-15-C20:4
cis-2, cis -4 -C10:2cis-9,cis -12-C18:2cis-13,cis -16-C22:2
acido stearico (p.f.: 71,5 °C) (acido ottadecanoico)
STRUTTURA E PROPRIETA’ FISICHE DEGLI ACIDI GRASSI
acido elaidinico (p.f.: 45 °C) (acido trans-9-ottadecenoico)
9
acido oleico (p.f.: 16,3 °C)(acido cis-9-ottadecenoico)
9
acido linoleico (p.f.: - 5 °C) (acido cis-9,cis-12-ottadecadienoico)
acido linolenico (p.f.: - 11,5 °C) (acido cis-9,cis-12,cis-15-ottadecanoico)
acido arachidonico (p.f.: - 49,5 °C) (acido cis-5,cis-8,cis-12,cis-15-eicosatetraenoico)
COMPONENTI MINORICOMPONENTI MINORI(2-3%)(2-3%)
FRAZIONE SAPONIFICABILE
EFRAZIONE
INSAPONIFICABILE
CLASSIFICAZIONE (comportamento all’idrolisi)
• digliceridi• monogliceridi• acidi grassi (liberi, trans, ossigenati, ciclici, ramificati, dimeri)• cere• fosfolipidi• sfingolipidi
• idrocarburi saturi e insaturi• caroteni• tocoferoli e tocotrienoli• alcoli alifatici superiori)• alcoli triterpenici• 4-metilsteroli• steroli• dialcoli triterpenici
frazione saponificabile
frazioneinsaponificabile
FRAZIONESAPONIFICABILE
H3C COOH
CH3(CH2)24 CO
O (CH2)25CH3
CERE
acido esacosanoico (C26:0)
esacosanolo (C26:0)
esacosanoato di esacosanile (C52)
H3C OH
FOSFOLIPIDIDerivano dall’acido -glicerofosforico e sono i principali componenti delle membrane.
acido ortofosforicoglicerolo
+
CH2OHCHOCH2OH
HPHO OHO
OH
acido -glicerofosforico
CH2OHCHOCH2
HO P
OOH
O
+-
+-
glicerolo acido ortofosforico acido -glicerofosforico
FOSFOLIPIDI: Acidi fosfatidiciSono i diesteri dell’acido -glicerofosforico.
diacil-glicerofosfati
CH2
COCH2
HO P
OOH
O
OC
OR
CR'
O +-
diacilglicerofosfati
FOSFOLIPIDI: FosfatidilgliceroliSono i prodotti dell’esterificazione dell’ossidrile dell’acido fosforico degli acidi fosfatidici con una molecola di glicerolo (fosfatidilgliceroli), alla quale si può legare un’altra molecola di acido fosfatidico (difosfatidilgliceroli).
fosfatidilglicerolo
+-
CH2
CHO HCH2OH
RO
CO
OO
OPO
HCH2
O CCH2
CO
R'
di-fosfatidilglicerolo
+-
+-
CH2
CHO HCH2
O
OPO
R
OC
OO
R'C CH2
HO CCH2O
RO
CO
OO
OPO
HCH2
O CCH2
CO
R'
fosfatidilglicerolo difosfatidilglicerolo (PG) (DPG)
FOSFOLIPIDI: Esteri fosfatidiciSono i prodotti dell’esterificazione dell’ossidrile dell’acido fosforico degli acidi fosfatidici con una base azotata (colina, etanolammina, serina).
++-
RO
CO
O
OPO
HCH2
O CCH2
CO
R'O CH2 CH2 N
CH3CH3
CH3lecitina (fosfatidilcolina)lecitina(fosfatidilcolina = PC)
RO
CO
O
OPO
HCH2
O CCH2
CO
R'O CH2 CH2 N
HH
H-+ +
cefalina (fosfatidiletanolammina)
+-
RO
CO
O
OPO
HCH2
O CCH2
CO
R'O CH2 C
H
NH3
COO
fosfatidilserina+
-
cefalina(fosfatidiletanolammina = PE)
fosfatidilserina(PS)
FOSFOLIPIDI: InositolfosfatidiSono i prodotti dell’esterificazione dell’ossidrile dell’acido fosforico degli acidi fosfatidici con il mio-inositolo (1,2,3,4,5,6-esaidrossicicloesano).
+-
RO
CO
O
OPO
HCH2
O CCH2
CO
R'O
OH
OHOH
OH
OH2
fosfatidilinositolofosfatidilinositolo(PI)
FOSFOLIPIDI: Lipidi aldogenici
1-es-1-enil,2-acil,3-glicerofosforil-colina
+-
CCO
O
OPO
HCH2
O CCH2
CO
R'O colina
HH
CH31
+-O
OPO
HCH2
O CCH2OH
CO
R'O colina
2-acil,3-glicerofosforil-colina esanale
H3O+H2O
1CH3
CO
H
1-es-1-enil, 2-acil, 3-glicerofosforilcolina
2-acil, 3-glicerofosforilcolina esanale
SFINGOLIPIDISono ammidi di acidi grassi con la sfingosina
• Cerammidi• Fosfosfingolipidi• Cerebrosidi• Sulfatidi
18
NH2
OH
OHCH3
1
sfingosina(2-ammino,3-idrossi, ottadec- 4 - en-1-olo)
234
sfingosina(2-ammino,3-idrossi,ottadec-4-en-1-olo)
SFINGOLIPIDI: CerammidiSono ammidi della sfingosina (N-acilsfingosine) con acidi grassi.
N-stearil-sfingosina
CH3(CH2)12 CH CH CHOH
CHN
CH2OH
H CO
CH2
CH3
( )16
N-stearilsfingosina
SFINGOLIPIDI: FosfosfingolipidiSono gli esteri delle cerammidi con acido ortofosforico a sua volta eterificato con una base azotata (colina, etanolammina).
sfingomieline
CH3(CH2)12 CH CH CHOH
CHN
CH2
H CO
R
O PO
OO CH2 CH2 N
CH3
CH3CH3
+ +-
sfingomieline(SPH)
SFINGOLIPIDI: CerebrosidiSono cerammidi che si legano al monosaccaride galattosio mediante un legame -glucosidico tra C1-C1.
1CH3(CH2)12 CH CH CH
OHCHN
CH2
H CO
R
O1C
H OHHO HHO H
HCH2OH
H
O
cerebrosidi
SFINGOLIPIDI: SulfatidiSono cerebrosidi nei quali l’ossidrile del C3 del galattosio è esterificato con l’acido solforico
sulfatidi
3
CH3(CH2)12 CH CH CHOH
CHN
CH2
C H
O
R
O
CH OHO H
HO HH
CH2OH
H
OSHO
O
O++
--
sulfatidi
FRAZIONEINSAPONIFICABILE
Separazione TLC dell’insaponificabile
front solvent (Rf = 1)idrocarburi saturi +squalene(caroteni)tocoferoli + tocotrienolialcoli alifatici +alcoli triterpenici
4-metilsterolisterolidialcoli triterpenici
start line (Rf = 0)
IDROCARBURI: Saturi
n-alcani da C13:0 a C33:0
alcani della serie iso/anteiso da C12:0 a C21:0
CH2 CHCH3
CH3 CH2 CHCH3
CH2 CH3serie iso serie anteiso
IDROCARBURI: Insaturi
H3C
CH3
CH3CH3
CH3H3C
CH3
CH3
squalene (C30H50)
(2,6,10,15,19,23-esametil-triaconta-2,6,10,14,18,22-esaene)
2
6 1015
1923
squalene (C30H50) (2,6,10,15,19,23-esametil-triaconta-
2,5,10,14,18,22-esaene)
TOCOFEROLI E TOCOTRIENOLI
Sono derivati del benzotetraidropirano (cromano), con un ossidrile in C6 (6-cromanolo) e con un metile e una catena isoprenica a 16 atomi di carbonio in C2 (tocolo).
O
tetraidropirano benzotetraidropirano 6-cromanolo tocolo (cromano)
O O
HO
O
HOCH3
R12
345
6
78
9
10
tetraidropirano benzotetraidropirano 6-cromanolo tocolo (cromano)
_______________________________________________________________________ TOCOFEROLI 5 7 8________________________________________________________________________5,7,8-trimetiltocolo (tocoferolo = -T) CH3 CH3 CH3
5,8-dimetiltocolo (-tocoferolo = -T) CH3 H CH3
7,8-dimetiltocolo (-tocoferolo = -T) H CH3 CH3
8-metiltocolo (-tocoferolo = -T) H H CH35,7-dimetiltocolo CH3 CH3
H27-metiltocolo H CH3 H
O
HOCH3
R
5
78
R = (CH2)3 CH (CH2)3CH3
CHCH3
(CH2)3 CHCH3
CH3 tocoferolitocoferoli
_______________________________________________________________________ TOCOTRIENOLI 5 7 8________________________________________________________________________5,7,8-trimetiltocotrienolo (T3) CH3 CH3 CH35,8-dimetiltocotrienolo (-T3) CH3 H CH37,8-dimetiltocotrienolo (-T3) H CH3 CH38-metiltocotrienolo (-T3) H H CH3
O
HOCH3
R
5
78
R = (CH2)2 CH CCH3
(CH2)2 CH CCH3
(CH2)2 CH CCH3
CH3 tocotrienolitocotrienoli
COMPONENTI MINORI POLARI
Sono composti di natura fenolica (monofenoli e polifenoli) che svolgono una importantissima attività antiossidante.I monofenoli sono derivati dell’acido benzoico, dell’acido cinnamico e dell’alcol fenetilico.I polifenoli sono composti di natura varia, ma i più diffusi sono l’acido chinico, l’acido shikimico, l’oleoeuropeina, l’apigenina e la luteolina.
