Consiglio Nazionale delle Ricerche Istituto per lo Studio degli...

Introduzione IC v.2 03/06/2008 pag.

C.N.R. Istituto per lo Studio degli Ecosistemi – Lab Idrochimica Largo Tonolli, 50 I-28922 Verbania Pallanza Tel. 0323 518300

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Consiglio Nazionale delle Ricerche Istituto per lo Studio degli Ecosistemi

Verbania Pallanza Laboratorio di idrochimica - metodi analitici ad uso interno

a cura di Gabriele TARTARI

INTRODUZIONE ALLA CROMATOGRAFIA IONICA

ANALISI IN CROMATOGRAFIA IONICA Dall’inizio degli anni ’90 la cromatografia ionica (IC) è diventata una delle tecniche analitiche più frequentemente utilizzate nella determinazione degli anioni (Cl-, SO4

-- e NO3-) e dei cationi (Ca++

Mg++, Na+, K+ ed NH4+) anche a bassi livelli di concentrazione. Nel laboratorio del CNR Istituto

per lo Studio degli Ecosistemi (già Istituto Italiano di Idrobiologia) questa tecnica analitica con strumentazione Dionex è stata introdotta nel 1984 per la determinazione degli anioni e nel 1990 per la determinazione dei cationi. Attualmente si determinano otto variabili chimiche in IC rispetto al totale di 12-14 determinazioni generalmente eseguite per singolo campione. L’analisi in cromatografia ionica con soppressione chimica della conducibilità dell’eluente, è una determinazione cromatografica liquida ad alte prestazioni (HPLC) che utilizza una fase mobile (eluente alcalino o acido) in grado di scambiare anioni o cationi con la fase stazionaria (resina a scambio anionico o cationico contenuta nelle colonne di separazione). Prima di giungere al rivelatore la conducibilità dell’eluente viene soppressa chimicamente e gli ioni analizzati trasformati nei corrispondenti acidi o basi forti rispettivamente nella determinazione di anioni o cationi. Il rivelatore comunemente utilizzato per queste analisi è quello conduttometrico in quanto la misura della conducibilità è il metodo ideale per la per la quantificazione dei composti ionici, dove la conducibilità di una soluzione a bassa concentrazione di elettroliti è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’elettrolita stesso. Il sistema strumentale può essere così sintetizzato: pompa per l’eluente, autocampionatore per l’iniezione del campione, colonne a scambio ionico per la separazione degli analiti, sistema di soppressione chimica, rivelatore conduttometrico, software per la gestione della strumentazione, l’acquisizione, l’integrazione e l’elaborazione del segnale (Fig. 1).

Fig. 1 - Schema generico di un cromatografo ionico Dionex con generazione e soppressione dell’eluente per via

elettrochimica



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La rivelazione in conducibilità diventa molto più efficace se l’eluente all’uscita della colonna separatrice viene trasformato in una soluzione a bassa conducibilità, operazione realizzata tramite il soppressore chimico o elettrochimico (Fig. 2). In questo modo gli eluenti potassio idrossido o acido metansolfonico che vengono trasformati in acqua, e l’eluente carbonato e bicarbonato trasformato in acido carbonico subito dissociato in acqua ed anidre carbonica. Questo processo di soppressione ha inoltre il vantaggio di esaltare il segnale dell’analita (Fig. 3) grazie alla sostituzione del controione anionico con l’idrogenione (H+) e del controione cationico con l’ossidrilione (OH-) entrambi con una elevata conducibilità specifica (rispettivamente 315,1 e 174 µS cm2 µeq-1 a 20°C).

Fig. 2 – Spaccato di un soppressore elettrochimico

autorigenerante (SRS) Fig. 3 – Schema di flusso di un IC con rivelatore a

conducibilità soppressa Una particolarità dei sistemi analitici Dionex oltre alla soppressione dell’eluente per via elettrochimica autorigenerante, è la possibilità di produrre automaticamente l’eluente partendo da acqua ultrapura ed utilizzando una cartuccia con l’eluente concentrato. Il sistema tramite la pompa che mantiene il flusso costante di acqua ultrapura alimenta una cella elettrolitica che genera l’eluente alcalino (KOH, NaHCO3 e Na2CO3) o l’acido metansolfonico (MSA) alla concentrazione necessaria per le determinazioni, attraverso la variazione di intensità dell’alimentazione elettrica; è così possibile produrre eluenti a concentrazione costante con risoluzione 1 mM nell’intervallo 1÷100 mM, oppure eseguire gradienti di concentrazione nello stesso intervallo di concentrazioni. Il vantaggio più importante di questo sistema oltre alla comodità operativa, è la possibilità di produrre l’eluente alcalino KOH a concentrazioni molto basse 10÷30 mM senza contatto con l’aria, quindi senza problemi di carbonatazione, con un elevato miglioramento della prestazione analitica in termini di linearità nella determinazione degli anioni. Per una descrizione più approfondita delle tecniche riguardanti l’analisi in cromatografia ionica si rimanda a Fritz et al. (1995), Weiss (1995) e Sarzanini (1998). Come per le altre metodiche descritte in uso nei laboratori del CNR-ISE di Verbania, anche in questo capitolo verranno riportate per ogni metodo le informazioni riguardanti il principio della determinazione, l’intervallo analitico di utilizzo con i limiti di determinazione (LOD) e quantificazione (LOQ) e la ripetibilità del metodo a diverse concentrazioni, ottenuti sulla base delle carte di controllo utilizzate per anni nel laboratorio. I valori riportati in queste tabelle si riferiscono alle condizioni ottimizzate per l’analisi di routine con le colonne a scambio ionico in uso presso il laboratorio dell’Istituto; queste possono anche essere ottimizzate per altri analiti ed intervalli analitici a condizione però che vengano eseguite le necessarie verifiche metodologiche. Vengono poi descritti i reagenti necessari per la determinazione, il procedimento analitico e gli standard utilizzati nelle fasi di calibrazione; infine si riportano i riferimenti bibliografici da cui sono tratte le metodiche. Nelle descrizioni degli aspetti pratici più direttamente collegati all’uso dei metodi, si



