UNIVERSITÀ DI MILANO “CENTRO DINO FERRARI”

PER LA DIAGNOSI E LA TERAPIA DELLE MALATTIE NEUROMUSCOLARI E NEURODEGENERATIVE

FONDAZIONE I.R.C.C.S. CA’ GRANDA OSPEDALE MAGGIORE POLICLINICO

FONDAZIONE DI RICOVERO E CURA A CARATTERE SCIENTIFICO DI NATURA PUBBLICA

DIRETTORE PROF. NEREO BRESOLIN

Via F. Sforza, 35 - 20122 Milano – Tel. 02.5503.3809 - Fax 02.5503.3800 E-mail: nereo.bresolin@unimi.it - centro.dinoferrari@policlinico.mi.it - www.centrodinoferrari.com

CONSUNTIVO DELLA RICERCA

SCIENTIFICA

2016

SEZIONI DEL “CENTRO DINO FERRARI”

� LABORATORIO RADIOISOTOPI DI BIOCHIMICA E GENETICA Pag. 3

� LABORATORIO DI NEUROIMMUNOLOGIA CLINICA Pag. 17

� LABORATORIO CELLULE STAMINALI NEURALI Pag. 25

� LABORATORIO PARKINSON E ALTRI DISTURBI DEL MOVIMENTO Pag. 37

� U.O.S.D. MALATTIE NEURODEGENERATIVE Pag. 43

� LABORATORIO DI CELLULE STAMINALI Pag. 59 � U.O.S.D. MALATTIE NEUROMUSCOLARI E RARE Pag. 71

� SEDE DISTACCATA DEL “CENTRO DINO FERRARI” PRESSO U.O.NEUROLOGIA – STROKE UNIT E LABORA- TORIO DI NEUROSCIENZE UNVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO I.R.C.C.S. ITITUTO AUXOLOGICO ITALIANO Pag. 81

� SEDE DISTACCATA DEL “CENTRO DINO FERRARI” PRESSO IL LA BORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE, CITOGENETICA, ANALISI BIOCHIMICO-CLINICHE, BIOINFORMATICA – I.R.C.C.S. E. MEDEA Pag. 103

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LABORATORIO DI BIOCHIMICA E GENETICA

• RESPONSABILE: • Prof. Giacomo P. Comi, Professore Associato

• MEDICI: • Prof.Stefania Corti • Dott. Francesca Magri • Dott. Alessandra Govoni • Dott. Simona Brajkovic • Dott. Roberta Brusa • Dott. Eleonora Mauri • Dott. Delia Gagliardi

• BIOLOGI: • Dott. Roberto Del Bo • Dott. Sabrina Lucchiari • Dott. Daniela Piga

• BIOTECNOLOGI • Dott. Dario Ronchi • Dott. Serena Pagliarani • Dott. Federico Ribaudo

• TECNICI • Sig.Ra Andreina Bordoni • Sig. Francesco Fortunato • Dott. Manuela Garbellini

• STUDENTI • Loriana Valentino • Stefano Lamberti

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STUDIO DELLE MALATTIE MITOCONDRIALI Nel corso del 2016, il gruppo di lavoro sulle malattie mitocondriali del Laboratorio di Biochimica e Genetica del Centro Dino Ferrari ha portato avanti numerose linee di ricerca nell’ambito di un progetto finanziato da Fondazione Cariplo (CARIPLO 2014-1010) per uno stanziamento complessivo di 230.000 Eur: “MITIPS, Assessing neuronal dysfunction in pediatric MITochondrial encephalopathies by induced pluripotent stem (iPS) cells: novel tools to investigate energetic metabolism as a potential therapeutic target”. Il progetto ha come tema lo studio della disfunzione mitocondriale nella patogenesi della neurodegenerazione che si osserva nelle encefalomiopatie mitocondriali ad esordio infantile (ed adulto). Nell’ambito di questo tema complesso sono state perseguite linee di ricerca indipendenti volte alla definizione delle cause molecolari mitocondriali nella genesi di patologie neurodegenerative e alla messa a punto di appropriati modelli cellulari per la loro indagine e la definizione di nuove terapie.

Modelli Neuronali di Sindrome di Leigh associata a mutazioni nel gene che codifica per l’assemblatore della Citocromo C Ossidasi SURF1. Abbiamo derivato cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da tre linee di fibroblasti cutanee ottenute da pazienti con le seguenti mutazioni nel gene SURF1 (P1: c.552delG / c.758_759delCA; P2: c.588+1G>A p.Gln251*; P3: c.240+1G>T / c.552delG). I cloni ottenuti sono stati caratterizzati per l’espressione di marker di staminalità utilizzando tecniche di immunocitochimica e RT-PCR quantitativa. I genotipi sono stati riverficati e corrispondono a quelli cellule originatrici. Sono attualmente in corso processi di differenziamento in senso neuronale che sfruttando due protocolli: uno si basa sull’ottenimento intermedio di corpi embroidi che vanno dissociati per permettere l’isolamento di cellule neuronali; il secondo, più rapido, non prevede questo passaggio intermedio. Stiamo confrontando i due metodi usando una linea di iPSC controllo e una linea generata da paziente SURF1 (P1). Le cellule ottenute verranno nuovamente caratterizzate per l’espressione di marker neuronali di espressione molecolare o mediante saggi di immunocitochimica che si basano sul kit Human Neural Stem Cell Immunocytochemistry. Il differenziamento terminale dei neuroni maturi sarà ottenuto sfruttando un protocollo già pubblicato e validato in laboratorio.

Modelli Neuronali di Sindrome di Alpers associata a mutazioni nel gene che codifica per la DNA polimerasi mitocondriale POLG1. Abbiamo raccolto fibroblasti di 3 pazienti affetti da Sindrome di Alpers (P1:p.Trp748Ser / p.Tyr1210*; P2: p.Arg232Gly / p.Thr251Ile+p.Pro587Leu; P3: p.Trp175Arg / p.Gly268Ala) e usato fibroblasti di pazienti adulti con mutazioni di POLG1 associate a fenotipo adPEO (n=2), arPEO (n=1) o una forma di atassia recessiva mitocondriale (MIRAS, n=1). I fibroblasti sono stati sottoposti a processo di riprogrammazione basato su Sendai Virus per l’ottenimento di cloni di iPSC. Sono stati condotti due round di riprogrammazione che non hanno consentito l’ottenimento di iPSC. Infatti, dopo la trasduzione dei fattori di Yamanaka e l’avvio della fase di riprogrammazione le cellule non sembrano procedere lungo il cammino di de-differenziamento e non sopravvivono. Un comportamento simile è stato recentemente osservato per fibroblasti embrionali ottenuti dal modello murino POLG (“mutator mouse”) che sembrano presentare uno scarso potenziale di riprogrammazione. Il motivo di questa peculiarità è da rintracciarsi nell’aumentata, mutagenicità del DNA mitocondriale e nella comparsa di radicali liberi che limitano il potenziale staminale. Vogliamo quindi valutare questi due aspetti nei fibroblasti e nei fibroblasti in riprogrammazione mediante un approccio NGS per il sequenziamento del DNA mitocondriale e la valutazione dei ROS prodotti per via immunocitochimica. Allo stesso tempo vogliamo ripetere la fase di riprogrammazione in presenza di sostanze anti-ossidanti

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come l’N-acetil cisteina e il CoQ10 per valutare se l’aggiunta di questi additivi consente di incrementare il tasso di riprogrammazione. Modelli neuronali per il modelling del Parkinsonismo associato a mutazioni nel gene che codifica per l’elicasi mitocondriale PEO1 (C10Orf2, Twinkle). Abbiamo reclutato e riprogrammato fibroblasti cutanei ottenuti da 4 pazienti con mutazioni dominanti nel gene PEO1. I cloni iPS sono in corso di caratterizzazione per marcatori molecolari e immunocitochimici di staminalità. Su una serie parallela di cloni sono state già condotte analisi di stabilità del DNA mitocondriale che hanno confermato una riduzione del contenuto di DNA mitocondriale (atteso) rispetto ai fibroblasti originatori ma una sua sostanziale integrità (nessuna differenza rispetto ai controlli). A partire da gennaio sui nuovi cloni procederemo ad un differenziamento in senso dopaminergico (PSC Dopaminergic Neuron Differentiation Kit) e successiva carattizzazione dei neuroni ottenuti. Nel frattempo stiamo studiando i fibroblasti dei pazienti PEO1 che mostrano una riduzione del contenuto di DNA mitocondriale rispetto ai controlli, senza alterazione nel contenuto totale mitocondriale. Questo evento si riflette nella riduzione dei complessi della catena respiratoria a codifica mitocondriale e in un difetto biochimico. Stiamo procedendo anche alla valutazione di alcuni aspetti della biologia mitocondriale in condizioni di crescita permissiva (+glucosio) o condizionata (-glucosio, +galattosio, +piruvato).

La tessuto specificità nella Sindrome di Leigh associata a mutazioni nel gene SURF1. Abbiamo iniziato l’analisi dei tessuti autoptici di un paziente deceduto per Sindrome di Leigh a causa di una mutazione omozigote recessiva nel gene SURF1 (c.240+1G>T). Sono stati eseguiti esperimenti SDS-PAGE seguiti dall’esposizione delle membrane con un cokctail di anticorpi diretti contro varie subunità/complessi della catena respiratoria mitocondria in quattro differenti tessuti autoptici del paziente (cuore, cervello, muscolo e fegato). La banda corrispondente alla Citocromo c ossidasi (epitopo dell’anticorpo sulla subunità COXII) risulta assente in tutti i tessuti, tranne nel cuore, tessuto a più alto contenuto mitocondriale, dove se ne apprezza una comunque significativa riduzione. Il pattern ottenuto restituisce un dato tecnicamente pulito quanto qualitativamente chiaro circa l’impatto ubiquitario del deficit biochimico di cIV correlato alla rispettiva mutazione rilevata, ma non spiega la selettività dei tessuti che si riscontra invece in clinica. L’SDS-PAGE non è risultato dunque lo strumento d’indagine adatto all’approfondimento della comprensione dei meccanismi patogenetici di questa forma di Sindrome di Leigh. Verrà svolto un approfondimento sulla tessuto specificità̀ dell’assemblaggio del complesso IV servendosi dell’analisi della proteina in condizioni native (BN-PAGE), andandone ad indagare le singole subunità̀ COXI, COXII, e COXIV, nella speranza che questo tipo di analisi fornisca delle informazioni aggiuntive circa la tessuto-specificità̀ di questo difetto.

La tessuto specificità nella encefalomiopatie mitocondriali dovuta a macrodelezione del DNA mitocondriale. E’ stata eseguita un’analisi in SDS-PAGE e WB su biopsie muscolari con anticorpi monoclonali diretti alla subunità COXII del complesso IV ed SDHA del complesso II di pazienti già diagnosticati per Sindrome MELAS (m.3243A>G), MERRF (m.8344C>G) e di pazienti che hanno mostrato la presenza di singole (macro) delezioni del DNA mitocondriale all’analisi Southern blot e in almeno un saggio di long-PCR. Sono stati inoltre eseguiti degli studi di complesso in WB anche su tessuti autoptici di tre pazienti (uno per condizione testata) sfruttando il cocktail total OXPHOS Human antibody per valutare l’intero spettro dei complessi respiratori. Il focus dell’indagine è stato posto nel tentativo di approfondire la conoscenza circa le correlazioni tra il difetto mtDNA noto e l’impatto che questo può avere sulla stabilità dei complessi della catena respiratoria e la traduzione mitocondriale più in generale. L’analisi, ancora in itinere, estesa a più tessuti sui campioni

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autoptici mira inoltre a chiarire i meccanismi di tessuto-specificità che sono propri dei fenotipi clinici delle sindromi trattate. Relativamente al caso di macrodelezione del DNA mitocondriale non è stata rilevata nessuna differenza significativa in cuore, rene, fegato ed encefalo, rispetto ai controlli. Questo dato può essere spiegato con il basso tasso di eteroplasmia stimato nei tessuti analizzati: rispettivamente 17%, 5%, 30%, 40%. Per quanto riguarda i tessuti muscolari, risultano risparmiati pettorale e retto-femorale, mentre si osserva una riduzione del 51% nel cIV nell’ileopsoas, il cui dato percentuale di eteroplasmia ha un valore a sua volta molto elevato (81%). Questo dato è in sintonia con il deficit di cIV rilevato sulla biopsia muscolare della stessa paziente nel medesimo tessuto.

Il ruolo del metabolismo del Coenzima Q10 nell’Atrofia Multisistemica (MSA). L’atrofia multisistemica (MSA) è una malattie neurodegenerativa ad eziologia ignota, caratterizzata dalla perdita delle funzione autonome in combinazione con parkinsonismo poco responsivo alla Levodopa, disfunzione cerebellare e segni piramidali. Mutazioni recessive nel gene COQ2, che codifica per un enzima coinvolto nella biosintesi del Coenzima Q10, sono state recentemente descritte in un singolo studio come possibili cause nelle forme familiari e sporadiche di MSA. Abbiamo analizzato il gene COQ2 in una corte di 14 pazienti con diagnosi di MSA probabile (tipo P: 2 casi familiari e 12 apparentemente sporadici) e 6 pazienti sporadici con MSA di tipo C. Questo screening ha portato alla individuazione di nuova variante omozigote (p.A43G) in un paziente italiano sporadico con MSA-C e della mutazione eterozigote p.N180S in un paziente con MSA-P. Un set di saggi molecolari, proteici e biochimici (in collaborazione con il Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie dell’Università di Bologna, prof.sa Fato) mi ha permesso di analizzare le conseguenze di queste varianti in tessuti umani patologici e di controllo dimostrando che esse non hanno effetti negativi sulla espressione del gene COQ2, la maturazione della proteina o la biosintesi di Coenzima Q10. Le mutazioni nel gene COQ2 non rappresentano una causa comune di MSA nei pazienti familiari e sporadici con MSA nella popolazione italiana, parimenti a quanto osservato da altri gruppi in studi analoghi.

Lo screening clinico pregenetico per le forme monogeniche di ictus, lo studio Lombardia GENS. Nel corso del 2016 è stato inoltre pubblicato il risultato di uno studio pluriennale sulle cause monogeniche di ictus a cui il gruppo di lavoro sulle malattie mitocondriali ha contributo per la definizione genetica di una di queste cause (MELAS). Lo studio GENS è uno studio prospettico multicentrico finalizzato alla diagnosi 5 cause monogeniche associate (CADASIL, cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy; Malattia di Fabry; MELAS, mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes; angiopatia amiloide; sindrome di Marfan) a ictus usando uno specifico algoritmo diagnostici per ognuna delle cause sospettate. Per farlo lo studio ha arruolato una serie consecutiva di pazienti con ictus ischemico o emorragico o TIA ricoverati presso le Stroke Units dei centri regionali partecipanti al progetto. I pazienti sono stati definiti come “probabili” quando presentavano ictus o TIA ad eziopatogenesi sconosciuta o in presenza di 3 fattori di rischio vascolari o età di esordio precoce oppure con anamnesi familiare positiva o con caratteristiche cliniche specifiche. I pazienti che rispondevano ai criteri stabiliti per ogni algoritmo diagnostico sono stati indirizzati all’analisi genetica. L’applicazione di questi criteri ha permesso di individuare 227 pazienti con una possibile malattia monogenica e le analisi molecolari hanno permesso di identificare mutazioni nel 7% dei casi. Il riscontro di una storia familiare positiva è stato l’unico elemento per distinguere i pazienti mutati da quelli non mutati. La presenza di fattori di rischio per eventi cerebrovascolari non esclude la presenza di difetti molecolari.

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PATOLOGIE DA ACCUMULO LISOSOMIALE Nel corso del 2016 si è concluso il finanziamento Telethon GEP14049 (50.000 Eur) dedicato allo studio della patogenesi della Amiotrofia Spinale con Epilessia Mioclonica Progressiva: “Patient-specific cellular models for spinal muscular atrophy with progressive myoclonic epilepsy: from pathogenesis to therapeutics development for a neglected neurological disorder”. Nelle amiotrofie spinali (SMA) la morte dei motoneuroni, le cellule che trasmettono lo stimolo per la contrazione muscolare, determina una grave debolezza muscolare (amiotrofia) con conseguente difficoltà di movimento e respirazione. In questo progetto abbiamo studiato una forma particolare di SMA, chiamata SMA-PME, che associa la SMA a un’epilessia progressiva, intrattabile con i comuni farmaci. La malattia esordisce nei bambini di 3-5 anni e progredisce lentamente ma inesorabilmente causando una tetraparesi areflessica ipotonica progressiva e un grave deficit cognitivo, che portano a uno stato apallico vegetativo di un bambino che nei primi anni della sua esistenza appariva normale ai genitori. L’insieme di queste gravi disabilità presenta ricadute rilevanti sulla vita delle famiglie e sul Sistema Sanitario Nazionale. Si tratta quindi di una malattia grave e rarissima (1/milione), su cui non sono stati fatti investimenti in termini di assistenza e ricerca. La SMA-PME è causata dalla ridotta funzionalità di un enzima necessario per degradare una molecola (la ceramide), che quindi si accumula nelle cellule. Lo stesso problema è causa di un’altra grave malattia multisistemica, la malattia di Farber. Non sappiamo perché nella SMA-PME solo i neuroni (motori e della corteccia cerebrale) siano colpiti. Un grande ostacolo per comprendere questo aspetto e sviluppare adeguate terapie è la mancanza di modelli. Per superare questi limiti, abbiamo usato cellule staminali indotte pluripotenti (iPS) ottenute da fibroblasti di pazienti affetti da SMA-PME come modello di malattia. Le iPS rispettano i criteri originariamente definiti per le cellule staminali embrionali umane, ma non ne condividono i problemi etici non essendo derivate da embrioni. Lo sviluppo di questi modelli ha consentito di ampliare la nostra conoscenza della SMA-PME (e della malattia di Farber) e a testare terapie per il trattamento di queste malattie oggi incurabili.

ARTICOLI Bersano A, Markus HS, Quaglini S, Arbustini E, Lanfranconi S, Micieli G, Boncoraglio GB, Taroni F, Gellera C, Baratta S, Penco S, Mosca L, Grasso M, Carrera P, Ferrari M, Cereda C, Grieco G, Corti S, Ronchi D, Bassi MT, Obici L, Parati EA, Pezzini A, De Lodovici ML, Verrengia EP, Bono G, Mazucchelli F, Zarcone D, Calloni MV, Perrone P, Bordo BM, Colombo A, Padovani A, Cavallini A, Beretta S, Ferrarese C, Motto C, Agostoni E, Molini G, Sasanelli F, Corato M, Marcheselli S, Sessa M, Comi G, Checcarelli N, Guidotti M, Uccellini D, Capitani E, Tancredi L, Arnaboldi M, Incorvaia B, Tadeo CS, Fusi L, Grampa G, Merlini G, Trobia N, Comi GP, Braga M, Vitali P, Baron P, Grond-Ginsbach C, Candelise L; Lombardia GENS Group*.. Clinical Pregenetic Screening for Stroke Monogenic Diseases: Results From Lombardia GENS Registry. Stroke. 2016 Jul;47(7):1702-9. doi: 10.1161/STROKEAHA.115.012281.

ABSTRACT Ronchi D, Rizzo F, Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Stuppia G, Del Bo R, Piga D, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Selective mitochondrial depletion, apoptosis resistance, and increased mitophagy in human Charcot-Marie-Tooth 2A motor neurons”. "Mitochondrial Medicine: Developing New Treatments for Mitochondrial Disease", May 4th-6th May, 2016, Hinxton, Cambridge, UK.

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Ronchi D. “Patients derived cellular models to investigate the pathogenesis and to develop therapies for human disorders caused by acid ceramidase deficiency”.3rd Research Day Istituto Nazionale di Genetica Molecolare e IRCCS Fondazione Ca'Granda Ospedale Maggiore Policlinico (16th November 2016).

Patogenesi e storia naturale delle distrofinopatie Il nostro centro è centro di riferimento per la diagnosi e il follow-up di pazienti affetti da distrofinopatie. La presenza di ambulatori dedicati e la possibilità di effettuare uno screening genetico completo del gene della distrofina, comprensivo di ricerca di mutazioni puntiformi, ha reso possibile negli ultimi anni la raccolta di dati clinici e molecolari di più di 250 pazienti affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) seguiti non solo presso il nostro centro ma anche presso altri Istituti.

Nell’ultimo anno abbiamo proseguito la collaborazione a studi multicentrici finalizzati alla definizione patogenetica e alla identificazione di outcome measure nella Distrofia Muscolare di Duchenne. Questi aspetti sono fondamentali al fine di potenziare la ricerca di nuovi approcci terapeutici e di elementi utili per la valutazione della storia naturale di queste patologie e la sua modificazione durante il trattamento. La definizione della storia naturale è infatti fondamentale non solo ai fini prognostici ma anche al fine di valutare l’efficacia di eventuali terapie sperimentali. In particolare nel corso di questo anno sono stati confrontati i dati di 6MWT e test funzionali in una ampia coorte di pazienti DMD al fine di valutare sensibilità del tempo di Gowers come fattore predittivo di progressione di malattia (Mazzone et al.). I dati di storia naturale raccolti sono stati inoltre utilizzati con gruppo di controllo per dimostrare l’efficacia del farmaco Eterlipsen nel trattamento della DMD, ed hanno consentito di dimostrare una differenza statisticamente significativa nel gruppo dei trattati (Mendell et al. 2016).

I notevoli sviluppi degli approcci terapeutici nella distrofia muscolare di Duchenne rende ipotizzabile la possibilità che nei prossimi anni si rendano disponibili nuove terapie sperimentali anche nella Distrofia Muscolare di Becker (BMD). Abbiamo pertanto iniziato la raccolta di dati relativi a 6MWT e prove funzionali nei pazienti BMD seguiti presso i nostri ambulatori al affetti da l fine di costruire una storia naturale di questo gruppo di pazienti.

Infine abbiamo collaborato alla raccolta e revisione dei dati derivanti dall’esperienza nella gestione e nel trattamento dei pazienti, condotta dal comitato TREAT-NMD allo scopo di elucidare i criteri per la programmazione e la realizzazione delle sperimentazioni cliniche per le patologie neuromuscolari.

Pubblicazioni

Mercuri E; DMD Italian Group.. Registries versus tertiary care centers: How do we measure standards of care in Duchenne muscular dystrophy? Neuromuscul Disord. 2016 Apr-May;26(4-5):261-3.

Mendell JR, Goemans N, Lowes LP, Alfano LN, Berry K, Shao J, Kaye EM, Mercuri E. Eteplirsen Study Group and Telethon Foundation DMD Italian Network.. Longitudinal effect of eteplirsen versus historical control on ambulation in Duchenne muscular dystrophy. Ann Neurol. 2016 Feb;79(2):257-71.

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Categorizzare traiettorie di storia naturale della deambulazione misurata sulla distanza percorsa in 6 minuti in pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne. L’ elevata variabilità nei cambiamenti dei pazienti nella distanza di cammino di 6 minuti (6MWD) nel corso del tempo ha complicato gli studi clinici di efficacia di terapie per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD). Abbiamo valutato se i ragazzi con DMD potessero essere raggruppati in classi che condividano simili traiettorie di funzione della deambulazione come misurato dal 6MWD. Ragazzi deambulanti di età compresa tra 5 anni o più anziani con DMD geneticamente confermata, che sono stati arruolati in uno studio di storia naturale da 11 centri di cura in tutta Italia, sono stati inclusi. Per ogni ragazzo, valutazioni standardizzate di 6MWD erano disponibili a intervalli annuali che coprono 3 anni. Traiettorie di 6MWD vs. età e traiettorie di 6MWD vs. tempo di arruolamento sono state esaminate utilizzando l'analisi di classe latente. Un totale di 96 ragazzi sono stati inclusi. Al momento dell'arruolamento, l'età media era di 8,3 anni (media 6MWD: 374 metri). Oltre all’età, al valore basale del 6MWD, e l'uso di steroidi, quattro classi di traiettoria latenti sono state identificate come utili per predirre l’outcome a 3 anni. I pazienti sono stati così classificati come aventi declino veloce (n = 25), moderata deflessione (n = 19), funzione stabile (n = 37), e miglioramento della funzione (n = 15) durante il follow-3 anni su. Dopo la valutazione per le classi di traiettoria, la deviazione standard della variazione del 6MWD è stata ridotta di circa il 40%. La storia naturale della funzione della deambulazione in DMD può essere composta da classi distinte di traiettoria. Ridurre la variabilità non spiegata nelle analisi funzionali dei pazienti DMD potrebbe contribuire a migliorare ulteriormente la progettazione e l'analisi della sperimentazione clinica per questi pazienti.

Pubblicazioni Mercuri E, Signorovitch JE, Swallow E, Song J, Ward SJ; DMD Italian Group.; Trajectory Analysis Project (cTAP).. Categorizing natural history trajectories of ambulatory function measured by the 6-minute walk distance in patients with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 2016 Sep;26(9):576-83. doi: 10.1016/j.nmd.2016.05.016. PubMed PMID: 27423700; PubMed Central PMCID: PMC5026045.

Analisi del tempo impegato per rialzarsi da terra come un fattore predittivo di progressione della malattia nella distrofia muscolare di Duchenne: uno studio osservazionale. Le prove funzionali a tempo, e più in particolare, il tempo per rialzarsi dal pavimento, sono state proposte come fattori prognostici precoci della progressione della malattia e della perdita della deambulazione. Lo scopo del nostro studio è stato quello di indagare la correlazione tra il tempo impiegato per rialzarsi da terra e il 6MWT per 12 mesi in una coorte di ragazzi Duchenne deambulanti. Un totale di 487 misurazioni a 12 mesi sono state raccolte da 215 ragazzi Duchenne deambulanti. L'età era compresa era tra 5.0 e 20.0 anni (media 8.48 ± 2.48 DS). I risultati del tempo per rialzarsi dal pavimento al basale variava da 1,2 a 29,4 secondi nei ragazzi che potevano eseguire il test. 49 pazienti sono stati in grado di eseguire il test al basale e 87 a 12 mesi. I valori 6MWT variava da 82 a 567 metri al basale. 3 pazienti hanno perso la capacità di effettuare il 6MWT a 12 mesi. La correlazione tra il tempo per rialzarsi dal pavimento e il 6MWT al basale è stata elevata (r = 0.6, p <0.01). Sia il tempo per rialzarsi dal pavimento che la linea di base del 6MWT sono elementi validi per predire i cambiamenti del 6MWT nel gruppo di età superiore ai 7 anni, senza alcuna interazione tra le due misure. I nostri risultati suggeriscono che il tempo per rialzarsi dal pavimento può essere considerato un ulteriore importante fattore prognostico dell 6MWT e, più in generale, di progressione della malattia.

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Pubblicazioni Mazzone ES, et al., Timed Rise from Floor as a Predictor of Disease Progression in Duchenne Muscular Dystrophy: An Observational Study. PLoS One. 2016 Mar 16;11(3):e0151445.

Registro Italiano delle Distrofie Muscolari dei Cingoli: frequenza relativa, caratteristiche cliniche e diagnosi differenziale. Le Distrofie Muscolari dei Cingoli (LGMDs) sono caratterizzate da elevata eterogeneità molecolare, sovrapposizione clinica, e una scarsità di biomarcatori specifici. La loro definizione molecolare è fondamentale ai fini prognostici e terapeutici. Abbiamo creato un registro LGMD italiano che ha incluso 370 pazienti molecolarmente definiti. Abbiamo esaminato i dati retrospettivi e prospettici dettagliati e confrontato ogni sottotipo LGMD a fini di diagnosi differenziale. LGMD 2A e 2B sono le forme più frequenti in Italia. L'età di esordio della malattia, progressione clinica, e coinvolgimento cardiaco e respiratorio può variare notevolmente tra ogni sottotipo di LGMD. In una serie di pazienti ampiamente caratterizzata, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha identifcato mutazioni nel 36,5% dei casi. Una dettagliata caratterizzazione clinica in combinazione con l'analisi del tessuto muscolare è fondamentale per guidare la diagnosi differenziale e per affrontare in modo razionale i test molecolari. L’analisi NGS è utile per la diagnosi di forme senza biomarcatori specifici, anche se, almeno nel nostro studio, diversi meccanismi molecolari responsabili di LGMD devono ancora essere identificati.

Pubblicazioni: Magri F, Nigro V, Angelini C, Mongini T, Mora M, Moroni I, Toscano A, D'angelo MG, Tomelleri G, Siciliano G, Ricci G, Bruno C, Corti S, Musumeci O, Tasca G, Ricci E, Monforte M, Sciacco M, Fiorillo C, Gandossini S, Minetti C, Morandi L, Savarese M, Fruscio GD, Semplicini C, Pegoraro E, Govoni A, Brusa R, Del Bo R, Ronchi D, Moggio M, Bresolin N, Comi GP. The italian limb girdle muscular dystrophy registry: Relative frequency, clinical features, and differential diagnosis. Muscle Nerve. 2017 Jan;55(1):55-68.

La base genetica delle distrofie muscolari non diagnosticati e miopatie: I risultati di 504 pazienti. In questo studio abbiamo applicato il sequenziamento di nuova generazione (NGS) per l'indagine delle basi genetiche delle distrofie muscolari non diagnosticate e miopatie in un’ampia coorte di pazienti. Abbiamo applicato una piattaforma NGS-based chiamata Motorplex al nostro flusso di lavoro diagnostico per testare geni di malattie muscolari con un'alta sensibilità e specificità per le piccole varianti del DNA. Abbiamo analizzato 504 pazienti non diagnosticati affetti da quadri clinici tipo distrofie dei cingoli o miopatie congenite. L’analisi con Motorplex ha fornito una diagnosi molecolare completa in 218 casi (43,3%). In altri 160 pazienti (31,7%) sono state identificate varianti candidate come patogenetiche, ma ancora non provate. Varianti patogenetiche sono state identificate in 47 su 93 geni, e in più del 30% dei casi, il fenotipo era non convenzionale, ampliando lo spettro di presentazione della malattia in almeno 10 geni. Il nostro studio è un esempio della rivoluzione in corso in diagnostica molecolare, evidenziando i vantaggi nell'utilizzo NGS come approccio di primo livello per condizioni genetiche eterogenee.

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Pubblicazioni Savarese M, Di Fruscio G, Torella A, Fiorillo C, Magri F, Fanin M, Ruggiero L, Ricci G, Astrea G, Passamano L, Ruggieri A, Ronchi D, Tasca G, D'Amico A, Janssens S, Farina O, Mutarelli M, Marwah VS, Garofalo A, Giugliano T, Sanpaolo S, Del Vecchio Blanco F, Esposito G, Piluso G, D'Ambrosio P, Petillo R, Musumeci O, Rodolico C, Messina S, Evilä A, Hackman P, Filosto M, Di Iorio G, Siciliano G, Mora M, Maggi L, Minetti C, Sacconi S, Santoro L, Claes K, Vercelli L, Mongini T, Ricci E, Gualandi F, Tupler R, De Bleecker J, Udd B, Toscano A, Moggio M, Pegoraro E, Bertini E, Mercuri E, Angelini C, Santorelli FM, Politano L, Bruno C, Comi GP, Nigro V. The genetic basis of undiagnosed muscular dystrophies and myopathies: Results from 504 patients. Neurology. 2016 Jul 5;87(1):71-6.

Un caso con la particolare concomitanza di due differenti sindromi genetiche. La sindrome di Down (DS) è il disturbo cromosomico più comune nei bambini nati vivi, che colpisce diversi sistemi del corpo, ma di solito risparmia i muscoli scheletrici. Presentiamo il caso di un bambino con la coesistenza di DS e distrofinopatia. Solo 1 caso simile è stato riportato fino ad ora in letteratura. Il caso riguarda un paziente di 8 anni con DS che ha avuto una storia di scoperta incidentale di un aumento dei livelli sierici di creatina chinasi fino al 1775 U / L (valori normali 38-174 U / L). Non ha presentato alcun ritardo nello sviluppo motorio; all’ esame neurologico, nessuna debolezza muscolare o affaticamento è stata rilevata in 2 diverse valutazioni effettuate nel corso di un periodo di 6 mesi. La biopsia muscolare ha rivelato alterazioni distrofiche con immunostaining per la distrofina. Il gene della distrofia muscolare di Duchenne è stato analizzato per eventuali delezioni mediante PCR multiplex, ma non sono state evidenziate delezioni. Le analisi della sequenza del gene della distrofia muscolare di Duchenne ha rivelato una mutazione c.1812 + 1G> A nell’introne 15 e ha confermato la diagnosi di distrofia muscolare di Becker. Il paziente ha iniziato una fisioterapia specifica per preservare le capacità motorie. Un follow-up multidisciplinare è stato avviato. Questo caso particolare di "double trouble" esemplifica il valore di una attenta valutazione clinica e un'adeguata esperienza clinica per identificare la concomitanza di due differenti sindromi genetiche nello stesso paziente e sottolinea l'importanza della valutazione della forza muscolare nei pazienti DS per formulare una prognosi corretta, e, di conseguenza, per organizzare le migliori cure a lungo termine.

Pubblicazioni: Lerario A, Colombo I, Milani D, Peverelli L, Villa L, Del Bo R, Sciacco M, Comi GP, Esposito S, Moggio M. A case report with the peculiar concomitance of 2 different genetic syndromes. Medicine (Baltimore). 2016 Dec;95(49):e5567.

Sperimentazioni cliniche nelle patologie neuromuscolari

E’ proseguita la partecipazione attiva a sperimentazioni cliniche Nazionali ed Internazionali in pazienti affetti da malattie neuromuscolari, in particolare Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD), Miopatia a Corpi Inclusi e Amiotrofia Spinale (SMA). Per quanto riguarda la DMD sono in corso numerose sperimentazioni cliniche con farmaci che agiscono sia attraverso il ripristino di una distrofina funzionante sia su meccanismi di compenso. Sono attualmente in corso la Fase di estensione (PTC019) e fase in aperto (PTC020) per la somministrazione di Ataluren, molecola in grado di promuovere il reading through di mutazioni di stop codon del gene della distrofina. Tale farmaco si è rivelato efficace nel rallentare la progressione di malattia in pazienti DMD e verrà a breve messo in commercio. E’ stato sospeso lo studio con Tadalafil, donatore di ossido nitrico, per mancanza di efficaci.

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E’ inoltre proseguita la fase di estensione dello studio per sicurezza, tollerabilità ed efficacia del farmaco Givinostat, molecola che agisce come inibitore del’istone deacetilasi. L’analisi dei dati dei 20 pazienti trattati a consentito di dimostrare degli effetti positivi dal punto di vista istologico, come dimostrato in una recente pubblicazione. Il gruppo di pazienti era tuttavia troppo ristretto per poter valutare anche delle modificazioni dal punto di vista funzionale. E’ previsto pertanto a breve l’inizio di uno studio di fase III in doppio cieco con la molecola Givinostat condotto ai fini di confermare l’efficacia di questo farmaco in una ampia corte di pazienti. Prevediamo inoltre nel prossimo anno la possibilità di disegnare un protocollo sperimentale per il trattamento con tale molecola anche di pazienti affetti da BMD. Abbiamo collaborato inoltre nello studio clinico promosso dal Prof. Jerry Mendell presso il Nationwide Children’s Hospital di Columbus in Ohio condotto in pazienti affetti da Distrofia Muscolare di Becker trattati con somministrazioni intramuscolari di virus adenoassociati, vettori del gene della follistatina, molecola che agisce inibendo l’attività della miostatina. La metà dei soggetti trattati (3/6) ha presentato un miglioramento delle performances motorie e gli studi bioptici su campioni muscolari hanno evidenziato riduzione della fibrosi e incremento delle dimensioni delle fibre. Tali risultati sono promettenti per il potenziale impiego di tale terapia in modo trasversale nelle distrofie muscolari. E’ inoltre iniziato presso il nostro Istituto un trial clinico di fase III con acido sialico in pazienti affetti da Miopatia a Corpi inclusi da mutazioni nel gene GNE. Tale forma di miopatia al momento attuale è priva di terapie efficaci, studi di fase II hanno dimostrato una stabilizzazione del quadro clinico nei pazienti trattati e questo studio di fase III consentirà di consolidare i risultati. Nel corso del 2016 si sono inoltre verificati notevoli sviluppi per quanto riguarda la definizione di potenziale approcci sperimentali in pazienti affetti da SMA. Nel corso del 2016 è stato riaperto presso il nostro centro il trial con farmaco Olexosime in pazienti affetti da SMAII/SMAIII. Si tratta di una fase di estensione in pazienti già precedentemente trattati presso il nostro centro in un trial di fase III. Questo studio è volto a valutare efficacia e sicurezza a lungo termine del farmaco. Al momento attuale non si sono verificati effetti collaterali e i pazienti presentano una stabilizzazione del quadro clinico. Una strategia molto promettente in pazienti affetti da SMA è l’utilizzo di farmaci in grado di modulare lo splicing del gene SMN2. Nel corso del 2016 sono stati resi pubblici i risultati del trial con Nusinersen somministrato per via intratecale in pazienti affetti da SMA I. I risultati della sperimentazione nei pazienti affetti da SMAII/III saranno resi noti nella seconda metà del 2017. E’ in atto un programma di accesso allargato per i pazienti affetti da SMAI. Un secondo farmaco in grado di modulare lo splicing di SMN2, con somministrazione per via orale, è la molecola RO7034067. La nostra UO parteciperà allo studio Sunfish, a un trial clinico in doppio cieco, controllato con placebo, che recluterà 200 i pazienti affetti da SMA di tipo 2 e 3 (deambulanti e non deambulanti), di età compresa tra i 2 a 25 anni. L’inizio dello studio è previsto entro la prima metà del 2017. Parteciperemo inoltre anche allo studio Firefish, che arruolerà circa 50 bambini affetti da SMA di tipo I in Stati Uniti e Europa.

Pubblicazioni Bettica P, Petrini S, D'Oria V, D'Amico A, Catteruccia M, Pane M, Sivo S, Magri F, Brajkovic S, Messina S, Vita GL, Gatti B, Moggio M, Puri PL, Rocchetti M, De Nicolao G, Vita G, Comi GP, Bertini E, Mercuri E. Histological effects of givinostat in boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 2016 Oct;26(10):643-649.

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Aspetti genetici della Sclerosi Laterale Amiotrofica La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa caratterizzata da una perdita progressiva di motoneuroni che porta a paralisi e morte. Attualmente non ci sono terapie efficaci per questa malattia che ha un grave impatto sulla vita personale e socio-economica di migliaia di pazienti e dei loro caregiver. Le cause della SLA sono in gran parte sconosciute, sebbene siano stati identificati recentemente, grazie alla diffusione di nuove tecnologie di screening massivo, diversi geni causativi. Nel novembre 2011 l’evidenza della relazione tra l’espansione intronica nel gene C9orf72 e lo sviluppo della malattia ha cambiato lo scenario fino ad allora conosciuto. Circa il 90% delle forme di SLA sono di tipo sporadico (SALS) e senza alcuna eziologia nota. Le forme familiari (FALS) rappresentano circa il 5%-10% dei casi e sono molto eterogenee dal punto di vista genetico. I meccanismi genetici coinvolti nella SLA sono probabilmente più complessi di quanto inizialmente ipotizzato. Si rende quanto mai necessaria una conoscenza approfondita delle componenti genetiche della SLA per indagare i processi che portano allo sviluppo della malattia e per fornire nello stesso tempo nuovi bersagli terapeutici molecolari. L’attività di ricerca è stata volta a caratterizzare geneticamente un’ampia coorte di pazienti affetti da SLA reclutati presso l’ambulatorio malattie del motoneurone afferente al Unità di Neurologia Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti dell’Università degli Studi di Milano. Il Dipartimento rappresenta un centro di riferimento per la diagnosi e il trattamento delle malattie del motoneurone. Tutti i pazienti inclusi nello studio hanno soddisfatto i criteri di El Escorial per la SLA probabile o definita; un consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti arruolati. I risultati ottenuti dal nostro gruppo di pazienti sono confluiti in studi genetici multicentrici per lo studio e la caratterizzazione di nuovi loci malattia e di nuovi geni modificatori. In un primo studio multicentrico sono stati genotipizzati oltre 7000 nuovi casi di pazienti affetti da SLA e oltre 4600 soggetti controllo. Ai dati così ottenuti sono stati aggiunti i dati dei genotipi di precedenti studi GWA per un totale di 41 coorti indipendenti di pazienti e controlli. In totale sono stati analizzati 12577 casi e 23475 soggetti controllo. Sono state imputate quasi 9 milioni di varianti. La meta-analisi (fixed-effects) ha evidenziato 4 loci statisticamente significativi (p<5x10-8), tre dei quali già statisticamente significativi in GWA precedenti: C9orf72 (rs3849943), UNC13A (rs12608932) e SARM1 (rs35714695). La nuova associazione riguarda invece la variante non sinonima rs75087725 sul locus C21orf2 (p=8.7x10-11). Nello studio di replicazione sono stati genotipizzati in ulteriori 2600 casi e altrettanti controlli sani provenienti da 9 coorti indipendenti. I dati ottenuti confermavano l’associazione statisticamente significativa con i loci precedentemente descritti, incluso quindi C21orf2. L’associazione con la variante a bassa frequenza contenuta in questo gene pone quindi C21orf2 tra i geni che possono aumentare il rischio per lo sviluppo della SLA. C21orf2 è una proteina ricca di repeat di leucina, tuttavia il suo ruolo biologico rimane al momento poco caratterizzato. La sua presenza è fondamentale per la formazione e il mantenimento delle cilia primarie. C21orf2 localizza nei mitocondri nelle cellule immunitarie e potrebbe essere coinvolta nei meccanismi di riparazione del DNA. Si ipotizza che C21orf2 difettosa possa portare ad una disfunzione delle cilia primarie e/o dei mitocondri, e che non possa svolgere le funzioni di riparo del DNA. Altri studi sono ovviamente necessari per chiarire il ruolo di C21orf2 nel processo neurodegenerativo associato alla SLA. Con lo scopo di identificare nuovi geni “modificatori” della SLA, sono stati analizzati i dati di sopravvivenza di oltre 4200 pazienti provenienti da differenti popolazioni Europee. Per questo studio sono stati imputati i dati genotipici di oltre 7 milioni di varianti. Dall’analisi bioinformatica dei dati di 4256 pazienti (2589 maschi, età media di insorgenza della malattia 59 anni) sono emersi due nuove varianti associate in modo statisticamente significativo con una diversa sopravvivenza: rs139550538 sul cromosoma 10q23 all’interno

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di una regione intronica del gene IDE e rs2412208 sul cromosoma 1p36 localizzata in una regione intronica del gene CAMTA1. Per quanto riguarda la variante rs139550538 la presenza del genotipo AA e AT si associa ad una riduzione di 8 mesi in confronto ai soggetti aventi il genotipo TT (OR: 1.61, p=1.87x10-

9). Nel caso del locus CAMTA1, i portatori del genotipo GG e GT presentano una sopravvivenza minore di 4 mesi rispetto ai pazienti con genotipo TT (OR: 1.17, p=3.53x10-8). L’identificazione di geni “modificatori”, quali IDE e CAMTA1, che possono influenzare la sopravvivenza nei casi SLA potrebbe aiutare a comprendere la biologia della malattia stessa e a trovare nuovi target terapeutici per interventi farmacologici. Caratterizzare varianti genetiche associate ad ampi effetti sulla sopravvivenza potrebbe inoltre essere importante per la progettazione e l’analisi di nuovi trials clinici.

