Rober

to Pi

erge

ntili

Univer

sità di U

rbino

“Car

loBo”

CORSO DI GENETICA

CONTROLLO DELL’ATTIVITÀGENICA NEI PROCARIOTI

Rober

to Pi

erge

ntili

Univer

sità di U

rbino

“Car

loBo”Trascrizione e traduzione

La trascrizione è il processo con cui l’informazione ereditaria vienetrasferita dal DNA all’RNA. La traduzione è il processo con cuil’informazione viene trasferita dall’RNA alle proteine. Latrascrizione viene effettuata dalla RNA polimerasi. Neiprocarioti esiste solo una RNA polimerasi che trascrive tutti igeni, mentre negli eucarioti ci sono 3 diverse RNA polimerasi:

• RNA polimerasi I per la sintesi dell’RNA ribosomale (rRNA)

• RNA polimerasi II per la sintesi dell’RNA messaggero (mRNA)

• RNA polimerasi III per la sintesi dell’RNA transfer (tRNA)

Rober

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erge

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Univer

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“Car

loBo”Il messaggero

La struttura finale del mRNA, pronta per la traduzione, èuguale sia nei procarioti che negli eucarioti.

Non tutto il messaggero codifica per la proteina!

Rober

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erge

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Univer

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“Car

loBo”

Riassunto della traduzioneInizio della traduzione

Un ribosoma si attacca alla molecola di mRNA in corrispondenza dellatripletta di inizio AUG. Su questo codone AUG si lega il tRNA conl’anticodone corrispondente che porta la metionina (N-formil metioninanei procarioti).

Sintesi della proteina

Entra il tRNA corrispondente al secondo codone e si forma il legamepeptidico tra la metionina iniziale e il secondo amminoacido. Il ribosomasi sposta sull’mRNA permettendo che una sola tripletta alla volta siadisponibile all’attacco col tRNA specifico. Man mano che il ribosoma sisposta si ha l’allungamento della catena proteica.

Termine della traduzione

Quando il ribosoma raggiunge le triplette di stop (UAG,UAA,UGA) sistacca dall’mRNA.

Rober

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erge

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Univer

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“Car

loBo”

Il tRNAEsistono meno di 64tRNA perché in alcunicasi lo stesso tRNA puòleggere più di un codoneche codifica per lo stessoamminoacido.

Ciò è possibile per ilvacillamento (wobbling) ooscillazione della terzabase dell’anticodone.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Accoppiamento della trascrizionee della traduzione nei procarioti

Rober

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“Car

loBo”Regolazione genica nei procarioti

Il metabolismodel lattosio

Rober

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“Car

loBo”

Il metabolismodel lattosio èinducibile in

E. coli

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Si parla di induzione se,aggiungendo il substrato,la sintesi enzimatica siinnalza.Si parla di repressione

se, aggiungendo ilsubstrato, la sintesienzimatica si abbassa.

I geni inducibili

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Controllo positivo e negativo

Rober

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Ci sono tre enzimi che vengonocoespressi in presenza di lattosio

lattosio

galattosio

glucosio

ambiente

interno della

cellula

ambiente esterno

glucosio galattosio

lattosio permeasib-

galattosidasi

transacetilasi

In assenza di lattosio sono presenti circa 3 molecole di ciascun enzima nella cellula. Inseguito all’aggiunta di lattosio il numero delle molecole dei tre enzimi arriva a circa 3000.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La scopertadell’operone

From left to right: Francois Jacob (1920- ), JacquesMonod (1910-1976) and André Lwoff (1902-1994),awarded the Nobel Prize for Physiology or Medicinein 1965. Jacques Monod was director of the PasteurInstitute in Paris from 1971 to 1976.

Grazie all’uso sistematico di mutantiincapaci di metabolizzare il lattosioe al loro studio tramite creazione didiploidi parziali (sfruttando leproprietà di ceppi F’) tra il 1960 e il1964 F. Jacob, J. Monod e A. Lwoffidentificarono tre categorie dimutanti: o non producevano la b-gal,oppure la permeasi, oppure la

transacetilasi. Esistevano inoltredue tipi di mutazioni: quelle missensoa carico di ciscun gene che nondavano un prodotto funzionale delgene mutato, e quelle nonsenso checompromettevano la sintesi delleproteine a valle (mostravano effetti

polari), suggerendo che il mRNAfosse policistronico.