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farà riferimento esclusivamente alla strumentazione in uso nel laboratorio dell’Istituto descritta nei paragrafi successivi. STABILITÀ DELLA RISPOSTA STRUMENTALE Una caratteristica delle determinazioni IC eseguite con le metodiche riportate in questo capitolo è la notevole stabilità della risposta strumentale per tempi relativamente lunghi (settimane ed anche mesi). Questa caratteristica è evidenziata per gli anioni (Fig. 4) e per i cationi (Fig. 5) con la deviazione standard relativa (R.S.D) sul segnale in area ottenuto dall’iniezione con lo stesso loop da 100 µL degli standard di calibrazione preparati ed utilizzati in giorni diversi durante un lungo periodo (30 e 19 mesi). Come si può vedere i valori di R.S.D. sono contenute entro il 2-8 % per concentrazioni superiori a 1 mg L-1, mentre dispersioni più elevate (5-15 %) si riscontrano solo per concentrazioni inferiori a 0,1 mg L-1. Si deve tuttavia sottolineare che la variabilità non è determinata solo dalla risposta strumentale, ma anche dalla preparazione, manipolazione e conservazione degli standard, fasi particolarmente delicate alle basse concentrazioni e che possono introdurre molta variabilità per gli analiti più sensibili agli inquinamenti, quali sodio, cloruri o potassio utilizzato in IC come eluente (KOH).

0

5

10

15

0.0 0.1 1.0 10.0 100.0

Concentrazione degli standard (mg L-1)

R.S

.D. a

ree

dei

pic

chi

Cloruri

Azoto nitrico CDM

Azoto nitrico UV 215 nm

Solfati

Fig. 4 - Deviazione standard relativa (R.S.D) sul segnale in area ottenuta da iniezioni con loop da 100 µL degli standard di calibrazione degli anioni preparati ed utilizzati in giorni diversi; per l’azoto nitrico sono riportati i valori ottenuti con il rivelatore conduttometrico (CDM) ed spettrofotometrico (UV 215 nm). I dati si riferiscono alla linea analitica DX320-AS50 con colonne AG19-AS19-AAES nel periodo 11/2005 ÷ 4/2008.

0

5

10

15

20

25

30

0.0 0.1 1.0 10.0 100.0

Concentrazione degli standard (mg L-1)

R.S

.D. a

ree

dei

pic

chi

Sodio

Azoto ammoniacale

Potassio

Magnesio

Calcio

Fig. 5 - Deviazione standard relativa (R.S.D) sul segnale in area ottenuta da iniezioni con loop da 100 µL degli standard di calibrazione dei cationi preparati ed utilizzati in giorni diversi. I dati si riferiscono alla linea analitica DX500-AS3500 con colonne CG12A-CS12A-CAES nel periodo 10/2006 ÷ 4/2008.



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MODALITÀ DI CALIBRAZIONE Le determinazioni in cromatografia ionica descritte in questo capitolo, come la maggior parte delle determinazioni cromatografiche, richiedono almeno una (meglio due) calibrazioni giornaliere necessarie al controllo delle prestazioni del sistema analitico. In IC le modalità di calibrazione sono spesso poco dettagliate ed anche alcuni metodi ufficiali (A.P.H.A. 2005) lasciano molta elasticità a questo aspetto, mentre al normativa italiana APAT IRSA-CNR (2003) dedica un paragrafo specifico alla taratura per anioni e cationi in IC. Nella pratica si va dall’uso di un minimo di tre standard esterni multielemento (per una regressione lineare) fino a cinque o più standard utilizzando regressioni lineari o quadratiche. Sottovalutare la modalità di calibrazione può portare in tutte le determinazioni quantitative a forti errori sistematici; un esempio è l’analisi degli anioni in cromatografia ionica soppressa con eluente carbonato e bicarbonato, dove l’evidente non linearità delle calibrazioni è giustificata dal principio chimico della soppressione di questo eluente (Midgley & Parker 1989, Tartari et al. 1995) ed impone la calibrazione quadratica. In questo paragrafo vengono riassunti i concetti riguardanti la scelta delle modalità di calibrazione in IC nell’analisi di anioni e cationi inorganici. mentre per quanto riguarda più in generale le regressioni si rimanda a ISO 8466-1 (1990) e ISO 8466-2 (1993), Green (1996), Danzer K & Currie L. (1999), Miller & Miller (2005), Brüggemann et al. (2005). Esaminando le calibrazioni ottenute per anioni e cationi in IC nell’intervallo di concentrazioni comunemente riscontrabili nelle acque naturali, si notano risposte generalmente lineari per gli anioni con eluente potassio idrossido e cationi (ammonio escluso), andamenti quadratici sono invece tipici per gli anioni con eluente carbonato - bicarbonato e per l’ammonio con eluente acido metansolfonico (MSA). La scelta della migliore calibrazione può essere fatta attraverso l’osservazione e l’analisi dell’andamento dei punti ed ottimizzata tramite il fattore di risposta per unità di concentrazione (RF) e dall’analisi dei residui della regressione o del test F di Fischer. Fattore di risposta: è ottenuto dal rapporto fra il segnale misurato dal rivelatore (area del picco) e la concentrazione in mg L-1 dell’analita nello standard di calibrazione (Green 1996, Dorschel et al. 1989).