PUBBLICAZIONI

van Rheenen W, Shatunov A, Dekker AM et al. Genome-wide association analyses identify new risk variants and the genetic architecture of amyotrophic lateral sclerosis. Nat Genet. 2016 Sep;48(9):1043-8. doi: 10.1038/ng.3622.

Kenna KP, van Doormaal PT, Dekker AM, et al. NEK1 variants confer susceptibility to amyotrophic lateral sclerosis. Nat Genet. 2016 Sep;48(9):1037-42.

Fogh I, Lin K, Tiloca C et al. Association of a Locus in the CAMTA1 Gene With Survival in Patients With Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis. JAMA Neurol . 2016 Jul 1;73(7):812-20. doi: 10.1001/jamaneurol.2016.1114.

CANALOPATIE MUSCOLARI

Le canalopatie muscolari sono caratterizzate da un’alterata eccitabilità della membrana muscolare e si dividono in miotonie non-distrofiche e paralisi periodiche. Esordiscono principalmente nelle prime due decadi di vita e sono caratterizzate da rigidità muscolare, dolore, debolezza e facile affaticabilità. Sono causate da mutazioni nei geni CLCN1, SCN4A, CACNA1S e KCNJ2 che codificano rispettivamente per i canali del cloro, del sodio, del calcio e del potassio muscolari. Negli ultimi anni abbiamo caratterizzato un’ampia coorte di pazienti affetti sia da miotonie non-distrofiche che da paralisi periodica. Nel nostro laboratorio le indagini genetiche sono eseguite sia come completamento dell’iter diagnostico sia come aspetto di pura ricerca sulle cause genetiche delle canalopatie muscolari nella popolazione italiana. Relativamente al canale del cloro muscolo specifico (CLCN1), l’attività di diagnostica, corredata da studi funzionali e di espressione in sistemi in vitro per casi selezionati, ha permesso di collezionare in pochi anni una coorte di oltre 100 soggetti Thomsen/Becker. La nostra coorte consta, inoltre, di 23 soggetti affetti da paralisi periodica (paralisi periodica ipokaliemica, paralisi periodica iperkaliemica e sindrome di Andersen-Tawil e di circa 30 pazienti affetti da miotonia del canale del sodio. Nuove mutazioni sono state identificate e analizzate con studi funzionali. Questi studi finora sono stati presentati a congressi internazionali e hanno portato alla pubblicazione su riviste internazionali di articoli, alcuni dei quali in collaborazione con altri gruppi che si occupano dello studio delle canalopatie muscolari. In collaborazione con il gruppo di Conte-Camerino/Desaphy, presso l’Università degli Studi di Bari, è stata caratterizzata dal punto di vista funzionale una nuova mutazione, p.P1158L, sul canale del sodio (Nav1.4) identificata in una giovane paziente con miotonia severa e

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rigidità muscolare (miotonia permanens). Lo studio ha permesso di correlare la scarsa risposta della paziente al trattamento con mexiletina alla p.P1158L la quale, localizzata in un domain essenziale al docking del canale, ne diminuisce sensibilmente l’inattivazione veloce rendendolo insensibile alla mexiletina. La proteina mutata risponde bene ad un altro principio farmacologico, la flecainide, utilizzata con successo per migliorare le condizioni della paziente. Lo studio è stato pubblicato su Neurology.

PUBBLICAZIONI Desaphy JF, Carbonara R, D'Amico A, Modoni A, Roussel J, Imbrici P, Pagliarani S, Lucchiari S, Lo Monaco M, Conte Camerino D. Translational approach to address therapy in myotonia permanens due to a new SCN4A mutation. Neurology. 2016; 86(22):2100-8.

Federica Ginanneschi, Andrea Mignarri, Sabrina Lucchiari, Gianna Ulzi, Giacomo P. Comi, Alessandro Rossi, Maria Teresa Dotti. Motor axons excitability changes produced by sustained natural activity and response to mexiletine in myotonia congenital. Clinical Neurophysiology, in press.

GLICOGENOSI DI TIPO III

La glicogenosi di tipo III (GSDIII) è una malattia genetica rara, con trasmissione autosomica recessiva, con anomalo accumulo di glicogeno nei tessuti, principalmente nel fegato e muscolo scheletrico. È causata da mutazioni nel gene AGL che codifica per l’enzima deramificante (GDE). La malattia in genere si manifesta nell’infanzia con epatomegalia, ritardo di crescita e crisi ipoglicemiche, mentre durante l’età adulta si sviluppano miopatia e sovente cardiomiopatia. Il nostro laboratorio studia da anni questa patologia attraverso il dosaggio del contenuto di glicogeno nei tessuti, il dosaggio dell’attività enzimatica e la diagnosi genetica. Abbiamo anche sviluppato un modello murino per la glicogenosi di tipo III che è stato ampiamente caratterizzato e che presenta le caratteristiche essenziali della malattia: epatomegalia, accumulo di glicogeno in tutti i tessuti, principalmente fegato e muscolo scheletrico, e intolleranza all’esercizio fisico. La caratterizzazione del modello animale è stata pubblicata su BBA-Molecular basis of disease nel 2014. Il lavoro su questo modello si è sviluppato in un progetto finanziato da Telethon (#) con il duplice scopo di: a) testare a lungo termine diete atte a limitare la deposizione di glicogeno. Abbiamo testato una dieta ad elevato contenuto proteico e basso contenuto di carboidrati e una dieta a contenuto proteico ancora maggiore, ma totalmente priva di glucosio. Entrambi i trattamenti hanno mostrato un miglioramento della funzionalità muscolare, anche se con grado diverso, valutata come capacità di correre sul treadmill. b) somministrare a modelli murini privi dell’enzima la proteina GDE funzionale mediante virus adenoassociati, in collaborazione con il Dott. Federico Mingozzi del Genethon di Parigi. Abbiamo testato i primi costrutti e due dei costrutti testati sono in grado di esprimere la proteina veicolata in vivo.

GLICOGENOSI DA DEFICIT DI GLICOGENINA

Recentemente, è stata identificata una nuova forma di glicogenosi causata dal deficit di glicogenina, la proteina da cui originano nuove molecole di glicogeno. Dopo il primo studio che identificava una forma di cardiomiopatia legata a mutazioni del gene GYG1, un secondo studio ha correlato anche una forma di miopatia caratterizzata dalla presenza di corpi poliglucosanici a mutazioni in questo gene. Abbiamo riscontrato mutazioni nel gene che codifica per la glicogenina in una famiglia, seguita in questo centro da circa 30 anni, che

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presentava i caratteristici corpi poliglucosanici alla biopsia, ma che ancora non aveva una diagnosi molecolare. Le due pazienti affette presentano la forma miopatica senza coinvolgimento cardiaco. Il lavoro è stato pubblicato su Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry.

PUBBLICAZIONI Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Cinnante CM, Fagiolari G, Ciscato P, Bordoni A, Fortunato F, Magri F, Previtali SC, Velardo D, Sciacco M, Comi GP, Moggio M. Longitudinal follow-up and muscle MRI pattern of two siblings with polyglucosan body myopathy due to glycogenin-1 mutation. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2016 Jul;87(7):797-800.

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LABORATORIO DI NEUROIMMUNOLOGIA CLINICA

• Prof. Giacomo P. Comi Neurologo • Dr. Domenica Saccomanno Biologa Nutrizionista

Laboratorio di Neuroimmunologia: Certificazione di qualità INSTAND (europeo) anno 2016 inerente la diagnostica delle neuropatie disimmuni e sindromi paraneoplastiche. Diagnostica: Il Laboratorio di Neuroimmunologia si occupa del dosaggio dei principali anticorpi associati a neuropatie periferiche (NP) disimmuni quali: polineuropatia cronica infiammatoria demielinizzante (CIDP), neuropatia motoria multifocale (MMN), neuropatia sensitivo-motoria demielinizzante associata a gammopatia monoclonale IgM, sindrome di Guillain Barré (GBS), sue varianti e la sindrome di Miller Fisher (MFS). Si occupa altresì del dosaggio di anticorpi anti-neurone/cervelletto associati alle sindromi neurologiche paraneoplastiche quali: Sindrome di Stiff-person, Atassia cerebellare, Encefalite limbica, Encefalomielite e Lambert-Eaton Myasthenic syndrome (LEMS) mediante tecniche di immunofluorescenza indiretta ed immunblot. Ultimamente è stato esteso il pannello degli antigeni onconeurali indagati in immunoblot, quindi è possibile richiedere presso il nostro laboratorio la ricerca degli anticorpi anti- HuD, Yo, Ri, CV2, Amfifisina, Ma1, Ma2, SOX1, Tr, Zic4 e GAD65.

Ricerca: Studio di collaborazione tra il Dip. Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Sezione di Neuroscienze, Centro Dino Ferrari, Università degli Studi di Milano: Dott.ssa Domenica Saccomanno, Dott.ssa Francesca Magri, Prof. Giacomo Pietro Comi e il Centro per la Prevenzione e Diagnosi della Malattia Celiaca della Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano: Dott.ssa Carolina Tomba, Dott.ssa Leda Roncoroni, Dott. Luca Elli, Prof.ssa Maria Teresa Bardella.

STUDIO CLINICO RETROSPETTIVO SULLA PRESENZA DI ANTICORPI ANTI-GANGLIOSIDI ED ANTI-SULFATIDE NEI PAZIENTI AFFETTI DA MALATTIA CELIACA ED EFFETTI DELLA DIETA SENZA GLUTINE

La malattia celiaca (MC) è un’enteropatia autoimmune (Th1) scatenata dall’ingestione di glutine, in particolare da alcune sue componenti proteiche, chiamate gliadine. La diagnosi si basa sulla presenza di autoanticorpi circolanti (anti transglutaminasi tipo 2), conferma bioptica (danno atrofico della mucosa intestinale) e risposta alla dieta senza glutine (DGS). Al momento l’unica terapia consiste nel seguire per tutto l’arco della vita una DSG al fine di proteggere il paziente dall’insorgenza di complicanze, associate alla MC non trattata. Le complicanze neurologiche sono state riportate in letteratura in circa il 10% dei pazienti affetti da MC e possono interessare il sistema nervoso centrale e quello periferico, con neuropatie periferiche (NP) disimmuni associate alla presenza nel siero dei pazienti di anticorpi anti-gangliosidi. I dati della letteratura mostrano la presenza di anticorpi anti-gangliosidi IgG in pazienti celiaci con e senza neuropatia verosimilmente attraverso una risposta autoimmune mediata dai linfociti T contro i gangliosidi e tali dati sono contrastanti in merito alla risposta clinica e sierologica della patologia neurologica alla DSG. Per la prima volta , abbiamo identificato in pazienti affetti da MC, con e senza disturbi neurologici, la presenza di anticorpi anti-sulfatide di classe IgG (36%) e IgA (19%). Tale reattività è stata riportata in passato in pazienti affetti da neuropatie acute, rispettivamente da Guillain-Barré Syndrome (GBS) e GBS dopo enterite da Campylobacter Jejuni. Nella diagnostica di routine viene di fatto indagata la presenza di anticorpi anti-sulfatide di classe IgM in pazienti con neuropatie disimmuni croniche, come riportato da svariati studi di

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associazione che hanno appunto evidenziato una prevalenza di correlazioni cliniche di questi anticorpi con tale fenotipo clinico, principalmente sensitivo motorio. Non abbiamo riscontrato nessuna positività anti-sulfatide IgA in tutti i pazienti aventi sintomi neurologici durante la dieta contenente glutine. Questo potrebbe suggerire un diverso meccanismo d’azione rispetto a quello ipotizzato in pazienti con anticorpi anti-gangliosidi IgA affetti da GBS sviluppata in seguito ad enterite, dove sembrerebbe possibile un legame tra infiammazione intestinale, produzione di IgA e neuropatia autoimmune attraverso un mimetismo molecolare. Nessuna differenza statisticamente significativa in pazienti con reattività anti-sulfatide IgG tra il gruppo di pazienti con e senza disturbi neurologici. La scomparsa in tutti i pazienti trattati della reattività anti-sulfatide IgG suggerisce un possibile legame tra glutine e auto-anticorpi IgG mentre la persistenza della reattività anti-sulfatide IgA in alcuni pazienti durante la DSG potrebbe indicare una maggiore suscettibilità a sviluppare una risposta autoimmune indipendentemente dal glutine. La reattività anti-sulfatide in pazienti con sintomi neurologici e MC non classica potrebbe indicare una fase acuta della patologia neurologica, ma nessun disordine neurologico è stato riportato con questi auto-anticorpi nei nostri pazienti. Abbiamo riscontrato inoltre anticorpi anti-sulfatide, anti-GM1 ed anti-GM2 IgM in 2 pazienti trattati senza disturbi neurologici ed altre malattie autoimmuni (MA). Nessuno dei due pazienti riferiva la comparsa di disturbi neurologici associati agli auto-anticorpi rilevati di classe IgM, come la neuropatia demielinizzante sensitivo motoria e la neuropatia motoria multifocale (NMM).

Pubblicazioni Saccomanno D., Tomba C., Magri F., Backelandt P., Roncoroni L. Doneda L., Bardella M.T., Comi G.P., Bresolin N., Conte D. and Elli L. Anti-sulfatide reactivity in patients with celiac disease. Scand. J. of Gastroenterology. 2016,1:1-5

PUBBLICAZIONI

Magri F, Nigro V, Angelini C, Mongini T, Mora M, Moroni I, Toscano A, D'angelo MG, Tomelleri G, Siciliano G, Ricci G, Bruno C, Corti S, Musumeci O, Tasca G, Ricci E, Monforte M, Sciacco M, Fiorillo C, Gandossini S, Minetti C, Morandi L, Savarese M, Fruscio GD, Semplicini C, Pegoraro E, Govoni A, Brusa R, Del Bo R, Ronchi D, Moggio M, Bresolin N, Comi GP. The italian limb girdle muscular dystrophy registry: Relative frequency, clinical features, and differential diagnosis. Muscle Nerve. 2017 Jan;55(1):55-68. doi: 10.1002/mus.25192. PubMed PMID: 27184587.

Lerario A, Colombo I, Milani D, Peverelli L, Villa L, Del Bo R, Sciacco M, Comi GP, Esposito S, Moggio M. A case report with the peculiar concomitance of 2 different genetic syndromes. Medicine (Baltimore). 2016 Dec;95(49):e5567. PubMed PMID: 27930565.

Saccomanno D, Tomba C, Magri F, Backelandt P, Roncoroni L, Doneda L, Bardella MT, Comi GP, Bresolin N, Conte D, Elli L. Anti-sulfatide reactivity in patients with celiac disease. Scand J Gastroenterol. 2016 Dec 1:1-5. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 27908207.

Bettica P, Petrini S, D'Oria V, D'Amico A, Catteruccia M, Pane M, Sivo S, Magri F, Brajkovic S, Messina S, Vita GL, Gatti B, Moggio M, Puri PL, Rocchetti M, De Nicolao G, Vita G, Comi GP, Bertini E, Mercuri E.

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Histological effects of givinostat in boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 2016 Oct;26(10):643-649. doi: 10.1016/j.nmd.2016.07.002. PubMed PMID: 27566866.

van Rheenen W, Shatunov A, Dekker AM, McLaughlin RL, Diekstra FP, Pulit SL, van der Spek RA, Võsa U, de Jong S, Robinson MR, Yang J, Fogh I, van Doormaal PT, Tazelaar GH, Koppers M, Blokhuis AM, Sproviero W, Jones AR, Kenna KP, van Eijk KR, Harschnitz O, Schellevis RD, Brands WJ, Medic J, Menelaou A, Vajda A, Ticozzi N, Lin K, Rogelj B, Vrabec K, Ravnik-Glavač M, Koritnik B, Zidar J, Leonardis L, Grošelj LD, Millecamps S, Salachas F, Meininger V, de Carvalho M, Pinto S, Mora JS, Rojas-García R, Polak M, Chandran S, Colville S, Swingler R, Morrison KE, Shaw PJ, Hardy J, Orrell RW, Pittman A, Sidle K, Fratta P, Malaspina A, Topp S, Petri S, Abdulla S, Drepper C, Sendtner M, Meyer T, Ophoff RA, Staats KA, Wiedau-Pazos M, Lomen-Hoerth C, Van Deerlin VM, Trojanowski JQ, Elman L, McCluskey L, Basak AN, Tunca C, Hamzeiy H, Parman Y, Meitinger T, Lichtner P, Radivojkov-Blagojevic M, Andres CR, Maurel C, Bensimon G, Landwehrmeyer B, Brice A, Payan CA, Saker-Delye S, Dürr A, Wood NW, Tittmann L, Lieb W, Franke A, Rietschel M, Cichon S, Nöthen MM, Amouyel P, Tzourio C, Dartigues JF, Uitterlinden AG, Rivadeneira F, Estrada K, Hofman A, Curtis C, Blauw HM, van der Kooi AJ, de Visser M, Goris A, Weber M, Shaw CE, Smith BN, Pansarasa O, Cereda C, Del Bo R, Comi GP, D'Alfonso S, Bertolin C, Sorarù G, Mazzini L, Pensato V, Gellera C, Tiloca C, Ratti A, Calvo A, Moglia C, Brunetti M, Arcuti S, Capozzo R, Zecca C, Lunetta C, Penco S, Riva N, Padovani A, Filosto M, Muller B, Stuit RJ; PARALS Registry.; SLALOM Group.; SLAP Registry.; FALS Sequencing Consortium.; SLAGEN Consortium.; NNIPPS Study Group., Blair I, Zhang K, McCann EP, Fifita JA, Nicholson GA, Rowe DB, Pamphlett R, Kiernan MC, Grosskreutz J, Witte OW, Ringer T, Prell T, Stubendorff B, Kurth I, Hübner CA, Leigh PN, Casale F, Chio A, Beghi E, Pupillo E, Tortelli R, Logroscino G, Powell J, Ludolph AC, Weishaupt JH, Robberecht W, Van Damme P, Franke L, Pers TH, Brown RH, Glass JD, Landers JE, Hardiman O, Andersen PM, Corcia P, Vourc'h P, Silani V, Wray NR, Visscher PM, de Bakker PI, van Es MA, Pasterkamp RJ, Lewis CM, Breen G, Al-Chalabi A, van den Berg LH, Veldink JH. Genome-wide association analyses identify new risk variants and the genetic architecture of amyotrophic lateral sclerosis. Nat Genet. 2016 Sep;48(9):1043-8. doi: 10.1038/ng.3622. PubMed PMID: 27455348.

Kenna KP, van Doormaal PT, Dekker AM, Ticozzi N, Kenna BJ, Diekstra FP, van Rheenen W, van Eijk KR, Jones AR, Keagle P, Shatunov A, Sproviero W, Smith BN, van Es MA, Topp SD, Kenna A, Miller JW, Fallini C, Tiloca C, McLaughlin RL, Vance C, Troakes C, Colombrita C, Mora G, Calvo A, Verde F, Al-Sarraj S, King A, Calini D, de Belleroche J, Baas F, van der Kooi AJ, de Visser M, Ten Asbroek AL, Sapp PC, McKenna-Yasek D, Polak M, Asress S, Muñoz-Blanco JL, Strom TM, Meitinger T, Morrison KE; SLAGEN Consortium., Lauria G, Williams KL, Leigh PN, Nicholson GA, Blair IP, Leblond CS, Dion PA, Rouleau GA, Pall H, Shaw PJ, Turner MR, Talbot K, Taroni F, Boylan KB, Van Blitterswijk M, Rademakers R, Esteban-Pérez J, García-Redondo A, Van Damme P, Robberecht W, Chio A, Gellera C, Drepper C, Sendtner M, Ratti A, Glass JD, Mora JS, Basak NA, Hardiman O, Ludolph AC, Andersen PM, Weishaupt JH, Brown RH Jr, Al-Chalabi A, Silani V, Shaw CE, van den Berg LH, Veldink JH, Landers JE. Collaborators: D'Alfonso S, Mazzini L, Comi GP, Del Bo R, Ceroni M, Gagliardi S, Querin G, Bertolin C, Pensato V, Castellotti B, Corti S, Cereda C, Corrado L, Sorarù G. NEK1 variants confer susceptibility to amyotrophic lateral sclerosis. Nat Genet. 2016 Sep;48(9):1037-42. doi: 10.1038/ng.3626. PubMed PMID: 27455347.

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Savarese M, Di Fruscio G, Torella A, Fiorillo C, Magri F, Fanin M, Ruggiero L, Ricci G, Astrea G, Passamano L, Ruggieri A, Ronchi D, Tasca G, D'Amico A, Janssens S, Farina O, Mutarelli M, Marwah VS, Garofalo A, Giugliano T, Sanpaolo S, Del Vecchio Blanco F, Esposito G, Piluso G, D'Ambrosio P, Petillo R, Musumeci O, Rodolico C, Messina S, Evilä A, Hackman P, Filosto M, Di Iorio G, Siciliano G, Mora M, Maggi L, Minetti C, Sacconi S, Santoro L, Claes K, Vercelli L, Mongini T, Ricci E, Gualandi F, Tupler R, De Bleecker J, Udd B, Toscano A, Moggio M, Pegoraro E, Bertini E, Mercuri E, Angelini C, Santorelli FM, Politano L, Bruno C, Comi GP, Nigro V. The genetic basis of undiagnosed muscular dystrophies and myopathies: Results from 504 patients. Neurology. 2016 Jul 5;87(1):71-6. doi: 10.1212/WNL.0000000000002800. PubMed PMID: 27281536; PubMed Central PMCID: PMC4932234.

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Bersano A, Markus HS, Quaglini S, Arbustini E, Lanfranconi S, Micieli G, Boncoraglio GB, Taroni F, Gellera C, Baratta S, Penco S, Mosca L, Grasso M, Carrera P, Ferrari M, Cereda C, Grieco G, Corti S, Ronchi D, Bassi MT, Obici L, Parati EA, Pezzini A, De Lodovici ML, Verrengia EP, Bono G, Mazucchelli F, Zarcone D, Calloni MV, Perrone P, Bordo BM, Colombo A, Padovani A, Cavallini A, Beretta S, Ferrarese C, Motto C, Agostoni E, Molini G, Sasanelli F, Corato M, Marcheselli S, Sessa M, Comi G, Checcarelli N, Guidotti M, Uccellini D, Capitani E, Tancredi L, Arnaboldi M, Incorvaia B, Tadeo CS, Fusi L, Grampa G, Merlini G, Trobia N, Comi GP, Braga M, Vitali P, Baron P, Grond-Ginsbach C, Candelise L; Lombardia GENS Group*.. Clinical Pregenetic Screening for Stroke Monogenic Diseases: Results From Lombardia GENS Registry. Stroke. 2016 Jul;47(7):1702-9. doi: 10.1161/STROKEAHA.115.012281. PubMed PMID: 27245348.

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Mazzone ES, Coratti G, Sormani MP, Messina S, Pane M, D'Amico A, Colia G, Fanelli L, Berardinelli A, Gardani A, Lanzillotta V, D'Ambrosio P, Petillo R, Cavallaro F, Frosini S, Bello L, Bonfiglio S, De Sanctis R, Rolle E, Forcina N, Magri F, Vita G, Palermo C, Donati MA, Procopio E, Arnoldi MT, Baranello G, Mongini T, Pini A, Battini R, Pegoraro E, Torrente Y, Previtali SC, Bruno C, Politano L, Comi GP, D'Angelo MG, Bertini E, Mercuri E. Timed Rise from Floor as a Predictor of Disease Progression in Duchenne Muscular Dystrophy: An Observational Study. PLoS One. 2016 Mar 16;11(3):e0151445. doi: 10.1371/journal.pone.0151445. PubMed PMID: 26982196; PubMed Central PMCID: PMC4794120.

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Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ulzi G, Ramirez A, Rizzuti M, Bordoni A, Bucchia M, Gatti S, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Morpholino-mediated SOD1 reduction ameliorates an amyotrophic lateral sclerosis disease phenotype. Sci Rep. 2016 Feb 16;6:21301. doi: 10.1038/srep21301. PubMed PMID: 26878886; PubMed Central PMCID: PMC4754711.

Mendell JR, Goemans N, Lowes LP, Alfano LN, Berry K, Shao J, Kaye EM, Mercuri E; Eteplirsen Study Group and Telethon Foundation DMD Italian Network. Collaborators: Pane M, Mazzone E, Messina S, Vita GL, D Amico A, Bertini, Berardinelli A, Torrente Y, Magri F, Comi GP, Baranello G, Mongini T, Pini A, Battini R, Pegoraro E, Bruno C, Politano L, Previtali S, Hamid HA, Byrne BJ, Connolly AM, Dracker RA, Frank LM, Heydemann PT, O'Brien KC, Sparks SE, Specht LA, Rodino-Klapac L, Sahenk Z, Al-Zaidy S, Cripe LH, Lewis S Longitudinal effect of eteplirsen versus historical control on ambulation in Duchenne muscular dystrophy. Ann Neurol. 2016 Feb;79(2):257-71. doi: 10.1002/ana.24555. PubMed PMID: 26573217; PubMed Central PMCID: PMC5064753.

Pichiecchio A, Berardinelli A, Moggio M, Rossi M, Balottin U, Comi GP, Bastianello S. Asymptomatic Pompe disease: Can muscle magnetic resonance imaging facilitate diagnosis? Muscle Nerve. 2016 Feb;53(2):326-7. doi: 10.1002/mus.24936. PubMed PMID: 26474166.

Desaphy JF, Carbonara R, D'Amico A, Modoni A, Roussel J, Imbrici P, Pagliarani S, Lucchiari S, Lo Monaco M, Conte Camerino D. Translational approach to address therapy in myotonia permanens due to a new SCN4A mutation. Neurology. 2016; 86(22):2100-8.

Musumeci O, la Marca G, Spada M, Mondello S, Danesino C, Comi GP, Pegoraro E, Antonini G, Marrosu G, Liguori R, Morandi L, Moggio M, Massa R, Ravaglia S, Di Muzio

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A, Filosto M, Tonin P, Di Iorio G, Servidei S, Siciliano G, Angelini C, Mongini T, Toscano A; Italian GSD II group.. LOPED study: looking for an early diagnosis in a late-onset Pompe disease high-risk population. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2016 Jan;87(1):5-11. doi: 10.1136/jnnp-2014-310164. PubMed PMID: 25783438.

Abstracts presentati a Congressi Internazionali

Bucchia M., Nizzardo M., Ramirez A., Rizzo F., Rizzuti M., Rinchetti P., Ulzi G., Bordoni A., Bresolin N., Comi G.P., Corti S. Morpholino antisense oligomers as a therapeutic approach for Amyotrophic Lateral Sclerosis. The 27th International Symposium on ALS/MND, Dublin, Ireland, 2016.

M. Nizzardo, M. Bucchia, A. Ramirez, F. Rizzo, M. Rizzuti, P. Rinchetti, G. Ulzi, A. Bordoni, N. Bresolin, G.P. Comi, S. Corti. Antisense oligonucleotides-based strategy as a therapy for the development of genetic Motor Neuron Diseases. The Society for Neuroscience 2016 Annual Meeting, San Diego, USA, 2016.

Rizzo F, Ronchi R, Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Stuppia G., Del Bo R, Piga D, Bresolin N, Comi GP, Corti. Selective mitochondrial depletion and enhanced mitophagy in human Charcot-Marie-Tooth 2A motor neurons. The Society for Neuroscience 2016 Annual Meeting, San Diego, USA, 2016.

Rizzo F, Ramirez A, Ronchi R, Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Bresolin N, Comi GP, Corti S Functional analysis and genome-wide RNA-seq of human motor neurons implicate selective mitochondrial depletion, resistance to apoptosis and increased mitophagy in Charcot-Marie-Tooth 2a. 6th international charcot-marie-tooth and related neuropathy consortium (CMTR) meeting. Venezia, Settembre 2016.

Ronchi D, Rizzo F, Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Stuppia G, Del Bo R, Piga D, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Selective mitochondrial depletion, apoptosis resistance, and increased mitophagy in human Charcot-Marie-Tooth 2A motor neurons. Mitochondrial medicine: developing new treatments for mitochondrial disease, Hinxton, Cambridge, 2016.

Bucchia M, Ramirez A, Rizzo F, Rizzuti M, Rinchetti P, Ulzi G, Bassani G, Bordoni A, Bresolin N, Comi GP, Corti S, Nizzardo M. Antisense oligonucleotides approach for the development of Amyotrophic Lateral Sclerosis therapy, ENCALS meeting 2016.

Nizzardo M, Rizzo F, Ulzi G, Comley L, Allodi I, Nichterwitz S, Bresolin N, Comi GP, Hedlund E, and Corti S, Oculomotor restricted protein SYT13 protects motor neuron from selective death in ALS and SMA, ENCALS meeting 2016.

Corti S., Rizzuti M., Ramirez A., Rizzo F., Rinchetti P., Bucchia M., Bresolin N., Comi GP, Nizzardo M. Development of peptide-conjugated morpholino oligomers for SMA therapy.

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Cure SMA 16-18, June, Anheim, 2016.

Faravelli I, Simone C., Rizzo F., Ulzi G., Ramirez A., Bucchia M, Bordoni A., Bresolin N., Comi GP, Corti S., Nizzardo M. Targeting SOD1 with Morpholino for Amyotrophic Lateral Sclerosis treatment. 2nd European Academy of Neurology Congress, Copenhagen, Denmark, May 28-31 2016

Abstracts presentati a Congressi Nazionali

Rizzuti M., Filosa G., Nizzardo M., Rinchetti P., Dioni L., Loffreda A., Calandriello L., Comi G.P., Barabino S., Corti S. ALS molecular therapy exploiting integrated small RNAs analysis of patient-derived iPSCs. 6th Annual AriSLA Conference, Milan, Italy. 2016.

Ramirez A., Rizzuti M., Rizzo F., Rinchetti P., Bucchia M., Giulia Bassani., Bresolin N., Comi G.P., Corti S., Nizzardo M. Peptide-conjugated morpholino oligomers for treatment of spinal muscular atrophy. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Lecce, Italy, 2016.

Rizzuti M., Nizzardo M., Filosa G., Rinchetti P., Calandriello L., Dioni L., Bresolin N., Comi G.P., Barabino S., Corti S. ALS molecular therapy exploiting integrated small RNAs analysis of patient-derived iPSCs. INGM POLICLINICO 3rd Research Day, 2016, Milan, Italy.

Rizzo F, Ramirez A, Ronchi R, Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Del Bo R, Piga D, Bresolin N, Comi GP, Corti S. iPSC-derived motor neurons from CMT2A patients showed selective mitochondrial depletion, resistance to apoptosis and increased mitophagy. INGM – POLICLINICO 3rd Research Day, 2016, Milan, Italy.

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LABORATORIO CELLULE STAMINALI NEURALI

• Responsabile: • Prof.ssa Stefania Corti

• Medici: • Dott.ssa Irene Favarelli

• Biologi: • Dott.ssa Sabrina Salani • Dott.ssa Federica Rizzo • Dott.ssa Monica Bucchia • Dott.ssa Valeria Parente

• Biotecnologi: • Dott.ssa Monica Nizzardo • Dott.ssa Agnese Ramirez • Dott.ssa Mafalda Rizzuti • Dott.ssa Paola Rinchetti • Dott.ssa Michela Taiana • Dott.ssa Valentina Melzi

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L’attività di ricerca del Laboratorio di Cellule Staminali Neurali è concentrata sullo sviluppo di strategie terapeutiche cellulari e molecolari per patologie neurodegenerative tra cui malattie del motoneurone ad esordio infantile – Atrofia Muscolare Spinale (SMA) e Atrofia Muscolare Spinale con Distress Respiratorio (SMARD1) – o adulto come la Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) e neuropatie ereditarie come la Malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A (CMT2A). La riprogrammazione di cellule somatiche adulte in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) offre la possibilità di ottenere cellule paziente specifiche, utili come modello in vitro per lo studio dei meccanismi patogenetici e come sorgente cellulare per strategie di tipo cellulo-mediato. Il trapianto di cellule staminali può rappresentare un possibile approccio terapeutico per le malattie neurodegenerative ed in particolare per le malattie del motoneurone. Nel nostro laboratorio sono inoltre oggetto di studio strategie di terapia genica con vettori adeno-associati (AAV) o di terapia molecolare con oligonucleotidi in particolare con chimica morfolino.

Sono qui presentati in sintesi i risultati ottenuti dalle nostre ricerche nel 2016.

Le cellule staminali neurali LewisX+, CXCR4+, β1-integrina+ derivate dalle iPSC migliorano il fenotipo della Sclerosi Laterale Amiotrofica preservando i motoneuroni e le giunzioni neuromuscolari in modelli umani e murini (Nizzardo et al., 2016) La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia fatale incurabile caratterizzata dalla progressiva degenerazione dei motoneuroni che porta a paralisi muscolare. Nella fase iniziale della malattia, la perdita motoneuronale e la conseguente denervazione muscolare sono compensate dalla crescita di nuovi collaterali assonali dai motoneuroni rimanenti, tuttavia, a lungo termine, questo meccanismo è insufficiente. In questo lavoro abbiamo dimostrato che le cellule staminali neurali derivate da cellule pluripotenti indotte, in particolare la sottopopolazione positiva per LewisX-CXCR4-β1-integrina, aumentano la sopravvivenza neuronale e la crescita assonale di motoneuroni di pazienti SLA in co-coltura con astrociti SLA tossici, agendo sia sulle caratteristiche autonome e non autonome della patogenesi della malattia. Il trapianto della frazione selezionata di cellule staminali neurali nel topo SLA transgenico SOD1G93A protegge i motoneuroni in vivo, promuovendone l’ abilità di mantenere l’integrità delle giunzioni neuromuscolari, inducendo nuovo sprouting assonale e riducendo la macro e la microgliosi. Questi effetti portano a un significativo aumento della sopravvivenza ed a un miglioramento nel fenotipo neuromuscolare nei topi SOD1G93A trapiantati. Questi risultati suggeriscono che un’effettiva protezione dell’innervazione motoneuronale può essere ottenuta dalla modulazione di diversi pathway cellulari e molecolari disregolati, sia nei motoneuroni che nelle cellule gliali. Questi pathway devono essere considerati nel disegno di strategie terapeutiche per i pazienti SLA.

- Nizzardo M, Bucchia M, Ramirez A, Trombetta E, Bresolin N, Comi GP, Corti S. iPSC-derived LewisX+CXCR4+β1-integrin+ neural stem cells improve the amyotrophic lateral sclerosis phenotype by preserving motor neurons and muscle innervation in human and rodent models. Hum Mol Genet. 2016 Aug 1;25(15):3152-3163. PubMed PMID: 27270413.

La riduzione della SOD1 mediata da oligonucleotidi con chimica morfolino migliora il fenotipo della Sclerosi Laterale Amiotrofica (Nizzardo et al., 2016) La neurotossicità dovuta all’accumulo di proteine mutate potrebbe essere coinvolta nella patogenesi nelle malattie neurodegenerative. Mutazioni nella superossido dismutasi 1 (SOD1) sono associate alla sclerosi laterale amiotrofica di tipo familiare (fSLA); queste mutazioni danno luogo a morte progressiva dei motoneuroni attraverso una o più tossicità acquisite. Inoltre, la SOD1 non è solo responsabile della SLA familiare, ma può anche giocare un ruolo

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significativo nella SLA sporadica; quindi SOD1 rappresenta un promettente target terapeutico. In questo studio, abbiamo riportato un rallentamento della progressione della malattia, un miglioramento della funzionalità neuromuscolare ed un aumento della sopravvivenza in un modello in vivo di SLA dopo il trattamento con oligonucleotidi di tipo Morfolino (MO) disegnati in modo tale da ridurre la sintesi della SOD1 umana. Le analisi neuropatologiche hanno dimostrato un aumento del numero dei motoneuroni e del numero degli assoni ed una sostanziale riduzione dell’astrogliosi e della microgliosi. Per testare questa strategia in un modello umano, abbiamo trattato con MO motoneuroni derivanti da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) umane con mutazioni nella SOD1; queste cellule hanno mostrato un aumento della sopravvivenza ed una ridotta espressione dei marcatori apoptotici. I nostri dati dimostrano l’efficacia della terapia mediata dal MO in modelli murini ed umani di SLA, ponendo le basi per i trials clinici umani.

- Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ulzi G, Ramirez A, Rizzuti M, Bordoni A, Bucchia M, Gatti S, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Morpholino-mediated SOD1 reduction ameliorates an amyotrophic lateral sclerosis disease phenotype. Sci Rep. 2016 Feb 16;6:21301. doi: 10.1038/srep21301. PubMed PMID: 26878886; PubMed Central PMCID: PMC4754711.

La vulnerabilità differenziale dei neuroni identifi ca IGF-2 come un fattore protettivo nella SLA (Allodi et al., 2016) La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è caratterizzata dalla perdita di motoneuroni somatici che porta ad atrofia muscolare e paralisi. Tuttavia i motoneuroni del nucleo oculomotore che controllano i movimenti dell’occhio, per qualche meccanismo non ancora ben identificato, sono risparmiati dalla malattia. Abbiamo osservato che l’insulin-like growth factor 2 (IGF-2) viene espresso in particolar modo nei neuroni oculomotori nella SLA e ciò suggerisce un ruolo di IGF-2 nella loro resistenza in questa patologia. Abbiamo inoltre osservato che il recettore di IGF-1 (IGF-1R) che media l’induzione delle vie della sopravivenza a seguito del legame con IGF, è espresso ad alti livelli nei neuroni oculomotori e sulla placca neuromuscolare extraoculare. Abbiamo valutato che il trattamento con IGF-2 induce la fosforilazione di Akt, la fosforilazione di GSK3β e l’incremento dei livelli di β-catenina, proteggendo i motoneuroni dei pazienti ALS. IGF-2 inoltre preserva i motoneuroni derivati dai pazienti con atrofia muscolare spinale (SMA) dalla degenerazione. In fine, la somministrazione virus-mediata di IGF2 (AAV9::IGF-2) nei muscoli di topi SLA SOD1G93A estende la sopravvivenza del 10%, preserva i motoneuroni e induce la rigenerazione degli assoni motori. Questo studio dimostra come il profilo di espressione specifico dei neuroni oculomotori possa essere utilizzato per identificare geni candidati in grado di proteggere dalla degenerazione i motoneuroni vulnerabili.

-Allodi I, Comley L, Nichterwitz S, Nizzardo M, Simone C, Benitez JA, Cao M, Corti S, Hedlund E. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Sci Rep. 2016 May 16;6:25960. doi: 10.1038/srep25960. PubMed PMID: 27180807; PubMed Central PMCID: PMC4867585.

Selettiva deplezione mitocondriale, resistenza all’apoptosi e aumento della mitofagia in motoneuroni umani derivati da pazienti con la malattia di Charcot-Marie-Tooth 2A (Rizzo F et al., 2016) La malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) causata da mutazioni nel gene della mitofusina 2 (CMT2A2), è una neuropatia periferica caratterizzata da progressiva debolezza muscolare, associata ad atrofia, perdita di sensibilità e difficoltà motorie prevalentemente a livello artuale distale. I fenotipi descritti mostrano una notevole diversità per gravità e manifestazioni cliniche, ma nella maggior parte dei casi presentano un coinvolgimento sensitivo-motorio di

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tipo assonale (Schroder JM et al., 2001; Chung KW et al., 2006), la cui severità è tanto maggiore quanto più precoce è l’esordio (Lawson VH et al., 2005; Del Bo et la. 2006; Cho HJ et al., 2007). Nella maggior parte dei casi la modalità di trasmissione è autosomica dominante, sono frequenti le mutazioni de novo e rare le mutazioni autosomiche recessive.

Sono state identificate numerose mutazioni nel gene della mitofusina 2 (MFN2) come responsabili della CMT2A, a partire dalla scoperta del gene (Zuchner S et al., 2004). Il gene MFN2 codifica per la mitofusina 2, una proteina ubiquitaria localizzata nella membrana mitocondriale esterna coinvolta nella fusione mitocondriale e nella interazione fra i mitocondri e il reticolo endoplasmico. Non è attualmente definito come mutazioni a carico di questo gene siano alla base della patogenesi della CMT2A. La possibilità di generare, a partire da fibroblasti cutanei di soggetti affetti, cellule staminali pluripotenti indotte e da queste determinare il differenziamento in cellule specificatamente affette dalla malattia, quali i motoneuroni spinali, è una opportunità unica per la comprensione dei meccanismi patogenetici in un modello umano.

Nello studio pubblicato su Human Molecular Genetics, abbiamo generato motoneuroni (MN) da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ottenute da pazienti CMT2A.