mRNA policistronici

Una mutazione non-sensoha effetto polare perchégiunto al primo codone distop il ribosoma si stacca enon procede nella tradu-zione dei geni a valle.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Lemutazioni

polari

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Un individuo chesia eterozigote intrans viene anche

detto trans-eterozigote. Unacellula battericacontenente unesogenote è un

diploide parziale,o merozigote.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Altre mutazioni delmetabolismo del lattosio

Furono trovate anche mutazioni in altri geni che influenzavano lasintesi delle proteine b-galattosidasi (gene lacZ), permeasi (genelacY) e transacetilasi (gene lacA). Dato che queste mutazionialteravano la modalità di sintesi dei tre enzimi, Jacob Monod eLwoff supposero che fossero mutazioni in geni regolativi (i genilacZ, lacY e lacA sono invece detti geni strutturali).La caratteristica di questi geni regolativi consisteva nel fattoche, quando immessi nel ricevente tramite un F’, alcuni erano ingrado di agire anche in trans, mentre altri potevano esplicare laloro funzione soltanto in cis. Le mutazioni regolative furonomappate in due gruppi di complementazione che definiscono i geniO ed I.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

La genetica dei geni regolatori

--Plac-

+*-ISQ

+*-IQ

++I-d

--Is

++I-

++Oc

induttorepresente

induttoreassente

mutante

* indotti da alte concentrazioni di lattosio

Sintesi di b-galattosidasi,permeasi e transacetilasi

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Organizzazione dell’operone lac

La definizione di operone

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

L’operone è uninsieme di geni

metabolicamentecorrelati che

vengonocoespressi etradotti a

partire da ununico mRNA

policistronico; igeni regolatorinon fanno parte

dell’operone.

lacI+ è dominante su lacI-

sia in cis che in trans!

Rober

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“Car

loBo”

La regolazione dell’operonelac: il gene lacI

La regolazione dell’operonelac: il gene lacOc - 1

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Il gene lacOc è dominante sul

gene lacI+, ma solo in cis!

Nel caso a destra, il metabolismodel lattosio è ancora inducibile.

Il metabolismo del lattosio questa volta NON è inducibile!

Laregolazione

dell’operone lac:

il genelacOc - 2

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

ConclusioniDa tutti questi dati si dedusse che I+ è trans dominante e siipotizzò che codificasse per una proteina diffusibile nel citoplasmain grado di influenzare anche i geni in trans, mentre per Oc sidedusse che era una mutazione cis dominante (in grado diinfluenzare solo i geni in cis) e che il gene O non producesse unaproteina diffusibile ma che fosse una sequenza di regolazione, chevenne chiamata operatore. Oc è un operatore costitutivo. Jacob,Monod e Lwoff ipotizzarono anche che il gene O fosse una sequenzadi DNA alla quale si lega il prodotto del gene I (la proteinarepressore). Il lattosio, legandosi al repressore, favorisce il suodistacco dal gene O consentendo alla polimerasi di legarsi alpromotore per iniziare la trascrizione dei geni a valle. L’operone lacè un modello di controllo negativo.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Ilmodello

lacI è una proteina allosterica

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”La mutazione lacIS

È anche detta super

repressore. In questocaso il repressore èmutato nel sito di legamecon il lattosio, ma non nelsito di legame conl’operatore: il repressoreè quindi insensibile allattosio, per cui l’operoneè sempre “spento”.Is è dominante su I+.

* indotti da alteconcentrazioni di

lattosio

Sintesi di b-galattosidasi,permeasi e transacetilasi

--Plac-

+*-ISQ

+*-IQ

++I-d

--Is

++I-

++Oc

induttorepresente

induttoreassente

mutante

La mutazione lacI-d

--Plac-

+*-ISQ

+*-IQ

++I-d

--Is

++I-

++Oc

induttorepresente

induttoreassente

mutante

* indotti da alteconcentrazioni di

lattosio

Sintesi di b-galattosidasi,permeasi e transacetilasi

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Nelle cellule aploidi le mutazioni I-d hanno fenotipo costitutivo. Neidiploidi parziali I+/I-d le mutazioni I-d sono trans dominanti su I+. Ilrepressore selvatico è un tetramero. La mutazione I-d produce unaproteina alterata che nei diploidi parziali I+/I-d si lega alle molecole“buone” impedendone il legame all’operatore.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”Le mutazioni IQ e ISQ

--Plac-

+*-ISQ

+*-IQ

++I-d

--Is

++I-

++Oc

induttorepresente

induttoreassente

mutante

* indotti da alteconcentrazioni di

lattosio

Sintesi di b-galattosidasi,permeasi e transacetilasi

Sono mutazioni a carico delpromotore del gene I edeterminano la produzionedi un gran numero dimolecole di repressore.Riducono l’efficienza diinduzione e sono indotti soloda alte concentrazioni dilattosio.