MONOFENOLI
COOH
R3
R2
R1
acido benzoico(R1= R2 =R3 = H)
(R1= R2 =R3 = H)acido cinnamico
R1R2
R3
CH CH COOHR1= H; R2 = OH; R3 = HR1= OH; R2 = OH; R3 = OCH3R1= OCH3; R2 = OH; R3 = OCH3
R1= OCH3; R2 = OH; R3 = H
R1= H; R2 = OHR1= OH; R2 = OH
CH2 CH2 OH
R1
R2alcol fenetilico(R1 = R2 = H)
acido vanillicoacido omovanillicoacido protocatechicoacido gensiticoacido p-idrossibenzoicoacido siringico
R1= OCH3; R2 = OH; R3 = HR1= OH; R2 = OCH3; R3 = HR1= OH; R2 = OH; R3 = HR1= OH; R2 = H; R3 = OHR1= H; R2 = OH; R3 = HR1= OCH3; R2 = OH; R3 = OCH3
acido p-cumarico
acido ferulicoacido sinapicoacido 5-idrossicaffeico
tirosolo3-idrossitirosolo
POLIFENOLI
acido chinico
oleoeuropeina
HO COOH
HO OHOH
HO OHOH
COOH
acido scikimico
HO
HO O C O COOCH3
OH3C
O D glucopiranosio
OH
OOH
HO O
apigenina
OH
OOH
HO O
OH
luteolina
ALCOLI SUPERIORI
Sono alcoli da C16 a C30, ma quelli più diffusi sono:
C22H45OH docosanolo
C24H49OH tetracosanolo
C26H53OH esacosanolo
ALCOLI TRITERPENICIContribuiscono al “finger print” di un grasso perché sono caratteristici di ogni matrice lipidica.
cicloartenolo 24-metilencicloartanolo -amirina -amirina ciclobranolo butirrospermolo
cicloartanolo 24-metilenlanost-9(11)enolo lupeolo parkeolo ciclolaudenolo lanostenolo
HO HO HO
HO HO HO
cicloartenolo 24-metilencicloartanolo -amirina
-amirina ciclobranolo butirrospermolo
cicloartanolo 24-metilenlanost-9(11)enolo lupeolo
parkeolo ciclolaudenolo lanostenolo
HO HO HO
HO HO HO
4-METILSTEROLISono derivati del ciclopentanperidrofenantrene:
ciclopentan-peridro(14 H) fenantrenefenantrene
18
19
CH3
CH3
R
4
12
35
67
8
910
111312
14 15
1617
HO
CH3
fenantrene ciclopentan-peridro(14H)fenantrene
HO HO
HO HO
HO HO
obtusifoliolo gramisterolo
citrostadienolo cicloeucalenolo
31-norcicloartenololofenolo
STEROLISono derivati del ciclopentanperidrofenantrene con un ossidrile in C3, un metile in C10, un metile in C13, un’insaturazione nell’anello B e una catena laterale in C17.
CH3
CH3
R
4
12
35
67
8
910
111312
14 15
1617
HO
18
19
A BC D
FITO STEROLI
R =CH3
CH3
CH3
CH3
25
26
20
21
22
23 24
27
2829
2928
27
2423
22
21
20
26
25CH3
R =
28
27
2423
22
21
20
26
25CH3
CH3
CH3
CH3
R =
28
27
2423
22
21
20
26
25CH3
CH3
CH3
CH3
R =
CH3
CH3
CH3
-sitosterolo(24-etil-5-colesten-3-olo)
stigmasterolo(24-etil-5,22-colestadien-3-olo)
campesterolo(24-metil-5-colesten-3-olo)
brassicasterolo(24-metil-5,22-colestadien-3-olo)
ZOO STEROLI
H3C CH3
CH3
HO
CH3
CH3
colesterolo(5-colesten-3-olo)
DIALCOLI TRITERPENICISono due composti tipici dell’olio di oliva (specialmente quello ottenuto per estrazione con solventi) e dell’olio di vinaccioli.
HO
CH2OH
HO
CH2OH
eritrodiolo uvaolo
EVOLUZIONE DEI METODI ANALITICI
1860 - 1870
Titolazione acidi grassi
1870 - 1890
Numero di Henner
Numero di aciditàNumero di saponificazioneIndice di Reichert-Meissl-PolenskeNumero di Henner
1890 - 1920
Numero di iodio
Numero di acetileNumero di polibromuroNumero di KirchnerNumero di idrossileIndice di BömerNumero di idrogeno
1920 -1940
Indice di Bellier
Numeri A e B (indici di Bellier)Numero di perossidiIndice di dieniNumero di tiocianogenoNumero di carbossileTest di Kreis (rancidità)Test di Fitelson (olio di tè)Reazione di Halphen (olio di semi di cotone)Reazione di Villavecchia (olio di semi di sesamo)
1940-1950
Potenziometria
Spettroscopia (UV-VIS, IR)
CHIMICA ANALITICA
DEGLI “INDICI”
1950 - 1960 Cromatografia su colonna (LC)Cromatografia su colonna a fasi invertiteCromatografia con resine a scambio ionicoCromatografia su strato sottile (TLC)Metodi enzimaticiGascromatografia (GC)Cromatografia liquida ad alta prestazione
1961 - 1970 Assorbimento atomicoRiflessione IR
1971 - 1980 TLC su bacchetta di quarzoChemio-luminescenzaSpettrometria di massaRisonanza magnetica nucleare (NMR)
1981 - 1990 Accoppiamento GC/MSGascromatografia capillare (HRGC)Metodi immunologiciAccoppiamento plasma-MS (ICP/MS)
1991 -2000
Fast GC, Ultrafast GC, GCxGC
2001-2010 Ultra Performance LC (UPLC), Comprehensive GC
CHIMICA ANALITICA
STRUMENTALE
PIONIERI DELLA CROMATOGRAFIA• 1903 - TSWETT: separazione e isolamento di pigmenti di vegetali (LSC)
• 1931 - LEDERER & KUHN: isolamento di carotenoidi (LSC)
• 1938 - ISMAILOV & SHRAIBER: detector per cromatografia su colonna (CCD)
• 1941 - MARTIN & SYNGE: cromatografia di partizione (LLC)
• 1944 - CONSDEN, GORDON & MARTIN: cromatografia su carta (PC)
• 1949 - SPEEDING & TOMPKINS: cromatografia ionica (IC)
• 1952 - MARTIN & JAMES: gascromatografia (GC)
• 1957 - GOLAY: colonne capillari per gascromatografia (CGC)
• 1959 - PORATH & FLODIN: cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)
• 1965-1970 - HALASZ; HORVATH; KIRKLAND; PRETORIUS: cromatografia liquida ad elevata prestazione (HPLC) e gascromatografia ad elevata risoluzione (HRGC)
EVOLUZIONE DEI METODI STRUMENTALI
GASCROMATOGRAFIA (GC)
• Colonna impaccata capillare
• Iniettore
splitlesssplitoperatore DCIon columnautomatico
• Rivelatore
catarometrotermistoriionizzazione di fiamma (FID)cattura di elettroni (ECD)termoionizzazione (TID)fotoionizzazione (PID)
CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ELEVATA PRESTAZIONE (HPLC)
• Colonna
assorbimento ripartizione in fase direttaripartizione in fase inversascambio ionico (senza e con soppressione) esclusione dimensionale
• Rivelatore
filorifrattometricoUVfluorescenzadiffusione di luceFT-IR
ANALISI DEI LIPIDINella valutazione delle caratteristiche delle sostanze grasse viene di norma determinata la composizione chimica - semplice o complessa - come uno dei parametri di riferimento più importanti. Infatti, la composizione dei costituenti lipidici di una sostanza grassa è indicativa della sua origine e spesso è diagnostica rispetto la sua “qualità”, intesa come comportamento fisico, chimico-fisico e nutrizionale.La determinazione analitica degli acidi grassi totali è sempre stata considerata come la principale determinazione da effettuare sui campioni di lipidi. Questa convinzione è più il frutto delle difficoltà chimico-analitiche che nel passato si incontravano nell’affrontare delle analisi complesse, che non una valutazione obiettiva, tanto che con l’avvento della GC capillare questi limiti sono stati progressivamente superati ed oggi le determinazioni analitiche relative al settore delle sostanze grasse sono tra le più approfondite e sofisticate.Oltre alla composizione degli acidi grassi totali è stata colta l’importanza della determinazione degli acidi grassi in forma libera, che in alcuni casi è determinante per una adeguata conoscenza dei substrati sottoposti ad indagine. Pertanto, sono stati messi a punto diversi metodi di preparazione del campione e di determinazioni analitiche.