Questi motoneuroni hanno mostrato una riduzione globale del contenuto mitocondriale ed un alterato posizionamento mitocondriale all’interno della cellula, senza differenze significative in termini di sopravvivenza e allungamento assonale. Lo studio molecolare approfondito, condotto tramite valutazione del profilo di espressione ed analisi proteica di componenti chiave del programma apoptotico, ha condotto all’individuazione di una maggiore resistenza all’apotosi caspasi-mediata dei motoneuroni mutati rispetto ai controlli. Lo studio della biogenesi mitocondriale e della regolazione dell’autofagia ha dimostrato un aumento del flusso autofagico in CMT2A-MNs, associato ad una aumentata espressione di PINK1, PARK2, BNIP3 e una variante di splicing di BECN1.

Considerati nel loro insieme, questi dati suggeriscono che la riduzione dei mitocondri nei motoneuroni che esprimono la forma mutata di MFN2 non sia il risultato di una ridotta produzione di mitocondri, ma più probabilmente la conseguenza di una maggiore mitofagia, la forma specifica di autofagia di questo organello. Questi meccanismi rappresentano possibili nuovi bersagli terapeutici molecolari per lo sviluppo di una cura efficace per questa malattia.

-Rizzo F, Ronchi D, Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Stuppia G, Del Bo R, Piga D, Fato R, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Selective mitochondrial depletion, apoptosis resistance, and increased mitophagy in human Charcot-Marie-Tooth 2A motor neurons. Hum Mol Genet. 2016

L’analisi proteomica e di RNA-Seq condotta sui motoneuroni umani mostra una selettiva alterazione del citoscheletro nella malattia Brown–Vialetto–Van Laere che viene parzialmente recuperata grazie al trattamento con riboflavina (Rizzo et al. Manoscritto sottomesso) La riboflavina (o vitamina B2) è essenziale in numerose reazioni di ossidoriduzione cellulare, ma non è sintetizzata dalle cellule di mammifero. L’assorbimento di riboflavina avviene attraverso i trasportatori umani RFVT1 e RFVT3 nell’intestino e RFVT2 nel cervello. Mutazioni in questi geni sono causativi della Brown–Vialetto–Van Laere (BVVL), sindrome neurodegenerativa infantile, caratterizzata da una selettiva degenerazione dei motoneuroni ponto-bulbari (MN). Ad oggi, non si conosce ancora quale sia la diretta relazione tra le mutazioni nei geni RFVT e la selettiva degenerazione delle cellule neuronali. In questo studio, abbiamo differenziato motoneuroni da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da pazienti BVVL come modello in vitro della malattia. I motoneuroni derivati da iPSC-BVVL mostrano una riduzione netta della lunghezza assonale, parzialmente migliorata con supplementazione di riboflavina. I dati di RNA sequence e gli studi proteici hanno mostrato

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alterazioni nelle componenti chiave delle strutture del citoscheletro e in particolare del neurofilamento. Inoltre, mentre alcuni pathway mitocondriali risultano alterati dalle analisi di RNA sequence, non abbiamo osservato disregolazioni della funzionalità mitocondriale. Lo studio del pathway autofagico ha dimostrato una riduzione del flusso autofagico nei motoneuroni dei pazienti che è stato associato ad una ridotta espressione di Parkina e BNIP3, proteine che vengono reclutate sui mitocondri prima della loro distruzione. Queste alterazioni vengono revertite a seguito del trattamento con riboflavina. Questo studio ha contribuito ad evidenziare alcuni aspetti del meccanismo patogenetico di questa malattia, suggerendo la necessità di sviluppare nuove strategie molecolari complementari al trattamento con riboflavina per un terapia risolutiva.

Federica Rizzo, Agnese Ramirez, Claudia Compagnucci, Sabrina Salani, Valentina Melzi, Andreina Bordoni, Francesco Fortunato, Nereo Bresolin, Giacomo P. Comi, Enrico Bertini, Monica Nizzardo and Stefania Corti. Genome-wide RNA-seq and proteomic analysis of human motor neurons indicates selective cytoskeletal perturbation in Brown–Vialetto–Van Laere disease that is partially rescued by riboflavin treatment. Submitted to Scientific Report.

La proteina Sinaptotagmina 13 protegge i motoneuroni dalla degenerazione nella SMA (Nizzardo et al., articolo in sottomissione) I meccanismi responsabili della degenerazione selettiva di alcuni sottotipi motoneuronali nelle malattie del motoneurone rimangono ampiamente sconosciuti. Le differenze di espressione dei neuroni oculomotori (OMN), sottopopolazione motoneuronale resistente alla degenerazione in queste malattie, e delle sottopopolazioni vulnerabili quali i motoneuroni (MN) spinali e del tronco encefalico, possono fornire indicazioni per spiegare tale vulnerabilità differenziale. In questo lavoro abbiamo osservato che gli OMN esprimono preferenzialmente la proteina sinaptotagmina13 (SYT13) rispetto ai MN spinali. Inoltre abbiamo dimostrato che la somministrazione di SYT13 mediante AAV9 nei topi SMA ne migliora il fenotipo patologico, ritardandone la denervazione muscolare e prolungandone la sopravvivenza. Queste osservazioni suggeriscono un ruolo della SYT13 come modificatore nella patologia della SMA e come possibile bersaglio terapeutico per le malattie del motoneurone. In conclusione il nostro studio conferma la possibilità di utilizzare tecnologie basate su AAV come strategia terapeutica efficace per il trattamento delle malattie del motoneurone. In particolare, i nostri risultati pongono le basi per traslare in clinica tale strategia terapeutica per il trattamento della SMARD1 e di altre malattie del motoneurone.

- Nizzardo M., Rizzo F., Taiana M., Allodi I., Aguila Benitez J., Nijssen J., Ulzi G., Melzi V., Del Bo R., Bresolin N., Comi GP, Hedlund

E. and Corti S. Synaptotagmin 13 protects

motor neurons from degeneration in ALS and SMA. Submitted to Nature Neuroscience.

L’atrofia muscolare spinale è una malattia che coinvolge solo i motoneuroni? Patogenesi e implicazioni terapeutiche (Simone et al. 2016) L’atrofia muscolare spinale (SMA) è una malattia neurologica genetica che causa mortalità infantile; attualmente non ci sono terapie efficaci disponibili. La SMA è dovuta a mutazioni in omozigosi e/o delezioni nel gene Survival Motor Neuron 1 (SMN1) con conseguente riduzione della proteina SMN che porta alla morte dei motoneuroni. Tuttavia si ha una crescente evidenza che, oltre ai motoneuroni, ci siano altri tipi cellulari coinvolti nella SMA. In questo studio abbiamo discusso le evidenze in merito al coinvolgimento di cellule non motoneuronali, localizzate sia dentro che fuori al sistema nervoso centrale, nell’esordio della malattia e nella sua progressione. Questo contributo di cellule non motoneuronali nella patogenesi della malattia ha importanti implicazioni terapeutiche: infatti, anche se il recupero di SMN è necessario nei motoneuroni, è stato dimostrato che miglioramenti ottimali nel

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fenotipo dei modelli animali di SMA richiedono una correzione di SMN anche in altri tipi cellulari. Sarà cruciale prendere in considerazione quanto osservato prima della traslazione clinica dei nuovi approcci terapeutici attualmente in sviluppo.

- Simone C, Ramirez A, Bucchia M, Rinchetti P, Rideout H, Papadimitriou D, Re DB, Corti S. Is spinal muscular atrophy a disease of the motor neurons only: pathogenesis and therapeutic implications? Cell Mol Life Sci. 2016 Mar;73(5):1003-20. doi: 10.1007/s00018-015-2106-9.

Development of Therapeutics for C9ORF72 ALS/FTD-Related Disorders (Cipolat Mis et al., 2016) L’identificazione dell’espansione dell’exanucleotide GGGGGCC (G4C2) nella regione non codificante del gene C9ORF72 come causa genetica più frequente sia della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) che della demenza frontotemporale (DFT) ha aperto la strada ad una miglior conoscenza per il trattamento di queste malattie, che rimangono incurabili. Recenti studi suggeriscono che l’RNA dell’espansione può acquisire nuove funzioni neurotossiche benchè sia stata ipotizzata anche un’aploinsufficienza. In questo studio, riassumiamo i recenti sviluppi riguardanti gli approcci terapeutici che hanno come bersaglio specifico l’espansione patologica di C9ORF72 nell’ambito della SLA e di altre malattie neurodegenerative. Tre sono gli approcci rilevanti: (1) l’utilizzo di oligonucleotidi antisenso/ RNA interference; (2) l’utilizzo di piccole molecole che contrastino direttamente l’effetto tossico esercitato dall’RNA derivante dalla trascrizione ripetuta (foci), dalla traduzione dei dipeptide proteici ripetuti (DPRs) derivanti dalla sequenza ripetuta o dal sequestro da parte dell’espansione C9ORF72 delle proteine che legano l’RNA; (3) la terapia genica, non solo per silenziare la tossicità dell’RNA/proteina, ma anche per il recupero dell’aploinsufficienza causata dalla riduzione della trascrizione della regione codificante C9ORF72 o dalla scarsa disponibilità delle proteine leganti l’RNA, le quali sono sequestrate all’interno dei foci. Infine, con la prospettiva di una terapia applicabile in clinica, descriveremo i progressi più promettenti che sono stati ad oggi raggiunti nel settore.

-Mis MS, Brajkovic S, Tafuri F, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Development of Therapeutics for C9ORF72 ALS/FTD-Related Disorders. Mol Neurobiol. 2016 Jun 28.

Progressi sperimentali verso la rigenerazione neuronale: da cellule staminali indotte fino alla riprogrammazione diretta in vivo (Dametti et al., 2016)

La perdita neuronale è una caratteristica comune di molte malattie neurologiche che mancano ancora di trattamenti efficaci e gravano sulle vite degli individui affetti. La scoperta di cellule staminali in grado di autorinnovarsi nel sistema nervoso centrale (SNC) ha portato alla possibilità di sfruttare la plasticità del SNC come strategia potenziale per lo sviluppo di terapie rigenerative in presenza di danno tissutale. Il ruolo delle cellule progenitrici neurali sembra essere cruciale, ma insufficiente, nei processi riparatori dopo il danno. Inoltre, i meccanismi che regolano questi eventi sono ancora ampiamente sconosciuti. Gli approcci terapeutici basati sulle cellule staminali si sono primariamente focalizzati sull’ uso sia di cellule staminali pluripotenti indotte, sia sull’uso di cellule staminali neurali come fonte per il trapianto cellulare. Recentemente, la riprogrammazione diretta in vivo di cellule endogene del SNC in cellule staminali multipotenti neurali/progenitrici è stata proposta come strategia alternativa, in quanto potrebbe superare i limiti collegati all’invasività del trapianto di cellule esogene e alcuni dei problemi tecnici della riprogrammazione in vitro (ad es. il tempo richiesto e la limitata quantità disponibile di cellule neurali indotte). Scopo di questo studio è stato quello di mettere in luce i recenti studi sulla riprogrammazione diretta in vivo, focalizzandoci sulla conversione degli astrociti in neuroni o in cellule staminali neurali/progenitrici, in prospettiva di una terapia per le patologie neurologiche.

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- Dametti S, Faravelli I, Ruggieri M, Ramirez A, Nizzardo M, Corti S. Experimental Advances Towards Neural Regeneration from Induced Stem Cells to Direct In Vivo Reprogramming. Mol Neurobiol. 2016 May;53(4):2124-31. doi: 10.1007/s12035-015-9181-7.

L'autofagia nelle malattie del motoneurone: meccanismi patogenetici chiave e bersagli terapeutici (Cipolat Mis et al., 2016) L'autofagia è un processo di degradazione intracellulare lisosoma-dipendente che elimina proteine ed organelli danneggiati dal citoplasma. Un numero crescente di evidenze suggerisce che la disregolazione di questo meccanismo svolga un ruolo fondamentale nell’eziologia e nella progressione delle patologie neurodegenerative, tra cui le malattie del motoneurone. In questo lavoro abbiamo analizzato i risultati più recenti che evidenziano il coinvolgimento dell'autofagia nella patogenesi della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e il ruolo potenziale di questo processo come possibile target terapeutico. L'autofagia permette la rimozione delle proteine che potrebbero generare degli aggregati tossici a livello citoplasmatico, aumentando la sopravvivenza cellulare e modulando l'infiammazione. L'esistenza di diversi farmaci che hanno come target questo meccanismo può facilitare il passaggio dalla ricerca di base alla sperimentazione clinica per la SLA e per le altre malattie del motoneurone.

- Cipolat Mis MS, Brajkovic S, Frattini E, Di Fonzo A, Corti S. Autophagy in motor neuron disease: Key pathogenetic mechanisms and therapeutic targets. Mol Cell Neurosci. 2016 Apr;72:84-90. doi: 10.1016/j.mcn.2016.01.012. PubMed PMID: 26837042.

Metabolismo e disregolazione dei microRNA nella Sclerosi Laterale Amiotrofica (Rinchetti et al., manoscritto in preparazione) I microRNA (miRNA) sono un gruppo di piccole molecole di RNA endogeno non-codificante, coinvolte nella regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica. Alterazioni nei pathway biologici regolati dai miRNA nel sistema nervoso centrale sono state associate a grave danno neuronale e a morte cellulare, che possono determinare lo sviluppo di malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA). La SLA è una patologia neurologica fatale dell’adulto caratterizzata dalla perdita selettiva dei neuroni motori superiori ed inferiori. Nonostante la patogenesi della SLA sia ancora in gran parte sconosciuta, le forme familiari legate a mutazioni nei geni TDP-43 e FUS, così come le forme sporadiche, mostrano alterazioni del metabolismo dell'RNA, inclusa la biogenesi e la maturazione dei miRNA. In questo studio, presentiamo una revisione della letteratura sul metabolismo degli miRNA, le funzioni biologiche ed il ruolo cruciale che essi hanno nella patogenesi della SLA con un'analisi approfondita dei differenti pathway biologici compromessi. Una maggiore comprensione del coinvolgimento dei miRNA nella SLA potrebbe essere utile non solo per chiarire il loro ruolo nell'eziopatogenesi della malattia, ma anche per indagare il loro potenziale come biomarcatori e nuovi bersagli terapeutici.

Paola Rinchetti, Mafalda Rizzuti, Irene Faravelli, Stefania Corti. microRNA metabolisms and dysregolation in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

ELENCO LAVORI SCIENTIFICI 2016

Articoli in esteso

Rizzo F, Ronchi D, Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Stuppia G, Del Bo R, Piga D, Fato R, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Selective mitochondrial depletion, apoptosis resistance, and increased mitophagy in human Charcot-Marie-Tooth 2A motor neurons. Hum Mol Genet. 2016 Aug 9. pii: ddw258.

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Mis MS, Brajkovic S, Tafuri F, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Development of Therapeutics for C9ORF72 ALS/FTD-Related Disorders. Mol Neurobiol. 2016 Jun 28. PubMed PMID: 27349438.

Nizzardo M, Bucchia M, Ramirez A, Trombetta E, Bresolin N, Comi GP, Corti S. iPSC-derived LewisX+CXCR4+β1-integrin+ neural stem cells improve the amyotrophic lateral sclerosis phenotype by preserving motor neurons and muscle innervation in human and rodent models. Hum Mol Genet. 2016 Aug 1;25(15):3152-3163. PubMed PMID: 27270413.

Allodi I, Comley L, Nichterwitz S, Nizzardo M, Simone C, Benitez JA, Cao M, Corti S, Hedlund E. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Sci Rep. 2016 May 16;6:25960. doi: 10.1038/srep25960. PubMed PMID: 27180807; PubMed Central PMCID: PMC4867585. Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ulzi G, Ramirez A, Rizzuti M, Bordoni A, Bucchia M, Gatti S, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Morpholino-mediated SOD1 reduction ameliorates an amyotrophic lateral sclerosis disease phenotype. Sci Rep. 2016 Feb 16;6:21301. doi: 10.1038/srep21301. PubMed PMID: 26878886; PubMed Central PMCID: PMC4754711.

Cipolat Mis MS, Brajkovic S, Frattini E, Di Fonzo A, Corti S. Autophagy in motor neuron disease: Key pathogenetic mechanisms and therapeutic targets. Mol Cell Neurosci. 2016 Apr;72:84-90. doi: 10.1016/j.mcn.2016.01.012. PubMed PMID: 26837042.

Simone C, Ramirez A, Bucchia M, Rinchetti P, Rideout H, Papadimitriou D, Re DB, Corti S. Is spinal muscular atrophy a disease of the motor neurons only: pathogenesis and therapeutic implications? Cell Mol Life Sci. 2016 Mar;73(5):1003-20. doi: 10.1007/s00018-015-2106-9. PubMed PMID: 26681261; PubMed Central PMCID: PMC4756905.

Dametti S, Faravelli I, Ruggieri M, Ramirez A, Nizzardo M, Corti S. Experimental Advances Towards Neural Regeneration from Induced Stem Cells to Direct In Vivo Reprogramming. Mol Neurobiol. 2016 May;53(4):2124-31. doi: 10.1007/s12035-015-9181-7. PubMed PMID: 25934102.

Abstracts presentati a Congressi Internazionali

Bucchia M., Nizzardo M., Ramirez A., Rizzo F., Rizzuti M., Rinchetti P., Ulzi G., Bordoni A., Bresolin N., Comi G.P., Corti S. Morpholino antisense oligomers as a therapeutic approach for Amyotrophic Lateral Sclerosis. The 27th International Symposium on ALS/MND, Dublin, Ireland, 2016.

M. Nizzardo, M. Bucchia, A. Ramirez, F. Rizzo, M. Rizzuti, P. Rinchetti, G. Ulzi, A. Bordoni, N. Bresolin, G.P. Comi, S. Corti. Antisense oligonucleotides-based strategy as a therapy for the development of genetic Motor Neuron Diseases. The Society for Neuroscience 2016 Annual Meeting, San Diego, USA, 2016.

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Rizzo F, Ronchi R, Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Stuppia G., Del Bo R, Piga D, Bresolin N, Comi GP, Corti. Selective mitochondrial depletion and enhanced mitophagy in human Charcot-Marie-Tooth 2A motor neurons. The Society for Neuroscience 2016 Annual Meeting, San Diego, USA, 2016.

Rizzo F, Ramirez A, Ronchi R, Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Bresolin N, Comi GP, Corti S Functional analysis and genome-wide RNA-seq of human motor neurons implicate selective mitochondrial depletion, resistance to apoptosis and increased mitophagy in Charcot-Marie-Tooth 2a. 6th international charcot-marie-tooth and related neuropathy consortium (CMTR) meeting. Venezia, Settembre 2016.

Ronchi D, Rizzo F, Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Stuppia G, Del Bo R, Piga D, Bresolin N, Comi GP, Corti S. Selective mitochondrial depletion, apoptosis resistance, and increased mitophagy in human Charcot-Marie-Tooth 2A motor neurons. Mitochondrial medicine: developing new treatments for mitochondrial disease, Hinxton, Cambridge, 2016.

Bucchia M, Ramirez A, Rizzo F, Rizzuti M, Rinchetti P, Ulzi G, Bassani G, Bordoni A, Bresolin N, Comi GP, Corti S, Nizzardo M. Antisense oligonucleotides approach for the development of Amyotrophic Lateral Sclerosis therapy, ENCALS meeting 2016.

Nizzardo M, Rizzo F, Ulzi G, Comley L, Allodi I, Nichterwitz S, Bresolin N, Comi GP, Hedlund E, and Corti S, Oculomotor restricted protein SYT13 protects motor neuron from selective death in ALS and SMA, ENCALS meeting 2016.

Corti S., Rizzuti M., Ramirez A., Rizzo F., Rinchetti P., Bucchia M., Bresolin N., Comi GP, Nizzardo M. Development of peptide-conjugated morpholino oligomers for SMA therapy. Cure SMA 16-18, June, Anheim, 2016.

A. Loffreda, A. Arosio, M.-D. Ruepp, M. Rizzuti, P. Rinchetti, M. Nizzardo, L. Tremolizzo, C. Lunetta, C. Ferrarese, S. Corti, S. Barabino. MicroRNAs in ALS: from molecular mechanisms to clinical relevance. 21st Annual Meeting of the RNA Society, Lake District, UK. 2016.

Faravelli I, Simone C., Rizzo F., Ulzi G., Ramirez A., Bucchia M, Bordoni A., Bresolin N., Comi GP, Corti S., Nizzardo M. Targeting SOD1 with Morpholino for Amyotrophic Lateral Sclerosis treatment. 2nd European Academy of Neurology Congress, Copenhagen, Denmark, May 28-31 2016

Abstracts presentati a Congressi Nazionali

Rizzuti M., Filosa G., Nizzardo M., Rinchetti P., Dioni L., Loffreda A., Calandriello L., Comi G.P., Barabino S., Corti S. ALS molecular therapy exploiting integrated small RNAs analysis of patient-derived iPSCs. 6th Annual AriSLA Conference, Milan, Italy. 2016.

Ramirez A., Rizzuti M., Rizzo F., Rinchetti P., Bucchia M., Giulia Bassani., Bresolin N., Comi G.P., Corti S., Nizzardo M.

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Peptide-conjugated morpholino oligomers for treatment of spinal muscular atrophy. XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Lecce, Italy, 2016.

Rizzuti M., Nizzardo M., Filosa G., Rinchetti P., Calandriello L., Dioni L., Bresolin N., Comi G.P., Barabino S., Corti S. ALS molecular therapy exploiting integrated small RNAs analysis of patient-derived iPSCs. INGM – POLICLINICO 3rd Research Day, 2016, Milan, Italy.

Rizzo F, Ramirez A, Ronchi R, Salani S, Nizzardo M, Fortunato F, Bordoni A, Del Bo R, Piga D, Bresolin N, Comi GP, Corti S. iPSC-derived motor neurons from CMT2A patients showed selective mitochondrial depletion, resistance to apoptosis and increased mitophagy. INGM – POLICLINICO 3rd Research Day, 2016, Milan, Italy.

Collaborazioni scientifiche in atto con istituti nazionali ed internazionali: 1. “Studio dei meccanismi molecolari non-cell autonomous nelle malattie del motoneurone” e Progetto NO-MND— “Transferring NOn autonomous cell degeneration models” Motor Neuron Center, Columbia University, Prof. S. Przedborski, director of the Center, and Prof. D. Re, New York, N.Y., USA. 2. Progetto NO-MND— “Transferring NOn autonomous cell degeneration models”, Prof. L. Stefanis Biomedical Foundation, Academy of Athens, Grecia. (“No: 612578, NOMND— Transferring Non autonomous cell degeneration models between EU and USA for development of effective therapies for Motor Neuron Diseases (No-MND) Call FP7- 12 PEOPLE-2013-IRSES”). 3. “Studio di nuovi approcci di terapia genica per l’Atrofia Muscolare Spinale (SMA) e l’atrofia muscolare spinale con Distress Respiratorio (SMARD1)”, Prof. Brian K Kaspar, Ph.D, Professore Associato, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital/ The Ohio State University, Center for Gene Therapy, Columbus, Ohio, USA. 4. “Identificazione di molecole con un ruolo neuroprotettivo nelle malattie del motoneurone”, Prof. Eva Hedlund, PhD, Professore Associato di Neurobiologia, Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, Stockholm Sweden 5. “Patogenesi molecolare delle SLA familiare associata a FUS”, Dr. Marc Ruepp and Prof. Müehlemann O, University of Bern. Il programma ha previsto lo scambio di ricercatori tra l’University of Bern e UNIMI. 6. “Studio di oligonucleotidi coniugati con peptidi per lo sviluppo di una strategia terapeutica della SMA”, Prof. H. Moulton Oregon University. 7. “ Ruolo dei trasportatori della riboflavin nelle malattie del motoneurone: Analisi genetiche delle Sindromi Brown Vialetto Van Laere e Fazio Londe e sviluppo di nuove strategie terapeutiche per le malattie del motoneurone” Dr. Enrico Bertini, Laboratorio di Medicina Molecolare, Dipartimento di Neuroscienze, IRCCS Ospedale Bambino Gesu', Roma 13 8. “Correzione dello splicing di SMN medinate Exon Specific U1 snRNA come terapia per l’Atrofia Muscolare Spinale (SMA)”, Dr. Franco Pagani, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB), Trieste 9. “Basi Molecolari della Sclerosi Laterale Amiotrofica” SLAGEN consortium 10. “European ALS population study”, EURALS Consortium 11. “Sviluppo di una strategia terapeutica per mitofusinopatie” in collaborazione con l’Associazione Mitofusina 2 (http://www.progettomitofusina2.com/it/associazione). 12. “Studi elettrofisiologici di motoneuroni derivati da cellule staminali in vitro e in vivo”, Prof. Luca Imeri, Dipartimento di Fisiologia Umana, Università degli Studi di Milano, Milano 13. “Basi molecolari della SMA”, Dr. Uberto Pozzoli, IRCCS E. Medea Bosisio, Parini, Italy

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14. “Sintesi di oligomeri morfolinici con nuova struttura chimica per lo sviluppo di strategie terapeutiche per le malattie del motoneurone“, Prof. ML Gelmi, Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università degli Studi di Milano.

Finanziamenti per progetti di ricerca ottenuti da enti pubblici o privati

1. MIUR, FIRB Futuro in Ricerca 2010-2016 “Development of a stem cell approach for motor neuron diseases”, 2. Fondation Thierry Latran (TLF) 2013-2016 “Identification of oculomotor-restricted genes with motor neuron protective properties for the development of ALS therapeutics” 3. Telethon Grant “Peptide-conjugated Morpholino for treatment of Spinal Muscular Atrophy”, PI, Dott.ssa Nizzardo. 2014-2017 4. Ministery of Health Grant, Bando Giovani Ricercatori, "Spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1): gene therapy as novel therapeutic approach". 2013-2016. Dott.ssa Nizzardo 5. Ministery of Health Grant, 2013-2016 “ROLE OF RIBOFLAVIN TRANSPORTERS IN MOTOR NEURON DISEASES: Genetic analysis of the Brown Vialetto Van Laere and Fazio Londe syndromes and development of potential treatment strategies for motor neuron diseases” 6. Cariplo 2013-2016 “Pathogenetic role of differentially expressed/spliced genes in Spinal Muscular Atrophy” PI Dott.ssa Corti. 7. ALS Association Grant (USA) Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) therapy via minimally invasive transplantation of a LeX+CXCR4+VLA4+ neural stem cell subpopulation derived from induced pluripotent stem cells. 8. 7PQ NO-MND 2014-2018— Transferring NOn autonomous cell degeneration models between EU and USA for development of effective therapies for Motor Neuron Diseases (MND). FP7-PEOPLE- 2013-IRSES (Finanziamento Comunità Europea). 9. ARISLA grant 2014-2017: ALS molecular therapy exploiting integrated small RNAs analysis of patient-derived induced pluripotent stem cells Project Acronym: smallRNALS 10. JPND grant 2014-2017: Elucidation of common transcriptional targets in vulnerable DopAmine, MotorNeuron and frontotemporal Dementia disease PATHwayS (Finanziamento Comunità Europea).

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CENTRO PARKINSON ED ALTRI DISTURBI DEL MOVIMENTO

• Responsabile: • Dr. Alessio Di Fonzo

• Medici: • Dott. Emanuele Frattini • Dott. Edoardo Monfrini • Dr.ssa Giulia Franco • Dr.ssa Linda Borellini • Dr.ssa Ilaria Trezzi • Dr.ssa Elena Abati • Dr.ssa Federica Arienti

• MD/PhD Student • Dr. Giacomo Monzio Compagnoni

• Biotecnologi: • Dott.ssa Valentina Melzi

• Medici e biologi in training: • Gabriele Buongarzone • Giulia Lazzeri • Giacomo Bitetto • Anna Chiara Di Caprio

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Nel corso del 2016 il gruppo di ricerca dedicato alla malattia di Parkinson ed altri disturbi del movimento ha condotto indagini molecolari e biochimiche volte ad indagare l’eziologia e la patogenesi della patologia che affligge i pazienti che afferiscono all’ambulatorio dedicato. Grazie a diverse collaborazioni in ambito nazionale ed internazionale sono state identificate nuove mutazioni genetiche sia in forme giovanili che in forme adulte di malattia di Parkinson che hanno portato a pubblicazioni scientifiche e presentazioni a congressi internazionali (Movement Disorder Meeting, World Parkinson Congress e International Congress on Parkinsonisms and Related Disorders). Oltre agli studi genetici sono stati portati avanti diversi progetti finalizzati all’identificazione di deficit enzimatici, in particolare dell’enzima lisosomiale Glucocerebrosidasi, sia nei linfociti che nei fibroblasti dei pazienti affetti da malattia di Parkinson. L’attività di ricerca clinica si è dedicata nel 2016 alla ricerca di biomarcatori per la malattia di Parkinson e parkinsonismi. Il centro ha partecipato, in collaborazione con l’Unità di Neuroradiologia del Policlinico, il Dipartimento di Bioingegneria del Politecnico di Milano e il Vanderbilt University Medical Center di Nashville US, ad uno studio di Risonanza Magnetica con specifiche sequenze per la Neuromelanina, volte a determinare le differenze di segnale specifiche dei parkinsonismi. La ricerca del 2016 ha portato anche importanti contributi alla comprensione delle cause di altri disturbi del movimento, come le atassie spino cerebellari, di cui abbiamo identificato un nuovo gene responsabile di una forma infantile. Inoltre abbiamo creato una collaborazione internazionale finalizzata allo studio dei neuroni dei pazienti affetti da una forma di atassia spastica di recente identificazione. Infine abbiamo proseguito gli ambiziosi progetti di studio della patogenesi della malattia di Parkinson e dell’Atrofia Multisistemica in modelli cellulari di neuroni, oligodendrociti e organoidi cerebrali generati a partire da cellule staminali pluripotenti indotte di pazienti affetti.

1) Screening genetici nella Atrofia Multisistemica e nelle atassie spinocerebellari. Lo studio dei parkinsonismi atipici parte dalla raccolta di campioni biologici dei pazienti con Atrofia Multisistemica di cui il Policlinico è centro di riferimento. Sono stati raccolti oltre 80 campioni di sangue da cui è stato estratto il DNA per valutare i fattori genetici causativi di Atrofia Multisistemica. Inoltre lo studio di una famiglia con atassia ad esordio adolescenziale ha portato all’identificazione di un nuovo gene implicato in questa forma.

- Mutational analysis of COQ2 in patients with MSA in Italy. Ronchi D, Di Biase E, Franco G, Melzi V, Del Sorbo F, Elia A, Barzaghi C, Garavaglia B, Bergamini C, Fato R, Mora G, Del Bo R, Fortunato F, Borellini L, Trezzi I, Compagnoni GM, Monfrini E, Frattini E, Bonato S, Cogiamanian F, Ardolino G, Priori A, Bresolin N, Corti S, Comi GP, Di Fonzo A. Neurobiol Aging. 2016 Sep;45:213.e1-2. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2016.05.022. PMID: 27394078

- Genetic analysis of eighty-seven multiple system atrophy patients. Franco, G., Ronchi, D., Trezzi, I., Borellini, L., Del Sorbo, F., Garavaglia, B., Di Fonzo A. (2016). Movement Disorders, 31, S197.

- Mutations in endocytic recycling protein Rab11FIP3 are associated with ataxia and intellectual disability Monfrini E, Ronchi D, Di Biase E, Franco G, Melzi V, Bordoni A, Borellini L, Trezzi I, Compagnoni GM, Frattini E, Bonato S, Bresolin N, Corti S, Comi GP, Di Fonzo A. Scientific Reports, submitted

2) Screening genetico e analisi funzionale in pazienti con malattia di Parkinson.

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Le varianti eterozigoti del gene GBA rappresentano il fattore di rischio genetico più frequente della malattia di Parkinson. Abbiamo sequenziato l’intero gene GBA in circa cento pazienti affetti da forme familiari e sporadiche della malattia, identificando mutazioni in circa il 10% degli analizzati. Inoltre partendo da linfociti dei pazienti affetti sono state eseguite analisi biochimiche volte a determinare sia l’attività enzimatica del gene che i livelli di proteina. I risultati sono stati oggetto di relazione a congressi internazionali e sono in fase di submission come lavoro scientifico in collaborazione con altri 5 centri Italiani che hanno eseguito l’analisi genetica e hanno inviato presso il nostro centro i linfociti per le analisi funzionali. Inoltre studi di analisi di linkage e di analisi mutazionali di altri geni sono stati eseguiti e hanno portato a importanti risultati volti ad identificare nuovi geni coinvolti nella malattia di Parkinson.

- LRRK2 and GBA mutation analysis in a cohort of Italian familial and sporadic PD. Trezzi, I., Melzi, V., Franco, G., Borellini, L., Monfrini, E., Bresolin, N., Corti, S., Comi, GP., Di Fonzo, A. (2016). Parkinsonism & Related Disorders, 22, e167.

- Glucocerebrosidase activity in a cohort of Pd patients Trezzi, I., Melzi, V., Franco, G., Borellini, L., Monfrini, E., Bordoni, A, Di Fonzo, A. B. (2016)..European Journal of Neurology, 23, 300.

- Mutation in TMEM230 are rare in autosomal dominant Parkinson’s disease Buongarzone G, Monfrini E, Franco G, Trezzi I, Borellini L, Frattini E, Melzi V, Di Caprio AC, Ronchi D, Monzio Compagnoni G, Cogiamanian F, Ardolino G, Bresolin N, Comi GP, Corti S, Di Fonzo A (2016). Parkinsonism & Related Disorders Accepted

3) Generazione e caratterizzazione di neuroni dopaminergici e midbrain organoids da cellule staminali pluripotenti indotte da pazienti con Atrofia Multisistemica e malattia di Parkinson Lo studio iniziato nel 2015 è proseguito quest’anno portando risultati innovativi. Per quanto riguarda l’MSA, la caratterizzazione dei neuroni ha portato ad identificare una aumentata quantità di alfa-sinucleina, la proteina che si accumula sia negli oligodendrociti che nei neuroni in questa malattia. Per meglio definire l’origine dell’aumento dell’alfa-sinucleina sono state eseguite analisi di RNA che hanno mostrato anche un aumento del trascritto del gene e, in collaborazione con il dipartimento di genetica medica, sono stati condotti anche studi epigenetici sul gene SNCA, che hanno mostrato una riduzione della metilazione del gene e conseguente aumento dell’espressione di alfa-sinucleina. Gli studi sul Parkinson hanno portato invece alla generazione di neuroni da iPSCs di pazienti con diverse forme monogeniche di malattia. In questi casi abbiamo valutato l’attività di alcuni enzimi lisosomiali e identificato una risposta ottimale alla somministrazione di molecole chaperon nel ristabilire i normali livelli di attività di questi enzimi. Infine abbiamo generato un modello innovativo, l’organoide con differenziamento mesencefalico, per meglio studiare la patogenesi della malattia in un tessuto simile a quello dei pazienti. I risultati sono stati presentati a congressi internazionali, nazionali e sono in fase di submission come lavori scientifici originali.

- Generation and characterization of ipsc-derived nigral dopaminergic and pyramidal glutamatergic neurons from patients affected by multiple system atrophy. Compagnoni, M. G., Frattini, E., Salani, S., Fortunato, F., Bresolin, N., Corti, S., Comi GP, Di Fonzo, A. (2016). Movement Disorders, 31, S76.

- Generation and characterization of iPSC-derived cortical pyramidal neurons from patients affected by multiple system atrophy. Compagnoni, G. M., Frattini, E., Salani, S.,

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Fortunato, F., Bresolin, N., Comi, G. P, Corti S., Di Fonzo, A. (2016). Parkinsonism & Related Disorders, 22, e119-e120.

- Pathological features of ipsc-derived midbrain dopaminergic neurons of familial Parkinson's disease. Frattini, E., Compagnoni, G. M., Salani, S., Bresolin, N., Comi, G. P., Corti, S., & Di Fonzo, A. (2016). European Journal of Neurology, 23, 395. - Generation and characterization of midbrain organoids from ipscs of familial Parkinson's disease. Frattini, E., Compagnoni, M. G., Salani, S., Rinchetti, P., Nizzardo, M., Baccarin, M., Brsolin N, Comi GP, Corti S, Di Fonzo, A. (2016). Movement Disorders, 31, S284.

- Generation of human iPSC-derived midbrain organoids as a novel model to dissect pathological features of familial Parkinson’s Disease. Frattini, E., Compagnoni, M. G., Salani, S., Rinchetti, P., Nizzardo, M., Baccarin, M., Brsolin N, Comi GP, Corti S, Di Fonzo, A. (2016). World Parkinson Congress, Portland, USA.

Lavori scientifici

Ronchi D, Di Biase E, Franco G, Melzi V, Del Sorbo F, Elia A, Barzaghi C, Garavaglia B, Bergamini C, Fato R, Mora G, Del Bo R, Fortunato F, Borellini L, Trezzi I, Compagnoni GM, Monfrini E, Frattini E, Bonato S, Cogiamanian F, Ardolino G, Priori A, Bresolin N, Corti S, Comi GP, Di Fonzo A. Mutational analysis of COQ2 in patients with MSA in Italy Neurobiol Aging. 2016 Sep;45:213.e1-2. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2016.05.022. PMID: 27394078

Cipolat Mis MS, Brajkovic S, Frattini E, Di Fonzo A, Corti S. Autophagy in motor neuron disease: Key pathogenetic mechanisms and therapeutic targets. Mol Cell Neurosci. 2016 Apr;72:84-90. doi: 10.1016/j.mcn.2016.01.012. Review. Altri lavori scientifici collaborativi dell’anno 2015 sono qui riportati:

Ferrucci R, Cortese F, Bianchi M, Pittera D, Turrone R, Bocci T, Borroni B, Vergari M, Cogiamanian F, Ardolino G, Di Fonzo A, Padovani A, Priori A. Cerebellar and Motor Cortical Transcranial Stimulation Decrease Levodopa-Induced Dyskinesias in Parkinson's Disease. Cerebellum. 2016 Feb;15(1):43-7. doi: 10.1007/s12311-015-0737-x.

Rango M, Piatti M, Di Fonzo A, Ardolino G, Airaghi L, Biondetti P, and Bresolin N. Abnormal Brain Temperature in early-onset PD Mov Disord. 2016 Mar;31(3):425-6. doi: 10.1002/mds.26548. PMID: 26873586

Abstracts presentati a Congressi Nazionali ed Internazionali

Frattini E, Monzio Compagnoni G, Salani S, Bresolin N, Comi GP, Corti S, Di Fonzo A Pathological features of iPSC-derived midbrain dopaminergic neurons of familial Parkinson’s disease 2nd Congress of the European Academy of Neurology, Copenaghen, Denmark, May 2016

Monzio Compagnoni G, Frattini E, Salani S, Fortunato F, Bresolin N, Corti S, Comi GP, Di Fonzo A Generation and characterization of iPSC-derived nigral dopaminergic and pyramidal glutamatergic neurons from patients affected by Multiple System Atrophy

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20th International Congress of Parkinson’s Disease and Movement Disorders, Berlin, Germany, June 2016

Frattini E, Monzio Compagnoni G, Salani S, Rinchetti P, Nizzardo M, Baccarin M, Bresolin N, Comi GP, Corti SP, Di Fonzo A Generation and characterization of midbrain organoids from iPSCs of familial Parkinson’s disease 20th International Congress of Parkinson’s Disease and Movement Disorders, Berlin, Germany, June 2016 I. Trezzi, V. Melzi, G. Franco, L. Borellini, E. Monfrini, A. Bordoni, N. Bresolin, G.P. Comi, A. Di Fonzo (Milan, Italy) Glucocerebrosidase activity in a cohort of PD patients 20th International Congress of Parkinson’s Disease and Movement Disorders, Berlin, Germany, June 2016

Monzio Compagnoni G, Frattini E, Salani S, Fortunato F, Bordoni A, Ronchi D, Baccarin M, Bresolin N, Corti S, Comi GP, Di Fonzo A Generation and characterization of dopaminergic and glutamatergic neurons from patients affected by Multiple System Atrophy 5th International Congress on Multiple System Atrophy, Salerno, Italy, April 2016

G. Franco, D. Ronchi, I. Trezzi, L. Borellini, F. Del Sorbo, B. Garavaglia, A.E. Elia, G. Ardolino, G. Mora, S. Bonato, N. Bresolin, G.P. Comi, A. Di Fonzo (Milan, Italy) Genetic analysis of eighty-seven multiple system atrophy patients 20th International Congress of Parkinson’s Disease and Movement Disorders, Berlin, Germany, June 2016

L. Borellini, G. Franco, P. Trujillo, P. Summers, A. Di Fonzo, D.O. Claassen, A. Costa (Milan, Italy) Neuromelanin-MRI of substantia nigra subregions in Parkinson’s disease 20th International Congress of Parkinson’s Disease and Movement Disorders, Berlin, Germany, June 2016

Frattini E, Monzio Compagnoni G, Salani S, Rinchetti P, Ronchi D, Aureli M, Nizzardo M, Baccarin M, Bresolin N, Comi GP, Corti S, Di Fonzo A Generation of human iPSC-derived midbrain organoids as a novel model to dissect pathological features of familial Parkinson’s Disease 4th World Parkinson Congress, Portland, Oregon, USA, September 2016

Collaborazioni scientifiche in atto con istituti nazionali ed internazionali: 1. “Studio del ruolo di alpha-synuclein tra membrana mitocondriale esterna e reticolo endoplasmatico in neuroni dopaminergici di pazienti con mutazione del gene SNCA” Cristina Guardia La Guarta, Columbia University, Prof. S. Przedborski, director of the Center, and Prof. D. Re, New York, N.Y., USA. 2. “Biochemical analysis of LRRK2 kinase in human cell lined of Parkinson’s disease”, Hardy Rideout Biomedical Foundation, Academy of Athens, Grecia. 3. “Analisi della sintesi del Coenzima Q10 in fibroblasti e neuroni da iPSCs di pazienti con atrofia multisistemica”, Prof. Catarina Quinzii, PhD, Columbia University, New York, N.Y., USA 4. “Neuromelanin-mri of substantia nigra subregions in Parkinson's disease”, Dr. Daniel Claassen il Vanderbilt University Medical Center, Nashville US.