ioneconcentraz

piccodelareaRF

Per regressioni con valori di intercetta prossima a zero la costanza degli andamenti dei valori di RF indica un’ottima correlazione lineare, mentre significative variazioni del valore di RF indicano una bassa correlazione lineare tra standard e segnale. Tali andamenti possono essere causati da errori nella preparazione delle soluzioni calibranti o da andamenti non lineari che richiedono altri modelli di regressione (esempi di figura 6). Generalmente la tendenza non contenuta nell’intervallo del ± 5 % attorno al valore di RF medio indica la necessità di utilizzare una regressione quadratica anziché lineare. Per regressioni con valori di intercetta significativamente diversa da zero, l’andamento dell’RF non è sufficiente per giustificare la scelta della regressione quadratica.



5

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Segnale in area

Co

nce

ntr

azio

ne

(mg

L-1

)

0,65

0,70

0,75

0,80

0,85

0,90

Fat

tore

di

risp

ost

a (R

F)

Dati

Lineare

Quadratica

RF

RFm +5%

RFm -5%

SolfatiAG19 - AS19 KOH 19 mM

-0,06

-0,04

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0 10 20 30 40 50 60

Concentrazione (mg L-1)

Res

idu

i (m

g L

-1)

Lineare Quadratica

SolfatiAG19 - AS19 KOH 19 mM

0

1

2

3

4

5

6

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Segnale in area

Co

nce

ntr

azio

ne

(mg

N L

-1)

2,2

2,3

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2,9

3,0

Fat

tore

di

risp

ost

a (R

F)

Azoto nitricorivelatore CDM

AG19 - AS19 KOH 19 mM

-0,020

-0,010

0,000

0,010

0,020

0 1 2 3 4 5 6


Res

idu

i (m

g L

-1)

Lineare Quadratica

Azoto Nitrico (CDM)AG19 - AS19 KOH 19 mM

0

1

2

3

4

5

6

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

Segnale in area

Co

nce

ntr

azio

ne

(mg

L-1

)

0,4

0,5

0,5

0,6

0,6

0,7

Fat

tore

di

risp

ost

a (R

F)

PotassioCG12A - CS12A

MSA 20 mM

-0,010

-0,005

0,000

0,005

0,010

0 1 2 3 4 5 6


Res

idu

i (m

g L

-1)

Lineare Quadratica

PotassioCG12A - CS12A

MSA 20 mM

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Segnale in area

Co

nce

ntr

azio

ne

(mg

L-1

)

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Fat

tore

di

risp

ost

a (R

F)

AmmonioCG12A - CS12A

MSA 20 mM

-0,25

-0,15

-0,05

0,05

0,15

0,25

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

Concentrazione (mg N L-1)

Res

idu

i (m

g L

-1)

Lineare Quadratica

AmmonioCG12A - CS12A

MSA 20 mM

Fig. 6 – Esempi di calibrazioni costruite per gli anioni (colonne AG19-AS19-AAES eluente KOH) e cationi (colonne CG12A-CS192A-CAES eluente MSA) entrambi con loop di iniezione da 100 µL. Nella colonna a sinistra sono riportate le regressioni con l’andamento del fattore di risposta, nella colonna di destra si osservano gli andamenti dei residui (lineare e quadratico).



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Analisi dei residui: questo esame permette di valutare gli scostamenti del modello di regressione utilizzato (lineare o quadratico) dai valori teorici assunti (le concentrazioni degli standard).

mg L-1 teorica – mg L-1 calcolata da regressione (lineare o quadratica) Se la regressione è adeguata, i residui rappresentano solo l’errore sperimentale (casuale) e sono distribuiti normalmente. L’analisi dei residui solitamente fine effettuata per via grafica attraverso una valutazione visiva dell’andamento degli scostamenti in valore assoluto (concentrazione) o percentuale. Ponendo sullo stesso grafico gli scostamenti dei due modelli di regressione (Fig. 6) si possono evidenziare andamenti tipici e quantificare gli scostamenti per una migliore valutazione della regressione più adatta. In pratica per questa analisi bisogna valutare: la forma del grafico (lineare, curvo, divergenti o convergenti, con tendenza); il numero dei residui positivi deve essere all’incirca uguale a quelli negativi; l’ordine casuale dei residui positivi e negativi; la presenza di singoli valori con scostamento troppo elevato (outliers).