Le mutazioni P

--Plac-

+*-ISQ

+*-IQ

++I-d

--Is

++I-

++Oc

induttorepresente

induttoreassente

mutante

* indotti da alteconcentrazioni di

lattosio

Sintesi di b-galattosidasi,permeasi e transacetilasi

Rober

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Univer

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“Car

loBo”Le mutazioni in P, sia nell’operone che nell’induttore, regolano il legame

della RNA polimerasi. Quindi se un operone è P- comunque non funziona,anche se tutto il resto è a posto.

Controllo positivo dell’operone lac

Rober

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“Car

loBo”

I geni lacZ, lacY e lacA sono espressi solo se nel terreno non è presenteil glucosio. Altrimenti questo zucchero viene usato preferenzialmenteanche in presenza di lattosio. In presenza di glucosio si ha larepressione da catabolita: il glucosio mantiene basso il livello di cAMP(AMP ciclico) impedendo la formazione del complesso CAP-cAMP.

Zuccheri nelterreno di

coltura

glucosio

glucosio+lattosio

lattosio

Quantitàrelativa di b-galattosidasi

1

50

2500

Rober

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“Car

loBo”

Il ruolo delcAMP

L’operonetriptofano

Rober

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“Car

loBo”

Il peptide leader

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Gli appaiamenti delmessaggero del gene trpL

Le strutture a forcina

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

L’attenuazione - 1

Rober

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Univer

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“Car

loBo”Il cammino del

ribosoma può alterarela formazione delleforcine. In assenza ditriptofano, il ribosomarallenta (o si ferma)permettendo quindil’appaiamento delleregioni 2 e 3 edimpedendo di fattol’appaiamento 3-4 Ÿ latrascrizione procede.

L’attenuazione - 2

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

In presenza ditriptofano, il ribosomanon si ferma e procedesulla zona 2 (da cui poisi stacca per lapresenza di un codonedi stop); in questomodo permette quindil’appaiamento 3-4:questa forcinadestabilizza la RNApolimerasi (ricordareche nei procarioti latrascrizione e latraduzione sonoaccoppiate!) e la

trascrizione si ferma.

Il fago l

Rober

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Univer

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“Car

loBo”Il cromosoma di l esiste sia

nella forma lineare checircolare. La forma lineare(quella inattiva nel capside)favorisce l’iniezione del DNAnell’ospite. Una voltainiettato, il DNA passa allaforma trascrizionalmenteattiva, quella circolare.

profago quiescente

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Ciclo liticoe lisogenicoIl fago l può riprodursi

sia attraverso ilclassico ciclo litico, sia

passare al ciclolisogenico. In questo

caso l’anello di DNA delfago ricombina con ilcromosoma batterico

(un crossing over)sempre nello stessopunto (ricordare la

trasduzionespecializzata!)

La repressione del ciclo litico

operatore destrooperatore sinistro

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Il mantenimentodel ciclo

lisogenico

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

Il repressore agisce intrans e impedisce sia alfago di innescare ilproprio ciclo litico, siaad altri eventuali fagi ldi farlo (effettodominante). Inoltre,come profago, un solo l

è presente nella cellulaperché c’è un solo sitod’inserzione.

Rober

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Univer

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“Car

loBo”

L’innesco del ciclo litico

Il repressore automantiene il sistema teoricamente all’infinito.L’unico modo per uscire dal ciclo lisogenico è l’eliminazione fisica delrepressore. Questo può avvenire tramite taglio proteolitico.La proteina RecA è una proteina batterica che viene innescata dalsistema SOS: questo sistema monitorizza continuamente l’integritàdel DNA batterico e se questo viene danneggiato promuove lasintesi di geni e l’attivazione di altri tramite tagli proteolitici. I geniattivati bloccano il ciclo cellulare e promuovono la riparazione delDNA tramite (anche) ricombinazione (da cui il nome di RecA).

Tra i bersagli degli enzimi proteolitici del sistema SOS c’è anche ilrepressore di l: quando la nave affonda, i topi scappano…

L’innesco del ciclo litico

Rober

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“Car

loBo”