Oltre a quelli sugli acidi grassi liberi sono stati messi a punto metodi di determinazione dei componenti minori dell’insaponificabile perché sono sostanze caratterizzanti l’origine della sostanza grassa, in alcuni casi dei veri e propri “markers”. L’analisi dei componenti sterolici (liberi ed esterificati), degli idrocarburi sterenici, dei tocoferoli, degli alcoli triterpenici e lineari, dei dialcoli triterpenici, delle cere, dei fosfolipidi, dei trigliceridi e dei gliceridi parziali (dicliceridi e monogliceridi) sono oggi procedure routinarie.Di recente si sono diffuse le determinazioni dei componenti condotte in maniera diretta sulla matrice lipidica per la crescente necessità di conoscere le strutture reali presenti nel substrato, ben più significative rispetto una composizione influenzata anche dalle inevitabili trasformazioni dovute ai vari passaggi del procedimento analitico.L’applicazione principale, dal punto di vista della messa a punto di metodi d’analisi sulle sostanze grasse, è il controllo degli oli provenienti dalla lavorazione delle olive. Questa finalità è stata, per motivi storici, molto stimolante per i ricercatori, anche perché consente di rivelare le frodi alimentari e di stabilire la qualità degli oli d’oliva. Non a caso i paesi del Mediterraneo possono vantare la massima competenza mondiale nel settore della chimica analitica delle sostanze grasse, un’affermazione che non sempre si può fare negli altri settori della chimica analitica applicata.
Le determinazioni analitiche che vengono eseguite sui prodotti alimentari, sulle sostanze grasse tal quali o su quelle contenute negli alimenti, hanno lo scopo di stabilire la “qualità” del prodotto. La qualità di una sostanza grassa si può stabilire determinando – con l’analisi chimica, chimico-fisica e organolettica - la composizione, il comportamento reologico e lo stato di conservazione. Attraverso la composizione si può controllare:• la rispondenza ai requisiti di legge, imposti sul prodotto;• la corrispondenza con il dichiarato sull’etichetta (genuinità, qualità, provenienza, ecc.);• il livello di conservazione (in buona parte);• la previsione o la conferma del comportamento reologico.Il comportamento reologico posseduto da un alimento o impartito ad un prodotto alimentare che impiega la sostanza grassa come ingrediente, definisce in maniera obiettiva le caratteristiche organolettiche di struttura del prodotto in relazione al consumo (accettabilità da parte del consumatore, conservazione delle caratteristiche originali, ecc.).Lo stato di conservazione della sostanza grassa di un prodotto alimentare è uno degli aspetti principali della qualità e, spesso, determina l’accettabilità del prodotto da parte del consumatore.
Estrazione dei costituenti lipidiciUn altro aspetto rilevante è quello della valutazione della quantità estratta di componenti dal prodotto alimentare sotto esame: un recupero scarso o molto selettivo nei costituenti da esaminare sarà fonte di maggiori errori di misura e poco rappresentativo della reale composizione della matrice.Il procedimento di estrazione della frazione lipidica dalle matrici più tradizionale è il metodo “Folch” (modificato), ovvero un’estrazione liquido-liquido (CHCl3/CH3OH = 2/1, attualmente CH2Cl2/CH3OH = 2/1) seguita dai tradizionali passaggi necessari ad ottenere una soluzione anidra dell’estratto totale in solvente organico. Questa operazione è molto importante ed è meglio dedicare il tempo necessario alla messa a punto del metodo di estrazione, per evitare un significativo condizionamento del risultato analitico. Ad esempio, diverse matrici naturali hanno una membrana di contenimento dei globuli di grasso impermeabile ai solventi: è pertanto indispensabile operare una preliminare denaturazione delle membrane prima di procedere all’estrazione con solvente.
Analisi della composizione delle sostanze grasseLa composizione di un qualsiasi sistema reale può essere condotta adottando due tipi di determinazioni:1) analisi dei costituenti collezionati mediante trattamento del campione;2) analisi della composizione originale. Quest’ultimo tipo di determinazione è in grande espansione: si basa sull’esame diretto del campione, senza l’intervento di manipolazioni di tipo preparativo, con metodi spettroscopici (IR, NMR, ecc.). Il primo tipo di determinazione, invece, si basa sull’estrazione dei costituenti di interesse analitico, sulla loro eventuale purificazione o frazionamento e sulla loro determinazione quali-quantitativa finale, spesso dopo una derivatizzazione che ne agevola la misura.Con la manipolazione del campione si possono introdurre degli errori di varia natura (formazione di artefatti, modificazione selettiva della composizione originale, ecc.) con un conseguente incremento del rischio di un’erronea comprensione della composizione reale dell’alimento per effetto delle differenti procedure preparative, sebbene si possano adottare delle opportune precauzioni ed introdurre delle adeguate correzioni per limitare gli equivoci.
Le determinazioni di tipo cromatografico hanno avuto, nel tempo, sempre maggiore incidenza nel controllo delle sostanze grasse e tra queste la gascromatografia, se compatibile, ha prodotto i risultati più soddisfacenti. Una volta estratta la sostanza grassa va sottoposta ad un esame preliminare che consente la visualizzazione delle diverse componenti lipidiche presenti. Il sistema migliore per attuare questo screening è una cromatografia tra le più semplici ed economiche: la cromatografia su strato sottile (TLC), come illustrato nella Fig. 1.
Fig. 1 - TLC dei lipidi totali estratti da drupe di lauro (Laurus nobilis) A = pericarpo, B = endocarpo, C = totale D = Fatty Acid Methyl Esters (FAME) di A, E = FAME di B, F = FAME di C
A B C D E F
ANALISI GCDEI LIPIDI
Nella Fig. 2 sono schematizzate le procedure analitiche impiegate nell’analisi di lipidi estratti da tessuti animali, con analisi conclusive di tipo gascromatografico. I lipidi totali sono analizzati sia direttamente sia dopo frazionamento. I lipidi totali e le singole frazioni TLC possono essere ulteriormente analizzate mediante GC capillare previa transesterificazione degli acidi grassi.
Fig. 2 – Analisi GC dei lipidi totali o delle frazioni TLC di estratto siero di sangue.
LIPIDITOTALI
HRGCGC
TLC
Analisi dei lipidi totali
I lipidi totali e/o le singole frazioni possono essere analizzati direttamente oppure sottoposti ad ulteriori procedure preparative (ad esempio transesterificati, per ottenere gli esteri metilici degli acidi grassi) prima di essere sottoposti a indagini più approfondite.Si può condurre un’analisi diretta per gas cromatografia capillare (HRGC) o mediante cromatografia liquida ad elevata prestazione (HPLC). In questi ultimi due casi, oltre ad informazioni qualitative o semi-quantitative, l’analisi potrà fornire anche un risultato quantitativo.La GC capillare dei lipidi totali, Fig. 3, mostra i costituenti del siero di sangue umano, mentre la Fig. 4 rivela le variazioni nel tempo delle componenti lipidiche del siero di ratto sottoposto a digiuno (condizione equivalente ad una alimentazione priva di sostanze grasse) e in particolare la variazione della composizione in acidi grassi nonostante non si modifichi il loro contenuto totale. Fino ad alcuni anni fa si riteneva che non intervenissero modificazione della composizione degli acidi grassi totali, la cui analisi è sempre stata la determinazione analitica più diffusa e spesso la sola realizzata anche in molti altri studi nel settore bio-medico.
Fig. 3 - GC dei costituenti lipidici del siero di sangue umano, dopo estrazione dalla matrice, metilazione degli acidi liberi (diazometano) e silanizzazione (I.S.: -sitosterolo).COLONNA: vetro 10 m x 0,32 mm i.d., SE 52 f.t. 0,15 µm.
CARRIER GAS (He): 2,5 ml/min.
COLONNA: vetro 10 m x 0,32 mm i.d., SE 52 f.t. 0,10-0,15 µm.CARRIER GAS (He): 2,5 ml/min.
Fig. 4 - GC dei lipidi totali estratti dal siero di sangue di ratti sottoposti a digiuno: a tempo 0 (A) e dopo 6 ore di digiuno (B).
A
0030 3015 15
squalene
**
B
L’analisi GC dei lipidi di membrana cellulare, riprodotta nella Fig. 5, è stato utilizzato per studiare le modificazioni di composizione della membrana in funzione dell’obesità per iperfagia del ratto: questa determinazione ha consentito di mettere in luce (per la prima volta) piccole quantità di trigliceridi nelle membrane e di evidenziarne il significativo aumento con l’obesità dell’animale, sia nelle membrane cellulari del fegato che in quelle dei mitocondri (anche se con incrementi inferiori). Tale risultato, in accordo con le misure di permeabilità della membrana (corrispondente alla sua funzionalità), ha messo in evidenza il problema dei danni biologici a carico dei soggetti in condizione di sovrappeso.L’esame dei componenti lipidici presenti sulla superficie della drupa di olivo, mostrata in Fig. 6 e analogamente sugli acini d’uva ha evidenziato, accanto a scarsi contenuti di cere, la presenza di elevate quantità di acidi grassi e di alcoli lineari a lunga catena, insieme a composti triterpenici, in entrambi i substrati. Con l’impiego di colonne GC capillari, polari e termostabili (ad es.: 50%fenil-50%dimetil-polisilossano), sono state ottenute separazioni, comparabili a quelle ottenute in HPLC, basate sulla dimensione e sul grado di insaturazione totale del singolo trigliceride (Fig. 7).