Test F di Fischer: questo test applicato all’analisi della varianza (ANOVA) permette di confrontare statisticamente la regressione con dei modelli di riferimento e viene eseguito a posteriori utilizzando i valori dell’errore quadratico medio del modello lineare (MSR,lin) con l’errore quadratico medio del modello non lineare di riferimento (MSR,nonlin) secondo il seguente rapporto:

nonlinR

linR

MS

MSF

,

,

dove GL

SSMS R

R ed 2 ciiiR yySS

SSR è la parte di variazione dei valori di y rispetto al valore medio ŷ attribuita al fatto che le osservazioni non stanno perfettamente sulla retta di regressione Il test F non viene eseguito sui valori medi calcolati in base ai rispettivi gradi di libertà che indicano quante parti di informazione indipendenti sono necessarie per calcolare quella somma di quadrati. Se il valore di Fc calcolato è superiore a quello critico Ft tabulato per il livello di significatività scelto, nel nostro caso α = 0,05 (5 %), l’ipotesi di linearità del modello deve essere rifiutata (Tab. 1 per gli anioni e Tab. 2 per i cationi a due intervalli analitici).



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Tab. 1 - Coefficienti di correlazione (r ed R2) delle regressioni lineari degli anioni (colonne AG19-AS19-AAES eluente KOH) eseguite sui segnali medi delle calibrazioni del periodo 11/2005÷4/2008 e risultati dei test F di Fischer calcolati (Fc) al livello di significatività α = 0,05 (5 %) e confronto con i valori tabulati (Ft) per la verifica della linearità. I valori si riferiscono ai due intervalli analitici più utilizzati.

Cl- N-NO3- CDM N-NO3

- UV 215 SO4=

Intervallo analitico (mg/L) 0,05 – 10 0,05 - 5 0,05 - 5 0,25 - 50

N° di standard 7 7 7 7

r 0,999998 0,999990 0,999990 0,999999

R2 0,999996 0,999981 0,999980 0,999998

Fc da SSR 5 18 7 2

Ft 8

Linearità: se Fc<Ft Lineare NON LINEARE Lineare Lineare

Intervallo analitico (mg/L) 0,05 – 2 0,05 – 1,5 0,05 – 1,5 0,25 - 10

N° di standard 5 5 5 5

r 0,999987 0,999998 0,999993 0,999998

R2 0,999974 0,999995 0,999986 0,999995

Fc da SSR 3 1 5 1

Ft 19

Linearità: se Fc<Ft Lineare Lineare Lineare Lineare Tab. 2 - Coefficienti di correlazione (r ed R2) delle regressioni lineari dei cationi (colonne CG12A-CS12A-CAES eluente MSA) eseguite sui segnali medi delle calibrazioni del periodo 10/2006÷4/2008 e risultati dei test F di Fischer calcolati (Fc) al livello di significatività α = 0,05 (5 %) e confronto con i valori tabulati (Ft) per la verifica della linearità. I valori si riferiscono ai due intervalli analitici più utilizzati.

Na+ N-NH4+ K+ Mg++ Ca++

Intervallo analitico (mg/L) 0,025 - 5 0,05 - 3 0,025 - 5 0,025 - 5 0,125 - 25

N° di standard 7 7 7 7 7

r 0.999997 0,993489 0,999995 0,999989 0,999961

R2 0.999994 0,987020 0,999990 0,999978 0,999921

Fc da SSR 7 9 1 8 6

Ft 8

Linearità: se Fc<Ft LINEARITA' NON LINEARE Lineare Lineare Lineare

Intervallo analitico (mg/L) 0,025 - 1 0,05 - 1 0,025 - 1 0,025 - 1 0,125 - 5

N° di standard 5 5 5 5 5

r 0,999990 0,996148 0,999906 0,999968 0,999991

R2 0,999980 0,992311 0,999813 0,999937 0,999982

Fc da SSR 2 55 5 4 14

Ft 19

Linearità: se Fc<Ft LINEARITA' NON LINEARE Lineare Lineare Lineare

Gli andamenti dei valori medi di RF ottenuti da standard di calibrazione di anioni e cationi preparati ed utilizzati in giorni diversi per un periodo di alcuni mesi (esempi in figura 4) e le verifiche con il test F di Fischer (Tab. 1 e 2), indicano che la regressione lineare è la più adatta per gli anioni cloruri, solfati e azoto nitrico rivelatore con UV215nm (eluente KOH) e per i cationi sodio,