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5. “Studio dei neuroni corticali da pazienti con atassia spastica con mutazione del gene GBA2”. Professor Kyproula Christodoulou, PhD Senior Scientist / Medical Geneticist, Head of the Neurogenetics Department, The Cyprus Institute of Neurology and Genetics. Medical Genetics Programme Coordinator, Cyprus School of Molecular Medicine 6. “Studio delle vescicole e del traffico vescicolare dei neuroni da iPSC di pazienti con atrofia multi sistemica e malattia di Parkinson”. Lorenza Lazzari, IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico di Milano 7. “Studio dell’attività della Glucocerebrosidasi in neuroni dopaminergici e midbrain organoids di pazienti con Parkinson’s disease”, Dr. Massimo Aureli, Ph.D, Università Degli Studi di Milano, Ospedale san Raffaele, Milano 8. “Studio dei neuroni dopaminergici da cellule staminali pluripotenti indotte da pazienti con malattia di Parkinson” Michela Deleidi, Assistant Professor of Molecular Mechanisms of Neurodegeneration, Department of Neurodegenerative Diseases, University of Tübingen

Finanziamenti per progetti di ricerca ottenuti da enti pubblici o privati

1. Intesa San Paolo Finanziamento per lo studio “Generazione di organoidi cerebrali per lo studio e lo sviluppo di nuove terapie per la malattia di Parkinson” 2. Unicredit Finanziamento per lo “Studio del misfolding di proteine che causano morte neuronale nella malattia di Parkinson”

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UOSD MALATTIE NEURODEGENERATIVE Centro per lo studio, la diagnosi e la terapia dei disturbi cognitivi e della memoria "Unità Valutativa Alzheimer -U.V.A." Centro per lo studio, la diagnosi e la terapia della Sclerosi Multipla • Direttore: Prof. Elio Scarpini Professore Associato di Neurologia • Dott.ssa Daniela Galimberti Dottore di Ricerca Scienze Neurologiche e del Dolore – Tecnico Laureato Università di Milano • Dott.ssa Chiara Fenoglio Dottore di Ricerca Scienze Neurologiche e del Dolore – Assegnista Università di Milano • Dott.ssa Emanuela Oldoni Dottoranda di Ricerca Medicina Molecolare – Università di Milano • Dott.ssa Maria Serpente Dottore di Ricerca in Medicina Molecolare – Borsista OMP • Dott.ssa Sara Cioffi Biologa - Borsista OMP • Dott.ssa Marina Arcaro Biotecnologa-Borsista OMP • Dott.ssa Marianna D’Anca Dottore di Ricerca-Borsista OMP • Dott.ssa Milena De Riz Neurologa Specialista – Dirigente medico OMP - t. indet. • Dott.ssa Anna Pietroboni Neurologa Specialista – Dirigente medico OMP – co.co.co

• Dott. Andrea Arighi Neurologo Specialista - Dirigente medico OMP-t. indet. • Dott. Giorgio Fumagalli Neurologo Specialista – Assegnista • Dott.ssa Laura Ghezzi Medico Specializzando • Dott. Alberto Calvi Medico Specializzando • Dott.ssa Paola Basilico Medico Specializzando • Dott.ssa Marta Scarioni Medico Specializzando • Dott.ssa Tiziana Carandini Medico Specializzando • Dott.ssa Annalisa Colombi Medico Specializzando • Dott. Roberto Vimercati Psicologo – Borsista OMP • Dr.ssa Emanuela Rotondo Psicologa – Dottore di Ricerca - Borsista OMP • Dr.ssa Priscilla Corti Psicologa – Dottore di Ricerca – Borsista OMP • Dott. Matteo Mercurio Psicologo – Dottore di Ricerca – Borsista OMP • Sig.ra Daniela Da Lisca Segretaria – Borsista OMP • Sig. Marco Milianti Segretario – Borsista OMP • Sig.ra Mahin Fardipoor Tecnico Laboratorio Ospedaliero

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1 - ATTIVITÀ CLINICA ED ASSISTENZIALE

Dal punto di vista clinico, il gruppo si è occupato di ricerche cliniche nel campo della Sclerosi Multipla e della malattia di Alzheimer e demenze correlate (demenza Frontotemporale, demenza a corpi di Lewy). I pazienti sono stati seguiti dai componenti del gruppo presso i seguenti Ambulatori Specialistici di “secondo livello”:

1.1. Ambulatorio Malattie Demielinizzanti del Sistema Nervoso Centrale

Nel corso dell’anno 2016 sono giunti all’ambulatorio per le Malattie Demielinizzanti circa 120 nuovi pazienti. Il numero totale di visite nel corso del 2016 è stato di più di 800 in ambulatori dedicati alla Sclerosi Multipla, attivi tutti i giorni sia al mattino che al pomeriggio. È operativo un servizio di “Macro Attività Complessa” (MAC) per consentire ai pazienti di sottoporsi a trattamenti quali la somministrazione di cortisonici ad alto dosaggio e. v. e l’infusione di Immunoglobuline e.v. nonché di effettuare tutte le procedure diagnostiche. Sono stati effettuati circa 200 ricoveri in MAC. Il Servizio è riconosciuto tra i Centri Provinciali autorizzati dalla Regione Lombardia alla dispensazione di: beta-Interferone Ia e Ib, Copaxone (glatiramer acetato), Tysabri (Natalizumab), Gylenia (Fingolimod), Tecfidera (Dimetilfumarato), Aubagio (Teriflunomide), Lemtrada (Alemtuzumab). In particolare, sono al momento registrati in File F per il trattamento circa 250 pazienti.

1.2. Ambulatorio per la Diagnosi e la Terapia dei Disturbi Cognitivi e della Memoria

Nel corso dell’anno sono giunti all’ambulatorio per la Diagnosi e la Terapia dei Disturbi Cognitivi e della Memoria circa 250 nuovi pazienti. Complessivamente sono state eseguite circa 1500 visite, in ambulatori attivi dal lunedì al venerdì, sia mattina che pomeriggio. Sono stati effettuati 200 ricoveri in regime di MAC per accertamenti diagnostici. Dall’ottobre 2000 il Centro è stato riconosciuto da parte della Regione Lombardia come “Unità Valutazione Alzheimer” (U.V.A) ed inserito nel Progetto CRONOS del Ministero della Sanità. Presso tale Centro afferiscono pazienti con sospetto decadimento cognitivo, inviati dal medico di base o dallo specialista, onde essere sottoposti ad un inquadramento diagnostico rivolto alla malattia di Alzheimer e demenze correlate, ai fini dell’inserimento nel progetto CRONOS che prevede l’erogazione gratuita dei nuovi farmaci anticolinesterasici. Nell’ambito del progetto CRONOS risultano al momento registrati per terapia con anticolinesterasici 250 pazienti. Inoltre, 10 pazienti sono registrati in File F per trattamento con memantina (Ebixa). Riguardo gli esami diagnostici per Sclerosi Multipla, malattia di Alzheimer e Degenerazione Lobare Frontotemporale, sono state effettuate le seguenti prestazioni (sia per pazienti degenti che richieste da ospedali esterni):

- esame liquor, IEF per diagnosi di sclerosi multipla: 180

- dosaggio Amiloide, Tau totale e fosforilata nel liquor per diagnosi Alzheimer: 250

- progranulina plasmatica: 150

- estrazione DNA, mutazioni MAPT, progranulina, PS1 e 2, APP: 100.

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2. SPERIMENTAZIONI CLINICHE (multicentriche, randomizzate) Long term, prospective, non-interventional,multinational, parallel-cohort study monitoring safety in patients with MS recently initiated with fingolimod once daily or treated with another approved disease-modifying therapy, Novartis, prot. CFTY720D2406 Transition: A two-year observational study to evaluate the safety profile of fingolimod in patients with MS who switch from natalizumab to fingolimod, Novartis, prot. CFTY720D2405 Studio multicentrico, in aperto, a un solo gruppo di trattamento per valutare la sicurezza , la tollerabilità e l’efficacia a lungo termine di 0.5 mg di fingolimod (FTY720) somministrato per via orale una volta al giorno in pazienti con sclerosi multipla, Novartis, prot. CFTY720D2399 A multicenter, randomized, double-blind, parallel-group, placebo-controlled variable treatment duration study evaluating the efficacy and safety of Siponimod (BAF312) in patients with secondry progressive MS, Novartis, prot. CBAF312A2304 A Phase 2/3, Multi-Center, Randomized, Double-Blind, placebo-controlled (Part A) and double-blind, double-dummy, active-controlled (Part B), parallel group study to evaluate the efficacy and safety of RPC1063 administered orally to relapsing MS patients, Receptos, prot. RPC1063 A prospective observational study to depict the role of adherence as a tool of treatment decision making in RMS subject experiencing first clinical relapse with 1st line DMDs (CHOICE) A Placebo-controlled, double-blind, parallel-group, Bayesian Adaptive randomization design and dose Regimen-finding Study to evaluate safety,tolerability andefficacy of BAN2401 in subjects with Early Alzheimer’s Disease, EISAI, prot. BAN2401 Randomised, double-blind, parallel-group, placebo-controlled, fixed-dose study of Lu AE58054 in patients with mild-moderate AD treated with donepezil, Lundbeck, 14861A A randomized, Placebo Controlled, Parallel-group, Double Blind efficacy and safety Trial of MK-8931 in Subjects with mild to moderate Alzheimer’s Disease, Merck Serono, MK-8931-017 A phase III, Randomized, placebo-controlled, parallel-group, double-blind clinical trial to study the efficacy and safety of MK-8931 in subject with Amnestic Mild Cognitive Impairment due to Alzheimer’s Disease (Prodromal AD), MK-8931-019 Continued Efficacy and Safety monitoring of solanezumab, an anti-amyloid beta antibody in patients with Alzheimer’s disease (H8A-MC-LZAO) Effect of passive Immunization on the progression of mild Alzheimer’s disease: Solanezumab (LY2062430) versus Placebo H8A-MC-LZAX

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A randomized, double-blind, Placebo-controlled, Parallel-group, 26-week, phase 3 study of two doses of EVP-6124 or placebo in subjects with mild to moderate AD currently or previously receiving an Acetylcholinesterase Inhibitor Medication EVP-6124-025

A 24-month, multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel- Group, efficacy, safety, tolerability, biomarker and pharmacokinetic of AZD3293 in early Alzheimer's disease (The AMARANTH study)

A multinational, multicenter, randomized, parallel Group, open-label study to assess medication satisfaction in patient with Relapsing Remitting Multiple Sclerosis (RRMS) treated with subcutaneous injection of Copaxone 40 mg/mL Three Times a Week compared to 20 mg daily (TY44400)

An open-label study to evaluate the efficacy and safety of Ocrelizumab in patients with Relapsing Remitting Multiple Sclerosis who have a suboptimal response to an adeguate course of disease-modifying treatment (MA30005)

3. ATTIVITÀ DI RICERCA DI BASE

È attualmente presente presso la UOS Malattie Neurodegenerative e Demielinizzanti una banca biologica comprendente:

1) circa 3300 campioni di DNA. Le patologie più rappresentate sono: - 600 pazienti con diagnosi di Malattia di Alzheimer

- 400 con altri tipi di demenza (Degenerazione Lobare Frontotemporale, demenza a corpi di Lewy, demenza vascolare, paralisi sopranucleare progressiva, degenerazione corticobasale) - 650 con diagnosi di Sclerosi Multipla

2) circa 600 campioni di liquido cerebrospinale, siero e plasma. Tra questi: - 300 pazienti con Sclerosi Multipla - 300 con patologie neurodegenerative (prevalentemente malattia di Alzheimer)

3) circa 500 cDNA ricavati da RNA estratto da cellule del sangue

Nel corso del 2016 l’attività del gruppo si è articolata sulle seguenti tematiche:

1) Ruolo dei microRNA e dei long non coding RNA nella Sclerosi Multipla (SM) Sono state completate le ricerche iniziate nel corso degli scorsi anni, sui microRNA (miRNA), che diverse evidenze sperimentali suggeriscono come possibili marcatori in patologie di varia natura ed eziogenesi. I miRNA sono dei modulatori trascrizionali di numerosissimi geni tra i quali anche geni propriamente implicati nella patogenesi della SM. Lo scopo di questo filone di ricerca è stato quello di verificare la funzione e il livello di espressione di queste molecole al fine di stabilire la loro possibile utilità come marcatore di patologia. Nel corso degli scorsi anni abbiamo identificato alcuni microRNA deregolati nelle cellule circolanti di pazienti con SM (Fenoglio et al., Multiple Sclerosis 2013), e messo a punto una tecnica per dosare i livelli di miRNA circolanti, che permette di ottenere dati senza bisogno di isolare le cellule. Nel 2015 abbiamo proseguito questi studi in pazienti sottoposti a diversi tipi di trattamento immonomodulante, e correlato l’andamento dei livelli di miRNA con i dati clinici e radiologici, al fine di identificare un marcatore che predica la risposta al trattamento. Inoltre, abbiamo intrapreso lo studio dei long non coding RNA, che sono molecole composte da >200 nucleotidi, che regolano l’espressione di diversi geni target e abbiamo valutato i livelli di queste molecole negli esosomi di origine neuronale, che hanno il vantaggio di essere facilmente isolati dal sangue e contemporaneamente di riflettere la composizione delle cellule del cervello che li originano.

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2) Analisi di mutazioni in pazienti con Degenerazione Lobare Frontotemporale e patologie psichiatriche Sono stati identificate nuove mutazioni in famiglie con forme autosomiche dominanti sia di patologie neurodegenerative che patologie psichiatriche. Sulla popolazione di pazienti sporadici sono stati effettuati studi di associazione ed identificati fattori di rischio genetici e sono stati analizzati i livelli di molecole infiammatorie nel siero e nel liquido cefalorachidiano.

3) Studi di associazione e di espressione in pazienti con malattia di Alzheimer e studio dei miRNA e lncRNA circolanti a livello del liquido cefalorachidiano e del siero.

I progetti di ricerca sono stati sviluppati grazie alla collaborazione con Centri sia italiani che stranieri.

Tra i primi vi sono:

- Prof. A. Maggi, Centro di Biotecnologie Farmacologiche, Dipartimento di Scienze Farmacologiche, Università di Milano - Prof. C. Mariani, Ospedale L. Sacco, Milano - Dott. G. Forloni, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Milano - Dr. G. Frisoni, IRCCS S. Giovanni di Dio Fatebenefratelli, Brescia - Dr. S. Cappa, Ospedale S. Raffaele Ville Turro, Milano - Prof. A. Padovani, Università di Brescia - Prof. I. Rainero, prof.ssa M.T. Giordana, Università di Torino

Tra i centri esteri:

- Dr. R.P. Lisak, Dip. di Neurologia, Detroit (USA) - Prof. P. Scheltens, Dept. of Neurology, VU University Medical Center, Amsterdam, The Nertherlands - Dr. Howard Feldman, Dept. of Neurology, University of British Columbia, Vancouver, Canada - Prof. A. Compston, Dr. Steven Sawcer, Dept. of Neurology, Cambridge, UK - Dr. A. Reif, Dept. Of Psychiatry and Psychotherapy, Julius-Maximilians-University, Wurzburg, Germany - Dr. Anne Cross, University of Saint Louis, USA - Prof. Philippe Amouyel, Lille, France - Dr. Jonathan Rohrer, UCL, London, UK - Dr. An Goris, Leuven, Belgium.

Inoltre, il gruppo ha contribuito a consorzi internazionali per studi su popolazioni di pazienti con: - Malattia di Alzheimer (IGAP: International Genomics of Alzheimer's Disease Project). - Demenza Frontotemporale (GENFI: GENetics of Frontotemporal dementia Initiative) - Sclerosi Multipla (IMSC: International Multiple Sclerosis Collaboration).

48

4. PUBBLICAZIONI SU RIVISTE INTERNAZIONALI CENSITE 2015

Bellelli G, Morandi A, Di Santo SG, Mazzone A, Cherubini A, Mossello E, Bo M, Bianchetti A, Rozzini R, Zanetti E, Musicco M, Ferrari A, Ferrara N, Trabucchi M; Italian Study Group on Delirium (ISGoD, including Scarpini E).

"Delirium Day": a nationwide point prevalence study of delirium in older hospitalized patients using an easy standardized diagnostic tool.

BMC Medicine 2016;14:106. doi: 10.1186/s12916-016-0649-8. IF=8,005

Montanari E, Rottoli M, Maimone D, Confalonieri P, Plewnia K, Frigo M, Francia A, Pala A, Losignore NA, Ragonese P, Veneziano A; POSIDONIA study group (including Scarpini E). A 12-month prospective, observational study evaluating the impact of disease-modifying treatment on emotional burden in recently-diagnosed multiple sclerosis patients: The POSIDONIA study. Journal of the Neurological Sciences 2016;364:105-9. doi: 10.1016/j.jns.2016.02.047.IF=2,126

Lublin F, Miller DH, Freedman MS, Cree BA, Wolinsky JS, Weiner H, Lubetzki C, Hartung HP, Montalban X, Uitdehaag BM, Merschhemke M, Li B, Putzki N, Liu FC, Häring DA, Kappos L;

INFORMS study investigators (including Scarpini E). Oral fingolimod in primary progressive multiple sclerosis (INFORMS): a phase 3, randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet 2016;387(10023):1075-84. doi: 10.1016/S0140-6736(15)01314-8. IF=44,002

Jun G, Ibrahim-Verbaas CA, Vronskaya M, Lambert JC, Chung J, Naj AC, Kunkle BW, Wang LS, Bis JC, Bellenguez C, Harold D, Lunetta KL, Destefano AL, Grenier-Boley B, Sims R, Beecham GW, Smith AV, Chouraki V, Hamilton-Nelson KL, Ikram MA, Fievet N, Denning N, Martin ER, Schmidt H, Kamatani Y, Dunstan ML, Valladares O, Laza AR, Zelenika D, Ramirez A, Foroud TM, Choi SH, Boland A, Becker T, Kukull WA, van der Lee SJ, Pasquier F, Cruchaga C, Beekly D, Fitzpatrick AL, Hanon O, Gill M, Barber R, Gudnason V, Campion D, Love S, Bennett DA, Amin N, Berr C, Tsolaki M, Buxbaum JD, Lopez OL, Deramecourt V, Fox NC, Cantwell LB, Tárraga L, Dufouil C, Hardy J, Crane PK, Eiriksdottir G, Hannequin D, Clarke R, Evans D, Mosley TH Jr, Letenneur L, Brayne C, Maier W, De Jager P, Emilsson V, Dartigues JF, Hampel H, Kamboh MI, de Bruijn RF, Tzourio C, Pastor P, Larson EB, Rotter JI, O'Donovan MC, Montine TJ, Nalls MA, Mead S, Reiman EM, Jonsson PV, Holmes C, St George-Hyslop PH, Boada M, Passmore P, Wendland JR, Schmidt R, Morgan K, Winslow AR, Powell JF, Carasquillo M, Younkin SG, Jakobsdóttir J, Kauwe JS, Wilhelmsen KC, Rujescu D, Nöthen MM, Hofman A, Jones L; IGAP Consortium (including Scarpini E and Galimberti D), Haines JL, Psaty BM, Van Broeckhoven C, Holmans P, Launer LJ, Mayeux R, Lathrop M, Goate AM, Escott-Price V, Seshadri S, Pericak-Vance MA, Amouyel P, Williams J, van Duijn CM, Schellenberg GD, Farrer LA.

A novel Alzheimer disease locus located near the gene encoding tau protein. Molecular Psychiatry 2016;21(1):108-17. doi: 10.1038/mp.2015.23. IF=13,314

Disanto G, Adiutori R, Dobson R, Martinelli V, Dalla Costa G, Runia T, Evdoshenko E, Thouvenot E, Trojano M, Norgren N, Teunissen C, Kappos L, Giovannoni G, Kuhle J; International Clinically Isolated Syndrome Study Group (including Scarpini E and Galimberti D). Serum neurofilament light chain levels are increased in patients with a clinically isolated syndrome.

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Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry 2016;87(2):126-9. doi: 10.1136/jnnp-2014-309690. IF=6,431

Abbate C, Caputo L, Damanti S, Zappa C, Nicolini P, Rossi PD, Arosio B, Mari D, De Riz MA, Dormia G, Trimarchi PD, Morello E, Monfardini S.

Reversible Parkinson's Dementia Associated with Withdrawal of Androgen-Deprivation Therapy for Prostate Cancer.

Journal of the American Geriatric Society 2016;64(10):e115-e117. doi: 10.1111/jgs.14417.

IF=3,842

Martinelli V, Dalla Costa G, Moiola L, Pavan G, Diotti RA, De Riz MA, Gerevini S, Comi G. Progressive ataxia in a natalizumab-treated multiple sclerosis patient: the dark side of JC virus infection.

European Journal of Neurology 2016;23(7):e39-40. doi: 10.1111/ene.13027. IF=3,956

Vercellino M, Fenoglio C, Galimberti D, Mattioda A, Chiavazza C, Binello E, Pinessi L, Giobbe D, Scarpini E, Cavalla P.

Progranulin genetic polymorphisms influence progression of disability and relapse recovery in multiple sclerosis.

Multiple Sclerosis Journal 2016;22(8):1007-12. doi: 10.1177/1352458515610646. IF=4,671 Gazzina S, Premi E, Zanella I, Biasiotto G, Archetti S, Cosseddu M, Scarpini E, Galimberti D, Serpente M, Gasparotti R, Padovani A, Borroni B. Iron in Frontotemporal Lobar Degeneration: A New Subcortical Pathological Pathway? Neurodegenerative Diseases 2016;16(3-4):172-8. doi: 10.1159/000440843. IF=2,937

Grande G, Cucumo V, Cova I, Ghiretti R, Maggiore L, Lacorte E, Galimberti D, Scarpini E, Clerici F, Pomati S, Vanacore N, Mariani C. Reversible Mild Cognitive Impairment: The Role of Comorbidities at Baseline Evaluation. Journal of Alzheimer’s Disease 2016;51(1):57-67. doi: 10.3233/JAD-150786. IF=3,920

Galimberti D, Scarpini E. Emerging amyloid disease-modifying drugs for Alzheimer's disease. Expert Opinion on Emerging Drugs 2016;21(1):5-7. doi:

10.1517/14728214.2016.1146678. IF=2,120

Oldoni E, Fumagalli GG, Serpente M, Fenoglio C, Scarioni M, Arighi A, Bruno G, Talarico G, Confaloni A, Piscopo P, Nacmias B, Sorbi S, Rainero I, Rubino E, Pinessi L, Binetti G, Ghidoni R, Benussi L, Grande G, Arosio B, Bursey D, Kauwe JS, Cioffi SM, Arcaro M, Mari D, Mariani C, Scarpini E, Galimberti D. PRNP P39L Variant is a Rare Cause of Frontotemporal Dementia in Italian Population. Journal of Alzheimer’s Disease 2016;50(2):353-7. doi: 10.3233/JAD-150863. IF=3,920

Piccio L, Deming Y, Del-Águila JL, Ghezzi L, Holtzman DM, Fagan AM, Fenoglio C, Galimberti D, Borroni B, Cruchaga C. Cerebrospinal fluid soluble TREM2 is higher in Alzheimer disease and associated with mutation status. Acta Neuropathologica 2016;131(6):925-33. doi: 10.1007/s00401-016-1533-5. IF=11,360

50

Bocchetta M, Mega A, Bernardi L, Di Maria E, Benussi L, Binetti G, Borroni B, Colao R, Di Fede G, Fostinelli S, Galimberti D, Gennarelli M, Ghidoni R, Piaceri I, Pievani M, Porteri C, Redaelli V, Rossi G, Suardi S, Babiloni C, Scarpini E, Tagliavini F, Padovani A, Nacmias B, Sorbi S, Frisoni GB, Bruni AC SINdem. Genetic Counseling and Testing for Alzheimer's Disease and Frontotemporal Lobar Degeneration: An Italian Consensus Protocol. Journal of Alzheimer’s Disease 2016;51(1):277-91. doi: 10.3233/JAD-150849. IF=3,920

Cova I, Clerici F, Maggiore L, Pomati S, Cucumo V, Ghiretti R, Galimberti D, Scarpini E, Mariani C, Caracciolo B. Body Mass Index Predicts Progression of Mild Cognitive Impairment to Dementia. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders 2016;41(3-4):172-180. doi: 10.1159/000444216. IF=3,408

Schott JM, Crutch SJ, Carrasquillo MM, Uphill J, Shakespeare TJ, Ryan NS, Yong KX, Lehmann M, Ertekin-Taner N, Graff-Radford NR, Boeve BF, Murray ME, Khan QU, Petersen RC, Dickson DW, Knopman DS, Rabinovici GD, Miller BL, Gonzalez AS, Gil-Néciga E, Snowden JS, Harris J, Pickering-Brown SM, Louwersheimer E, van der Flier WM, Scheltens P, Pijnenburg YA, Galasko D, Sarazin M, Dubois B, Magnin E, Galimberti D, Scarpini E, Cappa SF, Hodges JR, Halliday GM, Bartley L, Carrillo MC, Bras JT, Hardy J, Rossor MN, Collinge J, Fox NC, Mead S.

Genetic risk factors for the posterior cortical atrophy variant of Alzheimer's disease. Alzheimers & Dementia 2016;12(8):862-71. doi: 10.1016/j.jalz.2016.01.010. IF=11,619

Cova I, Clerici F, Rossi A, Cucumo V, Ghiretti R, Maggiore L, Pomati S, Galimberti D, Scarpini E, Mariani C, Caracciolo B. Weight Loss Predicts Progression of Mild Cognitive Impairment to Alzheimer's Disease. PLoS One 2016;11(3):e0151710. doi: 10.1371/journal.pone.0151710. eCollection 2016. IF=3,057

Ferri E, Arosio B, D'Addario C, Galimberti D, Gussago C, Pucci M, Casati M, Fenoglio C, Abbate C, Rossi PD, Scarpini E, Maccarrone M, Mari D.

Gene promoter methylation and expression of Pin1 differ between patients with frontotemporal dementia and Alzheimer's disease.

Journal of the Neurological Sciences 2016;362:283-6. doi: 10.1016/j.jns.2016.02.004. IF=2,126

Clarelli F, Mascia E, Santangelo R, Mazzeo S, Giacalone G, Galimberti D, Fusco F, Zuffi M, Fenoglio C, Franceschi M, Scarpini E, Forloni G, Magnani G, Comi G, Albani D, Martinelli Boneschi F. CHRNA7 Gene and Response to Cholinesterase Inhibitors in an Italian Cohort of Alzheimer's Disease Patients. Journal of Alzheimer’s Disease 2016;52(4):1203-8. doi: 10.3233/JAD-160074. IF=3,920

Marceglia S, Mrakic-Sposta S, Rosa M, Ferrucci R, Mameli F, Vergari M, Arlotti M, Ruggiero F, Scarpini E, Galimberti D, Barbieri S, Priori A.

Transcranial Direct Current Stimulation Modulates Cortical Neuronal Activity in Alzheimer's Disease.

Frontiers in Neuroscience 2016;10:134. doi: 10.3389/fnins.2016.00134. IF=3,398

51

Galimberti D, Bertram K, Formica A, Fenoglio C, Cioffi SM, Arighi A, Scarpini E, Colosimo C. Plasma Screening for Progranulin Mutations in Patients with Progressive Supranuclear Palsy and Corticobasal Syndromes. Journal of Alzheimer’s Disease 2016;53(2):445-9. doi: 10.3233/JAD-160073. IF=3,920

Luis E, Ortiz A, Eudave L, Ortega-Cubero S, Borroni B, van der Zee J, Gazzina S, Caroppo P, Rubino E, D'Agata F, Le Ber I, Santana I, Cunha G, Almeida MR, Boutoleau-Bretonnière C, Hannequin D, Wallon D, Rainero I, Galimberti D, Van Broeckhoven C, Pastor MA, Pastor P. Neuroimaging Correlates of Frontotemporal Dementia Associated with SQSTM1 Mutations. Journal of Alzheimer’s Disease 2016;53(1):303-13. doi: 10.3233/JAD-160006. IF=3,920

Neven KY, Piola M, Angelici L, Cortini F, Fenoglio C, Galimberti D, Pesatori AC, Scarpini E, Bollati V.

Repetitive element hypermethylation in multiple sclerosis patients. BMC Genetics 2016;17(1):84. doi: 10.1186/s12863-016-0395-0. IF=2,152

Galimberti D, Scarpini E. Old and new acetylcholinesterase inhibitors for Alzheimer's disease. Expert Opinion on Investigational Drugs 2016;25(10):1181-7. doi: 10.1080/13543784.2016.1216972. IF=4,408

Cioffi SM, Galimberti D, Barocco F, Spallazzi M, Fenoglio C, Serpente M, Arcaro M, Gardini S, Scarpini E, Caffarra P. Non Fluent Variant of Primary Progressive Aphasia Due to the Novel GRN g.9543delA(IVS3-2delA) Mutation. Journal of Alzheimer’s Disease 2016;54(2):717-21. doi: 10.3233/JAD-160185. IF=3,920

Sainaghi PP, Bellan M, Lombino F, Alciato F, Carecchio M, Galimberti D, Fenoglio C, Scarpini E, Cantello R, Pirisi M, Comi C. Growth Arrest Specific 6 Concentration is Increased in the Cerebrospinal Fluid of Patients with Alzheimer's Disease. Journal of Alzheimer’s Disease 2016;55(1):59-65. doi: 10.3233/JAD-160599. IF=3,920

Zimetti F, Caffarra P, Ronda N, Favari E, Adorni MP, Zanotti I, Bernini F, Barocco F, Spallazzi M, Galimberti D, Ricci C, Ruscica M, Corsini A, Ferri N. Increased PCSK9 Cerebrospinal Fluid Concentrations in Alzheimer's Disease. Journal of Alzheimer’s Disease 2016;55(1):315-320. doi: 10.3233/JAD-160411. IF=3,920

Fenoglio C, De Riz M, Pietroboni AM, Calvi A, Serpente M, Cioffi SM, Arcaro M, Oldoni E, Scarpini E, Galimberti D. Effect of fingolimod treatment on circulating miR-15b, miR23a and miR-223 levels in patients with multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 2016;299:81-3. doi: 10.1016/j.jneuroim.2016.08.017. IF=2,536

Heywood WE, Baud A, Bliss E, Sirka E, Schott JM, Zetterberg H, Galimberti D, Sebire NJ, Mills K.

52

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status.

Journal of Visualized Experiments 2016; (116). doi: 10.3791/54541. IF=1.113

5. COMUNICAZIONI SU RIVISTE CENSITE 2015

Cova I, Grande G, Cucumo V, Ghiretti R, Maggiore L, Galimberti D, Scarpini E, Pomati S, Mariani C. Anosognosia for memory impairment in Mild Cognitive Impairment is not predictive for dementia and Alzheimer’s disease. European Journal of Neurology 23 (Suppl. 2): 116, 2016. 2° Meeting of the European Academy of Neurology, Copenhagen, June 2016.

Galimberti D, Cioffi S, Fenoglio C, Serpente M, Hagen M, Oblak A, Rodriguez-Porcel F, Oldoni E, Arcaro M, Scarpini E, Ghetti B, Espay A. Primary progressive aphasia as presentation of frontotemporal lobar degeneration due to novel GRN g.1642_1645delTGAG mutation. European Journal of Neurology 23 (Suppl. 2): 255, 2016. 2° Meeting of the European Academy of Neurology, Copenhagen, June 2016.

Scarioni M, Basilico P, Pietroboni AM, Arighi A, Fumagalli GG, Calvi A, Galimberti D, Scarpini E. A case report of primary central nervous system lymphoma. European Journal of Neurology 23 (Suppl. 2): 711, 2016. 2° Meeting of the European Academy of Neurology, Copenhagen, June 2016.

Pottier C, Serie DJ, Huey ED, Neumann M, Johannsen P, Slawek J, Finger EC, Lippa CF, White CLI, Beach TG, Kwok JB, Sorbi S, Ghetti B, MesulamMM, Bigio EH, Sanchez-valle R, Pickering-Brown S, Bruni A, Rogaeva E, Rohrer JD, Graff C, Mackenzie IR, Bird TD, Cruchaga C, van Swieten JC, Miller BL, Lopez de Munain A, Van Deerlin VM, Rossi G, Benussi L, Borroni B, Galimberti D, Ghidoni R, Le Ber I, Biernacka J, Dickson DW, Graff-Radford NR, Boeve BF, Rademakers R. Global initiative to identify genetic modifiers of disease onset and presentation in patients with progranulin mutations. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 230-1. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Dick KM, Boeve BF, Borroni B, Boxer A, Brice A, Butler CR, Couratier P, Dickerson BC, Ducharme S, Finger E, Galimberti D, Gerhard A, Ghoshal N, Graff C, Grossman M, Hodges JR, Huey ED, LaforceJr R, Le Ber I, Levin J, Mackenzie IR, Masellis M, Martinaud O, Mendonca A, Moreno F, Nicholas JM, Onyike CU, Otto M, Roberson ED, Rogalski E, Rosen HJ, Rowe JB, Sanchez-Valle R, Santana I, Sorbi S, van Swieten J, Synofzik M, Tagliavini F, Vandenberghe R, Roher JD.

Symptom onset in genetic frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 232-3. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-

September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Bocchetta M, Toussaint N, Hutel M, Modat M, Cardoso MJ, Gordon E, Dick KM, Cash DM, van Swieten J, Borroni B, Galimberti D, Masellis M, Graff C, Tagliavini F, Frisoni GB, LaforceJr R, Finger E, de Mendonca A, Sorbi S, Warren JD, Ourselin S, Rohrer JD, on behalf of the Genetic FTD Initiative (GENFI).

53

Multimodal imaging analysis of C9orf72-associated FTD in the Genetic Frontotemporal dementia Initiative (GENFI) study.

Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 245. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-

September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Schneider R, Kim T, McKeever P, Graff C, van Swieten J, Laforce Jr R, Galimberti D, Masellis M, Rohrer J, Zhang Z, Robertson J, Tartaglia MC. Exosomal microRNAs in the cerebrospinal fluid as biomarkers in familial FTD. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 246-7. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Sellami L, Bocchetta M, van Swieten J, Borroni B, Galimberti D, Masellis M, Rowe JB, Graff C, Tagliavini F, Frisoni G, Finger E, Mendonca A, Sorbi S, Dick KM, Rohrer JD, LaforceJr R. Neuropsychiatric symptoms in the genetic frontotemporal dementia initiative (GENFI) cohort. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 290. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Alberici A, Nacmias B, Logroscino G, Bruni A, Tagliavini F, Ghidoni R, Galimberti D, Bonanni L, Cagnin A, Bozzali M, Silani V, Turrone R, Ferrari C, Lombardi G, Bessi V, Capozzo R, Zecca C, Arcuti S, Cupidi C, Bernardi L, Smirne N, Frangipane F, Rossi G, Caroppo P, Tiraboschi P, Benussi L, Binetti G, Ciani M, Fostinelli S, Arighi A, Fenoglio C, Fumagalli G, Onofrj M, Scarpini E, Sorbi S, Padovani A, Borroni B, Bessi V. More than two-hundred and fifty FTD patients looking for genes: results from Italian FTD Network. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 309. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Ferrari R, Grassi M, Graziano F, Palluzzi F, Archetti S, Bonomi E, Bruni A, Maletta R, Bernardi L, Cupidi C, Colao R, Rainero I, Rubino E, Pinessi L, Galimberti D, Scarpini E, Serpente M, Nacmias B, Piaceri I, Bagnoli S, Rossi G, G. Rossi, Giaccone G, Tagliavini F, Benussi L, Binetti G, Ghidoni R, Singleton A, Hardy J, Momeni P, Padovani A, Borroni B. Effects of multiple genetic loci on age at onset in frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 313. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Bonanni L, Franciotti R, Benussi A, Bozzali M, Cagnin A, Bruni A, Vincenzo S, Logroscino G, Ghidoni R, Nacmias B, Tagliavini F, Padovani A, Onofrj M, Galimberti D, Borroni B. Neural network organization in frontotemporal degeneration by means of graph theory on resting-state EEG recordings: a study on behalf of the Italian FTD Network. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 378-9. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Meeter L, Dopper E, Jiskoot L, Sanchez-Valle R, Graff C, Benussi L, Ghidoni R, Pijnenburg Y, Borroni B, Galimberti D, Laforce RJ, Masellis M, Vandenberghe R, Le Ber I, Otto M, van Minkelen R, Papma J, Rombouts S, Balasa M, O€ijerstedt L, Jelic V, Cash D, Harding S, Cardoso MJ, Ourselin S, Dick K, Rossor M, Binetti G, Padovani A,

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Scarpini E, Fenoglio C, Tartaglia C, Lamari F, Barro C, Kuhle J, Rohrer J, Teunissen C, van Swieten J. Neurofilament light chain: a biomarker for disease onset and survival in genetic frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 386. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

del Campo M, Elias N, Koel-Simmelink M, Boonkamp L, Galimberti D, Hu W, Teunissen C. Novel CSF biomarkers discriminating FTLD-TDP from non-demented controls. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 386. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Galimberti D, Fenoglio C, Cioffi S, Fumagalli G, Arighi A, Borroni B, Padovani A, Tagliavini F, Masellis M, Tartaglia C, Van Swieten J, Meeter L, Graff C, Mendonca A, Rohrer J, Scarpini E, O. B. O (GENFI).

Progranulin plasma levels predict the presence of GRN mutations but not the development of symptoms. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 390.

10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Fumagalli GG, Basilico P, Harding S, Arighi A, Bocchetta M, Mercurio M, Dick K, van Swieten J, Borroni B, Graff C, Masellis M, Tagliavini F, Rowe J, Laforce R, Finger E, Frisoni G, Mendonca A, Sorbi S, Scarpini E, Rohrer J, Galimberti D. Distinct patterns of brain atrophy in genetic frontotemporal dementia: visual rating scales in the GENFI cohort. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 391. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Fenoglio C, Serpente M, Cioffi S, Arcaro M, Oldoni E, Fumagalli G, Arighi A, Basilico P, Cattaneo A, Porretti L, Galimberti D, Scarpini E. Altered expression of non-coding RNAs in neural-derived serum exosomes in patients with FTD. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 392-3. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany. Serpente M, Fenoglio C, Cioffi S, Arcaro M, Oldoni E, Arighi A, Fumagalli G, Scarpini E, Galimberti D. Autosomal dominant and sporadic frontotemporal lobar degeneration: from non-coding RNAs to the identification of preclinical biomarkers and therapeutic targets. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 393. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Rohrer J, Bocchetta M, Gordon E, Cash D, Dick K, Thomas D, Nicholas J, Cardoso1 MJ, Ourselin S, van Swieten J, Borroni B, Galimberti D, Masellis M, Graff C, Tagliavini F, Frisoni LaforceJr GR, Finger E, Mendonca A, Sorbi S, Rossor M. Patterns of longitudinal neuroanatomical change in genetic FTD: results from the Genetic FTD Initiative (GENFI). Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 397.

55

10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Mutsaerts H, Mirza SS, Rohrer J, Thomas D, Cash D, De Vita E, Dick K, Ourselin S, van Swieten J, Galimberti D, Rowe JB, Graff C, Tagliavini F, LaforceJr R, Finger E, Mendonca A, Knight J, MacIntosh B, Masellis M. Presymptomatic cerebral perfusion biomarker changes in genetic frontotemporal dementia: results from the GENetic Frontotemporal dementia Initiative (GENFI). Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 404. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Panman JL, Meeter LHH, Dopper EGP, Jiskoot LC, Bouts MJM, M€oller C, van Minkelen R, Sanchez-Valle R, Balasa M, Graff C, O€ijerstedt L, Jelic V, Benussi L, Ghidoni R, Binetti G, Barbara B, Padovani A, Galimberti D, Scarpini E, Fenoglio C, RJ Laforce, Vandenberghe R, Le Ber I, Lamari F, Otto M, Rohrer JD, Cash DM, Rombouts SAR, Teunissen CE, Papma JM, van Swieten JC. Increased neurofilament light chain correlates with decreased white matter integrity in presymptomatic and symptomatic granulin carriers. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 406. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Premi E, Rohrer J, Grassi M, van Swieten J, Galimberti D, Graff C, Masellis M, Tagliavini F, Rowe, Laforce JR, Finger E, Frisoni G, de Mendonca A, Sorbi S, Gazzina S, Cosseddu M, Archetti S, Gasparotti R, Manes M, Padovani A, Borroni B. Nature and nurture in modulating brain damage in pre- symptomatic monogenic FTD: results from the GENFI study. Journal of Neurochemistry 2016 Suppl 1, 419. 10th International Conference on Frontotemporal Dementias August 31st-September 2nd, 2016, Munich, Germany.

Fenoglio C, Calvi A, Serpente M, De Riz M, Comi C, Lecchi E, Pietroboni AM, Arcaro M, Cioffi SMG, Oldoni E, Cantello R, Galimberti D, Scarpini E. Long non coding RNA (LncRNAs) expression analysis in patients with multiple sclerosis: potential biomarkers of disease susceptibility and progression. Multiple Sclerosis Journal 2016; 22(Suppl. 3): 271. 32th Congress of the European Committee for Research and Treatment in Multiple Sclerosis (ECTRIMS) and the 21th Annual Conference of Rehabilitation in MS (RIMS), September 14-17, 2016, London, UK.

Matute-Blanch C, Villar LM, Evdoshenko E, Makshakov G, Nazarov V, Lapin S, Midaglia L, Vidal-Jordana A, Drulovic J, García-Merino A, Saiz A, Zettl UK, Schroeder I, Ramió-Torrentà L, Quintana E, Galimberti D, Montalban X, Comabella M. Cerebrospinal fluid chitinase 3-like 1 levels in patients with radiologically isolated syndromes. Multiple Sclerosis Journal 2016; 22(Suppl. 3): 587-8. 32th Congress of the European Committee for Research and Treatment in Multiple Sclerosis (ECTRIMS) and the 21th Annual Conference of Rehabilitation in MS (RIMS), September 14-17, 2016, London, UK.

Fumagalli G, Basilico P, Harding S, Arighi A, Bocchetta M, Mercurio M, Dick K, van Swieten J, Borroni B, Graff C, Masellis M, Tagliavini F, Rowe8 J, Laforce R, Finger E, Frisoni G, Mendoca A, Sorbi S, Scarpini E, Rohrer J, Galimberti D.

