Rober

to Pi

erge

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Univer

sità di U

rbino

“Car

loBo”

CORSO DI GENETICA

CONTROLLO DELL’ATTIVITÀGENICA NEGLI EUCARIOTI

DalDNAalle

proteine

Rober

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Univer

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rbino

“Car

loBo”

I controlli amonte sono simili

(enhancers,silencers,

promotori, ecc.),mentre moltodiversi sono i

controlli a valle.

Confrontoprocarioti-eucarioti

I geni deiprocarioti sonocolineari con ilmessaggero,quelli degli

eucarioti no.

Rober

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“Car

loBo”

I geni eucariotici sono discontinui

Rober

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“Car

loBo”

Confronto DNA-RNA

Le lettere rappresentano gli introni, i numeri gli esoni.

Rober

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“Car

loBo”

Rober

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“Car

loBo”

Gli introni di geni correlatipossono essere correlati

Lo splicingalternativo

Detto anche hRNA (heavy)

Rober

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“Car

loBo”

Da un singolo gene sipossono ottenere più

prodotti proteici.

Un esempiodi splicingalternativo

Rober

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“Car

loBo”

Un esempiolimite dallaDrosophila

Come calcolo le isoforme?

Rober

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“Car

loBo”

DSCAM è l’omologo di Drosophilamelanogaster della Downsyndrome cell adhesion molecule.Nel lavoro originale gli autoririportano: if alternative exonscan be spliced independently,then the Dscam locus potentiallyencodes 38,016 isoforms.In effetti, molte migliaia di iso-forme sono state già identificate!

Il capping al 5’previene la degrada-zione del mRNA daparte delle esonucleasi5’Ÿ3’ e quindi necontrolla l’emivita.

Rober

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“Car

loBo”

Lamaturazione

del pre-mRNA

La codapoli-A

delmRNA

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La poliadenilazioneal 3’ previene ladegradazione delmRNA da partedelle esonucleasi3’Ÿ5’ e quindi necontrolla l’emivita.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Il metabolismo del ferronell’uomo

Distribuzione di Fe nell’organismo

3-5 g/70 kg:

• 68% in Emoglobina

• 4% in Mioglobina

• 0.1% in Transferrina

• 27% in Ferritina tissutale

• 0.004% in Ferritina plasmatica

• 0.6% in vari enzimi

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Trasferrina eferritina

Trasferrina (Tf):

è una b-glicoproteina di 78kDa sintetizzata nel fegato;

ha 2 siti di legame con Fe+++;

è presente in 3 forme:

• Tf o apoTf: 44%

• Tf - Fe: 44%

• Tf-2 Fe: 11%

altissima affinità, Keq=1019-1031 M-1 Ÿ in presenza diTf, non esiste Fe+++ libero

Ferritina (Ft):

24 subunità: H (Heavy o Heart) e L(Light o Liver);

25 isoforme: L24 in fegato e milza eH24 in tessuti fetali, neoplastici,cuore, placenta;

abbondante nella mucosa intestinale;

ha forma di sfera vuota: la cavitàcentrale contiene fino a 4500 atomidi Fe+++

saturazione di Ft per Fe:

• normalmente 50-70%, madipende dallo stato disovraccarico o deficit di Fe+++

• il Fe+++ in eccesso (>100% disaturazione) si depositaall’esterno della cavità centraledando origine a emosiderina.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Regolazione del livello del ferroSovraccarico di ferro

• Aumento della sintesi diapoferritina nella mucosa

• Aumento del sequestro diferro

• Escrezione del complessoFt-Fe durante il turnoverdella mucosa intestinale

Deficit di ferro

• Diminuzione della sintesi diapoferritina nella mucosa

• Diminuzione del sequestrodi ferro

• Aumento del passaggio diferro nella circolazioneenterica

• Aumento dell’assorbimentodi ferro

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Regolazione molecolare deldeficit/sovraccarico di Fe

• Iron Regulatory Protein (IRP o aconitasi) risponde a [Fe]

• si lega a Iron Responsive Element (IRE) sull’mRNA della Ft-H,Ft-L, ALA sintasi e sul recettore della Tf

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Effetto del deficit di ferroSul gene della ferritina:

IRP destabilizza l’mRNA di FtŸ diminuzione di Ft Ÿ

aumento dell’assorbimentointestinale del ferro.