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potassio, magnesio e calcio (eleuente MSA), mentre solo per il nitrato rivelatore conduttometrico (CDM) e per l’ammonio è necessaria la calibrazione quadratica. Vista inoltre la stabilità della risposta strumentale sulle letture degli standard (Fig. 2 e 3), si consiglia per anioni e cationi, di calibrare utilizzando da cinque a sette standard all’inizio ed alla fine dell’analisi di un gruppo di campioni (20-30 analizzati giornalmente). Per ottimizzare la calibrazione, quando non è necessario coprire un ampio intervallo analitico (sette standard per due o tre ordini di grandezza), si consiglia l’utilizzo di cinque standard in un intervallo di concentrazioni più ridotto. Per campioni molto simili (ad esempio acque provenienti dallo stesso lago) è meglio utilizzare la regressione lineare con solo tre standard a concentrazioni molto prossime ai valori attesi (inferiore ad un ordine di grandezza). LIMITI DI RIVELABILITÀ (LOD) E QUANTIFICAZIONE (LOQ) Per ogni metodo analitico è necessario identificare quale sia la concentrazione più piccola rilevabile e quantificabile, ed a maggior ragione qualora vengano effettuate misure a bassi livelli. Negli ultimi anni si è pero visto l’insorgere di diversi approcci per il calcolo di questi limiti, dettati principalmente dalle molteplici tecniche analitiche ormai presenti nei laboratori, al punto che ci si comincia anche a chiedere quale sia l’approccio matematico più idoneo (Rudiger 1998, Vogelgesang & Hadrich 1998). I limiti di rivelabilità (LOD) e quantificazione (LOQ) qui riportati per l’analisi di anioni e cationi, sono stati calcolati secondo il metodo IUPAC (Currie 1999) legato alla variabilità del bianco e con il più recente metodo dell’intervallo di predizione calcolato al 95 % dalle regressioni descritto originariamente da Hubaux & Vos (1970) e poi ripreso e sviluppato recentemente da vari altri autori (Geiβ & Einax 2001, EPA 2004, Lavagnini & Magno 2007). LOD e LOQ calcolati dalla variabilità del bianco Questo approccio secondo IUPAC è molto utilizzato in spettrofotometria per la valutazione dell’LOD e LOQ (Analytical Methods Committee 1987, Thompson et al. 2002, Miller & Miller 2005).

SDKSSLOD dbc

dove Sc e Sb sono rispettivamente i segnali misurati per campione e bianco, SD la deviazione standard dei segnali dei bianchi e Kd il coefficiente di proporzionalità normalmente non inferiore a 3 per l’LOD e compreso tra 8 e 10 per Kq nel calcolo dell’LOQ.

SDKSSLOQ qbc

Per passare dai valori di LOD e LOQ espressi come segnale (area nel caso di IC) minima rilevabile e quantificabile alle rispettive concentrazioni (mg L-1), si utilizza la retta di regressione rappresentativa del periodo di tempo in cui i bianchi sono stati analizzati. Applicare questo metodo all’IC risulta però abbastanza difficoltoso in quanto spesso nei bianchi (campione di acqua ultrapura che segue la stessa procedura di analisi dei campioni incogniti) l’analita è poco identificabile nelle condizioni analitiche di routine (assenza del picco). Per questo motivo si tende ad utilizzare la variabilità (SD) ottenuta su uno standard a concentrazione molto bassa, prossima ai valori di LOQ attesi per l’analita o comunque con una altezza del segnale dell’analita compresa tra 6 e 10 volte il rumore di fondo. LOD ed LOQ calcolati dall’intervallo di predizione delle regressioni di calibrazione Questo metodo di valutazione dell’LOD e LOQ si basa sulla regressione utilizzata per la calibrazione e permette di considerare tutti gli errori introdotti anche con il tipo di regressione



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utilizza. Questo approccio ha il vantaggio di poter essere applicato per tutte le tecniche analitiche in cui viene eseguita una calibrazione per regressione (lineare, quadratica o altro). Il principio su cui si basa è l’utilizzo dell’intervallo di predizione (e non l’intervallo di fiduciale) della calibrazione, che con la probabilità del 95% (test a una coda) valuta come una singola misura possa ricadere in questo intervallo come riportato in figura 7. Viene così calcolato il livello critico yc al limite superiore della banda di predizione del segnale dal quale si ottiene il valore di LOD corrispondente alla concentrazione del limite inferiore della banda di predizione. Il valore di LOQ si ottiene in modo analogo assumendo un valore di segnale dieci volte superiore all’errore standard dell’intercetta.

-0,05

-0,03

-0,01

0,01

0,03

0,05

0,07

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08

Concentrazione

Seg

nal

e

DatiIntervallo Predizione SuperioreIntervallo Fiduciale SuperioreRetta di regressioneIntervallo Fiduciale InferioreIntervallo Predizione InferioreL.O.D.L.O.Q.

yc

Fig. 7 – Grafico d’esempio per la determinazione dei valori di LOD ed LOQ dall’intervallo di predizione della regressione.