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Distinct patterns of brain atrophy in genetic Frontotemporal Dementia: visaual rating scales in the GENFI cohort. Neurological Sciences 37, Suppl.: S69, 2016. XLVII Congress of the Italian Neurological Society, October 22-25, 2016, Venezia, Italy .

Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi S, Arcaro M, Oldoni E, Fumagalli G, Arighi A, Basilico P, Cattaneo A, Porretti L, Scarpini E. Altered expression of non-coding RNAs in neural-derived exosomes in patients with Frontotemporal Dementia. Neurological Sciences 37, Suppl.: S76, 2016. XLVII Congress of the Italian Neurological Society, October 22-25, 2016, Venezia, Italy.

Calvi A, De Riz M, Pietroboni A, Arighi A, Fumagalli G, Ghezzi L, Basilico P, Scarioni M, Carandini T, Galimberti D, Scarpini E. Merkel cell carcinoma in a patirnt with relapsing-remitting Multiple Sclerosis treated with Fingolimod. Neurological Sciences 37, Suppl.: S243, 2016. XLVII Congress of the Italian Neurological Society, October 22-25, 2016, Venezia, Italy.

Galimberti D, Cioffi S, Fenoglio C, Serpente M, Hagen M, Oblak A, Rodriguez-Porcel F, Oldoni E, Arcaro M, Ghetti B, Espay A, Scarpini E. Primary progressive aphasia as presentation of Frontotemporal Lobar Degeneration due to novel GRN g.1642_1645delTGAG mutation. Neurological Sciences 37, Suppl.: S277-8, 2016. XLVII Congress of the Italian Neurological Society, October 22-25, 2016, Venezia, Italy.

Arighi A, Carandini T, Carpani G, Mercurio M, Pietroboni A, Fumagalli G, Ghezzi L, Basilico P, Calvi A, Scarioni M, Russo S, Rotondo E, Corti P, Vimercati R, Fenoglio C, Serpente M, Bozzali M, Triulzi F, Galimberti D, Scarpini E. Word and picture version of the free and cues selective reminding test (FCSRT): is there any difference? Neurological Sciences 37, Suppl.: S279, 2016. XLVII Congress of the Italian Neurological Society, October 22-25, 2016, Venezia, Italy.

Carandini T, Pietroboni A, Fumagalli G, Ghezzi L, Basilico P, Calvi A, Scarioni M, Gianelli U, Rosso L, Galimberti D, Arighi A, Scarpini E. An unusual case of Siff person syndrome: paraneoplastic or autoimmune? Neurological Sciences 37, Suppl.: S381-2, 2016. XLVII Congress of the Italian Neurological Society, October 22-25, 2016, Venezia, Italy.

Pietroboni A, Schiano di Cola F, Scarioni M, Fenoglio C, Spanò B, De Riz M, Galimberti D, Bozzali M, Scarpini E. CSF β-Amyloid as a putative biomarker of disease progression in Multiple Sclerosis. Neurological Sciences 37, Suppl.: S441, 2016. XLVII Congress of the Italian Neurological Society, October 22-25, 2016, Venezia, Italy.

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6. PARTECIPAZIONEN A EDITORIAL BOARD DI RIVISTE INT ERNAZIONALI O NAZIONALI CON IF>0

- Dott. D. Galimberti - Editorial Board Member della rivista The Open Geriatric Medicine Journal

- Dott. D. Galimberti - Senior Editor della rivista Journal of Alzheimer’s disease - Prof. E. Scarpini – Associate Editor della rivista Journal of Alzheimer’s disease

7. MEMBERSHIP SOCIETÀ SCIENTIFICHE

Dott.ssa D. Galimberti – Secretary of the Dementia Panel della European Federation of Neurological Societies

Prof. E. Scarpini – socio fondatore e segretario dell’Associazione per la ricerca sulle demenze della Società Italiana di Neurologia (SINDEM)

Dott.ssa D. Galimberti – segretaria dell’Associazione per la ricerca sulle demenze della Società Italiana di Neurologia (SINDEM)

8. FINANZIAMENTI

- Joint Program for Neurodegenerative Disorders “Searching for therapeutic interventions in frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansions in the presymptomatic stage” 40.000 € (Nov 2015-Ott 2017)

- Ricerca Finalizzata Ministero della Salute “Italian network for autosomal dominant Alzheimer’s disease and frontotemporal lobar degeneration” 40.980 € (30/11/2012- 29/11/2016)

- Ricerca Corrente, Ministero della Salute “Marcatori diagnostici e prognostici da esosomi circolanti di origine neuronale per la diagnosi e la risposta al trattamento dei pazienti con patologie neurodegenerative e demielinizzanti” 161.636 €

- Progetto di rete Ministero della Salute “New strategies for diagnostic, therapeutics and clinical care in neurological diseases” 70.000 € (Nov 2015-Ott 2018)

- Eranet JPND finanziato dal Ministero della Salute “Synapse-to-nucleus communication in Alzheimer’s disease (STAD) 70.000 € (Giu 2016-Mag 2019)

- Eranet JPND finanziato dal Ministero della Salute “Common pathways of protein misfolding in neurodegenerative diseases and molecular determinants of strains formation (PREFRONTALS)” 40.000 € (Mar 2016-Feb 2019).

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LABORATORIO CELLULE STAMINALI Responsabile: • Professor Yvan Torrente, Neurologo Universitario in convenzione

Personale:

• Marzia Belicchi biologa con contratto a tempo indeterminato di tecnico di laboratorio

laureato universitario

• Mirella Meregalli biologa con contratto a tempo determinato di tecnico di laboratorio

laureato universitario

• Andrea Farini biologo, PostDoc con borsa annuale ospedaliera

• Silvia Erratico biotecnologa, contrattista annuale

• Paola Razini biotecnologa, con assegno universitario di tipo B annuale

• Letizia Cassinelli, biologa con borsa annuale ospedaliera

• Paola Frattini, biotecnologa con borsa annuale ospedaliera

• Stefania Banfi, biologa PostDoc con assegno universitario di tipo A annuale

• Francesca De Santis, biologa con borsa annuale ospedaliera

• Chiara Villa, bioingegnere, PostDoc con assegno universitario di tipo B annuale

• Veronica Nervi studente della facoltà di Biotecnologie tirocinio per tesi triennale

• Pamela Bella studente della facoltà di Biologia tirocinante per tesi magistrale dei 5

anni

• Antonio Scopelliti studente della facoltà di Biologia tirocinante per tesi magistrale dei

5 anni

• Rossella Elia studente della facoltà di Biologia tirocinante per tesi magistrale dei 5

anni

• Naima Guarrata, dottore in economia, project manager contrattista

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Nel corso dell’anno 2016 il gruppo di lavoro diretto dal professor Torrente ha proseguito la propria ricerca nell’ambito della distrofia muscolare di Duchenne (DMD), una delle forme di distrofia più frequenti e aggressive, caratterizzata da degenerazione progressiva dei muscoli scheletrici, lisci e cardiaci, che genera debolezza muscolare diffusa. Si manifesta nella prima infanzia con problemi nella deambulazione che progrediscono fino alla perdita dell’autonomia. Fino alcuni anni fa la speranza di vita era limitata alla seconda decade, prevalentemente a causa di complicanze cardiache o respiratorie, nonostante i numerosi sforzi e i molteplici studi sperimentali, purtroppo, attualmente ancora non esiste una cura o terapie efficienti e risolutive. Il mondo scientifico sta studiando da alcuni anni composti di nuova generazione per sviluppare terapie innovative, in tal senso quest’anno, in collaborazione con un Jerry Mendel, direttore del Centro di terapia genica e distrofia muscolare del Nationwide Children's Hospital (Columbus, OH), il dott. Torrente ha realizzato uno studio clinico pubblicato sulla prestigiosa rivista scientifica internazionale “Annals of Neurology”. In questo lavoro gli autori valutano la sicurezza e l’efficacia a lungo termine del trattamento di pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne con Eteplirsen, un oligonucleotide antisenso disegnato per “saltare” l’esone 51 Vengono valutati i pazienti dopo tre anni dall’inizio del suddetto trattamento, paragonandoli con i controlli storici mecciati per età. Dopo trentasei mesi i 12 pazienti DMD trattati hanno mostrato un miglioramento statisticamente significativo nel test dei sei metri di cammino (6MWT) ed hanno evidenziato una minor incidenza della perdita del cammino rispetto ai controlli mecciati non trattati con una mutazione compatibile con lo skipping dell’esone 51. In tutti i pazienti trattati i clinici osservano che la funzionalità polmonare rimane invariata ed il farmaco risulta ben tollerato. I controlli non trattati confermano una progressione della malattia più severa. Questo studio conclude che il follow up dei pazienti trattati per tre anni conil farmaco eteplirsen mostra un più lento rate di peggioramento del cammino valutato con il test 6MWT rispetto ai controlli mecciati non trattati. Il primo passo da compiere quando si vuole sviluppare un nuovo tipo di trattamento, processo questo molto lungo e complesso, è la realizzazione di uno studio preclinico. A tal proposito il gruppo di lavoro diretto dal dott. Torrente quest’anno ha pubblicato, sulla rivista scientifica “Molecular Therapy” , uno studio preclinico importante in cui ha valutato il trapianto autologo intraarteria di cellule staminali CD133+, isolate da biopsie muscolari di cani distrofici Golden Retriever (GRMD), ingegnerizzate con un vettore lentivirale, al fine di correggere la mutazione, causa della patologia. Hanno esaminato pertanto la capacità di queste cellule di ristabilire a livello muscolare l’espressione della proteina distrofina e hanno valutato gli animali sottoponendoli a test funzionali (nuoto, fare le scale, cammino). Questo lavoro rappresenta il primo studio su un modello animale GRMD con fenotipo clinico medio e severo con un follow up di cinque anni che mostra un iniziale miglioramento clinico seguito da una stabilizzazione. Molti lavori evidenziano che nei pazienti adulti affetti da distrofia muscolare di Duchenne la distrofina è coinvolta nel pathway che regola l’omeostasi del calcio e i programmi di differenziamento. Tuttavia, aspetti secondari di questa patologia, quali l’insorgere di infiammazione e fibrosi, potrebbero falsarne l’analisi. E’ noto che il muscolo fetale non sia sottoposto a gravità e non sopporti un carico meccanico e/o infiammazione, pertanto durante il corso del 2016 il gruppo di ricerca del dott Torrente ha analizzato caratteristiche morfologiche e biochimiche di muscoli fetali sani e distrofici. Tale studio, pubblicato sulla rivista scientifica “Development” , analizza il muscolo scheletrico di feti di 12 settimane affetti da distrofia muscolare di Duchenne, mettendo in evidenza, per la prima volta, alterazioni nel pathway mediate dall’assenza stessa di distrofina, sottolineandone un ruolo non solamente strutturale durante lo sviluppo della patologia nei primi stadi della formazione del muscolo. Il gruppo del Dott. Torrente ha dimostrato che la via di segnale PLC/IP3/IP3R/Ryr1/Ca2+ è molto attiva nei muscoli fetali DMD e attraverso la proteina

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PKCα, calcio dipendente, esercita un ruolo regolatorio fondamentale nel ritardare la miogenesi e nello sviluppo delle miofibre. Questi dati rappresentano nuove importanti conoscenze e aprono la strada allo sviluppo di ulteriori indagini sui meccanismi che regolano l’insorgenza della distrofia muscolare di Duchenne a livello fetale. La ricerca di base e applicata condotta dal gruppo del Prof Torrente mira a capire la patofisiologia della malattia, individuarne i meccanismi di base, identificare prodotti farmacologici e cellulari da utilizzare in ambito terapeutico e trovare biomarkers che possano coadiuvare i medici nella diagnosi, nel fare una valutazione della progressione della malattia e nel poter quindi prevedere il futuro clinico dei pazienti, quasi sempre bambini. In tal senso il prof Torrente, in collaborazione con il professor Mercuri, direttore dell'Unità operativa di Neuropsichiatria infantile del Policlinico "Agostino Gemelli" - Università Cattolica del Sacro Cuore di Roma, e con un network di neurologi afferenti a diverse università italiane, quest’anno ha pubblicato sulla rivista scientifica “PLoS One” uno studio in cui si valuta il tempo impiegato da una coorte di pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne, ancora in grado di camminare, per alzarsi dal pavimento e si mette in relazione con i cambiamenti rilevati al test del cammino per 6 minuti (6-min walk test; 6MWT). In tale studio si conclude che il tempo impiegato ad alzarsi dal pavimento da un paziente DMD può essere considerato un importante fattore prognostico dei cambiamenti osservati al test 6MWT in 12 mesi e, più in generale, della progressione della malattia. Durante il 2016 il professor Torrente ha lavorato anche con un’equipe di neurologi, ematologi e fisioterapisti dell’Ospedale San Raffaele di Milano, collaborazione che ha portato alla realizzazione di un lavoro, pubblicato sulla rivista scientifica “Annals of Clinical and Translational Neurology”, in cui viene valutata la progressione della distrofia muscolare tramite l’utilizzo della risonanza magnetica (MRI). La RMI infatti come strumento di supporto nel percorso volto alla diagnosi di malattia neuromuscolare, si è rivelata uno strumento di indagine estremamente accurato e rapido, che permette di definire non solo se e quali muscoli sono alterati, ma anche il loro grado di compromissione e la loro distribuzione anatomica, fornendo informazioni di tipo prognostico, fornisce al clinico informazioni difficilmente ottenibili con il solo esame obiettivo, soprattutto in pazienti piccoli o molto compromessi. In questo studio sono stati valutati 26 ragazzi affetti da DMD, di età compresa tra 5-12 anni, quantificando l’infiltrato di grasso dei loro muscoli e l’indice di massa muscolare (MVI). Gli arti inferiori dei pazienti e dei controlli correlati per età sono stati analizzati con la risonanza magnetica 3T, misura della forza e tests funzionali (Il segno di Gowers, corsa/camminata 10 metri, North Star Ambulatory Assessment, test del cammino dei 6 minuti). Le misure quantitative ottenute con la MRI mostrano una significativa differenza tra i muscoli dei pazienti DMD e dei controlli sani; tale tecnica diagnostica si è rilevata una metodica più sensibile della misura della forza e dei test funzionali al fine di valutare la progressione della malattia, permettendo la quantificazione e la valutazione dei muscoli anche dopo la perdita, da parte dei pazienti, della capacità di camminare. Lo studio si conclude confermando che la valutazione quantitativa fatta con MRI è una metodica sensibile, che può diventare uno strumento importante per seguire la progressione della malattia rappresentando un nuovo elemento di analisi da utilizzare per il follow-up dei pazienti e per le valutazioni negli studi clinici. Negli ultimi anni, un filone innovativo nella ricerca di nuove terapia per le distrofie muscolari è rappresentato dalla possibilità di bloccare l’attività del proteasoma, un complesso enzimatico che degrada le proteine anomale. Una delle funzioni del proteasoma è la produzione di epitopi antigenici presentati in associazione con le molecole di MHC I; tali frammenti, di circa 8-11 aminoacidi, derivano da proteine estranee ed endogene, in particolare, queste ultime rappresentano la sorgente principale di antigeni. Si tratta di proteine danneggiate o ossidate, proteine nascenti con un ripiegamento non corretto, o a breve emivita. Una delle caratteristiche della via di presentazione antigenica da parte del MHC I è che molte delle sue componenti sono indotte da citochine infiammatorie come l’Interferone-γ (IFN-γ) e il Fattore di Necrosi Tumorale-α (TNF-α),

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fattori altamente presenti nel muscolo distrofico, affetto da infiammazione cronica. L'immunoproteasoma (iPS) deriva da una modificazone del proteosoma (PS) indotta dall'interferone (sostituzione di subunità catalitiche β1,2 e 5 con proteine a basso peso molecolare, LMP2 ed LMP5, e con un complesso endopeptidasi-simile, MECL1). Questo conferisce all'iPS una capacità catalitica ottimale per la processazione e presentazione di peptidi di classe MHC I e II, sensibilizzando quindi la risposta T linfocitaria. In tal senso nel corso dell’anno 2016 il gruppo di ricerca diretto dal dott. Torrente ha approfondito tale tema caratterizzando per la prima volta la presenza di linfociti T attivati contro epitopi della distrofina presente nelle fibre revertant del topo mdx, modello animale della distrofia muscolare di Duchenne. In questo studio, pubblicato sulla rivista “Molecular Therapy”, i ricercatori, bloccando in modo specifico la subunità LMP7 dell’immunoproteosoma, che è up-regolata nel muscolo scheletrico distrofico, hanno dimostrato il recupero dell’espressione della distrofina ed il miglioramento del fenotipo distrofico. Il blocco dell’immunoproteosoma porta, infatti, ad una diminuzione dell’espressione delle miofibre MHC di classe I e ad una riduzione della specifica risposta delle cellule T antidistrofina, dell’infiltrato cellulare nel muscolo, della produzione delle citochine proinfiammatorie, insieme ad un recupero della forza muscolare. Si conclude che l’inibizione dell’immunoproteosoma potrebbe rappresentare un promettente approccio terapeutico per la distrofia muscolare di Duchenne. Il futuro potrebbe essere quello di trovare un farmaco efficace nell’inibire la degenerazione delle proteine muscolari attivata dal sistema proteasomico, da somministrare ai pazienti con distrofia muscolare, senza rischiare pericolosi effetti collaterali. E’ ormai dimostrato che vi sono importanti correlazioni tra l’insorgenza di una malattia, il suo decorso, la risposta alla terapia ed il pattern genetico-molecolare del paziente. Le molteplici misurazioni molecolari di un campione (di sangue, tessuto, ecc.) e le informazioni cliniche si possono integrare con l’obiettivo di rivelare indicatori precoci di un problema e di personalizzare la terapia. In tal senso durante il 2016 il dott. Torrente ha portato avanti la ricerca clinica e con il suo gruppo di lavoro ha pubblicato, sulla rivista scientifica “BMC Medical Genetics”, un lavoro in cui descrive una particolare mutazione nel gene che codifica per la proteina distrofina. Più precisamente si descrive la sostituzione di un nucleotide in un sito accettore dell’introne 26 (c.3604-1G >C), in un bambino di sei anni con una storia clinica caratterizzata da una progressiva debolezza muscolare ed elevati livelli di creatinchinasi nel siero. Le analisi dell’RNA mostrano che i primi due nucleotidi mutati dell’introne 26 (AC) non sono riconosciuti dai meccanismi di splicing e che si crea un nuovo sito di splicing nell’introne 27, questo processo genera un prematuro codone di stop ed impedisce la formazione della proteina. La valutazione degli effetti patogeni di una mutazione attraverso l’analisi dell’RNA potrebbe essere utile nell’ottica di una terapia a base di oligonucleatidi antisenso (AON). Un secondo lavoro, pubblicato sulla rivista “Journal of Muscle Research and Cell Motility” descrive il caso clinico di una donna italiana di 26 anni affetta da miopatia miofibrillare (MFM) con neuropatia assonale, cardiomiopatia e sindrome rigida della spina dorsale. Tale paziente presenta la mutazione c.626 C >T nel gene BAG3, e, per capire le basi genetiche di questo complesso fenotipo clinico, sono stati analizzati con il sequenziamento dell’intero esoma i suoi genitori ed il fratello che sono sani e non presentano sintomi. Nella paziente i ricercatori guidati dal dott Torrente hanno trovato che la mutazione BAG3 è associata a varianti nei geni muscolo specifici NRAP e FHL1, proteine contenenti il dominio LIM. Analisi di PCR quantitativa, immunoistochimica e Western blot della biopsia muscolare della paziente mostrano nel tessuto muscolare l’assenza dell’espressione di NRAP e l’accumulo di FHL1 in aggregati. Inoltre analisi molecolari del dominio mutate FHL1 indicano una mutazione nella sua carica di superficie, che potrebbe interessare la capacità di legare le sue proteine target. Questo è il primo studio relativo a BAG3 e MFM, e, per la prima volta, si dimostra la presenza simultanea di varianti genetiche nei geni BAG3 e FHL1 (in precedenza descritte associate in modo indipendente con MFMs) e si lega il gene NRAP a MFM. Da

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molti anni il gruppo del dott. Torrente collabora con numerosi gruppi di ricerca che operano all’interno dell’Università degli Studi di Milano; in particolare, durante il 2016, la sinergia di diverse conoscenze cliniche, biologiche e un differente expertise tecnologico ha permesso la pubblicazione sulla rivista scientifica “Stem Cells Translational Medicine” di uno studio realizzato in collaborazione con il gruppo di ricerca diretto dalla Professoressa Cetin, Direttore UO Complessa di Ostetricia e Ginecologia, Direttore Centro di Ricerche Fetali Giorgio Pardi. In questo lavoro vengono caratterizzate per vitalità, proliferazione ed immunofenotipo le cellule isolate da membrane placentali e dischi basali di sei placente IUGR e cinque placente fisiologiche. Tutti i campioni inizialmente presentano una popolazione eterogenea che in coltura diventa omogenea esprimendo marcatori tipici della popolazione mesenchimale; taleprocesso avviene più precocemente nei campioni IUGR rispetto ai campioni controllo. In vitro la multipotenza delle cellule mesenchimali IUGR è ridotta, infatti queste cellule mostrano un’aumentata capacità di differenziare in adipociti ma diminuisce la loro abilità a differenziare in senso mio-endoteliale. Ulteriori collaborazioni hanno permesso l’integrazione di diversi know how e competenze consentendo al gruppo di concretizzare le proprie ricerche in pubblicazioni in importanti riviste scientifiche. In tal senso la proficua collaborazione con il gruppo di ricerca diretto da Francesco Meinardi, Professore di Fisica della Materia dell’Università di Milano Bicocca, ha dato origine ad una pubblicazione sulla prestigiosa rivista “Science” permettendo di sviluppare la sinergia tra specialisti di vari settori (fisica, biologia, bioengegneria). In questo lavoro i ricercatori hanno sfruttato la caratteristica struttura di cluster metallici per fabbricare strutture colloidali simili ad eccimeri (particelle instabili che formano complessi ragionevolmente stabili solo quando eccitati) fatti di nuclei d’oro che non interagiscono, tenuti insieme da una rete di legami idrogeno. Questo stato di aggregazione della materia, precedentemente sconosciuto, è stato studiato attraverso esperimenti di spettroscopia e convoglia la fotofisica degli eccimeri in stabili nanoparticelle che superano le limitazioni intrinseche degli eccimeri in applicazioni a singole particelle, cioè la loro quasi nulla probabilità di formarsi in soluzioni ultra-diluite. Inoltre in esperimenti in vivo gli autori dimostrano l’idoneità di queste strutture ad essere utilizzate come sonde intracellulari non risonanti e rivelano la loro capacità di ripulire le specie attive dell’ossigeno, queste caratteristiche ne aumentano le potenzialità per poterle usare quali agenti antitossici in applicazioni biomediche. Durante l’anno 2016 è proseguita anche la collaborazione internazionale con il Dr Ricordi, Professore di chirurgia e medicina della Divisione Trapianti cellulari presso l'Università di Miami e Direttore del famoso Diabetes Research Institute, che ha permesso di realizzare una importante pubblicazione sulla rivista “Transplantation”. In questo lavoro gli autori descrivono gli effetti del trapianto di microcapsule di alginato (Micro) nel ben confinato e vascolarizzato cuscinetto adiposo dell’epididimo (EFP) nel topo, modello dell’omento umano, invece di lasciarlo libero nella cavità peritoneale. Inoltre, vengono esaminati gli effetti del polietilenglicole (PEG) utilizzato per rinforzare l’alginato, poichè il PEG a differenza dell’alginato, è resistente allo stress osmotico. Vengono create delle microcapsule mischiando PEG e alginato (MicroMix) o creando nelle microcapsule di alginato con uno strato di PEG di 15±2µm (Double). I risultati dello studio suggeriscono che la composizione della capsula e il sito di trapianto influenzano gli esiti dell’innesto attraverso i loro effetti sulla disponibilità di nutrienti, la stabilità della capsula, e la biocompatibilità. Infine la collaborazione con Giuseppe Perale, professore del Dipartimento di Chimica, Materiali e Ingegneria Chimica "Giulio Natta" Sezione Chimica Fisica Applicata del Politecnico di Milano, ha reso possibile la pubblicazione di un capitolo del libro “Bioresorbable Polymers for Biomedical Applications From Fundamentals to Translational Medicine” in cui vengono descritti i diversi biomateriali sintetici e naturali bioriassorbili ad oggi coniosciuti ed utilizzati nel muscolo scheletrico; mettendo in evidenza in particolare le loro possibili applicazioni cliniche nella distrofia muscolare di Duchenne. Durante quest’anno il Prof. Torrente è stato impegnato anche nell’organizzazione di eventi

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scientifici divulgativi nazionali ed internazionali, aventi come tema le cellule staminali e rivolti a ricercatori, medici, biologi e studenti universitari; da ricordare in modo particolare le giornate di studio e i convegni organizzati da Unistem all’ Università degli Studi di Milano. Durante il 2016 il dott. Torrente ha continuato la sua attività di revisore di lavori scientifici per numerose prestigiose riviste internazionali e di progetti di ricerca ministeriali e internazionali; inoltre fa parte dell’editorial board della rivista scientifica CellR4, un giornale multidisciplinare focalizzato in particolare sulla riprogrammazione, differenziamento e rigenerazione cellulare. Infine nel 2016 il Dott. Torrente, ha proseguito la sua attività didattica presso l’Università degli studi di Milano quale Docente del Corso di Perfezionamento dal titolo “Cellule staminali nelle patologie neuromuscolari e neurodegenerative”, docente della lezione “Cellule staminali e medicina rigenerativa” all’interno del Master di Farmacologia Oncologica del Prof Alberto Corsini del Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari, docente per il seminario integrativo “Fisiologia e biochimica cellulare di cellule staminali per la terapia di malattie neuromuscolari” del Corso di Fisiologia (Docente Ref. Prof. Roberto Maggi) CdL Magistrale a ciclo unico in Farmacia – Facoltà di Scienze del Farmaco e Docente per il VII° modulo del Corso di Master in Farmacia e Farmacologia Oncologica del Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari,

PRODUTTIVITÀ SCIENTIFICA 2016

ELENCO PUBBLICAZIONI SU RIVISTE INTERNAZIONALI RECENSITE

Mirella Meregalli, Simona Maciotta, Valentina Angeloni and Yvan Torrente Duchenne muscular dystrophy caused by a frame-shift mutation in the acceptor splice site of intron 26Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy BMC Medical Genetics (2016) 17:55 " I.F.: 2.094

Chiara Mandò, Paola Razini, Chiara Novielli, Gaia Maria Anelli, Marzia Belicchi, Silvia Erratico, Stefania Banfi, Mirella Meregalli, Alessandro Tavelli, Marco Baccarin, Alessandro Rolfo, Silvia Motta, Yvan Torrente, Irene Cetin Impaired Angiogenic Potential of Human Placental Mesenchymal Stromal Cells in Intrauterine Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy Stem Cells Translational Medicine 2016; 5:451 – 463 I.F.: 5.709

Andrea Farini, Clementina Sitzia, Letizia Cassinelli, Federica Colleoni, Daniele Parolini, Umberto Giovanella, Simona Maciotta, Augusto Colombo, Mirella Meregalli and Yvan Torrente Inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3)-dependent Ca 2+ signaling mediates delayed myogenesis in Duchenne muscular dystrophy fetal muscle Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy Development (2016) 143, 658-669 doi:10.1242/dev.126193. I.F.: 6.1

Beatriz Santiago-Gonzalez, Angelo Monguzzi, Jon Mikel Azpiroz, Mirko Prato, Silvia Erratico, Marcello Campione, Roberto Lorenzi, Jacopo Pedrini, Carlo Santambrogio, Yvan Torrente, Filippo De Angelis, Francesco Meinardi, Sergio Brovelli

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Permanent excimer superstructures by supramolecular networking of metal quantum clusters M. Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy Science 5 AUGUST 2016 • VOL 353 ISSUE 6299. . I.F.: 34.66

Francesca D’Avila, Mirella Meregalli, Sara Lupoli, Matteo Barcella, Alessandro Orro, Francesca De Santis, Clementina Sitzia, Andrea Farini, Pasqualina D’Ursi, Silvia Erratico, Riccardo Cristofani, Luciano Milanesi, Daniele Braga, Daniele Cusi, Angelo Poletti, Cristina Barlassina, Yvan Torrente Exome sequencing identifies variants in two genes encoding the LIM-proteins NRAP and FHL1 in an Italian patient with BAG3 myofibrillar myopathyG. Orive, R. Cobos, J. Gorriti, J. L. Pedraz, Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy J Muscle Res Cell Motil (2016) 37:101–115 I.F.: 2.071

Claudia Godi, Alessandro Ambrosi, Francesca Nicastro, Stefano C. Previtali, Corrado Santarosa, Sara Napolitano, Antonella Iadanza, Marina Scarlato, Maria Grazia Natali Sora, Andrea Tettamanti, Simonetta Gerevini, Maria Pia Cicalese, Clementina Sitzia, Massimo Venturini, Andrea Falini, Roberto Gatti, Fabio Ciceri, Giulio Cossu, Yvan Torrente & Letterio S. Politi Longitudinal MRI quantification of muscle degeneration in Duchenne muscular dystrophy. Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Milan, Italy Ann Clin Transl Neurol . 2016 Jun 16;3(8):607-22. I.F.: 9.977

Jerry R. Mendell, MD, Nathalie Goemans, MD, PhD,Linda P. Lowes, PhD, Lindsay N. Alfano, PT, Katherine Berry, PT, James Shao, MS,Edward M. Kaye, MD, and Eugenio Mercuri, MD, PhD, for the Eteplirsen Study Group and Telethon Foundation DMD Italian Network Longitudinal Effect of Eteplirsen versus Historical Control on Ambulation in Duchenne Muscular Dystrophy Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy ANN NEUROL 2016;79:257–271. I.F.: 9.977

G. Cossu, S. C. Previtali, S. Napolitano, M. P. Cicalese, F. S. Tedesco, F. Nicastro, M. Noviello, U. Roostalu, M. G. Natali Sora, M. Scarlato, M. De Pellegrin, C. Godi, S. Giuliani, F. Ciotti, R. Tonlorenzi, I. Lorenzetti, C. Rivellini, S. Benedetti, R. Gatti, S. Marktel, B. Mazzi, A. Tettamanti, M. Ragazzi, M. A. Imro, G. Marano, A. Ambrosi, R. Fiori, M. P. Sormani, C. Bonini, M. Venturini, L. S. Politi, Y. Torrente & F. Ciceri. Correction: Intra-arterial transplantation of HLA-matched donor mesoangioblasts in Duchenne muscular dystrophy. Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy EMBO Molecular Medicine. 5 Novembre 2015 I.F.: 8.66

66

Chiara Villa, Vita Manzoli, MS a,h,+ ; Maria M. Abreu, PhD a ; Connor A. Verheyen b ; Michael Seskin b ; Mejdi Najjar, BS a ; R. Damaris Molano, DVM a ; Yvan Torrente, MD f,g ; Camillo Ricordi, MD, PhD a,b,c,d,e ; Alice A. Tomei, PhD a,b,c Effects of Composition of Alginate-Polyethylene Glycol Microcapsules and Transplant Site on Encapsulated Islet Graft Outcomes in Mice Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy Transplantation. 2016 Aug 12. I.F.: 3.828

Andrea Farini, Clementina Sitzia, Barbara Cassani, Letizia Cassinelli, Rosita Rigoni, Federica Colleoni, Nicola Fusco, Stefano Gatti, Pamela Bella, Chiara Villa, Filomena Napolitano, Rita Maiavacca , Silvano Bosari, Anna Villa and Yvan Torrente Therapeutic Potential of Immunoproteasome Inhibition in Duchenne Muscular Dystrophy

Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy Mol Ther . 2016 Nov;24(11):1898-1912 I.F.: 6.227

Clementina Sitzia, Andrea Farini, Luciana Jardim, Paola Razini, Marzia Belicchi, Letizia Cassinelli, Chiara Villa, Silvia Erratico, Daniele Parolini, Pamela Bella, Joao Carlos da Silva Bizario, Luis Garcia, Marcelo Dias-Baruffi, Mirella Meregall and Yvan Torrente Adaptive Immune Response Impairs the Efficacy of Autologous Transplantation of Engineered Stem Cells in Dystrophic Dogs Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy Mol Ther . 2016 Nov;24(11):1949-1964. I.F.: 6.227

Elena S. Mazzone, Giorgia Coratti, Maria Pia Sormani, Sonia Messina, Marika Pane, Adele D'Amico, Giulia Colia, Lavinia Fanelli, Angela BerardinelliAlice Gardani, Valentina Lanzillotta, Paola D ’Ambrosio, Roberta Petillo, Filippo Cavallaro, Silvia Frosini, Luca Bello, Serena Bonfiglio, Roberto De Sanctis, Enrica Rolle, Nicola Forcina, Francesca Magri, Gianluca Vita, Concetta Palermo, Maria Alice Donati, Elena Procopio, Maria Teresa Arnoldi, Giovanni Baranello, Tiziana Mongini ,Antonella Pini, Roberta Battini, Elena Pegoraro,Yvan Torrente, Stefano C. Previtali, Claudio Bruno, Luisa Politano, Giacomo P. Comi, MariaGrazia D ’ Angelo, Enrico Bertini, Eugenio Mercuri Timed Rise from Floor as a Predictor of Disease Progression in Duchenne Muscular Dystrophy: An Observational Study Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy PLoS One. 2016 Mar 16;11(3):e0151445. I.F.: 4.411

CAPITOLI DI LIBRO

Bioresorbable Polymers for Biomedical Applications From Fundamentals to Translational Medicine (Edited by Giuseppe Perale and Jons Hilborn)

Part Three Clinical and research and development (R&D) applications of bioresorbable polymers

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Cap 20 pag 469-486

Application of bioresorbable polymers in muscular system C. Villa, S. Erratico, M. Belicchi, Y. Torrente

Stem Cell Laboratory, Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico, Centro Dino Ferrari, Milan, Italy

ELENCO CONGRESSI 2016

1. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation) Therapeutic Potential of Immunoproteasome Inhibition in DMD.

A. Farini, C. Sitzia, B. Cassani B, R. Rigoni, N. Fusco, S. Gatti, P. Bella, C. Villa, F. Napolitano, R. Maiavacca, S. Bosari, A. Villa, Y. Torrente. INGM – POLICLINICO 3rd RESEARCH DAY . Padiglione Invernizzi, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico. Via F. Sforza 35, Milano. 16 Novembre 2016

2. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation) Therapeutic potential of immunoproteasome inhibition in Duchenne muscular dystrophy.

Farini, C. Sitzia, B. Cassani, L. Cassinelli, F. Colleoni, Y. Torrente, R. Rigoni, A. Villa, F. Napolitano and R. Maiavacca. FOCIS 2016. Boston, Massachusetts. 22-25 Giugno 2016

3. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation, Invited speaker) New frontiers in muscle diseases. Y. Torrente. VII Meeting Stem Cell Research Italy. Istituto Ortopedico Rizzoli, Bologna. 21-23 Giugno 2016

4. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation, Invited speaker) Stem Cells in muscle diseases. Y. Torrente. 2nd Congress of the European Academy of Neurology (EAN), Copenhagen, Danimarca. 28-31 Maggio 2016

5. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation) Exome sequencing identifies variants in two genes encoding the lim-proteins n-rap and fhl1

in a bag3 myofibrillar myopathy. F. De Santis, M. Meregalli, F. D’Avila, S. Luppoli, M. Barcella, A. Orro, C. Sitzia, A. Farini, P. D’Ursi, S. Erratico, L. Milanesi, D. Braga, D. Cusi, C. Barlassina, Y. Torrente. Myology 2016, 5th International Congress of Myology, Lyon Convention Centre, France. March 14-18, 2016

6. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation) Identification of miRNAs to improve myogenic differentiation of mesenchymal stem cells as regenerative therapy for Duchenne muscular dystrophy.

S. Banfi, P.Razini, S. Erratico, M. Meregalli, M. Belicchi, Y. Torrente. Myology 2016, 5th International Congress of Myology, Lyon Convention Centre, France. March 14-18, 20167.

7. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation)

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Adaptive immune response impairs the efficacy of autologous transplantation of engineered stem cells in dystrophic dogs.

C. Sitzia, A. Farini, L. Jardim, P. Razini, M. Belicchi, L. Cassinelli, C. Villa, S. Erratico, D. Parolini, J.C. da Silva Bizario, L. Garcia, M, Dias Baruffi, M. Meregalli, Y. Torrente. Myology 2016, 5th International Congress of Myology, Lyon Convention Centre, France. March 14-18, 20167.

8. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation) Fkrp rescue in blood-derived CD133+ cells isolated from patients affected by congenital muscular dystrophies.

P. Frattini, F. De Santis, P. Razini, S. Erratico, M. Belicchi, M. Meregalli, Y. Torrente. Myology 2016, 5th International Congress of Myology, Lyon Convention Centre, France. March 14-18, 2016

ELENCO DEI PROGETTI DI RICERCA FINANZIATI ED ANCORA IN CORSO 1)“Gene transfer of human frataxin protein (FXN) using engineered stem cells for the treatment of Friedreich’s ataxia (FRDA)” - Associazione “Ogni Giorno” - per Emma ONLUS, Associazione “Per il sorriso di Ilaria di Montebruno” ONLUS 2) “Studio dell’effetto anti-infiammatorio e immunomodulante di una miscela di flavonoidi ed acidi grassi naturali in modelli murini di distrofia muscolare” - Ricerca Corrente – Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano 3)“New international collaborative team on bag3 myofibrillar myopathy” - Fondazione Roby 5) Ricerca Finalizzata Ref. n. RF-2009-1547384 (2012-2014) "Design of a clinical trial using CD133-LV(U7)" 6) “Gene therapy for alpha-dystroglycan muscular dystrophy (MDC1C)” _Fondazione Opsis Onlus

ELENCO COLLABORAZIONI INTERNAZIONALI E NAZIONALI

- Luis Garcia, UPMC Um76, Inserm U974, CNRS UMR7215, Institut de Myologie, Paris, France

- Camillo Ricordi, Director of the Diabetes Research Institute (DRI) and the Cell Transplant Center, University of Miami (UM), Miami, Florida

- Giulio Cossu, Institute of Infalmmation and repair, University of Manchester, Manchester, UK

- Fulvio Mavilio, Scientific Director of Genethon, Evry, France - Pura Muñoz Cánoves, ICREA Research Professor and Cell Biology Professor at the

Department of Experimental and Life Sciences, Pompeu Fabra University, Barcelona, Spain

- Jacques Tremblay, Centre de recherche, Centre hospitalier de l’Université de Montréal, (CRCHUM), Montréal, Québec, Canada

- Joao da Silva Bizario, AADM/UNAERP Ribeirao Preto, Sao Paolo, Brazil - Humberto Cerrel Bazo, direttore Dipartimento Medicina riabilitativa AUSL Piacenza - Adolfo Lopez de Munain Arregui, Grupo Nerogenética, Hospital Donostia-Unidad

Experimental San Sebastian, Espana - Kay Davies, Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford,

Oxford, UK - Maurilio Sampaolesi, Stem Cell Research Institute, University Hospital Gasthuisberg,

Leuven, Belgium, Human Anatomy Section, University of Pavia, Pavia, Italy, Interuniversity Institute of Myology (IIM), Italy

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- Gillian Butler-Brown and Vincent Mouly, Institut de Myologie, Institut national de la sante´ et de la recherche me´ dicale, and L’Universite´ Pierre et Marie Curie Paris, Paris, France

- Giuseppe Perale, I.B.I. S/A, Svizzera, Dipartimento di Chimica, Materiali e Ingegneria Chimica "Giulio Natta" Sezione Chimica Fisica Applicata, Politecnico di Milano, Milano

- Roberto Maggi, Professore universitario di seconda fascia Fisiologia, Facoltà di Farmacia, Università degli Studi di Milano

- Mario Pellegrino, Prof. Associato presso il Dipartimento di Ricerca Traslazionale e delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia, Università di Pisa

- Daniele Cusi, Professore di Nefrologia, Università degli Studi di Milano - Cristina Barlassina, Dipartimento di Medicina, Chirurgia e Odontoiatria, Università degli

Studi di Milano - Anna Spada, U.O. di Endocrinologia e Diabetologia, Dipartimento di Scienze Mediche,

Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico - Irene Cettin, Direttore UO Complessa di Ostetricia e Ginecologia, Direttore Centro di

Ricerche Fetali Giorgio Pardi, Università degli Studi di Milano - Polo Universitario Ospedale L.Sacco di Milano

- Paola Rossi, Professore universitario per il settore scientifico disciplinare BIOO9 (Fisiologia Generale) presso il Dipartimento di Scienze Fisiologiche e Farmacologiche cellulari e molecolari- Sezione di Fisiologia dell’Università di Pavia.

- Angelo Poletti, Biologia Applicata, Università degli Studi di Milano, Facoltà di Farmacia, Università degli tudi di Milano

- Silvio Bicciato, bioinformatics unit, Faculty of Biosciences and Biotechnologies, University of Modena and Reggio Emilia

- Enrico Tagliafico , clinical Biochemistry, University of Modena and Reggio Emilia - Sergio Abrignani, direttore del National Institute of Molecular Genetics (INGM), Milan,

Italy - Silvano Bosari, direttore UOC Anatomia Patologica, Fondazione IRCCS Ca’ Granda

Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano

- Carlo Agostoni, Direttore della Clinica Pediatrica II dell’Università degli Studi, IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano

- Lorenza Lazzari e Rosaria Giordano, Cell Factory Center for Transfusion Medicine, Cell Therapy and Criobiology, Department of Regenerative Medicine, Fondazione IRCCS Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano

- Agostino Cortelezzi, direttore UOC Ematologia I e Centro Trapainti Midollo, Fondazione IRCCS Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico

- Giuseppe D’Antona, Department of Molecular Medicine, University of Pavia, Pavia, Italy LUSAMMR, Laboratory for Motor Activities in Rare Diseases, Sport Medicine, Centre Voghera, Voghera, Italy

- Enzo Nisoli, Center for Study and Research on Obesity, Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan, Milan, Italy;

- Dario Parazzoli, Imaging Facility IFOM Foundation – The FIRC Institute of Molecular Oncology Foundation, Milan, Italy

- Stefano Campaner, Center for Genomic Science of IIT@SEMM; Istituto Italiano di Tecnologia (IIT); Milan, Italy

- Francesco Nicassio, Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology, IFOM-IEO Campus

- Luciano Conti, Laboratory of Stem Cell Biology, CiBio, Università di Trento - Alessandro Quattrone, Director of CiBio, University of Trento

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- Elena Cattaneo, Department of Biosciences and Centre for Stem cell Research, Università degli Studi di Milano

- Giovanna Cantarella, Dirigente Medico Otorinolaringoiatra e Foniatra, Padiglione Monteggia, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano

- Mauro Pluderi e Nadia Grimoldi, UO Neurochirurgia, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano

- Paolo Vezzoni, Dirigente di Ricerca e Responsabile dell’Unità Operativa di Supporto (UOS) dell’Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica (IRGB) del CNR.