Sul gene del recettore di Tf:

IRP stabilizza l’mRNA Ÿ aumentodi espressione del recettore di TfŸ aumento della internalizzazionedi ferro.

Rober

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“Car

loBo”

Effetto del sovraccarico di ferroSul gene della ferritina:

IRP stabilizza l’mRNA di Ft Ÿ

aumento di Ft Ÿ diminuzionedell’assorbimento intestinale diferro.

Sul gene del recettore di Tf:

IRP destabilizza l’mRNA Ÿ

diminuzione di espressione delrecettore di Tf Ÿ diminuzionedell’internalizzazione di ferro.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Riassunto deicontrolli a valleIl controllo dell’espressione genicanegli eucarioti avviene a tre livelli:trascrizionale, traduzionale e post-traduzionale (modificazione delleproteine: metilazione, acetilazione,fosforilazione, glicosilazione, taglioproteolitico, ecc); quest’ultimo puòavvenire nel citoplasma, a livellodel reticolo endoplasmatico onell’apparato del Golgi.

La determinazione del sessonell’uomo

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La gonade umana èbipotente fino allasesta settimana di

sviluppoembrionale. Il

Testis DeterminingFactor (TDF)

prodotto dal geneSRY trasforma la

gonadeindifferenziata ingonade maschile.

Mappatura di SRY

I maschi XX hanno una porzione di Y che include SRY; lefemmine XY mancano della porzione di Y che include SRY.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Localizzazione fine edidentificazione di SRY

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

SRY codifica per un fattore nucleare con un dominio HGM conservataed un DNA binding domain di 79 aminoacidi; la maggior parte delle

mutazioni sex-reversal sono localizzate nel dominio HGM.

Il gene Tfm

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Rober

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“Car

loBo”

Problemi legati all’XLiane Russel e Mary Lion osservarono indipendentemente che moltemutazioni legate al sesso nei topi e nell’uomo presentavano un fenotipo

variegato nelle femmine eterozigoti. Pertanto suggerirono che neimammiferi la compensazione del dosaggio potesse avvenire perinattivazione di uno dei due cromosomi X delle femmine. Ad esempio indonne eterozigoti per due alleli del locus G6PD (glucosio-6-fosfato

deidrogenasi) legato all’X , che hanno due forme elettroforeticamentedistinguibili (F e S), cloni di cellule isolate dalla pelle contengono o laforma F o la forma S.

¸ Il cromosoma X inattivo può essere quello ricevuto dal padre o dalla

madre;

¸ l’inattivazione nell’uomo avviene circa al 16° giorno dalla

fecondazione (500-1000 cellule);

¸ l’inattivazione viene ereditata clonalmente.

La compensazione del dosaggio-1

Rober

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“Car

loBo”

Il cromosoma X inattivo a livello citologicoprende il nome di corpo di Barr.

La compensazione del dosaggio-2

Rober

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“Car

loBo”

Rober

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“Car

loBo”

La lionizzazioneLa scelta di quale X inattivare in una certa cellula è casuale, per cuile femmine di mammifero sono un mosaico genetico per i geni dell’X;il fenomeno dell’inattivazione a scacchiera dell’X prende il nome dilionizzazione (da Mary Lion). Ad esempio nei gatti un locus dell’X dàpelo nero o arancio, mentre un locus autosomico è responsabile delleparti bianche Ÿ i gatti di tre colori sono sempre femmine!

Rober

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“Car

loBo”

La determinazione del sessoin Drosophila melanogaster

A = un corredoaploide di autosomi(un cromosoma 2 + uncromosoma 3 + uncromosoma 4).

2X2A

1X2A

Nel 1916 Bridges avevadimostrato che gli individuiXXY sono femmine e gli X0sono maschi Ÿ non è ilcromosoma Y che determina ilsesso in D. melanogaster!

Rober

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“Car

loBo”

I rapporti X:A

Nel 1921 Bridges avevaottenuto rare femminetriploidi e le avevaincrociate per maschinormali ottenendo i risultatiin tabella. Non basta avere2 cromosomi X per essereuna femmina: gli intersessisono 2X3A!

Bridges concluse che in Drosophila il sesso è dato da un equilibrio trageni femminilizzanti sull’X e geni mascolinizzanti sugli autosomi.