Questo metodo di calcolo è stato applicato ai metodi in IC qui descritti, utilizzando il valore medio dei segnali in area per ciascun standard analizzati in un lungo periodo (alcuni mesi) ottenendo i valori di LOD ed LOQ riportati in seguito. Il calcolo dell’LOD secondo Hubaux-Vos può essere eseguito direttamente sulla calibrazione utilizzando la versione software Dionex Chromeleon 6.8 che implementa la funzione di calcolo per l’LOD impostabile per diversi livelli di probabilità, di cui un esempio è riportato in figura 8. Il calcolo dei valori di LOD ed LOQ viene qui eseguito sulle regressioni lineari e quadratiche costruite con i valori medi di segnale in area per ciascun standard, ottenuti in un lungo periodo di determinazioni (alcuni mesi) come già descritto nel paragrafo riguardante la stabilità della risposta strumentale. I limiti di rivelabilità e quantificazione (LOD e LOQ) possono essere notevolmente migliorati aumentando il volume del loop di iniezione fino a 250-500 µL, oppure preconcentrando il campione in apposite colonne utilizzate al posto del loop di iniezione.



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Fig. 8 – Grafico d’esempio dei cloruri per la determinazione dei valori di LOD secondo Hubaux-Vos a diversi livelli di probabilità (95 e 99 %) ottenuti con il software di integrazione Dionex Chromeleon 6.8; la retta viene riportata con i limiti di confidenza al 95 % di probabilità (linee rosse).

UTILIZZO DEL SOFTWARE DIONEX CHROMELEON La gestione completa di tutte le linee cromatografiche Dionex avviene tramite il software Dionex Chromeleon versione 6.8 in ambiente Microsoft Windows XP. In questo software è presente sia la parte di comunicazione e gestione dei singoli moduli cromatografici, che la parte di elaborazione ed integrazione del segnale, calibrazione, controllo di qualità, organizzazione ed interrogazione del data base dei dati analitici e molteplici altre funzioni per soddisfare quasi tutte le esigenze cromatografiche; Il livello avanzato e la sua completezza e versatilità ne permette l’utilizzo a vari livelli e con strumentazione non solo di produzione Dionex. In questo paragrafo vengono brevemente passati in rassegna solo alcuni degli aspetti tra i più utilizzati giornalmente, per una descrizione più approfondita fare riferimento esclusivamente all’esaustivo manuale in linea Chromeleon Tutorial disponibile anche in lingua italiana. Impostazione client – server: Chromeleon è una applicazione software basata sull’impostazione client – server dove il Server monitor comunica con i singoli moduli delle linee analitiche (timebase) inviando ed acquisendo tutte le informazioni necessarie al loro funzionamento, ed il client è l’interfaccia utente che permette all’operatore di comunicare con gli strumenti (tramite i pannelli) passando attraverso il Server monitor o di gestire ed elaborare tutti i dati acquisiti ed organizzati per ciascuna linea analitica (tramite il browser). Per questo motivo per comunicare con gli strumenti ed eseguire le analisi è indispensabile avere attivato il server monitor ed il client di Chromeleon e tramite i pannelli inviare i comandi, mentre per le elaborazioni delle analisi acquisite è sufficiente il client Chromeleon browser.



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Attraverso il modulo client Server Configuration è possibile impostare e scegliere le varie configurazioni di linee analitiche organizzate nelle cosiddette timebase. La configurazione analitica a cui qui si fa riferimento (Fig. 9) è la seguente:

DX120 linea analitica a due canali (anioni e cationi) con auto campionatore AS3500 DX320 linea analitica anionica con rivelatori conduttometrico e UV-VIS (AD25) ed

auto campionatore AS50 DX500 linea analitica cationica con auto campionatore AS3500 ICS3000 linea analitica cationica con auto campionatore AS.

Fig. 9 – Impostazione di Chromeleon browser con le due Datasource contenenti le linee analitiche (IC-CHIMICA_local) e l’archivio dati (Archivio Dati DX).

Pannelli di controllo: i pannelli comunicano con le linee strumentali tramite il Server monitor che deve essere precedentemente attivato. Aattraverso questi pannelli è possibile comunicare direttamente dal PC tra Chromeleon ed i vari moduli delle linee cromatografiche; dal pannello si applicano tutte le condizioni analitiche (flusso, concentrazione dell’eluente, alimentazione dei soppressori, azzeramenti, fondo scala, ecc.). In figura 10 vengono riportati gli esempi dei pannelli relativi alla linea anionica DX320 ed alla linea cationica ICS3000. Tutti i pannelli possono essere personalizzati con tasti funzione per comandi, visualizzatori grafici, visualizzatori di eventi, ecc. e tutte le impostazioni vengono salvate o richiamate a seconda dell’utilizzo.

Fig. 10 – Esempi dei due pannelli di controllo relativi agli anioni (DX320) ed ai cationi (ICS3000) Il passaggio dal browser ai pannelli di controllo o altre finestre attive può essere fatto dal menù Window e con la ripetuta sequenza dei tasti Ctrl+Tab.