- Marina Bouchè, Unit of Histology, and IIM, Sapienza University, DAHFMO, Rome, Italy

- Davide Gabellini, Dulbecco Telethon Institute and Division of Regenerative Medicine, San Raffaele Scientific Institute, Milan

- Franco Rustichelli, Dipartimento di Scienze Cliniche e Odontostomatologiche, Sezione di Biochimica, Biologia e Fisica, Università Politecnica delle Marche, Ancona, Italy

- Silvia Della Bella, Lab of Clinical and Experimental Immunology, Humanitas Clinical and Research Center, Rozzano (MI), Italy, Department of Medical Biotechnologies and Translational Medicine, University of Milan, Milan, Italy

- Aldo Pagano, Department of Experimental Medicine,UniversityofGenoa,Genoa,Italy, IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria SanMartino-IST, Genoa, Italy

- Francesco Meinardi , Professore di Fisica della Materia, l’Università di Milano Bicocca - Jose F Rodriguez-Matas-, Associate professor, LabS (www.labsmech.polimi.it)

Chemistry, Materials and Chemical Engineering Department “Giulio Natta”Politecnico di Milano, Italy

- Giorgio Roberto Merlo, Dipartimento di Biotecnologie Molecolari e Scienze per la salute-Università di Torino

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U.O.S.D. MALATTIE NEUROMUSCOLARI e RARE

• Direttore: • M. Moggio: Dirigente Medico Fondazione – Neurologo, direttore UOD malattie neuromuscolari e rare e direttore ”Banca tessuto muscolare scheletrico, nervo periferico, DNA e colture cellulari” • Collaboratori: • M. Sciacco: Dirigente Medico Fondazione - Neurologo, Dottore di ricerca in Scienze Neurologiche, co-responsabile ”Banca tessuto muscolare scheletrico, nervo periferico, DNA e colture cellulari” • G. Fagiolari: Biologo - Tecnico ospedaliero Fondazione • P. Ciscato: Tecnico ospedaliero Fondazione • L. Napoli: Biologo - Borsista Telethon (fino a luglio 2016) • M. Ripolone: Biologo - Borsista Fondazione • R. Violano: Biologo - Borsista Fondazione • L. Peverelli: Neurologo - Borsista Telethon • L. Villa: Specializzanda in Neurologia • P. Valentini: Architetto - amministrativa - Borsista Telethon • R. Tironi: Tecnico - Borsista Telethon • E. Conca: Biologo - Borsista Telethon (da ottobre 2016)

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ATTIVITÀ DIAGNOSTICA

1) Nell'anno 2016 l’attività assistenziale riguardante le malattie neuromuscolari è sovrapponibile a quella dell’anno precedente. In particolare:

- effettuate n. 1060 visite nell’ambulatorio per le malattie neuromuscolari in collaborazione con la UO di Neurologia.

- effettuati n. 310 accessi in regime MAC per le suddette patologie.

2) Nell'anno 2016 l’attività assistenziale riguardante le malattie neuromuscolari è sovrapponibile a quella dell’anno precedente. In particolare:

- effettuate n. 1060 visite nell’ambulatorio per le malattie neuromuscolari in collaborazione con la UO di Neurologia.

- effettuati n. 310 accessi in regime MAC per le suddette patologie.

3) Attività del Laboratorio per la diagnosi e lo studio delle Malattie Neuromuscolari: - studiate e refertate 250 biopsie muscolari e 20 biopsie di nervo.

I prelievi bioptici afferiscono al laboratorio della UOSD Malattie Neuromuscolari e Rare della Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico provenienti da: � UOC di Neurologia � UOSD Malattie Neuromuscolari e Rare � Dipartimento di Medicina della Fondazione � Altri Dipartimenti della Fondazione � Altri Ospedali quali: Ospedale S. Gerardo di Monza, Istituto Auxologico-Ospedale

San Luca, Istituto Mondino di Pavia, Istituto Humanitas, Istituto Don Gnocchi di Milano, Ospedale San Paolo, Ospedale Sacco, Ospedale Valduce di Como, Ospedale Cantonale di Lugano, Ospedale di Niguarda, Ospedale di Desio, Ospedale di Lugo di Romagna, Ospedale di Faenza, Ospedale di Ravenna, Ospedale di Rimini, Ospedale di Gallarate, Ospedale di Busto Arsizio, Ospedale di Melegnano, Ospedale di Ravenna, Ospedale di Vimercate, Ospedale di Legnano, Ospedale Policlinico di Pavia, Ospedale Santa Corona di Garbagnate e occasionalmente da altre strutture ospedaliere.

Regolari Convenzioni o regime di “fatturazione” intercorrono fra il Servizio di Diagnostica e i citati Enti ospedalieri.

4) Attività della “Banca di tessuti muscolari, nervo periferico, DNA e colture cellulari” della UOSD:

- Sono state effettuate spedizioni di campioni biologici di pazienti affetti da malattie Rare Neuromuscolari a n. 27 centri di diagnostica e ricerca sia nazionali sia internazionali.

- Sono state effettuate spedizioni per un totale di n. 123 campioni biologici (tessuti muscolari, DNA, colture).

Il laboratorio provvede alla tecnicazione delle biopsie, alla refertazione delle medesime, alla loro conservazione nella Biobanca della UOSD e alla spedizione dei referti ai vari enti ospedalieri.

� Dall’anno 1999 il Laboratorio ha avuto il riconoscimento di “Biobanca Telethon di tessuto muscolare scheletrico, nervo periferico, DNA e colture cellulari”. I diversi campioni biologici stoccati nella banca sono a disposizione dei ricercatori italiani e

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stranieri interessati e sono elencati in un dedicato sito web: http://www.centrodinoferrari.com/laboratori/u-o-d-diagnostica-malattie-neuromuscolari-e-rare/.

� Dall’anno 2001 la banca è parte dell’EuroBiobank, un network di banche di Istituti scientifici di diversi paesi della Comunità Europea. � Dall’anno 2002 la banca è anche parte del Progetto Finalizzato dell’Ospedale Maggiore “Bioredepositary”. � Dal Luglio 2002 l’Unità operativa ha ottenuto la certificazione ISO 9001:2000 per

“Progettazione ed erogazione di servizi di diagnostica morfologica e ricerca nell’ambito di malattie rare neuromuscolari, in regime di degenza, ambulatoriale e in convenzione per enti terzi. Gestione di una Banca di tessuto muscolare, nervo periferico e DNA”. � Dal 2008 è partner del “Telethon Network of Genetic Biobanks”. � Da Luglio 2013 è entrata a far parte dell’Infrastruttura di ricerca europea Biobanking

and Biomolecular Resources Research Infrastructure (BBMRI). � Dal 2013 la Biobanca è parte di RD-Connect.

Biopsie Muscolari

Microscopia ottica Durante l’anno 2016 sono state eseguite n. 250 biopsie muscolari indagate con metodiche istologiche, istoenzimatiche e immunoistochimiche. Tutte le biopsie di pazienti col sospetto clinico di distrofia sono state studiate anche con metodiche immunologiche con anticorpi contro le varie proteine coinvolte in queste patologie (distrofina, merosina, sarcoglicani, disferlina, caveolina, emerina, alfadistroglicano, miotilina, desmina, etc.). Tutte le biopsie di pazienti col sospetto di patologia infiammatoria sono state studiate mediante specifici markers immunocitochimici. In particolare, sono stati utilizzati anticorpi anti-HLA 1 (A,B,C), anti-membrane attack complex, anti-linfociti T (CD4 e CD8) e anti-B (CD 19). Biopsie con il sospetto di IBM vengono studiate con la colorazione Rosso Congo. In totale, relativamente a quanto sopra specificato, sono stati eseguiti 3178 tests.

Microscopia elettronica Le biopsie muscolari sono state studiate con metodiche ultrastrutturali quando ritenuto necessario e sono stati eseguiti 43 tests. In particolare, vengono studiate tutte le biopsie di pazienti affetti da miopatie dismetaboliche per la conferma delle seguenti diagnosi: glicogenosi, lipidosi, mitocondriopatie, miopatie a corpi inclusi e miopatie congenite. Sono infine analizzate tutte le biopsie nelle quali gli studi istologici, istoenzimologici, biochimici e genetici non sono indicativi di una particolare miopatia.

Biopsie di nervo

Microscopia ottica Durante l’anno 2016 sono state eseguite n. 20 biopsie di nervo periferico. Tutti i prelievi bioptici sono studiati su sezioni criostatiche con le comuni metodiche istologiche e su sezioni semifini incluse in resina per la microscopia elettronica colorate con blu di toluidina, sono stati eseguiti 96 tests (istologia e reazioni immunocitochimiche). Viene eseguita una valutazione quantitativa della densità delle fibre mieliniche con apposito analizzatore di immagini su sezioni semifini.

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Di tutte le biopsie vengono allestite apposite preparazioni atte all’analisi di singole fibre nervose isolate (metodica del teasing) e per ogni paziente se ne studiano almeno 100. Nelle biopsie di nervo con sospetto di patologia infiammatoria vengono inoltre eseguiti studi immunoistochimici con Abs anti HLA, MAC e linfociti. Nel sospetto di patologia da accumulo di amiloidosi viene eseguita la colorazione per il rosso Congo.

Microscopia elettronica Le biopsie di nervo sono state incluse in resine epossidiche e tecnicate per le osservazioni in microscopia elettronica, per l’isolamento delle singole fibre nervose e per la valutazione quantitativa della densità fibrale. A tal fine sono stati eseguiti circa 80 tests (sezioni semifini e griglie per ultrastruttura). In particolare vengono studiate tutte le biopsie nelle quali gli esami istologici e quantitativi non riescono ad indirizzare la diagnosi verso una particolare neuropatia.

ATTIVITÀ DI RICERCA

L'attività di ricerca è stata condotta utilizzando gli stessi laboratori e apparecchi impiegati per la diagnostica neuromuscolare. Anche i reagenti utilizzati sono, almeno per l’80%, quelli comunemente impiegati per la diagnostica. L’attività di ricerca ha prodotto nel 2016 i seguenti risultati:

SETTORE URGENZA – EMERGENZA

Linea 1 Epidemiologia Clinica

Magri F, Nigro V, Angelini C, Mongini T, Mora M, Moroni I, Toscano A, D'angelo MG, Tomelleri G, Siciliano G, Ricci G, Bruno C, Corti S, Musumeci O, Tasca G, Ricci E, Monforte M, Sciacco M, Fiorillo C, Gandossini S, Minetti C, Morandi L, Savarese M, Fruscio GD, Semplicini C, Pegoraro E, Govoni A, Brusa R, Del Bo R, Ronchi D, Moggio M, Bresolin N, Comi GP. The italian limb girdle muscular dystrophy registry: Relative frequency, clinical features, and differential diagnosis. Muscle Nerve. 2016 May 17. doi: 10.1002/mus.25192. [Epub ahead of print]. IF 2.713

Il lavoro multicentrico ha raccolto I pazienti affetti da distrofia dei cingoli seguiti in pratica in tutti i centri italiani dedicati alle malattie neuromuscolari e ne ha definite le caratteristiche cliniche e molecolari.

Savarese M, Di Fruscio G, Torella A, Fiorillo C, Magri F, Fanin M, Ruggiero L, Ricci G, Astrea G, Passamano L, Ruggieri A, Ronchi D, Tasca G, D'Amico A, Janssens S, Farina O, Mutarelli M, Marwah VS, Garofalo A, Giugliano T, Sanpaolo S, Del Vecchio Blanco F, Esposito G, Piluso G, D'Ambrosio P, Petillo R, Musumeci O, Rodolico C, Messina S, Evilä A, Hackman P, Filosto M, Di Iorio G, Siciliano G, Mora M, Maggi L, Minetti C, Sacconi S, Santoro L, Claes K, Vercelli L, Mongini T, Ricci E, Gualandi F, Tupler R, De Bleecker J, Udd B, Toscano A, Moggio M, Pegoraro E, Bertini E, Mercuri E, Angelini C, Santorelli FM, Politano L, Bruno C, Comi GP, Nigro V. The genetic basis of undiagnosed muscular dystrophies and myopathies: Results from 504 patients. Neurology. 2016 Jul 5;87(1):71-6. doi: 10.1212/WNL.0000000000002800. IF 8.166

Il lavoro multicentrico ha raccolto i pazienti affetti da malattie neuromuscolari diagnosticate sotto il profilo molecolare o non diagnosticate, e seguiti nella maggior parte dei centri italiani

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dedicati alle malattie neuromuscolari, e ne ha definito con metodiche di Next Generation Sequencies (NGS) le caratteristiche molecolari definendo la frequenza delle diverse malattie.

Ricci G, Ruggiero L, Vercelli L, Sera F, Nikolic A, Govi M, Mele F, Daolio J, Angelini C, Antonini G, Berardinelli A, Bucci E, Cao M, D'Amico MC, D'Angelo G, Di Muzio A, Filosto M, Maggi L, Moggio M, Mongini T, Morandi L, Pegoraro E, Rodolico C, Santoro L, Siciliano G, Tomelleri G, Villa L, Tupler R. A novel clinical tool to classify facioscapulohumeral muscular dystrophy phenotypes. J Neurol. 2016 Jun;263(6):1204-14. doi: 10.1007/s00415-016-8123-2. IF 3.408 Il lavoro ha modificato una preesistente scala di valutazione clinica di pazienti affetti da distrofia Facio Scapolo Omerale con la finalità di definire in modo più preciso i diversi fenotipi clinici in modo da meglio correrarli con i dati genetico-molecolari.

Piga D, Magri F, Ronchi D, Corti S, Cassandrini D, Mercuri E, Tasca G, Bertini E, Fattori F, Toscano A, Messina S, Moroni I, Mora M, Moggio M, Colombo I, Giugliano T, Pane M, Fiorillo C, D'Amico A, Bruno C, Nigro V, Bresolin N, Comi GP. New Mutations in NEB Gene Discovered by Targeted Next-Generation Sequencing in Nemaline Myopathy Italian Patients. J Mol Neurosci. 2016 Jul;59(3):351-9. doi: 10.1007/s12031-016-0739-2. IF 2.352

Il lavoro rappresenta una caratterizzazione molecolare, tramite la metodica Targeted Next-Generation Sequencing, di pazienti affetti da Miopatia Nemalinica.

Mancuso M, Orsucci D, Angelini C, Bertini E, Carelli V, Comi GP, Federico A, Minetti C, Moggio M, Mongini T, Tonin P, Toscano A, Bruno C, Ienco EC, Filosto M, Lamperti C, Diodato D, Moroni I, Musumeci O, Pegoraro E, Spinazzi M, Ahmed N, Sciacco M, Vercelli L, Ardissone A, Zeviani M, Siciliano G. "Mitochondrial neuropathies": A survey from the large cohort of the Italian Network. Neuromuscul Disord. 2016 Apr-May;26(4-5):272-6. doi: 10.1016/j.nmd.2016.02.008. IF 3.107

Il lavoro descrive la caratterizzazione clinica, bioptica e genetica di pazienti affetti da muiopatia mitocondriale seguiti dal network italiano dedicato a tale sindrome dismetabolica.

Nikolic A, Ricci G, Sera F, Bucci E, Govi M, Mele F, Rossi M, Ruggiero L, Vercelli L, Ravaglia S, Brisca G, Fiorillo C, Villa L, Maggi L, Cao M, D'Amico MC, Siciliano G, Antonini G, Santoro L, Mongini T, Moggio M, Morandi L, Pegoraro E, Angelini C, Di Muzio A, Rodolico C, Tomelleri G, Grazia D'Angelo M, Bruno C, Berardinelli A, Tupler R. BClinical expression of facioscapulohumeral muscular dystrophy in carriers of 1-3 D4Z4 reduced alleles: experience of the FSHD Italian National Registry. MJ Open. 2016 Jan 5;6(1):e007798. doi: 10.1136/bmjopen-2015-007798. IF 2.562

Il lavoro descrive la frequenza e le caratteristiche fenotipiche di espressione della distrofia Facio Scapolo Omerale in familiari di pazienti affetti da tale malattia. Le famiglie esaminate hanno evidenziato come i casi sporadici siano molto elevati e come la trasmissione della malattia sia massima nella prima generazione.

Musumeci O, la Marca G, Spada M, Mondello S, Danesino C, Comi GP, Pegoraro E, Antonini G, Marrosu G, Liguori R, Morandi L, Moggio M, Massa R, Ravaglia S, Di Muzio A, Filosto M, Tonin P, Di Iorio G, Servidei S, Siciliano G, Angelini C, Mongini T, Toscano A; Italian GSD II group.. LOPED study: looking for an early diagnosis in a late-onset Pompe disease high-risk population.

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J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2016 Jan;87(1):5-11. doi: 10.1136/jnnp-2014-310164. IF 6.431

Il lavoro ha analizzato le caratteristiche cliniche dei pazienti affetti da malattia di Pompe e seguiti dal network italiano dedicato a tale malattia con particolare attenzione riguardo la modalità di insorgenza della malattia, i sintomi di esordio ed il tempo che intercorre fra la loro comparsa e la diagnosi.

SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGA NI E TESSUTI Linea 6 Neuroscienze cliniche e di base

Pambianco S, Giovarelli M, Perrotta C, Zecchini S, Cervia D, Di Renzo I, Moscheni C, Ripolone M, Violano R, Moggio M, Bassi MT, Puri PL, Latella L, Clementi E, De Palma C. Reversal of Defective Mitochondrial Biogenesis in Limb-Girdle Muscular Dystrophy 2D by Independent Modulation of Histone and PGC-1α Acetylation.

Cell Rep. 2016 Dec 13;17(11):3010-3023. doi: 10.1016/j.celrep.2016.11.044. IF 7.870

In questo lavoro è stata caratterizzata la disfunzione mitocondriale nel modello murino alfa sarcoglicano e in pazienti affetti da LGMD2D. È stata dimostrata un’alterata biogenesi mitocondriale e una ridotta capacità ossidativa della catena respiratoria. Due distinti approcci terapeutici ristabiliscono il corretto numero di mitocondri e la loro funzionalità: l’utilizzo della TSA (Trichostatin A) e l’utilizzo di NO (ossido nitrico). Lerario A, Colombo I, Milani D, Peverelli L, Villa L, Del Bo R, Sciacco M, Comi GP, Esposito S, Moggio M. A case report with the peculiar concomitance of 2 different genetic syndromes. Medicine (Baltimore). 2016 Dec;95(49):e5567. IF 4,256

Il lavoro descrive l’insolita associazione di trisomia 21 con delezione del gene della Distrofina in un ragazzo di 10 anni.

Baldo C, Casareto L, Renieri A, Merla G, Garavaglia B, Goldwurm S, Pegoraro E, Moggio M, Mora M, Politano L, Sangiorgi L, Mazzotti R, Viotti V, Meloni I, Pellico MT, Barzaghi C, Wang CM, Monaco L, Filocamo M. The alliance between genetic biobanks and patient organisations: the experience of the telethon network of genetic biobanks. Orphanet J Rare Dis. 2016 Oct 24;11(1):142. IF 3.290

Il lavoro esamina gli aspetti relativi alle collaborazioni fra Associazioni di Pazienti e Biobanche Genetiche e i vantaggi che da tali collaborazioni possano derivare per i pazienti. In dettaglio è descritta l’esperienza del Telethon Network of Genetic Biobanks.

Gang Q, Bettencourt C, Machado PM, Brady S, Holton JL, Pittman AM, Hughes D, Healy E, Parton M, Hilton-Jones D, Shieh PB, Needham M, Liang C, Zanoteli E, de Camargo LV, De Paepe B, De Bleecker J, Shaibani A, Ripolone M, Violano R, Moggio M, Barohn RJ, Dimachkie MM, Mora M, Mantegazza R, Zanotti S, Singleton AB, Hanna MG, Houlden H; Muscle Study Group and The International IBM Genetics Consortium.. Rare variants in SQSTM1 and VCP genes and risk of sporadic inclusion body myositis. Neurobiol Aging. 2016 Nov;47:218.e1-218.e9. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2016.07.024. IF 5.153

Il lavoro multicentrico descrive le varianti molecolari associate ai geni SQSTM1 and VCP e la loro frequenza in casi sporadici di miopatia a corpi inclusi (IBM)

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Ferrara AM, Sciacco M, Zovato S, Rizzati S, Colombo I, Boaretto F, Moggio M, Opocher G. Coexistence of VHL Disease and CPT2 Deficiency: A Case Report. Cancer Res Treat. 2016 Oct;48(4):1438-1442. IF 4.245

Il lavoro descrive l’insolita associazione fra malattia di Von Hippel-Lindau e deficit di Carnitin Palmitoil Transferasi in un paziente che presentava una importante intolleranza all’esercizio fisico.

Bettica P, Petrini S, D'Oria V, D'Amico A, Catteruccia M, Pane M, Sivo S, Magri F, Brajkovic S, Messina S, Vita GL, Gatti B, Moggio M, Puri PL, Rocchetti M, De Nicolao G, Vita G, Comi GP, Bertini E, Mercuri E. Histological effects of givinostat in boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 2016 Oct;26(10):643-649. doi: 10.1016/j.nmd.2016.07.002. IF 3.107

Il lavoro multicentrico analizza gli effetti della terapia con Givinostat su una coorte di pazienti affetti da Distrofia di Duchenne. In particolare vengono indagati gli effetti istopatologici sulla biopsia muscolare alla quale sono stati sottoposti tutti i pazienti sia prima di iniziare la terapia sia a fine trattamento.

Onesto E, Colombrita C, Gumina V, Borghi MO, Dusi S, Doretti A, Fagiolari G, Invernizzi F, Moggio M, Tiranti V, Silani V, Ratti A. Gene-specific mitochondria dysfunctions in human TARDBP and C9ORF72 fibroblasts. Acta Neuropathol Commun. 2016 May 5;4(1):47. doi: 10.1186/s40478-016-0316-5. IF 2.665

Il lavoro sperimentale analizza l’espressione di TDP43 su fibroblasti di pazienti affetti da una rara malattia del motoneurone, determinata da una alterazione del gene C9ORF72.

Pichiecchio A, Berardinelli A, Moggio M, Rossi M, Balottin U, Comi GP, Bastianello S. Asymptomatic Pompe disease: Can muscle magnetic resonance imaging facilitate diagnosis? Muscle Nerve. 2016 Feb;53(2):326-7. doi: 10.1002/mus.24936. No abstract available. IF 2.713

Il lavoro analizza il ruolo della NMR muscolare, in pazienti affetti dalla forma tardiva di malattia di Pompe, con particolare attenzione alle possibilità diagnostiche che la metodica offre.

Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Cinnante CM, Fagiolari G, Ciscato P, Bordoni A, Fortunato F, Magri F, Previtali SC, Velardo D, Sciacco M, Comi GP, Moggio M. Longitudinal follow-up and muscle MRI pattern of two siblings with polyglucosan body myopathy due to glycogenin-1 mutation. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2016 Jul;87(7):797-800. doi: 10.1136/jnnp-2015-310553. No abstract available. IF 6.431

Il lavoro descrive gli aspetti clinici, di NMR encefalo e bioptici muscolari in due pazienti affetti da una rara forma di encefalomiopatia dovuta ad alterazioni del gene Glicogenina-1.

PROGETTI IN CORSO:

� Prosegue il progetto “Correlazioni genotipo fenotipo nella distrofia Facio Scapolo Omerale (FSHD)” nell’ambito del Consorzio Italiano per la FSHD con particolare attenzione per i casi con “aplotipi permissivi” A166. Lo studio è condotto su 23 famiglie che appartengono ai circa 700 casi indice studiati in corso del precedente progetto. Si tratta di un progetto in collaborazione con tutti i centri presenti in Italia che seguono

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pazienti affetti da tale malattia e che sono riuniti nel Telethon network of FSHD. E’ iniziato uno studio relativo all’espressione della malattia in familiari di pazienti affetti da FSHD. Sono al momento analizzate 34 famiglie.

� È in fase di validazione la messa a punto di una nuova e aggiornata scheda di valutazione clinica di pazienti affetti da FSHD che, rispetto a quella in uso, permette un maggior dettaglio clinico e quindi migliori correlazioni genotipiche. Il progetto è in pratica ultimato e si è passati all’applicazione della nuova scheda nei centri del network.

� Prosegue il percorso per un consenso attinente i requisiti diagnostici dei pazienti affetti da FSHD2, ovvero tutti quei pazienti che, pur presentando un quadro clinico compatibile con la distrofia FSHD, non sono portatori di una contrazione dell’allele D4Z4.

� Continua lo studio di una famiglia composta da due germani, un maschio di 30 anni e una femmina di 23 anni, entrambi affetti da distrofia facio-scapolo omerale (FSHD) con compromissione clinica rispettivamente moderata e lieve. Entrambi sono portatori di un frammento corto D4Z4 sul cromosoma 4q35 considerato diagnostico della patologia in questione. Anche la madre e il nonno materno presentano lo stesso difetto genetico, ma non sono clinicamente compromessi. Ciò potrebbe essere spiegato da una penetranza incompleta della patologia, in alternativa, potrebbe trattarsi di una forma a trasmissione autosomica recessiva nella quale il frammento corto D4Z4, ereditato in questo caso per via materna, unitamente ad un fattore genetico sconosciuto ereditato per via paterna, determina la malattia. Nel corso dell’ultimo anno, i risultati di uno studio di Next Generation Sequencing (NGS) hanno evidenziato nei probandi una serie di alterazioni in eterozigosi di geni responsabili di altre malattie neuromuscolari

� Proseguono le indagini bioptiche morfologiche e biochimiche in pazienti affetti da Glicogenosi di tipo II che assumono terapia con enzima ricombinante (ERT Therapy). Lo studio è coordinato dal nostro laboratorio assieme ai colleghi dell’Istituto Besta e prevede una analisi bioptica muscolare dopo 6 mesi, un anno e due anni dall’inizio della terapia. Oltre alle valutazioni morfologiche ed ultrastrutturali classiche, verrà indagato il sistema fagosomi/lisosomi con reazioni immunocitochimiche nonché eseguito un dosaggio biochimico dell’enzima alpha glicosidasi. Si tratta di un progetto multicentrico che coinvolge tutte le UUOO che in Italia somministrano enzima ricombinante a pazienti affetti da glicogenosi tipo II. Il progetto, iniziato due anni fa, è proseguito nel 2013 con l’acquisizione di 19 seconde biopsie provenienti, oltre che dal nostro Istituto, dai centri nazionali parte del network. Sono in corso le valutazioni sopraindicate e confermiamo i risultati preliminari che sembrano attestare l’efficacia della terapia. Nel corso dell’ultimo anno il numero di pazienti è aumentato a 18. In tutti è stato dimostrato un incremento dell’attività enzimatica GAA nelle seconde biopsie e in nove di questi, tramite metodica di WB, è stato dimostrato un incremento della proteina GAA nelle seconde biopsie. I risultati saranno a breve pubblicati, attualmente il lavoro è “under revision”.

� Continua la rivalutazione retrospettiva di biopsie muscolari della nostra Banca per evidenziare miopatie indotte da mutazioni nei geni che causano miopatie miofibrillari e miopatie congenite”. Il progetto ha assunto le caratteristiche di un progetto multicentrico che coinvolge alcuni dei laboratori italiani che si dedicano a tali patologie.

� E’ stato completato il progetto “Analisi biochimica, istologica e test comportamentali per lo studio della glicogenosi di tipo III nel modello murino knockout Agl” in collaborazione con il Prof. Comi Giacomo Pietro, Laboratorio di Genetica e Biochimica - Dipartimento di Scienze Neurologiche dell’Università di Milano – Fondazione IRCCS Ca' Granda – Ospedale Maggiore Policlinico di Milano. Abbiamo iniziato lo studio dei

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modelli knockout, trattati con terapia retro virale (adenovirus), per verificare se tale terapia porti ad una diminuzione delle vaste raccolte di glicogeno libero intramuscolare. In particolare, nel corso dell'ultimo anno, abbiamo esaminato gli effetti della dieta ad alto contenuto proteico e del ripristino dell'attività enzimatica con adenovirus. Il lavoro è attualmente in corso di pubblicazione.

� La UOD Malattie Neuromuscolari è stata accreditata dalla UE per partecipare agli ERN europei dedicati alle “Neurumuscular Rare Diseases” e alle “Muscoloskeletal connective Diseases”.

FINANZIAMENTI IN CORSO:

� Ministero della Salute Ricerca Corrente 2017 “Follow-up di pazienti affetti da Malattia di Pompe in trattamento con terapia enzimatica sostitutiva”.

� Telethon Network “Progetto Telethon Network of Genetic Biobanks” anni 2014-2018

� Telethon Network “Development of the Italian National Registry for FSHD” anni 2014-2017

� Telethon Network “Building a Nation-wide Italian collaborative network for muscle glycogenoses: registry and natural history” anni 2015-2016 Concluso a giugno 2016.

� Collaborazione con IRCCS Auxologico Italiano al progetto di ricerca finalizzata dal titolo "Understanding the biological continuum between Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Fronto-temporal dementia (FTD): a step towards a more efficient assistance model for the affected patients" - Resp. Scientifico UOSD Dr. Maurizio Moggio

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SEDE DISTACCATA DEL “CENTRO DINO FERRARI” - UNIVERS ITÀ DEGLI STUDI DI MILANO presso U.O. NEUROLOGIA – STROKE UNIT

LABORATORIO DI NEUROSCIENZEUNIVERSITÀ DEGLI STUDI D I MILANO IRCCS ISTITUTO AUXOLOGICO ITALIANO

Responsabile Prof. Dott. Vincenzo Silani U.O. Neurologia: Dott.ssa Laura Adobbati Dirigente I° Livello – Stroke Unit IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott. Luca Maderna Dirigente I° Livello - Neurofisiologia IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott. Stefano Messina Dirigente I° Livello - Neurologia IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott. Andrea Ciammola Dirigente I° Livello - Neurologia IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott. Barbara Corrà Dirigente I° Livello – Stroke Unit IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott. Nicola Ticozzi Ricercatore Universitario Neurologia Università degli Studi di Milano IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Claudia Morelli Dirigente I° Livello - Neurologia IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott. Luca Campana Neurologo, Contrattista in Convenzione IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott. Riccardo Doronzo Neurologo, Consulente in Convenzione IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Carolina Lombardi Dirigente I° Livello - Centro Sonno IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Paola Mattaliano Dirigente I° Livello - Centro Sonno IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott. Niccolò Mencacci Neurologo, Dottorato – UCL Institute of Neurology- Londra

Dott. Alberto Doretti Neurologo, Consulente in Convenzione IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott. Federico Verde Specializzando in Neurologia Università degli Studi di Milano IRCCS Istituto Auxologico Italiano

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Dott. Davide Sangalli Specializzando in Neurologia Università degli Studi di Milano

IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott. Ignazio Keller Sarmiento Specializzando in Neurologia Università degli Studi di Milano

IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Barbara Poletti Dirigente I° Livello - Psicologia IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott.ssa Annalisa Lafronza Psicologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott. Laura Carelli Psicologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Federica Solca Psicologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott. Paolo Banfi Pneumologo, Consulente in Convenzione IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Barbara Riccardi Tecnico neurofisiologa IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Francesca Gregorini Tecnico neurofisiologa IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Patrizia Nelli Segreteria Scientifica U.O. Neurologia IRCCS Istituto Auxologico Italiano Laboratorio di Neuroscienze Dott.ssa Antonia Ratti Biologa, Ricercatore Universitario

Università degli Studi di Milano IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Lidia Cova Biologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Isabella Fogh Biologa Genetista, Contratto di Consulenza IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Patrizia Bossolasco Biologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Claudia Colombrita Biologa, Assegni di ricerca Post doc -Tipo A Università degli Studi di Milano

IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Cinzia Tiloca Biotecnologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano

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Dott.ssa Valentina Gumina Biologa, Dottoranda Universitàà degli Studi di Milano IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Annamaria Maraschi Biologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Dott.ssa Francesca Sassone Biologa, Contrattista a Progetto IRCCS Istituto Auxologico Italiano

Rapporti di collaborazione:

Nazionali:

Prof. Nereo Bresolin, Prof. Giacomo Comi Centro “Dino Ferrari” Dott.Maurizio Moggio, Prof. Elio Scarpini IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico Dott.ssa Daniela Galimberti, Prof.ssa Stefania Corti, Dott. Roberto Del Bo Dott.ssa Cinzia Gellera, Dott. Franco Taroni IRCCS Istituto C. Besta, Milano Dott. Giuseppe Lauria, Dott.FrabrizioTagliavini Dott.ssa Lorenza Lazzari, IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico Prof. Giorgio Lambertenghi Dott. Fabio Blandini, IRCCS Istituto Mondino, Pavia Dott.ssa Cristina Cereda Dott. Christian Lunetta, Centro Clinico Nemo Dott.ssa Valeria Sansone Prof. Luca Persani Dipartimento di Endocrinologia IRCCS Istituto Auxologico Italiano Dott. Luigi Sironi, Dott. A.E. Rigamonti, Dipartimento di Farmacologia Università di Milano - CEND Prof. Fabio Triulzi IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico Dott. Alessandro Sillani Dott.ssa Clara Sina Prof. Massimo Filippi Neuroimaging Research Unit and Dott. ssa Federica Agosta Department of Neurology, Prof. Giancarlo Comi Institute of Experimental Neurology, Division of Neuroscience San Raffaele Scientific Institute, Milan Prof. Andrea Falini Department of Neuroradiology,

Vita-Salute University and San Raffaele Scientific Institute, Milan

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Internazionali: Prof. Robert H. Brown, John Landers University of Massachussetts Medical School of Boston

Prof. Albert Ludolph Università di Ulm, Germania Dipartimento di Neurologia

Prof. Ammar Al-Chalabi, Christopher Shaw King’s College, London Prof. John Powell Dipartimento di Neurologia

Prof. Leonard Petrucelli Mayo Clinic, Florida, USA Department of Neurology

Prof. Markus Weber Dipartimento di Neurologia Università di St. Gallen, Svizzera

Prof. Dale J. Lange Department of Neurology New York – USA Prof. Hiroshi Mitsumoto Department of Neurology Eleanor and Lou Gehrig MDA/ALS Research Center Columbia University Medical Center New York – USA

Prof. Merit E. Cudkowicz Neuromuscular Division Neurology

Massachusetts General Hospital Boston – USA

Prof. Stanley H. Appel Department of Neurology Methodist Neurological Institute Chair Houston -USA

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La Sede Distaccata del Centro "Dino Ferrari" presso la U.O. di Neurologia e Laboratorio di Neuroscienze dell' Università di Milano - IRCCS Istituto Auxologico Italiano ha prodotto nel 2016 rilevanti contributi scientifici volti ulteriormente a definire i meccanismi della patologia neurodegenerativa e cerebrovascolare sia acuta che cronica con una proficua translazione tra la clinica ed il laboratorio. La vastità della patologia affrontata con ambulatori dedicati e la ricerca di biomarcatori permette una visione unitaria della neurodegenerazione pur nella prospettiva dei diversi fenotipi clinici. In particolare, la Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), la Demenza Frontotemporale (FTD), la Malattia di Parkinson (PD) e di Huntington (HD) costituisco le patologie più selettivamente studiate con allestimento di bio-banche interfaciati con database clinici. È inoltre proseguita la formazione di giovani ricercatori medici, MD/PhD, biologi/biotecnologi che sono stati inviati per scambi culturali in Laboratori sia in Nord America che in Europa. La crescita degli investimenti in apparecchiature dedicate alla genetica ed alla biologia molecolare ha dato rilievo alle collezioni di materiale biologico ed ha permesso continuare l’ operato del Consorzio SLAGEN con un lavoro sinergico tra 6 diverse Istituzioni Italiane tra cui 4 IRCCS a cui si sono formalmente aggiunti nel 2016 altri 3 Centri altamanete qualificati. Il Centro “Dino Ferrari” è stato l’ interlocutore internazionale per ampie casistiche di pazienti per quanto riguarda le malattie neurodegenerative e la SLA/FTD in particolare. L’ FTD è oggi da consideratre un continuum biologico-clinico con la SLA sulla scorta delle crescenti evidenze sperimentali e il Centro ha aderito all’ Italian Frontotemporal Dementia Network (FTD Group – SINDEM). La formazione di équipe multidisciplinari è stata perseguita per le diverse patologie e ciò ha permesso di sviluppare innovative tematiche di ricerca come la Brain-Computer Interface (BCI) ed l’ Eye Tracking (ET) per l’ analisi dei pazienti nonchè di sviluppare studi con RM 3 Tesla. Un moderno ed umano approccio alle più temibili malattie neurodegenerative rappresenta l’ obiettivo perseguito della U.O. di Neurologia di cui il Centro “Dino Ferrari” è parte operante, vicino alla matrice storica della IRCCS Fondazione Ca’ Granda Ospedale Maggiore di Milano dove è originariamente nato. L’ aprirsi degli interessi alla patologia cerebrovascolare è stato alimentato della moderna Stroke Unit già dal 2007 e ciò ha fornito nuovi spunti di ricerca intersecati alla patologia neurodegenerativa. In particolare è maturato un largo interesse per la patologia amiloidotica primitiva dei vasi cerebrali ed all’ approccio intravascolare arterioso dell’ ictus acuto (trombolisi intrarteriosa). Nel 2016 è stata ulteriormente sviluppato il Servizio di Neurofisiologia con sviluppo dello studio Doppler del nervo periferico integrato all’ EMG/ENG classico e con lo studio della patologia nel sonno, mediante proficua interazione con la U.O. di Cardiologia diretta dal Prof. Gianfranco Parati. Il momento riabilitativo ha molto occupato l’ attenzione del Centro “Dino Ferrari” che ha collaborato a disegnare le fasi successive alla diagnosi nelle diverse patologie, proponendo studi clinici ed innovativi approcci riabilitativi, in sintonia con gli organismi Sanitari Regionali anche per l’ analisi dei costi. La Sede Distaccata del Centro “Dino Ferrari” ha ulteriormente ottimizzato gli investimenti in ricerca presso il Centro di Ricerche e Tecnologie Biomediche di Cusano Milanino dove ha locazione il Laboratorio di Neuroscienze. L’ acquisizione dell’apparecchiatura Illumina, piattaforma per l’analisi più approfondita di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) in relazione alle patologie neurodegenerative di cui il Centro "Dino Ferrari" per tradizione si occupa, ha permesso il completamento del progetto di associazione genica tipo “genoma wide” (GWA) per la definizione di geni di suscettibilità nella SLA sporadica dopo creazione del Consorzio SLAGEN per la raccolta dei campioni di DNA e una sincronia di ricerca presso Centri Italiani. La diagnostica molecolare è stata ulteriormente arricchita potendo fornire oggi un pannello diagnostico completo per le malattie del motoneurone (SLA), le Demenze (FTD e Malattia di Alzheimer o AD), per i disturbi extrapiramidali (Malattia di Huntington e di

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Parkinson). Relativamente alla SLA/FTD, la ricercata interazione tra eccellenza clinica e ricerca di base si era espressa nel 2014 con il completamento della più vasta metanalisi di GWA in oltre 13.000 campioni di DNA con identificazione di un locus sul cromosoma 17 associato alla SLA sporadica (Fogh et al., Hum Mol Gen 2014) che è stato riconfermato in un più ampio GWA unitamente ad altri 3 geni di rilevanza clinica (van Rheenen et al., Nat Gen 2016). Lo studio dell’ esoma di un numero rilevante di pazienti affetti da SLA/FTD ha permesso di identificare due nuovi geni patogenetici nell’ ambito di una vasta collaborazione internazionale: CCNF (Williams K., Nat Comm 2016), NEK1 (Kenna et al., Nat Gen 2016) ed ANXA11 (Smith et al., 2016 in press). È proseguita sotto la direzione della U.O. di Neurologia l’attività della moderna Stroke Unit con 6 letti di cui 4 con monitorizzazione fissa che ha comportato l’acquisizione e la formazione di nuovo personale specializzato, medico che infermieristico. È stata avviata una intensa attività clinica con monitoraggio innovativo di diversi parametri funzionali e studio del sonno in pazienti ricoverati per ictus acuto, in stretta collaborazione con la U.O. di Cardiologia diretta dal Prof. Gianfranco Parati. La collaborazione con il Dipartimento di Neuroscienze della IRCCS Fondazione Ca’ Granda Ospedale Maggiore – Università di Milano ha permesso di completare con successo molteplici procedure di trombolisi endovenosa ed endoarteriosa con limitata incidenza di effetti collaterali, contando sulla consulenza neurochirurgica della medesima istituzione. L’ acquisizione di una RM 3T ha rappresentato il presupposto per una nuova ricerca volta, in particolare, allo studio della patologia neurodegenerativa e cerebrovascolare. Il Servizio di Neurofisiologia coordinato dal Dott. Luca Maderna ha dato impulso sia dell’attività clinica che di ricerca di base con sviluppo di tecniche innovative di registrazione del muscolo diaframma utile a porre indicazione precoce per la ventilazione non invasiva in pazienti affetti da SLA e diverse patologie muscolari (Distrofia Miotonica di Steinert), allo studio del nervo periferico mediante utilizzo di Ecodoppler ed all’ apprendimento di una moderna tecnica per la determinazione del numero di motoneuroni fisiologicamente attivi (MUNE). L' attività didattica è stata espletata nel 2016 per Specializzandi in Neurologia affidati alla U.O. di Neurologia, Studenti in Medicina e Chirurgia e del corso MD/PhD che hanno selezionato la struttura per elaborare la Tesi di Laurea e Studenti in Biotecnologie Mediche che hanno frequentato il Laboratorio di Neuroscienze per il tirocinio pre-laurea per la preparazione dellatesi. Una Studentessa del Dottorato in Medicina Molecolare e Traslazionale ha svolto il suo primo anno di attività di ricerca presso i nostri Laboratori, I rapporti con diversi ricercatori del Centro "Dino Ferrari" sono stati molto attivi con l' avanzamento di comuni progetti. In particolare, il progetto di studio relativo alla caratterizzazione istochimica ed immunoistochimica di prelievi bioptici di nervo e di muscolo di pazienti affetti da diversa patologia neuromuscolare (Prof. Maurizio Moggio) con analisi biochimica o molecolare in casi selettivi (Prof. Giacomo Comi). La ricerca di base si è articolata in diverse tematiche che hanno rappresentato la fisiologica evoluzione di studi in parte avviati nel 2015, in armonia con le problematiche cliniche istituzionali di cui il Centro "Dino Ferrari" si interessa. In particolare, la Dott.ssa Antonia Ratti ha dato ulteriore impulso agli studi di ribonomica ribonomica associati alle “RNA-binding proteins” TDP-43 e FUS per una maggior comprensione dei meccanismi patogenetici delle malattie neurodegenerative (memoria-ippocampo-demenza e malattie del motoneurone). nella Il complesso quadro fenotipico dei pazienti conSLA e Demenza Fronto-Temporale è stato studiato a livello epigenetico mediante studi di metilazione del gene C9orf72, implicato in entrambe le patologie. Il Dott. Nicola Ticozzi ha completato una serie di lavori di estremo interesse quali lo sviluppo ulteriore del progetto di Exome Sequencing supportato dal grant Arisla EXOMEFALS che ha portato all’identificazione di un nuovo gene di rischio per la SLA, NEK1 (Kenna et al., Nat Gen

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2016), e alla conclusione dello studio dei Trios (probando SLA + genitori) al fine di identificare mutazioni de novo potenzialmente responsabili di malattia (submitted).. Nel 2016 il Centro “Dino Ferrari”ha mantenuto la funzione direttiva nell’ ambito dell' European ALS Consortium (EALSC), organizzazione Europea dedicata allo sviluppo delle problematiche inerenti le malattie del motoneurone (il Prof. V. Silani ne è stato Chairman). Diversi Teaching Course sono stati organizzati nell’ ambito della European Academy of Neurology (EAN): il Prof. Silani è stato rieletto co-chairman del l’ EAN Subspeciality Scientific panel ALS and Frontotemporal Dementia (Dicembre 2015 -). L’ ENCALS 2016 è stato organizzato a Milano ed ha avuto sede presso l’ Università degli Studi di Milano con afferenza da numerosissimi centri Europei e Nord-Americani. Il Centro è inoltre rappresentato in diverse Commissioni della Regione Lombardia avendo attivamente partecipato alla elaborazione di diverse linee guida relative alla SLA, Malattia Neuromuscolari, Extrapiramidali e Demenza. Nel 2016 è entrato a far parte attiva del Consorzio Italiano della Demenza a Corpi di Lewy, del Consorzio Italo-Tedesco per la FTD. Di notevole impatto è, inoltre, il ruolo riconosciuto nell’ European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases - EURO-NMD (2016). Il prof. Silani è Referente SINDEM per la Piattaforma Italiana per le Malattie Neurodegenerative (ItalPlaNeD). Il Prof. Vincenzo Silani è parte all’ editorial Board di European Neurology, ALS e American Joural of Neurodegenerative Diseases. La migliore espressione dell’attività svolta dalla Sede Distaccata del Centro “Dino Ferrari” sta nell’ ulteriore consenso internazionale raggiunto nel 2016 anche per un rilevante numero di ricercatori (no. 3) che stanno svolgendo o hanno completato periodi formativi in qualificati Laboratori in Europa o nel Nord-America con cui il Centro “Dino Ferrari” ha scambi collaborativi di elevato livello. In particolare, la Dr. Isabella Fogh si occupa dello studio di geni rischio e modificatori che regolano la SLA sporadica. In collaborazione con il Professor John Powell e Professor Chris Shaw presso il Dipartimento di Clinical e Basic Neuroscience al King’s College London, ha analizzato dati genotipici di tutto il genoma (GWAS) in un gran numero di pazienti Europei e nord Americani raccolti da consortia internazionali quali SLAGEN, ALSGEN e Project MinE. Il Dr. Niccolò Mencacci ha conseguito il dottorato di ricerca in Neurogenetica con il Professor John Hardy presso University College London dove ha studiato la genetica di patologie quail la Malattia di Parkinson e le Distonie largamente contribuendo alla identificazione di nuovi geni patogeentici. Il Dott. Federico Verde, Specializzando in Neurologia, è stato ammesso al Department of Neurology della Università di Ulm diretto dal Prof. Albert Ludolph per un per un periodo formativo di ricerca. La Dott.ssa Claudia Morelli ed il Dott. Nicola Ticozzi sono anche i primi due neurologi Italiani divenuti Fellows dell’ European Board of Neurology dopo avere sostenuto il relativo esame internazionale all’ ENS di Barcellona (2013). A loro si è aggiunto il Dott. Federico Verde che ha conseguito io riconoscimento al IV° anno della Scuola di Specializzazione in Neurologia.