Fig. 5 - GC dei lipidi totali estratti dalle membrane delle cellule di fegato di ratto, alimentato con dieta standard (i digliceridi derivano dalla pirolisi dei fosfolipidi per effetto della temperatura dell’iniettore, i componenti 1 e 2 dalle sfingomieline).COLONNA: vetro 10 m x 0,32 mm i.d., SE 52 f.t. 0,10-0,15 µm
TEMPERATURA: da 200 a 350°C, 5°C/minCARRIER GAS (He): 2,5 ml/min
cole
ster
olo
1
2
678
9
ABCD
DIGLICERIDITRIGLICERIDI
Fig. 6 - GC dei lipidi totali (A) estratti dalla superficie delle drupe di olivo, esterificati e silanizzati. Le frazioni B e C sono state ottenute per TLC. COLONNA: silice fusa 25 m x 0,25 mm i.d., TAP f.t. 0,1 µmTEMPERATURA: da 200 a 360°C, 3°C/minCARRIER GAS (He): 1,0 ml/min
A
B
C
FRAZIONAMENTO SPE DEI LIPIDI TOTALI
• idrocarburi• steroli esterificati• triacilgliceroli• alcoli esterificati
• triacilgliceroli• tocoferoli
• steroli liberi• dioli e tocoferoli• alcoli triterpenici e alifatici • diacilgliceroli • acidi grassi liberi
• monoacilgliceroli• fosfolipidi• polifenoli
3 ml esano
3 ml esano/etere = 8/2
4 ml esano/etere = 1/1
4 ml metanolo
SAPONIFICAZIONE
TLC
Analisi dei gliceridi
Con l’impiego di colonne capillari, polari e termostabili (50%fenil-50% dimetil-polisilossano), sono state realizzate ottime separazioni, comparabili a quelle ottenute con la HPLC, basate sulla dimensione e sul grado di insaturazione totale del singolo trigliceride, come mostra la Fig. 7.Con l’impiego dello stesso tipo di colonna, oltre a realizzare ottime separazioni basate sulla dimensione e sul grado di insaturazione totale del singolo trigliceride, è stato messo a punto un metodo di determinazione dei digliceridi associato alla separazione degli 1,2-DG dagli 1,3-DG, come mostra la Fig. 8. Con questa analisi si è evidenziata l’importanza del rapporto fra i due tipi di digliceridi nella valutazione della qualità degli oli di oliva.La determinazione della composizione degli acidi grassi presenti nella posizione 2 della glicerina, dopo degradazione con lipasi pancreatica dei trigliceridi di origine vegetale, è utile all’individuazione di sostanze grasse esterificate chimicamente. L’analisi diretta dei monogliceridi del lipolizzato dopo derivatizzazione (TMS), mostrata in Fig. 9, ha permesso un notevole risparmio di tempo e una migliore quantificazione, per effetto della diminuzione delle interferenze spesso riscontrate con il metodo ufficiale di analisi.
Fig. 7 - GC dei TG di olio di mais (A), di girasole (B), di arachide (C) e di soia (D). COLONNA: silice fusa 25 m x 0,25 mm i.d., TAP f.t. 0,1 µm.
TEMPERATURA: da 340 a 360°C, 1°C/minCARRIER GAS (He): 1,0 ml/min.
ANALISI DEI TRIACILGLICEROLI1. POP2. PLP+PPoO3. POS4. POO5. PLS6. PLO7. PLL+PoLO8. SOS+POA9. SOO10. OOO+SLS11. SLO12. OLO+SLL13. SLL14. OLL15. LLL16. LLnL17. POBe18. AOO19. GaOO+PLBe20. ALO21. OLGa22. ALL23. GaLL24. POLg+SOBe25. BeOO26. PLLg27. BeLO28. BeLL29. SOLg30.LgOO31. LgLO32.LgLL
P = acido palmiticoPo = acido palmitoleicoS = acido stearicoO = acido oleicoL = acido linoleicoLn = acido linolenicoA = acido arachidicoGa = acido gadoleicoBe = acido beenicoLg = acido lignocerico
Fig. 8 - GC dei digliceridi di un olio di oliva extra vergine: (A) appena prodotto ( B) dopo 10 mesi di conservazione in condizioni ideali .
COLONNA: silice fusa 25 m x 0,25 mm i.d., TAP f.t. 0,1 µm.TEMPERATURA: da 200 a 360°C, 3°C/minCARRIER GAS (He): 0,8 ml/min.
1. acidi liberi2. squalene3. -tocoferolo4. 1,2 DG a C345. 1,2 DG a C346. 1,2 DG a C347. 1,3-DG a C348. 1,2-DG a C369. 1,2-DG a C3610.1,3-DG a C3611.1,3-DG a C36 X unknownI.S. standard interno
ANALISI DEI DIACILGLICEROLI
A
B
COLONNA: vetro 25 m x 0,25 mm i.d., SE 52 f.t. 0,10-0,15 µmTEMPERATURA: da 120 a 280°C, 8°C/minCARRIER GAS (He): 2,5 ml/min
ANALISI DEI MONOACILGLICEROLI
1. squalene2. acido oleanolico3. 1-monostearina + 3 monostearina4. 1-C18 ins + 3-C18 ins5. 2-C18 ins6. 1-monopalmitina + 3-monopalmitina7. 1-monopalmitoleina + 3-
monopalmitoleina8. 2-monopalmitina9. 2-momopalmitoleina
Fig. 9 - GC della miscela di lipolisi (A) olio di oliva extra vergine (B) olio esterificato al 100%
A
B
Analisi degli acidi grassi
La determinazione degli acidi grassi è la più classica delle determinazioni gascromatografiche. Attualmente, oltre alla determinazione degli acidi grassi totali o di quelli relativi alle frazioni lipidiche, si dosano anche gli acidi grassi liberi, dopo metilazione con diazometano. Quando la composizione dei lipidi non è stata ancora sufficientemente studiata è bene approfondire in via preliminare la distribuzione dei costituenti anche mediante TLC analitica, con la quale si possono visualizzare anche degli acidi grassi derivati, più polari.Nel caso della determinazione della composizione degli acidi grassi (sotto forma di esteri metilici) è stato ampiamente sfruttato l’impiego di colonne GC capillari non polari (SE 30, SE 52, ecc.) e polari (OV 275, OV 285, ecc.); con quelle polari, in funzione della lunghezza e del film tickness del liquido di partizione, si possono separare anche i trans-isomeri, come mostra la Fig. 10 (*).
__________________________________________________
(*) questa procedura è divenuta il metodo ufficiale UE per il controllo della genuinità degli oli vergini.
Fig. 10 - GC degli esteri metilici degli acidi grassi (FAME) di un olio di oliva (A) e di un olio di girasole (B).
COLONNA: silice fusa 30 m x 0,25 mm i.d., OV 275 f.t. 0,2 µmTEMPERATURA: da 130 a 200°C, 3°C/minCARRIER GAS (He): 1,4 ml/min
A
B
Con l’impiego di colonne dello stessa fase stazionaria, ma di lunghezza elevata (75-100 m), sono possibili separazioni ottimali, comprese quelle degli isomeri di posizione dei doppi legami, come mostra la Fig. 11. L’impiego di colonne CG capillari corte, polari, è stato utilizzato convenientemente nella rapida determinazione (circa 4 minuti) sia del contenuto in sostanza grassa che della composizione degli acidi grassi totali, come mostra la Fig. 12, con la possibilità di esaminare circa 100 campioni al giorno con due analisti. L’utilizzo di una colonna CG mediamente polare (OV 17, OV 1701, ecc.) ha portato alla determinazione della composizione degli acidi organici (sono presenti numerosi idrossiacidi e acidi bicarbossilici) della gelatina reale, nota anche come “pappa reale” (royal jelly), come mostra la Fig. 13. Questa analisi è fondamentale per il controllo della genuinità del prodotto.L’impiego di colonne GC capillari, non polari (SE 30, SE 52, ecc.), nell’analisi della composizione degli acidi grassi, è un’ottima scelta per ottenere la separazione di acidi grassi ciclici, come mostrano la Fig. 14 (acidi grassi totali) e la Fig. 15 (acidi grassi frazionati) relativamente ad un olio di malva.La Fig. 16 mostra l’analisi di acidi grassi ossidati (OFA) di un olio raffinato riscaldato a 160°C in presenza di aria, mentre la Fig. 17 mostra i prodotti di ossidazione termica di un sistema modello costituito da oleato di metile.
Fig. 11 - GC dei FAME ottenuti da margarine vegetali (A e B) e da olio di girasole (C).
COLONNA: silice fusa 100 m x 0,25 mm i.d., OV 285 f.t. 0,2 µmTEMPERATURA: 175°CCARRIER GAS (He): 0,6 ml/min
acidi grassi isomeri geometrici
C14
C16
C18
C18:1 C18:2
trans
C12
t,c-C18:2c,t-C18:2
t,t-C18:2
trans
c,c-C18:2
A
B
C
Fig. 12 - GC dei FAME ottenuti di un olio di colza ad elevato contenuto di acido erucico.