Altri geni

che

controllano

la

determina-

zione del

sesso:

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Il gene Sexlethal (Sxl ) e ildifferenziamento femminile

Sxl ON Sxl OFF

Numeratori e denominatori

Rober

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“Car

loBo”

Rober

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“Car

loBo”Il gene

Sxl èregolatotramitesplicing

alternativi

Sxl si autoregola (feedback +)

Rober

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“Car

loBo”

Rober

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“Car

loBo”

Analisi molecolare dei geni delladeterminazione del sesso

Sxl, tra e tra-2 codificano per proteine che legano l’RNA

SXL si lega al proprio trascritto e a quello di tra regolandone lo splicingDSX è un fattore di trascrizione

Riassumendo…

Rober

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“Car

loBo”

Rober

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“Car

loBo”

I ginandromorfi in DrosophilaSono il risultato di una non-disgiunzione mitotica degli X durante la prima

mitosi di uno zigote femmina, subito dopo la fertilizzazione dell’uovo.

Rober

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“Car

loBo”

Dalla determinazione del sessoalla compensazione del dosaggio

Rober

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“Car

loBo”

La compensazione del dosaggio

Tanti sistemi,un solo scopo

Rober

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“Car

loBo”

Lo sviluppo della Drosophila e igeni omeotici

Rober

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“Car

loBo”

Il gene Ubx

Rober

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“Car

loBo”

Rober

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“Car

loBo”Corrispon-

denza traposizionesul cromo-soma ed

espressione

Rober

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Univer

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“Car

loBo”Questa

corrispon-denza è

evolutiva-mente

conservata

Piccole mutazioni, grandi cambiamenti

Rober

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“Car

loBo”

L’esempio della polidattilia

Rober

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“Car

loBo”

Ancorasulla

relazioneposizione/funzione

Rober

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“Car

loBo”

Nella variegazione per

effetto di posizione

(PEV) la funzione di ungene può essere

alterata se il genecambia di posto.

Metilazione eimprinting

Rober

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“Car

loBo”

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“Car

loBo”

Anche la quantità di prodottogenico può influire sul fenotipo

Rober

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“Car

loBo”

I cromosomi politenici e lostudio dell’attività genica

I puffs sono zone di DNA decondensato; tramite ibridazione in situ osomministrando uridina radioattiva (precursore dell’RNA) si è vistoche trascrivono RNA in abbondanza. Quindi il DNA nei puffs si

decondensa per permettere latrascrizione.

Rober

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“Car

loBo”

I puffs possono essere inducibiliI puffs appaiono e scompaiono conmodalità specifiche durante losviluppo, pertanto l’espressionegenica è regolata. Molti puffssono regolati dall’ormone ecdisoneche svolge un ruolo importantenello sviluppo pupale; altri invecepossono rispondere a stimoli divaria natura, per esempio termici(HSP, heat shock proteins).

I mitocondriSono responsabili dellarespirazione cellulare epossiedono un proprioDNA circolare checodifica funzioni non

presenti nel nucleo.

Rober

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“Car

loBo”

È un esempiodi eredità

citoplasmatica

Rober

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“Car

loBo”

Esempiodi

ereditàmitocon-

driale

Malattiemitocondriali

umane

Rober

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“Car

loBo”

I cloroplasti

Sono responsabili dellafotosintesi clorofillianae anche loro possiedonoun proprio DNAcircolare che codificafunzioni non presenti

nel nucleo.

Rober

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“Car

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“Car

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Vari tipi dicloroplasti

I plastidi, presenti solo nelle piante,si suddividono in cloroplasti verdiche contengono clorofilla e servonoper la fotosintesi, cromoplasti

colorati con funzione per lo piùvessillifera, cioè di richiamo (fiori efrutti) e leucoplasti incolori confunzione di riserva di amido(patate); questi organelli possonotrasformarsi l’uno nell’altro inseguito a stimoli opportuni, comenelle patate che diventano verdi seesposte alla luce.

Rober

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“Car

loBo”

Esempi di ereditàplastidica - 1

cells

Mitocondri ecloroplasti vengono

ereditati con ilcitoplasma delle

ovocellule e quindi sitrasmettono solo pervia materna e mai per

via paterna (né glispermi né i pollinihanno una vera epropria struttura

cellulare; ricordareSxl).

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Esempi dieredità

plastidica - 2

La sterilità maschile nel

mais mostra ereditàcitoplasmatica: reincrocisuccessivi che mettano ilnucleo di una linea maschio-fertile dentro il citoplasmadi una linea maschio-sterileproduce linee maschio-sterili.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Esempi dieredità

plastidica - 3