PRINCIPALI ARGOMENTI DI RICERCA:

1. SICUREZZA ED EFFICACIA DELL’INIBIZIONE DI SOD1 DA PIRIMETAMINA NELLA SLA FAMILIARE Il trial è stato concluso e i dati elaborati grazie alla collaborazione di 5 Centri internazionali e l’ arruolamento di 32 pazienti affetti da SLA con mutazione del gene SOD1. Il trattamento ha determinato una significativa riduzione dei livelli di SOD1 liquorale, senza rilevanti effetti collaterali. Il trial clinico ha fornito la prima evidenza di un trattamento farmacologico in grado di ridurre i livelli di SOD1 liquorale nei pazienti affetti da SOD1SLA. I dati sono in

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via di pubblicazione (Lange et al., submitted).

2. VALIDAZIONE ITALIANA DI UNO STRUMENTO DI SCREENING COGNITIVO (EDINBURGH COGNITIVE AND BEHAVIOURAL ALS SCREEN – ECAS) IN PAZIENTI AFFETTI DA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA

Lo studio è stato volto a validare, su una popolazione italiana, lo strumento di screening cognitivo ECAS, al fine di disporre di una misura sensibile alle alterazioni cognitive presenti nella SLA e somministrabile anche in presenza di limitazioni nelle capacità verbo-motorie. Come ulteriori sotto-obiettivi, in questo ambito, risultano: - L’indagine delle componenti di validità concorrente e di costrutto dell’ECAS, condotta mediante l’inclusione, nel protocollo di assessment, di prove testali standardizzate e tradizionalmente impiegate nell’indagine del funzionamento cognitivo globale e dell’efficienza frontale sia nella SLA, che in altre patologie. - La messa a punto e somministrazione di un questionario di valutazione dell’usabilità percepita dai partecipanti rispetto allo strumento ECAS, utile ai fini di eventuali future revisioni dello stesso. - L’integrazione dello screening cognitivo e comportamentale con ulteriori dati concernenti il profilo clinico-neuropsicologico (anosognosia e anosodiaforia), mediante l’inclusione di domande concernenti il livello di consapevolezza, da parte dei pazienti, delle eventuali alterazioni cognitive e comportamentali presenti. Ulteriore obiettivo è rappresentato dall’indagine della correlazione presente tra gli indici cognitivi rilevati mediante le prove testali ed i dati di genetica e di laboratorio, che consentirà di identificare peculiari pattern genotipo-fenotipo, utili al fine di meglio caratterizzare i profili clinici presenti nella patologia e, pertanto, fornire ulteriori evidenze di natura diagnostica e prognostica. A conclusione dello studio, la rilevazione delle prestazioni ottenute alle prove neuropsicologiche, in particolar modo concernenti le abilità fronto-esecutive, rende possibile ricavare indici relativi all’integrità cognitiva dei pazienti e quindi di valutare la capacità di assumere decisioni relative a questioni finanziarie, ai trattamenti invasivi proposti nel corso della malattia e alle decisioni di fine vita nei pazienti affetti da SLA negli stadi più avanzati di malattia. Sono stati oggetto di una recente pubblicazione i risultati del lavoro inerente la validazione dell’ECAS in lingua italiana (Poletti et al., 2016a), raccolti su una popolazione di 107 pazienti affetti da SLA e 248 soggetti sani. I risultati hanno evidenziato una soddisfacente sensibilità diagnostica, mostrando quale prevalente compromissione cognitiva nei pazienti affetti da SLA, quella riguardante le funzioni esecutive e la fluenza verbale. Sono state inoltre evidenziate correlazioni tra le prestazioni ottenute all’ECAS ed a strumenti di screening cognitivo e comportamentale tradizionali, sostenendo la sua piena validità convergente. I risultati dello studio sono ad oggi disponibili per usi clinici e di ricerca, fornendo uno strumento efficace, rapido e sensibile, utile ad identificare i diversi profili di deterioramento cognitivo-comportamentale nella SLA.

3. BRAIN COMPUTER INTERFACE ED EYE-TRACKING NELLA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA: L’IMPIEGO DELLE NUOVE TECNOLOGIE PER LA VALUTAZIONE COGNITIVA IN PRESENZA DI DIFFICOLTA’ VERBO-MOTORIE

Un ulteriore contributo alla valutazione delle funzioni cognitive nella SLA, anche in presenza di limitazioni verbo-motorie ed in stadi avanzati di malattia, consiste nell’impiego di nuove tecnologie, quali l’Eye-Tracker (ET) e la Brain Computer Interface (BCI), oggetto di un recente studio. In particolare, quali ulteriori sotto-obiettivi del lavoro, risultano:

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- La realizzazione di una batteria di test neuropsicologici, adattati ad una versione computerizzata somministrabile mediante entrambe le metodiche, tali da mantenere requisiti di aderenza e validità rispetto alle versioni tradizionali, in forma ‘carta e matita’. - La validazione di tale nuova metodica di assessment neuropsicologico su pazienti affetti da SLA e controlli sani, al fine di definire i seguenti aspetti: usabilità delle metodiche, intesa come utilità percepita e qualità dell’esperienza realizzata durante i test; validità concorrente rispetto alle tradizionali misure di screening cognitivo; sensibilità diagnostica nel discriminare tra pazienti affetti da SLA con lievi difettualità cognitive e controlli sani. - Il confronto tra le due metodiche (BCI ed ET) rispetto agli aspetti sopra descritti, al fine di individuare vantaggi e svantaggi dei due approcci sviluppati, per specifiche tipologie di pazienti affetti da SLA, in termini di stadio di malattia, livello di compromissione cognitiva e specifici aspetti motivazionali e psicologici che possono contribuire a determinare diversi gradi di usabilità delle due metodiche. - L’integrazione dei risultati inerenti le prestazioni ai test neuropsicologici, ottenuti mediante le due metodiche, con dati comportamentali e clinici, inclusa la presenza di mutazioni genetiche, al fine di meglio definire aspetti prognostici e percorsi di cura individualizzati. Nel biennio 2016-2017 sono stati pubblicati due lavori, riportanti i risultati preliminari inerenti le due metodiche. In particolare, sono stati confermati, su una popolazione di 15 pazienti affetti da SLA e 15 controlli, gli aspetti di usabilità e sensibilità diagnostica della batteria realizzata mediante BCI (Poletti et al., 2016b). E’ stato inoltre condotta un’indagine preliminare su 30 soggetti di controllo inerente la batteria somministrata mediante ET, evidenziandone gli aspetti di usabilità e di validità concorrente (Poletti et al., 2017). E’ in corso di pubblicazione la validazione della batteria ET su pazienti affetti da SLA ed il confronto tra le due metodiche.

4. STUDIO DELLE ALTERAZIONI COGNITIVE NELLA SINDROME DA ANTICORPI ANTI-FOSFOLIPIDI (APS) E NEL LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO

Le persone affette da lupus eritematoso sistemico (LES) e da sindrome da anticorpi anti-fosfolipidi hanno un aumentato rischio di sviluppare decadimento cognitivo; tale aspetto è stato pertanto oggetto di un recente studio (Gerosa, Poletti et al., 2016). Recenti indagini hanno suggerito un possibile ruolo degli anticorpi antifosfolipidi (aPL) e degli anticorpi per il recettore antiglutammato (anti-NMDA) nella eziopatogenesi delle manifestazioni neurologiche in queste due condizioni. In particolare, il ruolo degli anticorpi anti-NMDA nella patogenesi degli aspetti neuropsichiatrici nel LES è supportato da numerosi studi sperimentali su modelli animali e dal ritrovamento di una correlazione fra positività all’anti-NMDA nel fluido cerebrospinale e manifestazioni neurologiche nel LES. Tuttavia, i dati provenienti dalla letteratura sono controversi. La sinergia tra anti-NMDA ed altri concomitanti autoanticorpi, come aPL, potrebbe svolgere un ruolo nell'indurre un danno ai tessuti e, conseguentemente, delle anomalie funzionali. In linea con questa ipotesi, abbiamo trovato un'elevata incidenza di compromissione cognitiva in almeno un dominio cognitivo in una piccola coorte di pazienti con APS primario (PAP) e LES. È interessante notare che la presenza di aPL è apparsa associata a ridotte prestazioni in test di linguaggio e di attenzione, mentre la presenza di anti-NMDA è risultata inversamente correlata all’efficienza cognitiva misurata al Mini Mental State Examination (MMSE). Tuttavia, quando i pazienti sono stati stratificati in base alla presenza/assenza di aPL, la correlazione è stata confermata solo in pazienti positivi per aPL. Qualora tali constatazioni dovessero essere confermate, apparirebbe opportuno un’ulteriore approfondimento dell'eziologia delle difettualità prevalenti evidenziate nei pazienti PAPS, così come della sinergia tra aPL e anticorpi anti-NMDA.

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5. CARATTERIZZAZIONE DEI LIVELLI CIRCOLANTI DI ADIPONECTINA IN PAZIENTI AFFETTI DA MALATTIE NEURODEGENERATIVE

Alla luce della recente letteratura che suggerisce una compromissione neurometabolica nei pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) ed altre patologie neurodegenerative, nel corso del 2016 si sono concluse le indagini sulle alterazioni della adiponectina ottenendo un cospicuo ed equiparabile di campioni sierici di controlli sani (n°=36) e pazienti SLA (n°= 52, di cui 10 con mutazioni genetiche note, fALS), caratterizzati da un normale indice di massa corporea e assenza di sintomi disautonomici,. I campioni sono stati testati mediante enzyme-linked immunosorbent assay kits (ELISA) confermando una differenza sesso specifica per i valori di adiponectina con i maschi caratterizzati da valori statisticamente inferiori e femmine superiori rispetto ai controlli. La differenza sesso specifica veniva inoltre amplificata nei casi fALS. I valori nel liquido cerebrovascolare (ALS n°=40) risultavano invece indipendenti da quelli sierici e non correlate a sesso o familiarietà per malattia. Inoltre l’analisi quantitativa dei valori di adiponectina sierica in pazienti affetti da altre malattie neurologiche ha rivelato livelli statisticamente aumentati in pazienti affetti da Demenza Frontotemporale che condivide con la SLA diverse caratteristiche clinico-patologiche. I risultati del lavoro sono stati attualmente sottomessi ad una rivista internazionale peer review.

6. VALUTAZIONE DEI DIPEPTIDI DPR QUALI BIOMARCATORI SPECIFICI LIQUORALI IN PAZIENTI SLA CON MUTAZIONI NEL GENE C9ORF72

In collaborazione col Prof. L. Petrucelli (Mayo Clinic, Florida) è stato messo a punto un saggio immunoenzimatico ad eletrochemioluminescenza MSD (Meso Scale Discovery) per rilevare in modo specifico la presenza di dipetiti DPR (dipeptide repeat protein) derivanti dalla traduzione ATG-indipendente degli RNA C9orf72 con espansione (fenomeno della RAN translation). In particolare, abbiamo messo a punto un saggio specifico per il dipetide GPn e, in un nostro precedente e importante studio, abbiamo dimostrato che è possibile rilevare la sua presenza non solo nei lisati di cellule esprimenti C9orf72 mutato, ma soprattutto nel liquor dei pazienti C9orf72 mutati, suggerendolo come biomarcatore in tali pazienti (Su et al, Neuron 2014). Abbiamo ora messo a punto un analogo saggio, utilizzando la stessa tecnologia MSD, per misurare i dipeptidi GAn, anch’essi derivanti dalla RAN translation dell’RNA C9orf72 espanso, per valutarne la sensibilità rispetto al saggio GPn. Stiamo inoltre valutando se i livelli di dipetidi aumentano o sono stabili nel liquor durante la progressione di malattia. Ciò è di estrema importanza poiché è già stata dimostrata l’efficacia in vitro di oligonucleotidi antisenso (ASO) contro l’RNA C9orf72 espanso, che verranno presto somministrati a pazienti. La possibilità di utilizzare un biomarcatore specifico per C9orf72, quali i DPR misurabili nel liquor, permetterebbe quindi di misurare biologicamente l’efficacia della terapia con ASO. 7. STUDIO DELLA METILAZIONE DEL GENE C9ORF72 QUALE POSSIBILE FATTORE DI MODIFICAZIONE DEL FENOTIPO CLINICO SLA/FTD

Recenti dati di letteratura suggeriscono che il gene C9orf72 mutato vada incontro ad un’aumentata metilazione sia del suo promotore (26 siti CpG) che della sequenza esanucleotidica GGGGCC espansa (RE) rispetto ai pazienti SLA non mutati o a controlli sani. La metilazione del promotore sembra essere associata ad una ridotta espressione del gene mutato, agendo così potenzialmente da fattore neuroprotettivo nei confronti dell’RNA tossico prodotto in presenza della RE nel gene C9orf72. Abbiamo deciso di studiare questa associazione tra livelli di metilazione, espressione genica di C9orf72 e fenotipo clinico nella nostra coorte di pazienti SLA e FTD mutati per il gene C9orf72 (60 campioni). Lo studio è stato effettuato su DNA genomico ottenuto da sangue poiché, nonostante la metilazione sia

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una modificazione epigenetica tessuto-secifica, dati di letteratura indicano che, nel caso di C9orf72, questa è conservata tra tessuto cerebrale e sangue. Mediante conversione del DNA genomico con bisolfito e sequenziamento di Sanger abbiamo valutato la metilazione a carico dei 26 siti CpG del promotore e abbiamo confermato che, anche nella nostra coorte, il 65% dei pazienti C9orf72-positivi ha il promotore metilato rispetto al 9% dei pazienti SLA non mutati. Abbiamo inoltre dimostrato che tutti i pazienti C9orf72 hanno la RE stessa, che dà origine a potenziali siti CpG, altamente metilata. Nostri dati preliminari di Real time condotti su RNA estratto da sangue mostrano una correlazione inversa tra grado di metilazione del promotore ed espressione genica di tutte e 3 le isoforme del gene C9orf72. Stiamo attualmente valutando le possibili correlazioni tra grado di metilazione e caratteristiche cliniche dei pazienti C9orf72 per definire l’eventuale effetto modificatore della metilazione del promotore.

8. IDENTIFICATION OF RISK VARIATS ASSOCIATED WITH ALS SUSCEPTIBILITY USING A CASE-CONTROL, RARE VARIANT BURDEN ANALYSIS ON WES DATA

Nell’ambito dei progetti EXOMEFALS e IrisALS, abbiamo collaborato al sequenziamento dell’esoma di una coorte di circa 1500 pazienti affetti da SLA famigliare e sporadica, al fine di identificare varianti rare associate alla suscettibilità per la malattia, utilizzando diverse strategie di analisi. Lo studio di questi dati ha prodotto i seguenti risultati:

- mediante analisi di linkage su una famiglia australiana affetta da SLA, Williams et al. (Nat Commun, 2016) hanno identificato mutazioni patogenetiche nel gene candidato CCNF. Tale osservazione è stata confermata da una collaborazione internazionale che ha incluso le coorti EXOMEFALS e IrisALS. CCNF codifica per una proteina appartenente al complesso E3 ubiquitina-ligasi e mutazioni in questo gene determinano in modelli cellulari un accumulo di proteine ubiquitinate intraneuronali, tra cui TDP-43;

- mediante analisi manuale delle varianti rare comuni a più esomi di casi indice affetti da SLA famigliare, sono state evidenziate mutazioni comuni nel gene ANXA11. Tale gene codifica per una proteina la cui funzione è largamente sconosciuta, benché probabilmente coinvolta nell’omeostasi del calcio intracellulare. Cellule trasfettate con costrutti ANXA11mut formano aggregati citoplasmatici simili a quelli osservati in pazienti portatori di mutazioni in altri geni associati alla SLA (Smith et al., accepted);

- effettuando una rare-variant burden analysis in esomi di pazienti affetti da SLA famigliare e controlli sani, abbiamo identificato un eccesso di varianti rare, in particolare determinanti perdita di funzione, nel gene NEK1. Tale osservazione è stata indipendentemente validata mediante mappatura di omozigosi in una famiglia SLA Olandese e mediante replica in una coorte indipendente di pazienti con SLA sporadica. NEK1 codifica per una proteina coinvolta nei meccanismi di riparazione del DNA e nell’organizzazione microtubulare (Kenna et al., Nat Genet 2016).

Ci proponiamo di sviluppare tale linea di ricerca ampliando il numero di esomi Italiani sequenziati ed ottimizzando i protocolli di analisi bioinformatica in modo da aumentarne la sensibilità.

9. IDENTIFICATION OF VARIANTS ASSOCIATED WITH SURVIVAL IN SPORADIC AMYOTROPHIC LATERAL SCEROSIS AND C9orf72 CARRIERS

1. Nonostante l’aspettativa media di vita non superi i tre anni, il 5% dei pazienti SLA puo’ vivere piu’ di una decade. Allo scopo di studiare tale variabilita’, abbiamo cercato possibili geni modificatori associati al sub-phenotype survival. Dopo la raccolta di dati clinici di circa

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6000 pazienti Europei e Nord Americani, i dati genotipici originali presenti sulle piattaforme GWAS sono stati amplificati tramite analisi di imputazione genome wide. Oltre 7 millioni di SNPs sono stati poi analizzati per associazione con il survival utilizando un metodo statistico innovativo quale la Cox Proportional Hazard regression (CPH) analysis su scala genomica (ProbABEL program). Tale metodo ha permesso di studiare ogni singolo polimorfismo come fattore rischio di morte indipendente, portando all’identificazione di un nuovo gene, CAMTA1, capace di ridurre la sopravvivenza nei pazienti sporadici di circa 4 mesi (Fogh et al., JAMA Neurol. Jul 2016). 2. Dati genotipici e clinici di 386 pazienti SLA portatori di mutazioni nel gene C9orf72 e con fenotipo SLA e SLA-FTD sono stati forniti dai nostri collaboratori del MinE Project e dello SLAGEN Consortium. Tramite il metodo di genome wide CPH sopra descritto, carriers di 10 coorti indipendenti sono stati analizzati per associazione con il survival. Dati statistici risultanti dale single coorti sono stati poi combinati in meta-analisi (in progress).

10. STUDIO DELLE VARIANTI GENOTIPICHE PRESENTI SUL CROMOSOMA X

Insieme con età e storia familiare, il sesso maschile e’ considerato uno dei maggiori fattori richio per l’insorgenza della SLA con una prevalenza di 1.6:1 entro le prime 5 decadi di vita. Tale prevalenza diminuisce con l’invecchiamento suggerendo nelle donne un possibile ruolo protettivo degli estrogeni nel periodo pre-menopausa. In accordo con tali dati clinici, la Dr. Fogh ha studiato il contributo al fenotipo SLA delle varianti geniche sul cromosoma X analizzando una coorte internazionale di 6000 casi e 7000 controlli. Dopo amplificazione delle varianti X-linked mediante analisi di imputazione, diversi test di associazione sono stati eseguiti utilizzando programmi specifici per le analisi X-WIDE come XWAS v1.0 e GWAMA. Nessun locus e’ risultato associato significativamente (P-value < 5 x 10-8) alla suscettibilita’ della SLA. Quindi, in collaborazione con i nostril partners internazionali, abbiamo deciso di estendere le nostre analisi di associazione X-WIDE ad una coorte allargata includendo i nuovi dati di GWAS collezionati dal MinE Project (~13,000 casi e 20,000 controlli) (in progress).

11. IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI DE NOVO NELLA SLA MEDIANTE UN APPROCCIO DI EXOME SEQUENCING SU TRIOS

Nell’ambito del progetto NOVALS (Grant AriSLA) sono state identificate e validate 35 mutazioni de novo in 23 trio SLA (costituiti da un individuo affetto da SLA e dai suoi genitori non affetti). Sebbene analisi bioinformatiche abbiano suggerito un arricchimento dei geni contenenti mutazioni de novo nelle vie metaboliche cellulari coinvolte nella regolazione trascrizionale, modificazione della cromatina, legame con i nucleosidi purinici e nel trasporto del calcio intracellulare, l’assenza di ricorrenza genetica ha impedito di stabilire con certezza un eventuale ruolo patogenetico per ciascuna di esse. Pertanto, abbiamo effettuato un’analisi combinata con altri gruppi di ricerca internazionali (Germania, Paesi Bassi), raggiungendo una casistica di 82 nuovi trios e 173 totali includendo i dati disponibili in letteratura. L’analisi di quest’ampia coorte, contrariamente a quanto precedentemente riportato in letteratura, ha escluso un possibile ruolo patogenetico per le mutazioni de novo nella SLA (van Doormal et al., submitted).

12. IL METABOLISMO MITOCONDRIALE NEI FIBROBLASTI DI PAZIENTI AFFETTI DA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA

I motoneuroni sono cellule ad alto dispendio energetico e solo un’efficiente attività mitocondriale garantisce un corretto metabolismo neuronale. Nelle malattie neurodegenerative, inclusa la SLA, difetti nell’attività mitocondriale sono stati descritti sia come diretti che come indiretti patomeccanismi alla base dell’insorgenza di malattia e della

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sua progressione. In questo progetto abbiamo studiato la funzionalità mitocondriale in cellule periferiche, quali fibrobalsti primari ottenuti da biopsie di cute di pazienti SLA con mutazioni in geni noti (TARDBP e C9orf72). Nonostante i fibroblasti abbiano un metabolismo prevalentemente di tipo glicolitico, essi possono essere coltivati in terreni privi di glucosio ma addizionati di galattosio per stimolare un’attività di fosforilazione ossidativa simile alle cellule neuronali. Inoltre il vantaggio di utilizzare fibroblasti mutati direttamente da pazienti consente di studiare modelli di malattia in cui il gene/proteina mutati sono espressi in condizioni fisiologiche. Dal nostro studio è emerso che i fibroblasti dei pazienti SLA mutati mostrano un’alterata funzionalità mitocondriale, ma questa è completamente diversa in base al gene mutato. Nei fibroblasti TARDBP-positivi, infatti, abbiamo osservato una marcata frammentazione mitocondriale associata ad aumento dei livelli delle proteine di fissione (FIS1), diminuzione del potenziale di membrana, ma nessuna alterazione nell’attività degli enzimi delle catene respiratorie e nel parametro OCR (oxygen consumption rate) che misura il grado di consumo di ossigeno. Al contrario, nei fibroblasti con mutazioni C9orf72, abbiamo osservato che i mitocondri sono iper-polarizzati e hanno un maggior valore di OCR in associazione a più alti livelli di ATP e di ROS (reactive oxigen species) e ad una maggiore massa e quantità di DNA mitocondriale. I nostri dati indicano che le mutazioni nei geni TARDBP e C9orf72 hanno effetti opposti sulla funzionalità mitocondriale che risulta alterata in entrambe le condizioni, situazione che potenzialmente riflette quella presente anche nei neuroni/motoneuroni dei pazienti SLA. I nostri risultati suggeriscono nuovi meccanismi molecolari attraverso cui i geni TARDBP e C9orf72 mutati contribuiscono alla degenerzione neuronale.

13. STUDIO DELLA STIMOLAZIONE DELLA PROTEINA TDP-43 NELLA SLA

La SUMOilazione è una modificazione post-traduzionale delle proteine simile all’ubiquitinazione che ha importanti ruoli regolatori a vari livelli, dalla trascrizione, al trasporto nucleo-citoplasma e alla proprietà biochimiche delle proteine target (stabilità, solubilità, aggregazione). Dati di letteratura indicano che la proteina TDP-43, implicata nella patogenesi della SLA, possa essere un substrato di SUMOilazione, ma sia i possibili effetti di tale modificazione sia l’associazione tra SUMOilazione e formazione di aggregati patologici di TDP-43 non sono noti. Nostri dati preliminari dimostrano che la proteina TDP-43 è SUMOilata specificatamente nel dominio N-terminale importante per il legame agli RNA (RRM1). Studi di predizione in silico evidenziano un potenziale sito di SUMOilazione in posizione K136 e un vicino sito SIM (SUMO-interacting motif). Abbiamo creato mutazioni specifiche in tali siti e stiamo caratterizzando le proteine mutate in termini di stabilità, localizzazione cellulare e attività di splicing. I nostri dati preliminari indicano che le proteine TDP-43 mutagenizzate per SUMO hanno sia un’alterata distribuzione sub-cellulare sia una ridotta attività di splicing di geni target specifici da noi precedentemente descritti (TNIK, POLDIP3). Stiamo tuttora valutando gli effetti della SUMOilazione di TDP-43 anche sulla sua aggregazione patologica nel citoplasma.

14.iPSCs: UN MODELLO PER LO STUDIO DELLE INTERAZIONI TRA CELLULE NEURALI NELLE MALATTIE NEURODEGENERATIVE

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) ottenute mediante riprogrammazione di cellule adulte presentano caratteristiche del tutto simili alle cellule embrionali ma non sono soggette a limitazioni di ordine etico. Le iPSCs si sono rivelate essere un potente strumento di studio per la comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari, fisiologici o causativi di diverse patologie potendosi propagare indefinitamente in vitro e differenziare in qualsiasi tipo di cellula somatica. Le iPSCs sono particolarmente utili qualora si intendano studiare meccanismi relativi a cellule difficilmente isolabili direttamente da un organismo. Le iPSCs

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possono essere differenziate in vitro sia in cellule staminali neurali che in cellule differenziate quali astrociti e neuroni di vario tipo. Numerosi lavori suggeriscono che nella SLA, oltre al motoneurone, altri tipi cellulari del sistema nervoso centrale contribuiscono alla progressione di malattia, inclusi astrociti, microglia ed oligodendrociti. Lo studio delle interazioni tra diversi tipi cellulari risulta quindi di primaria importanza per la comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo e della progressione di malattia e per la valutazione di nuove strategie terapeutiche non solo nella SLA ma anche in altre patologie neurodegenerative. In particolare, l’individuazione di un preciso ruolo svolto dalle cellule accessorie al motoneurone consentirebbe di identificare possibili nuovi target terapeutici per la cura della malattia. Attualmente è in corso l’allestimento di una banca di iPSCs. Fibroblasti cutanei e cellule mononucleate derivanti da pazienti affetti da SLA e da donatori sani vengono riprogrammate mediante l’utilizzo di Sendai virus. Per ogni campione (al momento sono stati riprogrammati 15 campioni) vengono selezionati, espansi e congelati dai 6 ai12 cloni di iPSCs. Questi vengono testati mediante RT-PCR e immunocitochimica per l’espressione di marcatori di staminalità e la non espressione di marcatori specifici per cellule differenziate. Le iPSCs vengono inoltre differenziate in motoneuroni ed altri tipi neuronali per diversi studi in vitro quali: 1) Studio in vitro delle interazioni e degli effetti reciproci, mediati da esosomi, tra cellule neurali derivanti da fibroblasti cutanei di controlli sani e pazienti affetti da SLA ed altre patologie neurodegenerative. Gli esosomi sono vescicole extracellulari prodotte in modo costitutivo dalla maggior parte delle cellule e rappresentano uno dei modi mediante il quale avviene la comunicazione cellulare. Contengono sia RNA codificante che non codificante, miRNAs e proteine, hanno quindi un impatto sui naturali processi fisiologici. Gli esosomi possono inoltre facilitare la diffusione di una patologia attraverso il trasferimento di informazione genetica o proteine patogenetiche (come dimostrato nei tumori e di recente in alcune patologie neurodegenerative. In particolare viene valutata in vitro della possibile diffusione di aggregati di TDP-43 mediata da esosomi. E’ stato infatti suggerito che la diffusione di malattia potrebbe avvenire in modo prionico.

15. ANALISI DI GLUK2 QUALE NUOVO TARGET TERAPEUTICO PER I PARKINSONISMI GIOVANILI AUTOSOMICI RECESSIVI (ARJP) NEI NEURONI PRIMARI, NEI MODELLI ANIMALI DI PARK2 E NELLE CELLULE IPS DA PAZIENTI PARK2

Nei restanti mesi di validità del progetto, nell’anno 2015, valuteremo se Gluk2 può essere target di una terapia genica, mediante l’incrocio di topi parkin-Q311X con i topi Gluk2-/-. Questo ci permetterà di comprendere se la modulazione del recettore può essere un valido approccio come terapia neuroprotettiva in modelli PARK2. Nel corso del 2016 sono stai iniziati gli incroci tra i topi parkin-Q311X ed i topi GluK2-/-. E’ stata inoltre approntata l’analisi dell’espressione del recettore GluK2 nella sostanza nera compatta tramite microscopia elettronica.

16. DISFAGIA in HD

La Malattia di Huntington (MH - MIM ID #143100), è una patologia neurodegenerativa a trasmissione autosomica dominante causata dall’espansione di una tripletta CAG nel gene IT-15. La malattia ha una prevalenza di 5-10/100.000 persone ed esordio nella vita adulta (35-40 anni). Le caratteristiche cliniche della MH includono sintomi motori, alterazioni cognitive e disturbi psichiatrici principalmente legati alla disfunzione ed alla perdita dei neuroni dei gangli della base. La MH ha un decorso lentamente progressivo che porta al decesso dopo 15-20 anni, generalmente causato da polmonite ab ingestis a seguito della disfunzione della muscolatura bulbare. La disfagia in corso di Malattia di Huntington è ancora poco

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caratterizzata. Infatti, sebbene la pratica clinica sembrerebbe suggerire che difficoltà deglutitore si presentino anche in fase relativamente precoce, l’entità e la frequenza in relazione allo stadio di malattia ed alla terapia farmacologica in atto non sono ancora state studiate in maniera accurata. Il presente progetto si pone i seguenti obiettivi: 1) valutare l’incidenza del disturbo disfagico in pazienti affetti da Malattia di Huntington a diversi stadi di malattia; 2) identificare quali disordini motori, cognitivi e/o comportamentali correlino con specifiche alterazioni della dinamica deglutitoria; 3) individuazione di interventi riabilitativi e compensativi in MH e valutazione di efficacia tramite re-testing a 6 mesi.

CENTRO SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA (SLA)

Nell'anno 2016, circa 320 pazienti affetti da patologia motoneuronale (prevalentemente SLA) sono stati esaminati nel Centro SLA. Alla valutazione clinica sono state accostate diverse indagini ed iniziative terapeutiche:

- ricerca di mutazioni per i geni SOD1, angiogenina, SETX, VAPB, TDP43, FUS/TLS, OPT, VCP, C9orf72, Profilina1, Malattia di Kennedy, SMN in parte presso il Laboratorio di Neuroscienze ed in parte in collaborazione con l'Istituto C. Besta di Milano (Dott.ssa Cinzia Gellera). Tali indagini hanno permesso di identificare mutazioni in pazienti apparentemente affetti da SLA sporadica (TARDP per TDP-43, FUS/TLS, C9orf72 in particolare). Oggi il Centro offre la diagnostica molecolare delle principali patologie motoneuronali;

- sviluppo di nuovi parametri neurofisiologici per definizione del numero residuo di Unità Motorie (MUNE) ed analisi neurofisiologica della funzionalità diaframmatici per porre indicazione alla NIV;

- analisi delle caratteristiche nutrizionali con studio della PEG, BMI, etc, in collaborazione con l'Unità di Endocrinologia dell'IRCCS Istituto Auxologico Italiano;

- valutazione neuropsicologica longitudinale del paziente affetto da SLA mediante valutazione seriata per evidenziare specifici deficit neuropsicologici; particolare attenzione al coinvolgimento fronto-temporale anche con tecniche di eye-tracking e sviluppo di BCI (studio ECAS) anche per approntamento grazie al Servizio di Neuropsicologia della versione italiana (Poletti et al., 2016);

- partecipazione a nuovi trial terapeutici (Pirimetamina nella SLA Familiare SOD1 mutata, G-CSF, etc).

Il Centro "Dino Ferrari" ha partecipato a diverse iniziative nazionali ed internazionali per l'ottimizzazione delle cure palliative, la definizione dei costi della malattia, l' educazione dei medici e paramedici in stretto rapporto con l'AISLA (Associazione Italiana Sclerosi Laterale Amiotrofica), la definizione dei criteri di invalidità in collaborazione con la Regione Lombardia. Il Centro "Dino Ferrari" è implicato nel Gruppo di Studio Malattie del Motoneurone della Società Italiana di Neurologia - SIN) e nell’ European ALS Consortium. Il Prof. Silani è divenuto membro del Website Management Committee della World Federation of Neurology in rapporto alla ALS/MND. Nell' ambito dell’ ALS European Consortium il Prof. Silani ha tenuto vari Teaching Courses: nell' ambito della nascente EAN il Prof. V. Silani è stato rinominato (2016-) referente per il gruppo Malattie del Motoneurone e Demenza Frontotemporale con il Prof. Albert Ludolph.

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CENTRO MALATTIE EXTRAPIRAMIDALI

Nel corso dell'anno 2016, oltre 350 nuovi pazienti circa affetti da diversi disordini extrapiramidali del movimento (Morbo di Parkinson, Paralisi Sopranucleare Progressiva, Atrofia Multisistemica e Degenerazione Cortico-Basale, Corea di Huntington, ect.) sono stati esaminati e trattati presso il “Centro Disturbi del Movimento” che ha eseguito circa 1.000 visite ambulatoriali. È stata creata una stretta collaborazione con l'Associazione Parkinson Milano di cui il Prof. Silani fa parte del Comitato Scientifico creando un interscambio scientifico e di pazienti. È stata creata una èquipe multispecialistica per la presa in carico del paziente. Il Centro è riconosciuto nell'ambito del NECTAR (Network for European CNS Transplantation and Regeneration) dedicato alle malattie extrapiramidali. Maggior impeto è stato dato inoltre alla creazione di un Centro dedicato alla Malattia di Huntington con creazione di una equipe plurispecialistica formata da neurologi, psichiatri, neuropsicologi e fisiatri nell'intento di fornire un approccio interdisciplinare al paziente, garantendo così un supporto ed un riferimento costante nel tempo che è stato esteso anche ai familiari. Nell'ambito della Malattia di Huntington l'assenza di una cura risolutiva della malattia comporta un particolare impatto emotivo nel soggetto che ancora asintomatico decide di testarsi per la mutazione. Ciò impone un continuo supporto psicologico al paziente durante tutto il lungo processo che porta alla diagnosi pre-clinica. Per questo è stato sviluppato ed applicato un protocollo di test predittivo nella Malattia di Huntington secondo le linee guida dell'International Huntington Association e della Federazione Mondiale di Neurologia. Sono state seguite varia famiglie affette da Malattia di Huntington e seguiti sei pazienti nell'iter del test predittivo. Dal 2005 il Centro è in grado di formulare diagnosi molecolare di Malattia di Huntington. Alla valutazione clinica sono state accostate diverse indagini ed iniziative terapeutiche quali lo studio del sonno nei pazienti affetti da M. di Huntington in collaborazione con il Centro del Sonno (Dott.ssa Carolina Lombardi). Particolare attenzione è oggi dedicata alla cura della disfagia, principale causa di morte dei pazienti accanto alle complicanze polmonari. Il Dott. Andrea Ciammola ha dato particolare impulso a questa iniziativa unitamente alla équipe multidisciplinare.

CENTRO DISTURBI COGNITIVI

Nell'anno 2016 vi è stato un ulteriore incremento di pazienti rivoltisi al nostro centro per una valutazione diagnostica di tipo neuropsicologico; infatti sono state effettuate oltre 6.500 prestazioni neuropsicologiche e psicodiagnostiche per pazienti degenti in regime di ricovero ordinario o in Day Hospital, nonché 970 colloqui psicologici clinici in pazienti affetti da molteplici forme di coinvolgimento cognitivo a partire dal Mild Cognitive Impairment (MCI), Malattia di Alzheimer, Demenza Fronto-Temporale, Demenza a Corpi di Lewy, Parkinson’s Demenza, Demenza di Huntington, Paralisi Sopranucleare Progressiva, Degenerazione Cortico-Basale ecc. Al già presente ambulatorio neuropsicologico convenzionato S.S.N. è stato aggiunto un nuovo ambulatorio di Valutazione Multidimensionale dei Disturbi Cognitivi (VMD) condotto congiuntamente da neurologo/neuropsicologo nell’ottica di fornire al paziente affetto da patologia cognitiva un’approccio multidisciplinare che tenga conto delle molteplici problematiche che spesso ne caratterizzano il decorso clinico. Particolare attenzione è stata posta alla valutazione neuropsicologica longitudinale dei pazienti affetti da patologia motoneuronale (SLA, PLS) esaminati nel Centro SLA. Sono stati effettuati, in collaborazione con altri presidi ospedalieri quali l’Ospedale S. Anna di Como ed il Centro UVA di Bussolengo a Verona, studi sugli aspetti cognitivi, psico-emotivi e di personalità nella Sclerosi Multipla, nella SLA, nelle cefalee e nella Malattia di Parkinson. Si sono inoltre organizzati diversi eventi formativi ECM in merito all’inquadramento dei disturbi cognitivi, agli aspetti di diagnosi differenziale e gestione dei disturbi psico-emotivi delle malattie

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neurodegenerative. Particolare attenzione ha richiesto la messa a punto, con il Centro dedicato alla Malattia di Huntington, di un protocollo di test predittivo per la malattia che ha visto nel supporto psicologico fornito ai pazienti, ai loro familiari ed ai soggetti asintomatici che si sottopongono al test, un ruolo fondamentale. Sempre più spazio è stato dato al caregiver nell’ascolto delle problematiche di gestione quotidiana della patologia cognitiva dei loro congiunti allo scopo di migliorare la qualità diagnostica, clinica ed assistenziale fornita a questa tipologia di pazienti. La consulenza del Centro Disturbi Cognitivi è stata offerta anche al CIERRECI, nuova struttura dell’ IRCCS Istituto Auxologico Italiano per lo studio dell’ invecchiamento. È stato avviato un ambulatorio dedicato alla patologia cognitiva.