COLONNA: silice fusa 15 m x 0,32 mm i.d., Carbowax 20M f.t. 0,2 µmTEMPERATURA: 200°CCARRIER GAS (He): 1,5 ml/min
Fig. 13 - GC degli FFA (metilati con CH2N2) dell’estratto lipidico di gelatina reale.
COLONNA: vetro 20 m x 0,32 mm i.d., OV 17 f.t. 0,2 µmTEMPERATURA: 160°CCARRIER GAS (He): 2,5 ml/min
1. 7-idrossipentanoico2. 8-idrossiottanoico3. ottandioico4. 9-idrossinonanoico5. metil-ottandioico6. idrossidecanoico7. metil-ottandioico8. 9-idrossidecenoico9. 10-idrossidecanoico10.decandioico11.10-idrossidecenoico12.decendioico
acidi grassi bicarbossilici e idrossi-sostituiti
acidi grassi ciclopropanici
COLONNA: vetro 25 m x 0,32 mm i.d., OV 1 f.t. 0,2 µmTEMPERATURA: da 150 a 260°C, 5°C/minCARRIER GAS (He): 2,5 ml/min
Fig 14 - GC dei FAME di un olio di malva (Abutilon avicennae, Gaertn.).
1. C14:02. C15:03. C16:14. C16:05. C17:26. C17:17. C17:08. acido malvalico (C18)9. C18:110. C18:211. C18:012. acido sterculico (C19)13. acido diidrossisterculico14. C19:015. C20:216. C20:117. C20:018. C21:019. C22:120. C22:021. C23:022. C24:0
CH3 C C COOHCH2
CH3 C C COOHCH2 HH
acido sterculico
acido diidrosterculico
CH3 C CCOOH
CH2
acido malvalico
Fig. 15 - GC degli esteri metilici degli acidi grassi di un olio di malva (Abutilon avicennae, Gaertn.) dopo frazionamento mediante TLC-AgNO3.A = acidi grassi saturiB = acidi grassi monoinsaturiC = acidi grassi diinsaturi
COLONNA: vetro 25 m x 0,32 mm i.d., OV 1 f.t. 0,2 µmTEMPERATURA: da 150 a 260°C, 5°C/minCARRIER GAS (He): 2,5 ml/min
Fig. 16 - GC di acidi grassiA = olio di girasole raffinatoB = olio dopo 3 ore a 160°C all’aria
COLONNA: silice fusa 25 m x 0,32 mm i.d., SE 52 f.t. 0,1 µmTEMPERATURA: da 120-280°C, 8°C/min.CARRIER GAS (He): 1,5 ml/min
B
A
OFA0 6 12
min
OFA
COLONNA: silice fusa 10 m x 0,32 mm i.d., SE 52 f.t. 0,10-0,15 µmTEMPERATURA da 150 a 350°C, 8°C/min.CARRIER GAS (He): 2,5 ml/min
Fig. 17 - GC di una miscela di perossidazione termicadell’oleato di metile.
min 15 10 5 0
olea
to d
i met
ile
I.S.
VOLATILINON VOLATILI
R – RDIMERI
R – O - R
acidi grassi ossidati
Le Fig. 18, 19, 20 e 21 mostrano i tracciati GC rispettivamente dell’analisi di miscela di acidi grassi polinsaturi; acidi grassi 3, 6, 9; di acidi grassi cis e trans; di acidi grassi isomeri geometrici e di posizione che si formano durante il processo di idrogenazione di un olio di girasole.
Nickel Raney
C CH H
910
CCH HHH
811
meccanismo di Horyuti-Polany
COLONNA: silice fusa 30 m x 0.25 mm i.d., SPB-PUFA f.t. 0,2 µm. TEMPERATURA: 210 °CCARRIER GAS (He): 1, 5 ml/min
acidi grassi polinsaturi
Fig. 18 - GC di una miscela di esteri metilici di acidi grassi al alto grado di insaturazione
1. acido miristico C14:02. acido palmitico C16:03. acido stearico C18:04. acido oleico C18:15. acido stearidonico C18:4 36. acido arachidico C20:07. 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico (EPA) C20:5 38. 7,10,13,16,19-docosapentaenoico (DPA)
C22:5 39. 4,7,10,13,16,19-docosaesaenoico (DHA)
C22:6 3
acidi grassi 3, 6, 9Fig. 19 - GC di una miscela di esteri metilici di acidi grassi ad alto grado di insaturazione.
COLONNA: silice fusa, 30 m x 0.32 mm i.d., Omegawax f.t. 0.25 µmTEMPERATURA: 200 °CCARRIER GAS (He): 1,5 ml/min
COLONNA: silice fusa 75 m x 0.18 mm i.d., SP-2560 f.t. 0,14 µm. TEMPERATURA: 180 °CCARRIER GAS (He): 1,5 ml/min
acidi grassi cis e trans
Fig. 20 - GC di una miscela di isomeri geometrici di FAME C18:1, C18:2 e C18:3
1. t-7,18:1+t-6,18:12. t-9,18:13. t-11, 18:14. t-12, 18:1+c-6, 18:1+c-7,18:1+t-
13,18;15. c-9, 18:16. c-11, 18:17. c-12,18:18. c-13,18:19. t-9,t-12,18:210.c-9,t-12,18:211.t-9,c-12,18:212.c-9,c-12,18:213.t-9,t-12,t-15,18:314.t-9,t-12,c-15,18:315.t-9,c-12,t-15,18:316.c-9,t-12,t-15,18:3+c-9,c-12,t-
15,18:317.c-9,t-12,c-15,18:318.t-9,c-12,c-15,18:319.c-9,c-12,c-15,18:3
COLONNA: silice fusa 100 m x 0,20 mm i.d., SP-2560 f.t. 0,20 µmTEMPERATURA: 170 °CCARRIER GAS (He): 1,2 ml/min
acidi grassi isomeri geometrici e posizionali
1. C18:02. C18:1 isomeri trans3. C18:1 isomeri cis e trans 4. C18:1 isomeri cis5. C18:26. C20:0
Fig. 21 - GC degli FAME di un olio di girasole idrogenato.
Analisi dell’ insaponificabile
CLASSI DELL’INSAPONIFICABILE( 1% dell’estratto lipidico totale in prodotti raffinati)
1. idrocarburi2. caroteni3. tocoferoli e tocotrienoli4. alcoli alifatici (grassi) liberi5. alcoli triterpenici6. 4-metilsteroli7. steroli8. diacoli triterpenici
FRAZIONAMENTO PER TLC
TLC degli insaponificabili di lipidi estratti dall’epicarpo (A) e dall’endocarpo-mesocarpo (B) delle drupe di olivo in diversi stadi della maturazione (agosto-gennaio).
idrocarburi
toferoli e tocotrienoli
4-metilsteroli
dialcoli triterpenici
caroteni
alcoli alifatici + alcoli triterpenici
sterolidialcoli triterpenici carbossilati
FAME
A B
ANALISI DELL’INSAPONIFICABILE TOTALEUtilizzando una colonna GC capillare, polare e termostabile (50% fenil-50% dimetil-polisilossano), è stata analizzata la frazione insaponificabile totale (dopo silanizzazione) di diversi oli, in modo da metterne in evidenza le differenze compositive, come mostra la Fig. 22.
Nel caso degli oli di oliva lampanti o rettificati, l’analisi è in grado di mettere in evidenza la eventuale presenza di olio di sansa negli oli di oliva lampanti o rettificati, come mostra la Fig. 23.
Nel caso dell’insaponificabile del caffè si può determinare con discreta precisione il rapporto di miscelazione fra i due varietà di caffè, a partire da un minimo del 5-7% circa di varietà Robusta nella varietà Arabica, come mostra la Fig. 24.
COLONNA: colonna di silice fusa, 25 m x 0.25 mm i.d., TAP f.t. 0,1 µm.TEMPERATURA: da 200 a 300 °C, 3°C/min.CARRIER GAS (He): 0,8 ml/min
Fig. 22 – GC dell’insaponificabiledi oli diversi:
A = olivaB = nocciolaC = arachideD = maisE = soiaF = vinaccioli 1. FFA
2. docosanolo3. tetracosanolo4. esacosanolo5. squalene6. unknown7. unknown8. unknown9. -tocoferolo10.diidrobrassicasterolo11.campesterolo12.stigmasterolo13. -sitosterolo14. 5-avenasterolo 15.cicloartenolo16.unknown17.24-
metilencicloartanolo18.citrostadienolo19.acido oleanolico
A
B
C
D
E
F
COLONNA: silice fusa 25 m x 0.25 mm i.d., TAP f.t. 0,1 µm TEMPERATURA: da 200 a 300 °C , 3°C/min.CARRIER GAS (He): 0,8 ml/min
Fig. 23 - GC dei componenti degli insaponificabili (TMS) di un olio extra vergine di oliva miscelato con il 5, 10 e 20% di olio di sansa.
I.S. 1 = standard interno (eicosanolo)I.S. 2 = standard interno (squalano) 22 = docosanolo 24 = tetracosanolo 26 = esacosanolo 28 = ottacosanolo E = eritrodiolo
extra v.
extra v.+
5%
extra v.+
10%
extra v.+
20%
COLONNA: silice fusa 25 m x 0,25 mm i.d., TAP f.t. 0,1 µm TEMPERATURA: da 200 a 300 °C a 5°C/minCARRIER GAS (He): 1,0 ml/min
Fig. 24 - GC dei componenti degli insaponificabili (TMS) di caffè arabica (A) e robusta (B).