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Il browser e l’impostazione della sequenza analitica: per iniziare un ciclo analitico è necessario preparare la sequenza dal browser, posizionandola nella cartella corrispondente alla linea analitica dove verrà analizzata, ad esempio sotto ICS3000 la cartella FIUMI_0521 (Fig. 11). La sequenza può essere duplicata da un’altra con Copy o Save as e successivamente adattata alle esigenze del momento aggiungendo e cambiando campioni o standard ed associando diversi programmi (file.prg) o metodi analitici (file.qnt) presi da altre sequenze e trasferiti nella finestra superiore del browser. Tutte le impostazioni relative alle condizioni analitiche strumentali sono riportate nel file.prg (Fig. 12) alla colonna Program, mentre le modalità di integrazione e quantificazione sono contenute nel file.qnt (Fig. 13) alla colonna Method. Normalmente nella sequenza il file.prg resta uguale per tutti i campioni, mentre il file.qnt può cambiare anche per gruppi di campioni. Dando inizio all’analisi della sequenza i campioni da analizzare saranno identificati alla colonna Status con la condizione Single che al termine dell’analisi verrà sostituita con Finished.

Fig. 11 – Browser di Chromeleon con la sequenza FIUMI_0521 pronta per l’analisi sul sistema analitico ICS3000



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Fig. 12 – Esempi di file.prg per la linea anioni (DX320) e cationi (ICS3000).

Fig. 13 – Esempio del file.qnt per la linea anioni (DX320).



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Per dare inizio all’analisi di una più sequenze analitiche, dal menù del browser Batch Start oppure Batch Edit, accedere alla finestra dalla quale si può visualizzare e gestire tutte le sequenze analitiche in corso (Fig. 14). Durante l’analisi aprendo il pannello di controllo (Fig. 10) si potrà verificare in tempo reale il procedere della determinazione con la visualizzazione dei picchi degli analiti e delle impostazioni sui moduli cromatografici; il cromatogramma ottenuto potrà invece essere aperto ed editato dal browser (Fig. 11) con un doppio clic sulla linea corrispondente al campione da visualizzare (Fig. 15).

Fig. 14 – Finestra relativa al Batch di Chromeleon per le analisi sul sistema analitico DX320

Fig. 15 – Visualizzazione della cartella Integration di un campione analizzato



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Controllo e visualizzazione dei risultati analitici (reports): al termine delle analisi è sempre

necessario visualizzare il report di ogni campione scorrendoli con il tasti per controllare visivamente l’integrazione e la calibrazione; se necessario è possibile poi ritoccare l’integrazione agendo sui parametri utilizzati nel metodo (file.qnt) con effetto immediato su tutti i campioni analizzati con quel metodo, oppure correggendo il singolo campione ritoccando inizio e fine integrazione del picco, o forzando il riconoscimento di un’analita. Visualizzando il singolo campione (Fig. 15) è possibile controllare le cartelle che riportano i risultati dell’integrazione (Integration), della calibrazione (Calibration), dell’analisi della forma dei picchi (Peak Analysis) oppure avere un sommario dei risultati analitici per tutti i campioni analizzati nella sequenza per l’analita selezionato (Summary), ed infine consultare una tabella che riporta tutti gli eventi avvenuti durante l’analisi di quel campione (Audit Trail); tutte queste cartelle possono essere personalizzate per visualizzare altri parametri quali ad esempio i valori di LOD secondo Hubaux-Vos alla cartella Calibration (Fig. 8). Le versioni personalizzate dei reports possono essere salvate e richiamate con nome dal menu Workspace Load o Save Retort Definition. Nel caso l’acquisizione venga fatta con due o più rivelatori (canali), come nel caso degli anioni DX320 dove il nitrato viene determinato conduttometricamente (CDM) e con rivelatore spettrofotometrico a 215 nm (UV215), si può visualizzazione il cromatogramma o la calibrazione di

un canale o dell’altro agendo sul tasto . Principali impostazioni del metodo analitico (file.qnt): terminata l’acquisizione di un cromatogramma o dell’intera sequenza analitica, attraverso il metodo QNT vengono integrati e assegnati i nomi ai picchi. E’ comunque possibile modificare successivamente un campione nel suo rapporto, ma quanto più il metodo QNT è ottimizzato per tutti i campioni e minore sarà l’impegno per riprocessarli. In figura 13 viene riportato l’esempio del metodo per la determinazione degli anioni (AN AS19 KOH ST 0123567.qnt). Questo file è organizzato in cartelle tra cui quelle più utilizzate sono General, Detection, Peak Table, Amount Table, Peak Tracking, Calibration all’interno delle quali sono organizzati tutti i parametri riguardanti il metodo tra cui anche gli standard analizzati ed il tipo di calibrazione. Gli aspetti più significativi da considerare sono alla cartella General l’impostazione del volume del loop (µL) che deve corrispondere a quello riportato nella colonna Inj. Vol. del Browser, altrimenti vengono fatti automaticamente i calcoli relativi alla diluizione (o preconcentrazione) secondo le dovute proporzioni, e l’impostazione Total o Group per le impostazioni di calibrazione, dove con Total vengono considerati in una unica calibrazione tutti gli standard identificati nella sequenza analitica (opzione normalmente utilizzata). Alla cartella Detection sono riportati in ordine temporale i parametri per la rilevazione dei picchi attivati nel corso dell’acquisizione cromatografica (Fig. 16), una buona ottimizzazione di questi parametri permette l’identificazione e la quantificazione degli analiti in modo immediato e senza perdite di tempo in fase di controllo per la risistemazione di ogni singolo cromatogramma.