CENTRO DI MEDICINA DEL SONNO

È continuata nel corso del 2016 l’attività del Centro di Medicina del Sonno presso l’ IRCCS Istituto Auxologico Italiano, Ospedale San Luca, diretto dal Prof. G.F. Parati e dal Prof. V. Silani e coordinato dalla dott.ssa Lombardi. Nello 2016 sono state eseguite circa oltre 800 visite ambulatoriali e polisonnografie portatili, 200 video polisonnografie in laboratorio di medicina del sonno, 60 monitoraggi polisonnografici prolungati (24 ore) e 20 actigrafie. Le patologie osservate nel centro, vista anche l’ispirazione volutamente multidisciplinare, riguardano ad ampio spettro le malattie cardiovascolari associate a disturbi respiratori durante il sonno (ipertensione arteriosa, scompenso cardiaco, stroke) e tutte le patologie neurologiche coinvolgenti il sonno, comprendendo quindi i disturbi del respiro in corso di sonno (Sindrome delle Apnee Ostruttive nel Sonno – OSAS -, Sindrome delle Apnee Centrali, Ipoventilazione Centrale, alterazioni del pattern ventilatorio nelle patologie neuromuscolari), le ipersonnie (narcolessia, ipersonnie secondarie a malattie neurodegenerative), le parasonnie REM e NREM (disturbo comportamentale della fase REM, sonnambulismo, bruxismo ecc), le epilessie ad estrinsecazione prevalentemente notturna (Nocturnal Frontal Lobe Epilepsy) i disturbi del movimento in corso di sonno (Sindrome delle Gambe senza Risposo) e tutte le forme di insonnia. Oltre alle attività assistenziali, il Centro cura un’ampia sfera di ricerca.

STROKE UNIT Nel 2016 l’ attività della Stroke Unit a direzione neurologica si è ulteriormente consolidata con ottimizzazione della moderna struttura che offre 6 letti di cui 4 completamente monitorizzati con possibilità di inquadramento del paziente affetto da evento cerebrovascolare acuto. L’ attività direttiva della Dott.ssa Laura Adobbati, coordinatrice, e dalla Dott.ssa Barbara Corrà è stata particolarmente efficace, avendo portato gli standards dell’ attività della Stroke Unit a livello competitivo sia dal punto di vista medico che organizzativo. Il paziente che accede al Pronto Soccorso in tempo utile viene rapidamente inquadrato e può essere sottoposto nei casi indicati a trombolisi intravenosa, intrarteriosa o posizionamento di stent in rapida sequenza anche per la attiva collaborazione con la U.O. di Neuroradiologia e Neurochirurgia dell’ IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore di Milano. L’ angiografia diagnostica classica viene eseguita nella sala angiografica dell’ Istituto Auxologico Italiano come il posizionamento di stents extracranici ed una serie di procedure è stata conclusa con successo: oltre 30 trombolisi intravenose sono state eseguite nel 2016 con successo e senza complicanze. Un numero rilevante di trombolisi intrarteriose sono state completate con successo e senza rilevanti effetti collaterali. La stretta collaborazione con la UO di Cardiologia diretta dal prof. Gianfranco Parati garantisce un attento monitoraggio cardiologico con una ottimizzazione del monitoraggio clinico per la migliore impostazione terapeutica e lo studio del sonno è stato completato con la

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collaborazione del Centro del Sonno (dott.ssa Carolina Lombardi) e della consulenza pneumologica (Dott. Paolo Banfi ed èquipe). Una collaborazione è in corso con l’ U.O.di Neurochirurgia della Fondazione Ospedale Maggiore di Milano (Consulente Dott. Mario Locatelli) e con la U.O. di Neuroradiologia del medesimo Istituto anche per lo sviluppo della RM 3 Tesla acquisita dell’ Istituzione. Il percorso del paziente post-ictus è assicurato da due U.O. di Riabilitazione nella Istituzione. Oltre all’ allestimento del database, diversi studi sono stati impostati tra i quali quello del sonno e delle apnee ostruttive in stretta relazione con l’ evento ischemico e la ricerca genetica nelle forme familiari. In stretta collaborazione con le altre Stroke Unit di Milano e con la Regione Lombardia, la Stroke Unit collabora a diversi studi programmatici regionali offrendo la propria disponibilità e competenza. Particolare attenzione è rivolta alla patologia cerebrovascolare rare per mitocondriopatie, per esempio,che vengono attivamente studiate con esecuzione di biopsie muscolari e ricerca di mutazioni in collaborazione con il Centro “Dino Ferrari” dell’ IRCCS Ospedale Maggiore di Milano. Le potenzialità diagnostiche e d’intervento della Stroke Unit in acuto sono ad ora ottimizzate dalla pronta disponibilità di una RM 1.5 Tesla ed, ora, di una RM 3 Tesla per cui è stata programmata un’attività di ricerca volta ulteriormente ad ottimizzare la diagnosi precoce dell’ evento ischemico nella prospettiva della più adeguata terapia.

PRODUZIONE SCIENTIFICA 2016

Pubblicazioni su Riviste Internazionali Indicizzate

Muller H.P., Turner M.R., Grosskreutz J., Abrahams S., Bede P., Govind V., Prudlo J., Ludolph A., Filippi M., Kassubek J., for The Neuroimaging Society in ALS (NiSALS) DTI Study Group. A large-scale multicentre cerebral diffusion tensor imaging study in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiat 87(6), 570-9, 2016 doi: 10.1136/jnnp-2015-311952; I.F. 6,431

Gerosa M., Poletti B., Pregnolato F., Castellino G., Lafronza A., Silani V., Riboldi P., Meroni P.L., Merrill J.T. Antiglutamate receptor antibodies and cognitive impairment in primary antiphospholipid syndrome and sistemi lupus erythematosus. Front Immunol 2016 Feb 1;7:5. doi:10.3389/ fimmu.2016.00005. Review; I.F. 5,695

Verde F., Ticozzi N., Messina S., Calcagno N., Girotti F., Maderna L., Moda F., Scola E., Falini A., Tagliavini F., Silani V. MRI abnormalities found one year prior to symptom onset in a case of Creutzfeldt-Jakob disease. J Neurol 263(3), 597-9, 2016. doi 10.1007/s00415-016-8022-6; I.F. 3,408

Oeckl P., Jardel C., Salachas F., Lamari F., Andersen P.M., Bowser R., Mamede de Carvalho, Costa J., van Damme P., Gray E., Grosskreutz J., Hernández-Barral M., Herukka S-K., Huss A., Jeromin A., Kirby J., Kuzma-Kozakiewicz M., del Mar Amador M., Mora J.S., Morelli C., Muckova P., Petri S., Poesen K., Heidrun Rhode H., Rikardssond A.-K., Robberecht W., Rodríguez Mahillo A.I., Shaw P., Silani V., Steinacker P., Turner M.R, Tüzün E., Yetimler B., Ludolph A.C., and Otto M.. Multicenter validation of CSF neurofilaments as diagnostic biomarkers for ALS. Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener, 17, 404-413, 2016; I.F. 2,677

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Bocchetta M, Mega A, Bernardi L, Di Maria E, Benussi L, Binetti G, Borroni B, Colao R, Di Fede G, Fostinelli S, Galimberti D, Gennarelli M, Ghidoni R, Piaceri I, Pievani M, Porteri C, Redaelli V, Rossi G, Suardi S, Babiloni C, Scarpini E, Tagliavini F, Padovani A, Nacmias B, Sorbi S, Frisoni GB, Bruni AC, Bozzali M., Parnetti L., Ferrarese C., Cappa S.F., Marra C., Masullo C., Rainero I., SINdem Collaborators: Silani V., Sorrentino G., Bruni G., Cagnin A. Genetic counseling and testing for Alzheimer’s disease and frontotemporal lobar de generation: an Italian consensus protocol. J Alzheimers Dis. 51, 277-291, 2016 Jan 29. [Epub ahead of print]PMID: 26901402; I.F. 3,920

Williams K., Topp S., Yang S., Smith B., Fifita J., Warraich S., Zhang K., Farrawell N., Vance C., Hu X., Chesi A., Leblond C., Sundaramoorthy V., Dobson-Stone C., Lee A., Rayner S., Molloy M., van Blitterswijk M., Dickson D., Petersen R., Graff-Radford N., Boeve B., Murray M., Pottier C., Don E., Winnick C., McCann E., Hogan A., Daoud H., Levert A., Dion P., Mitsui J., Ishiura H., Takahashi Y., Goto J., Kost J., Gellera C., Gkazi A.S., Miller J., Stockton J., Brooks W., Boundy K., Polak M., Muñoz-Blanco J.L., Esteban-Pérez J., Rabano A., Hardiman O., Morrison K., Ticozzi N., Silani V., de Belleroche J., Glass J., Kwok J., Guillemin G., Chung R., Tsuji S., Brown R., García-Redondo A., Rademakers R., Landers J., Gitler A., Rouleau G., Cole N., Yerbury J., Atkin J., Shaw C., Nicholson G., and Blair I. CCNF mutations in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Nature Communications 2016 Apr 15;7:11253.doi: 10.1038/ncomms11253; I.F. 11,329

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Poletti B., Solca F., Carelli L., Madotto F., Lafronza A., Faini A., Monti A., Zago S., Dalini D., Tiloca C., Doretti A., Verde F., Ratti A., Ticozzi N., Abrahams S., Silani V. The validation of the Italian Edinburgh Cognitive and Behavioural ALS Screen (ECAS). Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener, 17, 489-498, 2016; May 24:1-10. [Epub ahead of print] PMID: 27219526; I.F. 2,677 Fogh I., Lin K., Tiloca C., Rooney J., Gellera C., Diekstra F.P., Ratti A., Shatunov A., van Es M.A., Proitsi, Jones A., Sproviero W., Chiò A., McLaughlin R.L., Sorarù G., Corrado L., Stahl D., Del Bo R., Cereda C., Castellotti B., Glass J.D., Newhouse S., Dobson R., Bradley N. S., Topp S., van Rheenen W., Meininger V., Melki J., Morrison K.E., Shaw P.J., Leigh P.N., Andersen P.M., Comi G.P., Ticozzi N., Mazzini L., D’Alfonso S., Traynor B.J., MD; Damme P., Robberecht W., Brown R.H., Landers J.E., Hardiman O., Lewis C.M., van den Berg L.H., Shaw C.E., Veldink J.H., Silani V., Al-Chalabi A., Powell J. Association of a Locus in the CAMTA1 Gene With Survival in Patients With Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis. JAMA Neurol , 73, 812-820, 2016 May 31. doi: 10.1001/jamaneurol.2016.1114; I.F. 8,230

Kenna K.P., van Doormaal P.T.C., Dekker A., Ticozzi N., Kenna B.J., Diekstra F., van Rheenen W., van Eijk K.R., Jones A.R., Keagle P., Shatunov A., Sproviero W., Smith B.N., van Es M., Topp S., Kenna A., Miller J.W., Fallini C., Tiloca C. , McLaughlin R.L., Vance C., Troakes C., Colombrita C., Mora G., Calvo A., Verde F., Al-Sarraj S., King K., Calini D., de Belleroche J., Baas F., van der Kooi A., de Visser M., ten Asbroek A.L.M.A., Sapp P.C.,

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McKenna-Yasek D., Polak M., Asress S., Muñoz-Blanco J.L., SLAGEN Consortium, Lauria G., Williams K.L., Leigh N., Nicholson G.A., Blair I.P., Leblond C.S., Dion P.A., Rouleau G.A., Pall H., Shaw P.J., Turner M.R., Talbot K., Taroni F., Boylan K.B., Van Blitterswijk M., Rademakers R., Esteban-Pérez J., García-Redondo A., Van Damme P., Robberecht W., Chiò A., Gellera C., Drepper C., Sendtner M., Ratti A., Glass J.D., Mora J.S., A. Basak N., Hardiman O., Ludolph A.C., Andersen P.M., Weishaupt J., Brown R.H., Jr.1, Al-Chalabi A., Silani V., Shaw C.E., van den Berg L.H., Jan H Veldink J.H., Landers1 J.E. NEK1 variants confer susceptibility to amyotrophic lateral sclerosis. NatGen,48,1037-1042,2016.doi10.1038/ng.3626.Epub2016July25; I.F. 31,616 van Rheenen W., Shatunov A., Dekker A.M., McLaughlin R.L., Diekstra F.P., Pulit S.L., van der Spek R.A.A., Võsa U., de Jong S., Robinson M.R., Yang J., Fogh I., van Doormaal P.T.C. , Tazelaar G.H.P., Koppers M., Blokhuis A.M., Sproviero W., Jones A.R., Kenna K.P., van Eijk1 K.R., Harschnitz O., Schellevis R.D. , Brands W.J., Medic J., Menelaou A., Vajda A., Ticozzi N., Lin K., Rogelj B., Vrabec K., Ravnik-Glavač M., Koritnik B., Zidar J., Leonardis L., Grošelj L.D., Millecamps S., Salachas F., Meininger V., de Carvalho M., Pinto S., Mora J.S., Rojas-García R., Polak M., Chandran S., Colville S., Swingler R., Morrison K.E., Shaw P.J., Hardy J., Orrell R.W., Pittman A., Sidle K., Fratta P., Malaspina A., Topp S., Petri S., Abdulla S., Drepper C., Sendtner M., Meyer T., Ophoff R.A., Staats K.A., Wiedau-Pazos M., Lomen-Hoerth C., Van Deerlin V., Trojanowski J.Q., Elman L., McCluskey L., Basak A.N., Tunca C., Hamzeiy H., Parman Y., Meitinger T., Lichtner P., Radivojkov-Blagojevic M., Andres C.R., Maurel C., Bensimon G., Landwehrmeyer B., Brice A. , A.M. Payan C.A.M., Saker-Delye S., Dürr A., Wood N.W. , Tittmann L., Wolfgang Lieb W., Andre Franke A., Rietschel M., Cichon S., Nöthen M.M., Amouyel P., Tzourio C., Dartigues J.-F. , Uitterlinden A.G., Rivadeneira F., Estrada K., Hofman A., Curtis C., Blauw H.M., van der Kooi A.J., de Visser M., Goris A., Weber M. Shaw C.E., Smith B.N., Pansarasa O., Cereda C., Del Bo R., Comi G.P., D'Alfonso S., Bertolin C., Sorarù G., Mazzini L., Pensato V., Gellera C., Tiloca C., Ratti A., Calvo A., Moglia C., Brunetti M., Arcuti S., Rosa Capozzo R., Zecca C., Lunetta C., Penco S., Riva N., Padovani A., Filosto M., Muller B. Stuit R.J., PARALS registry, SLALOM group, SLAP registry, FALS Sequencing Consortium, SLAGEN Consortium, NNIPPS Study Group, Blair I., Zhang K., McCann E.P., Jennifer A. Fifita J.A., Nicholson G.A., Rowe D.B. , Roger Pamphlett R., Matthew C. Kiernan M.C., Julian Grosskreutz J., Witte O.W., Ringer T., Prell T., Stubendorff B., Kurth I., Hübner C.A., Leigh P.N., Casale F., Chiò A., Beghi E., Pupillo E., Tortelli R., Logroscino G., Powell J., Ludolph A.C., Weishaupt J.H., Robberecht W., Van Damme P., Franke L., Pers T.H., Brown R.H., Glass J.D., Landers J.E., Hardiman O., Andersen P.M., Corcia P., Vourc'h P., Silani V., Wray N.R., Visscher P.M., de Bakker P.I.W., van Es M.A., R. Jeroen Pasterkamp R.J., Lewis C.M., , Breen G. , Al-Chalabi A., H. van den Berg1 L., Jan H. Veldink J.H.. Genome-wide association analyses identify new risk variants and the genetic architecture of amyotrophic lateral sclerosis. Nat Gen, 48, 1043-1048, 2016. doi 10.1038/ng.3622.Epub2016July 25; I.F. 31,616 Aiello M., Silani V., Rumiati R.I. You stole my food! Eating alterations in frontotemporal dementia. Neurocase, 2016 Aug;22(4):400-9. doi: 10.1080/13554794.2016.1197952. Epub 2016Jun 21; I.F. 1,225

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Bonanni L., Cagnin A., Agosta F., Babiloni C., Borroni B., Bozzali M., Bruni A., Filippi M., Galimberti D., Monastero R., Parnetti L., Perani D., Serra L., Silani V., Tagliavini F., Tiraboschi P., Padovani A., on behalf of DLB-SINdem study group. The Italian Dementia with Lewy bodies Study Group (DLB-SINdem): toward a standardization of clinical procedures and multicenter cohort studies design. In press, Neurol Sci Sep13 2016, doi 10.1007/s10072-016-2713-8; I.F. 1,783

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Gendron T.F., Chew J., Stankowski J., Hayes L.R., Zhang Y.-J., Prudencio M., Carlomagno Y., Daughrity L.M., Jansen-West K., Perkerson E.A., O’Raw A., C. Cook1, Pregent L., Belzil V., Tabassian L.J., Lee C.W., Yue M., Tong J., Song Y., Castanedes-Casey M., Rousseau L., Phillips V., Dickson D.W., Rademakers R., Fryer J.D., Rush B.K., Pedraza O., Caputo A.M., Desaro P., Palmucci C., Robertson A., Heckman M.G., Diehl N.N., Wiggs E., Tierney M., Braun L., Farren J., Lacomis D., Ladha S., Fournier C.N., Toledo J.B., McBride J., Tiloca C., Morelli C., Poletti B., Solca F., Prelle A., Wuu J., Jockel-Balsarotti J., Rigo F., Ambrose C., Raitcheva D., Antognetti G., McCampbell A., Brown R.H., Bowser R., Miller T.M., Trojanowski J., Grossman M., Berry J.D., Hu W.T., Ratti A., Traynor B.J., Benatar M., Silani

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Tot. I.F.162,14

Registri

- Registro Nazionale delle Malattie Rare - Istituito dall’Istituto Superiore di Sanità. - Studio Epidemiologico sull’incidenza delle malattie rare: 36 nuovi casi - Registro Lombardo della Sclerosi Laterale Amiotrofica. - Studio epidemiologico su pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica: 30

Corsi ECM - Le cellule staminali nella patologia neurodegenerativa - Sala Convegni Ospedale San Luca – Milano, 24/11/2016

- Charcotiadi : i giovedì dell’aggiornamento clinico - Clinico - Laboratorio di Neuroscienze - Clinico/laboratorio - Lezioni magistrali - I mercoledì dell’aggiornamento di laboratorio - Discussione dei dati di laboratorio relativi ai differenti gruppi di ricerca - I mercoledì del gruppo di lavoro SLA/FTD - Aggiornamenti sulle Linee Guida - Novità cliniche e terapeutiche - Sperimentazioni nazionali ed internazionali

ATTIVITÀ PROMOZIONE E DIDATTICA

Partecipazione Editorial Board Internazionali - Amyotrophic Lateral Sclerosis and other Neuron Disorders - European Neurology - American Journal of Neurodegenerative Diseases

Stage all’estero di ricercatori:

- Dott.ssa Isabella Fogh - Department of Basic and Clinical Neuroscience, Institute of Psychiatry, Psychology & Neuroscience King's College London, UK

- Dott. Niccolò Mencacci – UCL Institute of Neurology – London , UK

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SEDE DISTACCATA DEL CENTRO “DINO FERRARI” PRESSO I L LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE, CITOGENETICA, A NALISI BIOCHIMICO-CLINICHE, BIOINFORMATICA- IRCCS E. MEDEA Responsabile Dott. M.T.Bassi

Personale strutturato:

Dott Maria Teresa Bassi Biologo IRCCS E. Medea Dott. Maria Clara Bonaglia Biologo IRCCS E. Medea Dott. Rachele Cagliani Biologo IRCCS E. Medea Dott Roberto Giorda Biologo IRCCS E. Medea Ing Uberto Pozzoli Bioingegnere IRCCS E. Medea Dott. Manuela Sironi Biologo IRCCS E. Medea Dott. Chiara Vantaggiato Biologo IRCCS E. Medea Dott. Alessia Arnoldi Biologo IRCCS E. Medea Dott. Silvana Beri Biologo IRCCS E. Medea

Personale Borsista laureato:

Dott. Francesca Ciceri Biologo Borsista IRCCS E. Medea Dott. Marianna Castelli Biologo Borsista IRCCS E. Medea Dott. Andrea Citterio Biotecnologo Contrattista Dott. Sara Bertuzzo Biologo Borsista IRCCS E Medea Dott Alessandra Mozzi Biotecnologa IRCCS E.Medea Ing. Erika Molteni Ingengere Biomedico – Contrattista IRCCS E.Medea Dottorandi: Dott. Diego Forni Biotecnologo – Contrattista IRCCS E. Medea Dott. Chiara Pontremoli Biologa –Universita’ di Milano Dott. Shikha Vashisht Biotecnologa –SEMM

Consulenti Dott. ME Raggi Biologo IRCCS E. Medea

Personale tecnico strutturato

Cinzia Baschirotto tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea Giulietta Gottardi tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea Paola Pozzi tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea Chiara Mapelli tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea Stefania Riva tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea Giorgia Menozzi Programmatrice IRCCS E. Medea

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L’attivita’ di ricerca nell’ambito del progetto su paraparesi spastiche e malattie del motoneurone e’ proseguita nell’anno 2016 con l’identificazione di nuove mutazioni in forme particolarmente rare e poco rappresentate di paraparesi spastiche quali SPG28, SPG21, SPG54 e SPG30. Contemporaneamente abbiamo completato lo studio degli effetti di mutazioni in spastizina in cellule (fibroblasti e linfoblasti) di pazienti con mutazioni missenso e troncanti nel gene, precedentemente identificate nel laboratorio. Nel 2016 abbiamo proseguito l’analisi della funzione di spastizina nell’autofagocitosi e la caratterizzazione dei difetti di maturazione degli autofagosomi in presenza di mutazioni missenso e troncanti di spastizina. Dopo aver dimostrato che spastizina interagisce con Beclin1, abbiamo dimostrato anche che questa proteina e‘ un componente dei complessi autofagici di Beclin1, ma è esclusa dal complesso Atg14-Beclin1. Beclin1 regola l’autofagocitosi formando un complesso centrale con Vps15 e Vps34 e regolando l’attività della chinasi Vps34 tramite l’interazione con una varietà di proteine, tra cui Atg14L, UVRAG e Rubicon. Il complesso generato dall’interazione con Atg14 regola la sintesi del PI3P, la formazione delle isolation membranes e la generazione degli autofagosomi. Il complesso generato dall’interazione con Uvrag regola sia la formazione che la maturazione degli autofagosomi (Liang et al., 2006, 2008). Infine il legame di Rubicon al complesso contenete Uvrag regola negativamente la maturazione degli autofagosomi (Zhong et al., 2009). Spastizina agisce all’interno di un eterocomplesso con spatacsina e AP5; anche queste due proteine sono coinvolte in forme di paraparesi spastica complicata e recessiva. Mutazioni sia di spatacsina sia di spastizina portano ad accumuli di autofagosomi nelle cellule dei pazienti. Abbiamo quindi cercato di definire differenze e analogie tra le funzioni di queste proteine nel traffico endosomale e nell’autofagia. Entrambe queste proteine interagiscono con RAB5 e RAB11, i principali regolatori del processo di endocistosi e fusione di vescicole endosomali. Mutazioni in spastizina annullano queste interazioni causando una diminuzione del tasso di internalizzazione e fusione di vescicole come dimostrato osservando il pathway di internalizzazione seguito dal recettore dell’EGF. Contemporaneamente si ha anche accumulo di autofagosomi quindi in cellule SPG15 i due difetti si sommano per dare un fenotipo più grave, con un maggiore accumulo di autofagosomi e rallentamenti nell’endocitosi. Ripetendo l’esperimento in cellule con mutazioni in SPG11, si e’ osservato che mutazioni in questo gene non alterano l’interazione con RAB5 e RAB11 e conseguentemente i processi di internalizzazione e fusione di vescicole proseguono normalmente. Era stato precedentemente dimostrato che in cellule SPG11 si ha un rallentamento del processo di rigenerazione di lisosomi (ARL) generando quindi un minore numero di lisosomi disponibili per la fusione con gli autofagolisosomi e conseguente maturazione degli autofagosomi. Ne deriva quindi che in caso di mutazioni della Spatacsina si ha solo accumulo di autofagosomi immaturi, senza alterazioni del processo di endocitosi. Conseguentemente l’accumulo di autofagosomi e’ meno marcato in cellule SPG11 rispetto a cellule SPG15. Nell’ambito della ricerca relativa ai disordine del neurosviluppo si e’ continuata l’attivita’di ricerca sulla Sindrome da delezione 22q13, nota anche come Sindrome di Phelan McDermid (PMS, MIM 606232). La PMS è una malattia del neurosviluppo causata dalla perdita (delezione) o interruzione della regione terminale del cromosoma 22 contenente il gene SHANK3, che codifica per una proteina sinaptica strutturale. Il quadro clinico, che include la manifestazione o meno di sintomi di tipo autistico e epilessia, è molto variabile anche tra pazienti con delezione della stessa taglia, ma la ragione per questo fenomeno è finora sconosciuta. E’ perciò probabile che altri fattori genetici, in aggiunta alla aploinsufficienza di SHANK3, abbiano un ruolo in questa variabilità. Il quadro clinico della sindrome inoltre evolve a seconda dell’età dei pazienti e l’approfondimento di questa evoluzione sarà fondamentale per determinare il trattamento appropriato. L’attività di ricerca, in corso presso

105

l’IRCCS E. Medea, riguarda perciò uno studio clinico-genetico su un’ampia coorte di 80 pazienti italiani con PMS di età che spazia dall’infanzia all’età adulta e prevede: a) un follow-up sistematico attraverso un approccio clinico inter-disciplinare, incluso lo studio del funzionamento cerebrale mediante studi elettroencefalografici (EEG) e di risonanza magnetica (MRI 3 Tesla), b) la definizione delle basi genetiche molecolari mediante NGS per individuare varianti genetiche clinicamente rilevanti, sia a livello della copia rimanente del gene SHANK3 che nella porzione codificante degli altri geni della regione 22q13 coinvolta nella delezione ed eventualmente, in presenza di evidenze cliniche peculiari, nel resto dell’esoma; c) uno studio mirato su una popolazione di soggetti adulti di età compresa fra i 18-50 anni attraverso una valutazione comportamentale sistematica e raccolta della storia clinica. L’attivita’ della sezione di bioinformatica si sta concentrando da alcuni anni sull’applicazione di approcci innovativi per analizzare i dati di variabilità genetica nell'uomo. Tali approcci prevedono l'utilizzo di strumenti di genetica di popolazione per identificare geni o regioni geniche che sono stati sottoposti a selezione naturale, partendo dal presupposto che le forze selettive agiscono su un locus specifico appunto perché tale locus contiene una variante polimorfica funzionale e che tali forze lasciano un “segno” che può essere utilizzato per identificare le varianti selezionate. E' noto che, durante la storia evolutiva dell'uomo, pathways specifici fondamentali per la sopravvivenza sono stati soggetti a pressione selettiva, ed è per questo che abbiamo applicato le metodiche di genetica di popolazione a geni di interesse biomedico quali, ad esempio, geni coinvolti nella regolazione della pressione arteriosa, nel pathway della coagulazione e fibrinolisi, nella regolazione metabolica. Abbiamo inoltre studiato i geni coinvolti nella risposta immune e nell'autoimmunità. Abbiamo inoltre messo a punto un approccio complementare che prevede l'analisi evolutiva a livello inter-specifico (tra mammiferi o tra primati) al fine di identificare siti o regioni di particolare importanza dal punto di vista funzionale. Per quanto riguarda l’azione di supporto all’attivita’ di sequenziamento NGS, sfruttando le competenze e gli strumenti messi a punto nel corso degli anni (in particolare la libreria GeCo++), è stato possibile implementare software di analisi particolarmente avanzati. Particolare cura è stata posta nella configurazione di una infrastruttura hardware/software in grado di garantire, oltre alla suddetta flessibilità nelle analisi, la possibilità di mettere a disposizione dei diversi gruppi strumenti accessibili attraverso interfacce web relativamente semplici nell'utilizzo e che non richiedano conoscenze informatiche troppo avanzate. L'idea è quella di costruire una sistema che possa integrare informazioni di diversa natura (database di annotazioni, dati clinici, software per l'analisi funzionale) per rispondere in modo il piu' possibile intuitivo ai quesiti posti da ogni esperimento. I software a disposizione consentono di analizzare i dati da diversi punti di vista: l'analisi dell'effetto di una variante su di un trascritto viene effettuata valutandone la sua posizione, l'effetto sul prodotto proteico, sullo splicing e sull'espressione. Ciascuna di queste tipologie di analisi richiede l'accesso a database di annotazioni, motivi regolatori, fattori di trascrizione, nonché' l'impiego di software specifici. Per un impiego efficace è necessario dunque avere a disposizione un sistema informatico in grado di correre diversi software contemporaneamente, garantendo l'accesso alle fonti di dati e integrando poi i risultati in tabelle di semplice lettura e consultazione. I progetti di ricerca del nostro laboratorio, quasi sempre di natura genome-wide, ci hanno consentito non solo di mettere a punto algoritmi specifici per i diversi aspetti di queste analisi ma anche di sviluppare il software proprio tenendo conto delle esigenze di flessibilità e integrazione citate sopra. In particolare la libreria GeCo++, che è stata sviluppata nel nostro laboratorio come supporto a progetti di ricerca genome wide. Ha trovato una efficace applicazione nei problemi posti dal sequenziamento NGS e, in particolare dall'analisi terziaria dei risultati. In altre parole l'aver pensato in termini genome wide fin dal momento della prima versione del genoma umano, ci consente ora di affrontare le problematiche NGS

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in modo efficiente sia in termini di tempi di realizzazione degli strumenti di analisi che di risorse necessarie.

Elenco delle Ricerche sviluppate nel corso del 2016 presso il laboratorio di biologia molecolare citogenetica e bioinformatica:

- Caratterizzazione dei meccanismi patogenetici coinvolti in forme recessive di paraparesi spastica ereditaria ad insorgenza precoce

- Associazione tra riarrangiamenti genomici costituzionali e disabilità del neurosviluppo - Significato fisiopatologico delle dinamiche mitocondriali nella degenerazione

muscolare e neuronale: identificazione di un bersaglio terapeutico innovativo

- Sviluppo di soluzioni Next Generation (NGS) per la diagnosi delle epilessie idiopatiche e forme isolate e sindromiche di disabilità intellettiva

- Malattie del motoneurone: analisi di modelli di Drosophila per lo studio del ruolo del metabolismo lipidico nei processi neurodegenerativi

- Analisi evolutiva di tratti fenotipici complessi per l'identificazione di varianti causative

- Analisi RNA - seq per l'identificazione de - novo di isoforme di trascrizione e di splicing in pazienti neuromuscolari

- Applicazione di un approccio di Next-Generation-Sequencing per l'identificazione di varianti causative/predisponenti a malattie autoimmuni (Sclerosi Multipla e Morbo di Crohn)

Progetti attivi nel 2016

- Lipid metabolism in the hereditary spastic paraplegia: genes, biomarkers, and models for therapy (NEUROLIPID)- (2014-206) ERARE JTC

- Role of DRP1 and mitochondrial dynamics in neuronal and muscular disorders: molecular mechanisms and therapeutics implications (2014-2016) prog GR-2011-02350544 (Ministero della salute)

Collaborazioni

Prof E. I Rugarli- Institute for Genetics CECAD Research Center University of Cologne Joseph-Stelzmann-Str. 26 50931 Köln Germany Prof W Griffith- Institute of Mass Spectrometry College of Medicine Grove Building Swansea University Singleton Park Swansea SA2 8PP Wales, UK. Prof Luca De Gioia - Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milan-Bicocca, 20126 Milan, Italy. Prof. Mario Clerici -Department of Physiopathology and Transplantation, University of Milan, 20090 Milan, Italy. and Don C. Gnocchi Foundation ONLUS, IRCCS, 20148 Milan, Italy. Edward J Hollox - Department of Genetics, University of Leicester, Leicester LE2 1TE, UK Prof Giuseppe Bianchi - Nephrology and Dialysis Unit, San Raffaele Scientific Institute, University Vita Salute San Raffaele, Milan, Ita Nasser M. Al-Daghri - Biomarker research program, Biochemistry Department, College of Science, King Saud University, Riyadh 11451, Kingdom of Saudi Arabia (KSA) and Prince Mutaib Chair for Biomarkers of Osteoporosis, Biochemistry Department, College of science, King Saud University, Riyadh, KSA

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Dott. Franca Guerini - Don C. Gnocchi Foundation ONLUS, IRCCS, 20100 Milan, Italy Dott. Mara Biasin - Department of Biomedical and Clinical Sciences, University of Milan, 20157 Milan, Italy Prof. Roberto de Franchis - IBD Unit, Chair of Gastroenterology, Luigi Sacco University Hospital, 20157 Milan Dott. Sergio Lo Caputo - S. Maria Annunziata Hospital, 50122 Florence, Italy Dott. Rosanna Asselta - Dipartimento di Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale, Università degli Studi di Milano, Milano, Italy. Dott. Juan Antonio Pineda - Infectious Diseases and Microbiology Clinical Unit. Valme Hospital, Seville, Spain Dott. Antonio Rivero-Juarez - Maimonides Institut for Biomedical Research (IMIBIC)-Reina Sofia Universitary Hospital-University of Cordoba, Spain Dott. Antonio Caruz - Immunogenetics Unit, Department of Experimental Biology, University of Jaen, Jaen, Spain Dott. Manuel Comabella - Hospital Universitari Vall d´Hebron (HUVH). Barcelona, Spain Dott. Matteo Fumagalli - UCL Genetics Institute, Department of Genetics, Evolution and Environment, University College London, Gower Street, London WC1E 6BT, United Kingdom Dott. Matteo Cereda - Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology (IEO), 20139 Milan, Italy Prof. Jernej Ule - Department of Molecular Neuroscience, UCL Institute of Neurology, Queen Square, London WC1N 3BG, UK

Estratto pubblicazioni Anno 2016

Arrigoni Filippo Silvio Aldo, Romaniello Romina, Peruzzo Denis, Righini Andrea, Parazzini Cecilia, Colombo Paola, Bassi Maria Teresa, Triulzi Fabio, Borgatti Renato (2016); Aberrant supracallosal longitudinal bundle: mr features, pathogenesis and associated clinical phenotype; European Radiology, 26(8):2587-2596 Doi: 10.1007/s00330-015-4084-6 PMID: 26560723 I.F. 2015: 3,640

Baldelli Sara, Cattaneo Dario, Pignatelli Pasquale, Perrone Valentina, Pastori Daniele, Radice Sonia, Violi Francesco, Clementi Emilio (2016); Validation of an lc-ms/ms method for the simultaneous quantification of dabigatran, rivaroxaban and apixaban in human plasma; Bioanalysis, 8(4):275-283 Doi: 10.4155/bio.15.261 PMID: 26808218 I.F. 2015: 2,813

Baldelli Sara, Cattaneo Dario, Cerea Matteo, Pignatelli Pasquale, Violi Francesco, Clementi Emilio (2016); Identification of different patterns of dabigatran in vivo bioactivation in patients on maintenance anticoagulation theraphy; Therapeutic Drug Monitoring , 38(6):814-816 – Letter to the Editor Doi: 10.1097/FTD.0000000000000342 PMID: 27855135 I.F. 2015: 2,094

Bersano Anna, Markus Hugh Stephen, Quaglini Silvana, Arbustini Eloisa, Lanfranconi Silvia, Micieli Giuseppe, Boncoraglio Giorgio B., Taroni Franco, Gellera Cinzia, Baratta Silvia, Penco Silvana, Mosca Lorena, Grasso Maurizia, Carrera Paola, Ferrari Maurizio, Cereda Cristina, Grieco Gaetano, Corti Stefania, Ronchi Dario, Bassi Maria Teresa, Obici Laura, Parati Eugenio A., Pezzini Alessandro, De Lodovici Maria Luisa, Verrengia Elena P., Bono Giorgio, Mazucchelli Francesca, Zarcone Davide, Calloni Maria Vittoria, Perrone Patrizia, Bordo Bianca Maria, Colombo Antonio, Padovani Alessandro, Cavallini Anna, Beretta

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Simone, Ferrarese Carlo, Motto Cristina, Agostoni Elio, Molini Graziella, Sasanelli Francesco, Corato Manuel, Marcheselli Simona, Sessa Maria, Comi Giancarlo, Checcarelli Nicoletta, Guidotti Mario, Uccellini Davide, Capitani Erminio, Tancredi Lucia, Arnaboldi Marco, Incorvaia Barbara, Tadeo Carlo Sebastiano, Fusi Laura, Grampa Giampiero, Merlini Giampaolo, Trobia Nadia, Comi Giacomo Pietro, Braga Massimiliano, Vitali Paolo, Baron Pierluigi, Grond-Ginsbach Caspar, Candelise Livia, Lombardia GENS Group (Bassi Maria Teresa) (2016); Clinical pregenetic screening for stroke monogenic diseases: results from lombardia gens registry, Stroke, 47(7):1702-1709 Doi: 10.1161/STROKEAHA.115.012281PMID: 27245348 I.F. 2015: 5,787

Bonaglia Maria Clara*, Giorda Roberto*, Epifanio Roberta, Bertuzzo Sara, Marelli Susan, Gerard Marion, Andrieux Joris, Zanotta Nicoletta, Zucca Claudio (2016); Partial deletion of depdc5 in a child with focal epilepsy; Epilepsia Open, 1(3-4):140-144 * Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro Doi: 10.1002/epi4.12012 Cagliani Rachele, Forni Diego, Filippi Giulia, Mozzi Alessandra, De Gioia Luca, Pontremoli Chiara, Pozzoli Uberto, Bresolin Nereo, Clerici Mario, Sironi Manuela (2016); The mammalian complement system as an epitome of host-pathogen genetic conflicts; Molecular Ecology, 25(6):1324-1339 Doi: 10.1111/mec.13558 PMID: 26836579 I.F. 2015: 5,947

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Gentili Marta*, Marinaccio Paola*, Galimberti Cesare*, Carnovale Carla, Antoniazzi Stefania, Pozzi Marco, Clementi Emilio“, Viganò Caterina**, Radice Sonia** (2016); A case of dysgraphia induced by sertraline and a review of official spontaneous adverse reaction databases; Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 41(1):106-107 * e ** Autori che hanno contribuito in ugual misura al lavoro “ Corresponding author in penultima posizione Doi: 10.1111/jcpt.12356PMID: 26792111 I.F. 2015: 1,833 Klionsky Daniel J., Abdelmohsen Kotb, Abe Akihisa, ……, Bassi Maria Teresa, …., Clementi Emilio, et al. (2016); Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition); Autophagy, 12(1):1-222 Doi: 10.1080/15548627.2015.1100356PMID: 26799652 I.F. 2015: 9,108

Landini Martina, Merelli Ivan, Raggi Maria Elisabetta, Galluccio Nadia, Ciceri Francesca, Bonfanti Arianna, Camposeo Maria Serena, Massagli Angelo, Villa Laura, Salvi Erika, Cusi Daniele, Molteni Massimo, Milanesi Luciano, Marabotti Anna, Mezzelani Alessandra (2016); Association analysis of noncoding variants in neuroligins 3 and 4x genes with autism spectrum disorder in an italian cohort; International Journal of Molecular Sciences, 17(10):E1765 Doi: 10.3390/IJMS17101765 PMID: 27782075 I.F. 2015: 3,257

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Marano Marco, Bottaro G., Goffredo B., Stoppa F., Pisani M., Marinaro A.M., Deodato F., Dionisi-Vici C., Clementi Emilio, Falvella Felicia Stefania (2016); Deferasirox-induced serious adverse reaction in a pediatric patient: pharmacokinetic and pharmacogenetics analysis; European Journal of Clinical Pharmacology, 72(2):247-248 - Letter to the Editor Doi: 10.1007/s00228-015-1956-2 PMID: 26403473 I.F. 2015: 2,710

Martinuzzi Andrea, Montanaro Domenico, Vavla Marinela, Paparella Gabriella, Bonanni Paolo, Musumeci Olimpia, Brighina Erika, Hlavata Hana, Rossi Giuseppe, Aghakhanyan Gayane, Martino Nicola, Baratto Alessandra T., D'Angelo Maria Grazia, Peruch Francesca, Fantin Marianna, Arnoldi Alessia, Citterio Andrea, Vantaggiato Chiara, Rizzo Vincenzo, Toscano Antonio, Bresolin Nereo, Bassi Maria Teresa (2016); Clinical and paraclinical indicators of motor system impairment in hereditary spastic paraplegia: a pilot study; Plos One, 11(4):e0153283 Doi: 10.1371/journal.pone.0153283 PMID: 27077743 I.F. 2015: 3,057 Mezzelani Alessandra, Raggi Maria Elisabetta, Marabotti Anna, Milanesi Anna (2016); ochratoxin a as possible factor trigging autism and its male prevalence via epigenetic mechanism; Nutritional Neuroscience, 19(1):43-46 Doi: 10.1179/1476830515Z.000000000186PMID: 25597866 I.F. 2015: 2,616

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