1
2
345
6
I.S.
7 8 9 10
1112
13
1415
16
1718
1920
21
22
1
2
3456
I.S.
7
8
9
10 12
13 1415
16
17 18
19
2021
22
1. F2. F3. F4. F5. F6. F7. prodotto di disidratazione del
cafestolo8. prodotto di disidratazione del
kahweolo9. kahweolo10. cafestolo11. unknown12. 16-O-metilcafestolo13. unknown14. unknown15. unknown16. campesterolo17. stigmasterolo18. ß-sitosterolo;19. 5-avenasterolo20. cicloartenolo21. 24-metilencicloartanolo22. citrostadienoloI.S. standard interno (squalano)
FFA
B
A
ANALISI DEGLI IDROCARBURIGli idrocarburi dei sistemi lipidici naturali sono presenti in modesta percentuale (raramente supera lo 0,2% dei lipidi totali); solo gli oli vergini d'oliva ne contengono lo 0,5% circa, in prevalenza rappresentati dallo squalene (idrocarburo triterpenico esainsaturo, C30H50). Oltre allo squalene nella frazione degli idrocarburi è presente una serie omologa di costituenti lineari, prevalentemente saturi, da 15 a 33 atomi di carbonio, con predominanza dei termini dispari (a differenza di quelli contenuti nei derivati del petrolio, paraffine e vasellina, che contengono serie con numero dispari e pari di atomi di carbonio). Sono altresì presenti, sebbene in piccole quantità, idrocarburi ramificati iso- e anteiso-.Un tracciato GC caratteristico della frazione idrocarburica delle sostanze grasse naturali, isolata per TLC, è riprodotto nella Fig. 25 .Alcuni idrocarburi ciclici insaturi, dotati di struttura steroidea, detti cumulativamente stereni, sono stati individuati come traccianti del processo tecnologico di raffinazione degli oli, perché non sono presenti nei lipidi naturali, ma derivano dalla disidratazione dei corrispondenti steroli.In alcuni oli di spremitura, non raffinati, possono essere presenti piccole quantità di inquinanti (pesticidi, composti organici volatili, idrocarburi clorurati e idrocarburi aromatici, ecc.).
Nel caso degli oli di oliva vergini sono state trovate quantità modeste (alcuni ppm) di benzene e ciò ha comportato la messa a punto di un metodo per il dosaggio di benzene sciolto in una sostanza grassa. Nella banda TLC corrispondente al fronte del solvente sono presenti anche idrocarburi policiclici aromatici (PAHs) che provengono dall’inquinamento ambientale. La concomitante presenza di idrocarburi ad elevato peso molecolare, che in GC si sovrappogono con alcuni PAHs, rende inidoneo il ricorso alla GC per la determinazione di entrambi i tipi di idrocarburi (salvo il ricorso all’accoppiamento GC-MS), ovvero è preferibile l’impiego della HPLC.Durante il processo di raffinazione e di idrogenazione delle sostanze grasse, gli idrocarburi insaturi, specialmente lo squalene, subiscono numerose isomerizzazioni (sia geometriche che posizionali) che generano una selva di isomeri, facilmente rilevabili con un’analisi GC con colonna capillare.
Fig. 25 - GC della frazione idrocarburica dell’estratto lipidico ottenuto da cariossidi di orzo.
COLONNA: silice fusa 30 m x 0.32 mm i.d., OV1 f.t. 0,10-0,15 µm TEMPERATURA: da 180 a 270 °C, 8°C/min.CARRIER GAS (He): 1,5 ml/min
1. C152. C163. C174. C185. C196. C207. C218. C229. C2310.C2411.C2512.C2613.C2714.C2815.C30
(squalene)16.C2917.C3018.C3119.C32
ANALISI DEI TOCOFEROLI E TOCOTRIENOLII tocoferoli e i tocotrienoli sono sostanze ad azione antiossidante e ad attività vitaminica (-tocoferolo o vitamina E). Recentemente hanno assunto molta importanza, soprattutto i tocotrienoli, in relazione ai loro effetti sulla salute umana. I tocotrienoli, pur presenti in modesta quantità in molte sostanze grasse, sono contenuti in quantità più elevate nel grasso di palma e nell’olio di vinaccioli. La separazione della miscela di tocoferoli e tocotrienoli (TMS), mostrata in Fig. 26, è l’analisi cromatografica più breve ed efficace per separare i componenti di queste classi.Nelle bande TLC dei tocoferoli e dei tocotrienoli sono presenti altre sostanze di analoga polarità. Fra queste sono stati individuati gli epossi-squaleni, prodotti di struttura simile allo squalene e contenenti un anello ossiranico. Queste sostanze possono derivare dalla ossidazione chimica od enzimatica dello squalene (come ad esempio negli oli di sansa di oliva). In campioni di oli estratti da olive raccolte a diversi stadi di maturazione sono stati trovati degli epossi-squaleni assenti negli oli estratti da olive mature: questo dato fa ritenere che gli epossi-squaleni siano precursori della biosintesi delle strutture steroidee (lanosterolo, per i sistemi animali e cicloartenolo per i sistemi vegetali).
COLONNA: SCOT di vetro 15 m x 0.25 mm i.d., OV 1 f.t. 0.10-0,15 µm TEMPERATURA: 240 °CCARRIER GAS (He): 2,5 ml/min
Fig. 26 - GC di una miscela di tocoferoli e tocotrienoli (da olio di palma e olio di vinaccioli).1.-tocoferolo2.-tocoferolo3.-tocoferolo4.-tocotrienolo5.-tocoferolo6.-tocotrienolo7.-tocotrienolo8.-tocotrienolo
ANALISI DEI COMPOSTI DELL’AROMAAlcuni acidi grassi costituenti dei lipidi della drupa di olivo sono i precursori di sostanze volatili che contribuiscono in modo rilevante all’aroma dell’olio, secondo lo schema:
La Fig. 27 riporta la GC dei composti volatili di un olio extra vergine di oliva.
ETILBENZENI o XILENI
Fig. 27 - GC dei composti volatili di olio extra vergine di oliva.
1. pentanale2. benzene3. esanale4. tricloroetilene5. tetracloroetano6. pentenale7. 1-pentanolo8. etilbenzeni o
xileni9. 2-esenale10. ottanale11. pentenale12. 1-esanolo13. 3-esen-1-olo14. 2-esen-1-olo15. acido acetico
ANALISI DEGLI ALCOLI ALIFATICI E TRITERPENICIGli alcoli lineari sono costituiti da una serie omologa di alcoli primari da 20 a 32 atomi di carbonio, in parte generati dalla saponificazione dei lipidi (ad esempio, l’alcol terpenico fitolo). Gli alcoli triterpenici (o 4,4’-dimetilsteroli), posseggono una struttura steroidea e sono costituiti da una serie di componenti che sono presenti, in proporzioni diverse, in tutte le sostanze grasse di origine vegetale. Gli alcoli lineari e triterpenici, che hanno una polarità superiore a quella dei tocoferoli, sono due classi dell’insaponificabile poco separate per TLC su gel di silice, ma non essendoci problemi nella successiva separazione per GC capillare, non occorre procedere alla loro separazione con una ulteriore TLC. La Fig. 28 mostra il gascromatogramma della frazione degli alcoli lineari e triterpenici (TMS) di un olio di semi di lino.Sono state studiate le modificazioni strutturali che i processi di raffinazione e di idrogenazione industriali producono a carico dei componenti di questa classe di composti. Queste modificazioni sono risultate prevalentemente dovute ad isomerizzazioni causate dalla presenza di un doppio legame in posizione 24 o dalla presenza di un anello a tre atomi di carbonio. La Fig. 29 mostra i tracciati GC della frazione di alcoli triterpenici di un olio di mais prima e dopo l’idrogenazione industriale.
COLONNA: vetro 25 m x 0,32 mm i.d., SE 52 f.t. 0,10-0,15 µm TEMPERATURA: da 150 a 300 °C, 8°C/min.CARRIER GAS (He): 2,5 ml/min
Fig. 28 - GC degli alcoli lineari e triterpenici di un olio di lino. 1.fitolo2.geranil-geraniolo3.docosanolo4.tetracosanolo5.pentacosanolo6.unknown7.esacosanolo8.eptacosanolo9.ottacosanolo10.triacontanolo11.-amirina12. cicloartenolo13.24-metilencicloartanolo
Fig. 29 - GC degli alcoli triterpenici di un olio di mais prima (A) e dopo (B) idrogenazione. 1. -amirina 2. -amirina 3. cicloartenolo 4. 24-metilencicloartanolo 3a 3b isomeri del cicloartenolo 3ci 4a 4b 4c 4d 4e 4f 4g 4h 4i 4l 4m
COLONNA: vetro 30 m x 0,32 mm i.d., SE 52 f.t. 0.20 µm.TEMPERATURA: 260 °CCARRIER GAS (He): 1,0 ml/min
4i4h4g isomeri del 24-
metilencicloartanolo
ANALISI DEI METILSTEROLINel frazionamento TLC dell’insaponificabile di una sostanza grassa, fra gli alcoli lineari (e triterpenici) e gli steroli, migra la frazione dei metilsteroli.La Fig. 30 riporta i tracciati GC delle frazioni di metilsteroli di un olio di mais, prima e dopo idrogenazione industriale. Analogamente a quanto avviene a carico degli alcoli triterpenici, i processi di raffinazione e di idrogenazione degli oli modificano sensibilmente anche i metilsteroli, con formazione di isomeri che possono essere utilizzati come markers rivelatori di una miscelazione di oli vergini di oliva con oli raffinati.