Fig. 16 – parametri per la rilevazione dei picchi nel corso dell’acquisizione cromatografica



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Le cartelle Peak Table, Amount Table, Peak Tracking contengono le informazioni sul riconoscimento dei picchi (Window), il tipo di regressione utilizzata (Cal.Type) e le concentrazioni di ciascuno standard utilizzato (Fig. 17) ed elencati poi alla cartella Calibration (Fig. 18) dove è anche possibile disattivarli (Enabled).

Fig. 17 – concentrazioni degli standard

Fig. 18 – Elenco degli standard letti nella sequenza analitica con posizione e data ed ora di iniezione Dalla cartella Peak Table alla colonna Cal. Type è possibile accedere con doppio clic alle varie tipologie di calibrazioni (Fig. 16) di cui la più utilizzata è la lineare con intercetta calcolata ed identificata con la sigla LOff, mentre per l’ammonio viene utilizzata la calibrazione quadratica con il punto zero “Add zero point (0,0) for curve fitting (0)” ed identificata con la sigla 0Qof (Fig. 19).

Fig. 19 – Esempi di parametri impostabili nel metodo analitico (file.qnt) alla cartella Peak Table colonna Cal. Type con la finestra relativa al dettaglio delle calibrazioni selezionabili. Nell’esempio è riportata la calibrazione dell’ammonio che utilizza la calibrazione quadratica con il punto zero (0,0).

In figura 20 vengono illustrati alcuni esempi di regressioni ottenute per anioni e cationi con riportati gli intervalli di confidenza al 95 % attorno alla retta.



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Fig. 20 –Esempi di alcune regressioni ottenute nella sequenza analitica, il software Chromeleon riporta con le linee rosse l’intervallo di confidenza al 95 % attorno alla

retta, ed i punti eliminati con un asterisco rosso.



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Elaborazione e trascrizione dei dati analitici: terminata l’analisi della sequenza si procede alla sua elaborazione, prima si deve verificare il corretto inserimento di tutte le informazioni dal nome del campione, alla tipologia (Standard o Unknown), al metodo analitico utilizzato (QNT), ed eseguire i seguenti controlli sui risultati ottenuti per ogni campione: Al termine dell’analisi della sequenza analitica si deve procedere ai seguenti controlli ed elaborazioni dei risultati ottenuti:

1. riconoscimento, acquisizione ed integrazione appropriata dei picchi degli analiti provvedendo ad eventuali ritocchi sulle linee di base controllando anche l’integrazione con l’eventuale secondo rivelatore (nitrati CDM e UV 215 nm);

2. controllare le calibrazioni selezionando nel metodo alla cartella General, in Global calibration setting, l’opzione Total al fine di visualizzare graficamente i punti di tutti gli standard e verificare la corrispondenza delle letture ottenute nella prima calibrazione con le successive;

3. selezionare gli standard necessari secondo gli intervalli analitici più appropriati in funzione della calibrazione adottata;

4. verificare la qualità della regressione attraverso l’osservazione dei parametri della calibrazione, il valore dell’intercetta prossimo allo zero e l’andamento dell’intervallo fiduciale al 95 % visualizzato graficamente (linee rosse), i punti molto fuori dall’intervallo fiduciale possono essere esclusi dalla regressione;

5. nel caso di derive strumentali provvedere alla scelta della calibrazione più opportuna, ad esempio impostando nel metodo alla cartella General, in Global calibration setting, l’opzione Group che utilizza la prima calibrazione per il primo gruppo di campioni, la seconda calibrazione con il secondo gruppo e così via;

6. verifica dell’accordo tra concentrazioni nominali degli standard e valori ottenuti dalle calibrazioni (iniziale e finale con impostazioni globali di calibrazione in modalità total), il software Chromeleon quando visualizza il report di uno standard, riporta le concentrazioni calcolate dalla regressione, questi valori devono essere in buon accordo con i valori nominali;

7. nel caso di letture discordanti sugli standard è possibile eliminare alcuni punti di calibrazione (1 o al massimo 2) per ciascun analita: prima di procedere all’eliminazione dei punti si consiglia di confrontare i valori dei segnali in area trasferendoli nell’archivio Excel delle aree per ciascun standard;

8. controllo dei valori ottenuti dall’analisi dei campioni di carte di controllo ed archiviazione su foglio di lavoro Excel, al fine di confrontare i dati ottenuti nella sequenza con i dati conseguiti nei periodo precedentemente considerato nella carta di controllo;

9. verifica dei valori ottenuti dall’analisi dei bianchi ed archiviazione su foglio di lavoro Excel al fine di confrontare i dati ottenuti nella sequenza con i dati precedentemente ottenuti;

10. controllo e trascrizioni dei valori di concentrazione ottenuti sui campioni prestando attenzione che la calibrazione utilizzata comprenda i valori riscontrati nei campioni; per le calibrazioni quadratiche bisogna controllare che il segnale in area o altezza (µS) dell’analita nel campione non oltrepassi il segnale in area o altezza dell’analita nello standard a concentrazione più elevata.



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