A e BCOLONNA: vetro 30 m x 0,32 mm i.d., SE 52 f.t. 0,2 µmTEMPERATURA: 260°CCARRIER GAS (He): 1,0 ml/min
C e D:COLONNA: vetro 20 m x 0,32 mm i.d., FFAP f.t. 0,2 µmTEMPERATURA: 220°CCARRIER GAS (He): 1,5 ml/min
Fig. 30 - GC dei 4-metilsteroli di un olio di mais, prima (A e B) e dopo (C e D) idrogenazione. 1.obtusifoliolo2.gramisterolo3.cicloeucalenolo4.citrostadienoloabdecdfg
isomeri dell’obtusifoliolo
isomeri del gramisterolo
isomeri del citrostadienolo
ANALISI DEGLI STEROLILa frazione degli steroli, certamente quella più studiata, può essere analizzata con colonne capillari corte, come mostra la Fig. 31 (steroli di olio di semi di pomodoro) e lunghe, come mostra la Fig. 32 (olio extra vergine di oliva) e la Fig. 33 (olio di extra vergine e olio di nocciola). Alla determinazione degli steroli totali può essere associata quella degli steroli in forma libera, in modo da determinare anche le quantità di steroli in forma combinata, come mostra la Fig. 34 (caffè verde e torrefatto). Mediante una TLC preparativa degli steroli totali è anche possibile frazionare gli steroli totali e determinare per GC la composizione delle diverse bande. Recentemente sono stati individuati degli steroli con posizioni isomeriche del doppio legame presente nella loro struttura ciclica. Questi isomeri possono essere considerati dei veri e propri markers di numerose frodi degli oli di oliva vergini, insieme alle isomerizzazioni del fucosterolo e del 5-avenasterolo per effetto della raffinazione di oli ad elevata acidità. L’analisi dei prodotti di ossidazione degli steroli è focalizzata su quelli del colesterolo (COPs), anche per i noti effetti nocivi sulla salute umana prodotti da questi composti. Per analizzare queste sostanze, presenti in piccola quantità, ma biologicamente molto attive, sono stati messi a punto metodi d’analisi sia GC che HPLC, sebbene i migliori risultati siano stati ottenuti con la GC capillare, come mostra la Fig. 35.
ACOLONNA: vetro 10 m x 0.32 mm i.d., FFAP f.t. 0,10-0,15 µmTEMPERATURA: 205 °CCARRIER GAS (He): 2,5 ml/min
BCOLONNA: vetro 10 m x 0,32mm i.d., SE 30 f.t. 0,32 µmEMPERATURA: 250°CCARRIER GAS (He): 2,5 ml/min
1. deidrocolesterolo2. colesterolo3. 24-metilencolesterolo4. brassicasterolo5. campesterolo6. stigmasterolo7.-sitosterolo8.5-avenasterolo9. unknown10.7-stigmastenolo
Fig. 31 - GC degli steroli totali (TMS) dell’olio di semi di pomodoro.
Fig. 32 - GC degli steroli totali (TMS) dell’olio extra vergine d’oliva (SE 52, 25 m).
1. colesterolo2. 24-metilencolesterolo3. campesterolo4. campestanolo5. stigmasterolo6. unknown7. 7-campesterolo8.-sitosterolo9. sitostanolo10.5-avenasterolo11.5,24-stigmastadienolo12.7-stigmastenolo13.7-avenasterolo14. etete etilico
(impurezza)15. eritrodiolo16. uvaolo + unknown
I.S.
Fig. 33 - GC degli steroli .A olio extra vergineB olio di nocciola raffinatoC olio extra vergine + 10% olio di nocciola
1. colestanolo (I.S.)2. 7-colesterolo
(I.S.)3. campesterolo4. stigmasterolo5. -sitosterolo6. 5-avenasterolo7. 7-stigmastenolo8. 7-avenasterolo
A
B
C
Fig. 34 - GC di steroli liberi (TMS) dei lipidi di caffè verdi (A) e torrefatti (B). 1. colesterolo
6. campestrolo 7. unknown 8. stigmasterolo10. -sitosterolo13. unknown14. 5-
avenasterolo18. unknown20. unknown
COLONNA: silice fusa 25 m x 0.25 mm i.d, TAP f.t. 0,10 µmTEMPERATURA: 240 °CCARRIER GAS (He): 1,0 ml/min
Fig. 35 - GC di una miscela di ossisteroli (TMS).
COLONNA: silice fusa 25 m x 0.25 mm i.d., TAP f.t. 0,10 µmTEMPERATURA: da 245 a 265 °C , 3,5°C/minCARRIER GAS (He): 1,5 ml/min
1. 5-colestano2. 7-OH3. colesta-3,5-diene4. 19-OH5. diidrocoleseterolo6. colesterolo7. 7-OH 8. 4-OH9. 20-OH10. 5,6-epossi11. tirolo12. 5,6-epossi13. 25-OH14. 4-colesten-3-one15. 5-colestan-3-ol-6-one16. colesta-3,5-dien-7-one17. 5-colesten-3-one18. 7-k (?)19. 5-colestan-3-ol-6-one20.colestan-3,5-diol-6-
one
ANALISI HPLCDEI LIPIDI
CLASSI DI LIPIDI ANALIZZATI CON HPLC1. Acidi grassi liberi2. Polifenoli3. Fenoli4. Fosfolipidi
1. HPLC di acidi grassi liberiNonostante le numerose colonne RP disponibili e una varietà di eluizioni isocratiche e a gradiente (con metanolo, acetonitrile, tetraidrofurano e acqua) che consentono ottime separazioni (i tempi di ritenzione aumentano con l’incremento del numero di atomi di carbonio e diminuiscono con il numero di doppi legami della catena alifatica), il limite principale consiste nel fatto che gli acidi grassi liberi generalmente non contengono cromofori per il rivelatore UV. È pertanto necessario procedere a derivatizzazioni (fenacilesteri e 2-nitrofenilidrazidi) precolonna o postcolonna (preferita). La resa non quantitativa delle derivatizzazioni, insieme alle maggiori difficoltà della messa a punto dell’analisi HPLC, mostrata nella Fig. 36, è il motivo che rende la GC, a tutt’oggi, la tecnica cromatografica ancora più diffusa ed affidabile per questo tipo di analisi.
Fig. 36 - Analisi HPLC di fenacilesteri di acidi grassi. COLONNA: 900 mm x 6,4 mm, Bondapak C-18 MISCELA MOBILE: ACN:H2O=76:24 iniziale, =74:26 da A, = 80:20 da B, =97:3 da C VELOCITA’ FLUSSO: 2 ml/min DETECTOR: UVD a 254 nm
R CO
O CO
CH3
R CO
O NH NH
O2N
A B C fenacilestere 2-nitrofenilidrazide
2. HPLC di polifenoliI polifenoli si dividono in:TANNINI: tannini condensati e tannini idrolizzabili. I primi sono detti anche proantocianidine perché per idrolisi producono le antocianidine. I secondi sono polimeri eterogenei contenenti acidi fenolici (ad es. l'acido gallico) e zuccheri semplici.FLAVONOIDI: la struttura base è il 2 fenil-benzopirone (flavonone), le cui variazioni strutturali danno origine a diverse famiglie: flavonoli, flavoni, flavanoli, isoflavoni, antocianidine.
L'apporto di polifenoli nella dieta umana varia enormemente in relazione al tipo, alla quantità e alla qualità dei vegetali consumati (frutta e verdura fresca, tè, cacao e derivati, olio extra vergine, vino, ecc.). La loro attività antiossidante, molto spiccata, diminuisce con la cottura dell’alimento per effetto dei cambiamenti strutturali dovuti alla temperatura.
L’analisi HPLC dei polifenoli estratti da Equisetum telmoteia Ehrh., un equiseto utilizzato nella farmacologia tradizionale per le spiccate proprietà antinfiammatorie e diuretiche, è riportata nella Fig. 37.
Fig. 37 - Analisi HPLC dei polifenoli di Equisetum temoteia.COLONNA: 150 mm x 4,6 mm i.d., ODS 2 3 m FASE MOBILE: (A) acido acetico (2,5%)
(B) acido acetico (2,5%):ACN = 90:10(C) ACN
GRADIENTE: da 100:0:0 (A:B:C) a 0:100:0 da 0 a 5’; 0:85:15 da 5 a 30’; 0:50:50 da 30 a 35’; isocratica 0:50:50 da 35 a 40’VELOCITA’ FLUSSO: 0,5 ml/minDETECTOR: PAD a 250 nm e 350 nm
0 10 20 30 40 50 min
250
1000
0
2000
1 23
4 5
67
8 910
11121314
15
16
17mAU
PICCO COMPOSTO (nm)1 acido protocatecuico 260, 2922 acido p-idrossibenzoico 2563 proantocianidina tetramera con 1 residuo APG 2804 procianidina dimera B2 2805 derivato dell’acido caffeico 292, 3246 procianidina trimera A 2807 derivato dell’acido caffeico 302, 3288 procianidina trimera C1 2809 proantocianidina trimera APG-C-C 280
10 campferolo acetildiesoso 266, 286, 34811 proantocianidina trimera C-C-APG 282, 31212 proantocianidina tetramera con 2 residui APG 280
13 campferolo glucoside-ramnoside 266, 282, 322, 348
14 derivato dell’acido caffeico 298, 32815 campferolo acetilglucoside-ramnoside 266, 292, 34816 campferolo 3-O-glucoside 266, 294, 34217 campferolo 3-O-acetilglucoside 266, 294, 342
POLIFENOLICOOH
OHOH
COOH
OH
OHO
OHOH
OH
OH+
OHO
OHOH
OHOH
OHOH
COOH
OH
HO
OH
O
OHO
acido protocatecuico acido p-idrossibenzoico
proantocianidina procianidina(flavan-3-olo)
acido caffeico
apigenina(APG)
campferolo
HO
OH
O
OH
OH
3. HPLC dei fenoliSono diffusissimi nella frutta, verdura, ortaggi, bevande alcoliche e contribuiscono in modo rilevante nella definizione del colore e dell’aroma del prodotto, più in generale influenzano tutte le caratteristiche sensoriali oltre ad avere una spiccata attività antiossidante. Il processo di raffinazione degli oli riduce in maniera rilevante il contenuto di fenoli (vengono neutralizzati dalla fase di deacidificazione dell’olio con KOH) determinando un notevole abbassamento della shelf life del prodotto, oltre a modificarne il colore e l’aroma (le fasi successive della raffinazione sono la decolorazione e la deodorazione).Nelle bevande alcoliche contribuiscono in modo decisivo al buquet del prodotto e l’evoluzione dei fenoli durante il periodo di invecchiamento di vini e liquori è il processo responsabile dell’aromatogramma finale (insieme al contributo delle sostanze cedute da botti, barilotti, ecc.).In molti vegetali (prezzemolo, rucola, the verde, ecc,) sono considerati pregevoli costituenti funzionali per effetto della loro attività antiossidante.La Fig. 38 e la Fig. 39 riportano l’analisi HPLC della frazione fenolica di due oli extra vergini di oliva di diverse cultivar.
COOH
R3
R2
R1
acido benzoico(R1= R2 =R3 = H)
(R1= R2 =R3 = H)acido cinnamico
R1R2
R3
CH CH COOHR1= H; R2 = OH; R3 = HR1= OH; R2 = OH; R3 = OCH3R1= OCH3; R2 = OH; R3 = OCH3R1= OCH3; R2 = OH; R3 = H
R1= H; R2 = OHR1= OH; R2 = OH
CH2 CH2 OH
R1
R2alcol fenetilico(R1 = R2 = H)
acido vanillicoacido omovanillicoacido protocatecuicoacido gensiticoacido p-idrossibenzoicoacido siringico
R1= OCH3; R2 = OH; R3 = HR1= OH; R2 = OCH3; R3 = HR1= OH; R2 = OH; R3 = HR1= OH; R2 = H; R3 = OHR1= H; R2 = OH; R3 = HR1= OCH3; R2 = OH; R3 = OCH3
acido p-cumarico
acido ferulicoacido sinapico
acido 5-idrossicaffeico
tirosolo3-idrossitirosolo
FENOLI
COLONNE HPLC250 mmx4,6 mm i.d.
FASE STAZIONARIASilice funzionalizzata C18, C8, C6 (RPC)
FASE MOBILERichiede la scelta di:• forza ionica (H2O/CH3CN, H2O/CH3OH, H2O/THF)• pH ( = 2-4, ottenuto con 2-5% di acido acetico o acido fosforico o acido trifluoroacetico)
DETECTOR• UVD• PAD• FLD (alta selettività e specificità per le cumarine)• ED (per i bassi potenziali red-ox dei fenoli)• MS (ESI, APCI)
Fig. 38 - Analisi HPLC dei fenoli di olio extra vergine di oliva.COLONNA: 250mm x 3,0 mm i.d., Luna-C18 5 mFASE MOBILE: (A) CH3COOH 0,5%
(B) ACNGRADIENTE: 0’-30’, da 95%A:5%B a 80%A:20%B; 30’-40’, da
80%A:20%B a 70%A:30%B; 40’-50’, da 70%A:30%B a 65%A:35%B; 50’-60’ da
65%A:35%B a 50%A:50%B; 60’-70’, da 50%A:50%B a 5%A:95%B;
70’-75’, da 5%A:95%B a 95%A:5%BVELOCITA’ FLUSSO: 0,5 ml/minDETECTOR: UVD a 280 nm
3-id
ross
itiro
solo
tiros
olo
acid
o el
enol
ico
deca
rbos
iimet
ileur
opei
na a
glico
ne
(+)-p
inor
esin
olo
(+)-1
-ace
toss
ipin
ores
inol
o
oleu
rope
ina
aglic
one
ligst
rosid
e ag
licon
e
0 30 60 min
8ligstrosideaglicone
oleoeuropeina
4decarbossimetiloleoeuropeina
aglicone
13-idrossitirosolo
2idrossitirosolo
O C
HO
HO COOCH3
O
O
H3C
O
Glucosio
O C
HO
HO COOCH3
O
OH
H3C
O
C COOCH3
O
OH
H3C
OHO
O CHO COOCH3
O
O
H3C
O
Glucosio
O CHO COOCH3
O
OH
H3C
O
O C
HO
HO H
O
OH
H3C
O
3acido elenolico
7oleoeuropeina
aglicone
ligstroside
OH
OHOH
OH
OH
O
OHO
OCH3
OHOCH3
O
O COOCH3
HOOCH3
OHOCH3
5(+)-pinoresinolo
6(+)-1-acetossipinoresinolo
Fig. 39 - Analisi HPLC dei fenoli di olio extra vergine di oliva Cv Arbequina.0 10 20 30 40 50 60 min
1. 3-idrossitirosolo2. tirosolo3. acido vanillico4. vanillina5. 4-(acetossietil)-1,2-diidrossibenzene6. acido p-cumarico7. dialdeide della decarbossimetiloleoeuropeina8. dialdeide del decarbossimetilligstroside9. 1-acetossipinoresinolo10.pinoresinolo11.oleoeuropeina aglicone12.luteolina
1 2I.S.
5
10
8
9
711
1 2
I.S.
510
8
97
11 1234 6
UVD
FLD
3. HPLC dei fosfolipidiSono costituenti delle membrane cellulari, la cui funzionalità dipende in gran parte dalla composizione del doppio strato di fosfolipidi, l’elemento strutturale più importante.Negli alimenti svolgono una rilevante funzione emulsionante (HLB = 9) e stabilizzano due fasi non miscibili quali l’acqua e il grasso (margarine, cioccolato, maionese, gelati, ecc,).Si ottengono come sottoprodotti del processo di raffinazione degli oli alimentari (specialmente dalla soia, che ne contiene il 2-3% del grasso totale) nello stadio preliminare della degommazione o demucillaginazione.L’analisi dei fosfolipidi, le cui polarità sono molto simili, viene sovente fatta precedere da una separazione dei singoli costituenti per TLC preparativa bidimensionale o per TLC-AgNO3. L’analisi HPLC delle cefaline del fegato di ratto è riportata in Fig. 40; quella dei fosfolipidi di un olio extra vergine di oliva nella Fig. 41.
RO
CO
O
OPO
HCH2
O CCH2
CO
R'O CH2 CH2 N
HH
H-+ +
cefalina (fosfatidiletanolammina)
++-
RO
CO
O
OPO
HCH2
O CCH2
CO
R'O CH2 CH2 N
CH3CH3
CH3lecitina (fosfatidilcolina)fosfatidiletanolammine (cefaline) fosfadildilcoline (lecitine)
-
Fig. 40 - Analisi HPLC dei fosfolipidi del fegato di ratto (cefaline).
COLONNA: 250 mm x 4,6 mm i.d., ODSFASE MOBILE: CH3OH:ACN:H2O = 90,5:7,0:2,5VELOCITA’ FLUSSO: 2 ml/minDETECTOR: UVD a 205 nm
16:0 -20:5
16:0 -22:6
16:0 -20:4
16:0 -18:218:0 -20:5
18:0 -20:4
18:0 -18:2
0 30 60 90 120 min
Fig. 41 - Analisi HPLC dei fosfolipidi di olio extra vergine di oliva.COLONNA: 250 mm x 4,6 mm i.d., ODSFASE MOBILE: CH3OH:ACN:H2O = 90,5:7,0:2,5VELOCITA’ FLUSSO: 2 ml/minDETECTOR: UVD a 205 nm
0 10 20 min
PG
PE
PI PC
SPH
Food Analysis by HPLCSecond Edition. Revised and ExpandedEdited by Leo M. L. NolletMarcel Dekker, Inc - New York
